CN112813143A - 一种免扩增的rna定量检测方法 - Google Patents

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CN112813143A CN202011429693.8A CN202011429693A CN112813143A CN 112813143 A CN112813143 A CN 112813143A CN 202011429693 A CN202011429693 A CN 202011429693A CN 112813143 A CN112813143 A CN 112813143A
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舒博文
周小明
田甜
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South China Normal University
Guangzhou First Peoples Hospital
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South China Normal University
Guangzhou First Peoples Hospital
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

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Abstract

本发明公开了一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；配制Cas13反应体系；将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升级的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；完成孵育反应后读取微反应单元信号，计算待测样品中目标RNA的含量。本发明所述的免扩增的RNA定量检测方法，可实现单分子水平的RNA定量检测，无需内参校正和建立标准曲线，无需反转录及核酸复制步骤，也无需进行标记和功能修饰，恒温反应无需热循环，操作步骤简单且检测精度高。

Description

一种免扩增的RNA定量检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物检测领域，特别涉及一种免扩增的RNA检测及其单分子定量检测方法。
背景技术
核糖核酸RNA(Ribonucleic Acid)，是一种广泛存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶)，其中U取代了DNA中的T(胸腺嘧啶)。RNA存在多种形式，包括基因组RNA、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖RNA(rRNA)和一系列非编码RNA(如microRNA、lncRNA、circRNA、snRNA、cfRNA等)，各自在生命进程中发挥着不同的重要作用。例如，microRNA参与调控一系列的细胞功能如细胞增殖、分化和死亡等，同时miRNAs可通过致癌和抑癌的双向功能参与多种实体瘤的细胞通路，因而miRNAs被认为是疾病早期诊断、预后和治疗监测的重要生物标志物。
然而,由于RNA自身的一些特性如片段长度短、序列相似度高、表达差异跨度大、环境背景复杂，使得其检测特别是单分子水平的定量分析存在重重挑战。传统的NorthernBlotting和高通量测序需要进行一系列的复杂操作、样本消耗量大、分析耗时长、而且检测灵敏度较低。基于RT-PCR技术的qRT-PCR、ddPCR方法和基于CRISPR(规律间隔性成簇短回文重复序列)效应蛋白的系列核酸扩增检测技术(包括“SHERLOCK系统”及其改进版本)具有较高的检测灵敏度，但是其过程涉及的逆转录和核酸扩增等步骤易受多种因素干扰而影响定量检测的准确性。目前，新近发展的一系列基于标记和修饰技术的RNA定量检测方法也由于其标记/修饰过程的复杂性也在一定程度上限制了其广泛适用性。
发明内容
本发明为解决现有RNA定量检测技术存在的不足，提供一种可实现单分子灵敏度、单碱基特异性的免扩增绝对数字化定量RNA的方法。
本发明的目的是通过以下技术方实现的：
一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：
S1：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；
S2：配制Cas13反应体系；
S3：将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量体积均一的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微液滴；
S4：完成孵育反应后读取微液滴信号，设定液滴阴性/阳性的信号强度阈值，计算待测样品中目标RNA的含量。
进一步，步骤S2中所述的Cas13反应体系配制包括以下组分：Cas13效应蛋白、crRNA、RNA报告探针和反应缓冲液。
进一步，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为10nM-100nM，crRNA在反应体系的终浓度为5nM-200nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为200nM-1000nM。
进一步，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为20nM，crRNA在反应体系的终浓度为10nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为300-500nM。
进一步，步骤S2中所述Cas13反应体系中，反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl。
进一步，步骤S3中所述的混合体系分散到大量体积均一的微反应单元的方式包括微腔室阵列方式和微液滴乳化方式。
进一步，步骤S3中的微反应单元的有效体积不超过20nL，包含目标RNA的待测物与预混反应液混合到分配到足够数目微反应单元之间的延迟时间不超过15分钟。
进一步，步骤S3中，所形成的微反应单元的孵育温度为25-40℃，孵育反应时间不超过90分钟。
进一步，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为直接计数，统计阳性液滴的总数，或者统计阳性液滴数目在液滴总数所占的比例。
进一步，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为利用泊松分布原理计算待测标本中目标RNA的原始浓度。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：本发明所述的免扩增的RNA定量检测方法，可实现单分子水平的RNA定量检测，无需内参校正和建立标准曲线，无需反转录及核酸复制步骤，也无需进行标记和功能修饰，恒温反应无需热循环，操作步骤简单且检测精度高。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明所述的免扩增RNA的定量检测方法原理图；
图2是实施例2中10fM的microRNA-17与无模板对照在液滴孵育过程中的典型荧光图像；
图3为实施例2中10fM的microRNA-17与无模板对照在液滴孵育过程中阳性液滴数的变化情况；
图4为实施例2中10fM的microRNA-17在液滴孵育过程中阳性液滴与阴性液滴的平均荧光强度差异图；
图5是实施例3中不同浓度水平下检测microRNA-17的典型终点荧光图像；
图6是实施例3中不同浓度水平的microRNA-17的定量检测效果；
图7是实施例4中临床标本中肿瘤标志物microRNA-21相对水平的检测结果；
图8是对比实施例中宏观体积下Cas13体系实时定量检测不同浓度水平的microRNA-17的检测结果。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的实施例进行详细说明，以便更清楚理解本发明的目的、特点和优点。应理解的是，附图所示的实施例并不是对本发明范围的限制，而只是为了说明本发明技术方案的实质精神。
一种免扩增的RNA定量检测方法的发明构思和检测原理如下：
CRISPR-Cas13/crRNA复合体体系(Cas13体系)具有特异性识别RNA序列且非特异性剪切周边单链RNA的特性，由于Cas13体系直接用于核酸检测的灵敏度仅达到亚皮摩尔水平(106copies/μL量级)，因此现有技术中基于Cas13体系的核酸检测方法均将其作为预扩增产物进行特异性信号放大的特异性与灵敏度增强步骤，Cas13体系在其中发挥的作用相当于一种同时增强检测特异性与灵敏度的“超级探针”。而本发明则是通过将包含靶分子RNA的Cas13体系分散到不超过纳升级的微反应单元中，使得包含靶分子的微反应单元中靶分子RNA的浓度相对增加，提高Cas13体系的RNA触发剪切效率；同时，由于被Cas13a持续剪切而不断释放的探针信号也被限域在微反应单元内，使得存在靶分子RNA的微反应单元的局域信号强度也获得相对提高，从而便于微反应单元信号的识别或读取。因此，微反应单元产生的限域作用可为Cas13体系与靶标分子RNA的反应带来两方面的协同增强效果，达到无需核酸预扩增即可检测单个RNA分子之目的。
本发明所述的免扩增RNA的定量检测方法原理图如图1所示。首先，将包含待测靶分子RNA的样品与Cas13a预混液混合，然后随即分散到数以万计的微液滴中，使得每个微液滴包含0或1个靶分子RNA。在微液滴孵育过程中，与靶分子RNA存在碱基互补配对关系的crRNA能和Cas13a蛋白形成复合物，一旦crRNA与靶分子RNA结合则激活Cas13a蛋白的非特异性协同剪切效应。被激活的蛋白则持续剪切周边的单链RNA报告探针并释放出检测信号。而不包含靶分子的微液滴内Cas13a蛋白未被激活无法产生协同剪切活性，从而不产生检测信号。孵育反应结束后，读取和分析微液滴的信号，有信号的液滴判为阳性液滴记为“1”，无信号的液滴判为阴性液滴记为“0”，统计阳性液滴的数目或阳性液滴比例，实现对靶分子RNA的数字化定量分析。
以下实施例便于理解本发明，但并不限定本发明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、LbuCas13a蛋白的表达纯化
首先，在加富培养基(Terrific Borth growth media，OXOID)中添加100mg/μL的氨苄西林(上海生工)。在37℃条件下，以此培养基培养构建有pET28a-His6-SUMO-LbuCas13a质粒的大肠杆菌Rosetta(DE3)直至菌密度达到OD(600nm)为0.6。然后，向上述细菌培养液中添加终浓度为100μM的异丙基-1-硫代β-D吡喃型半乳糖(isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside，购自sigma)，并将温度降至26℃继续培养4小时，以诱导蛋白的表达。接下来，收集上述培养的细菌并在添加包含20mM Tris-HCl，1M NaCl，10％glycerol且pH为7.5的裂解缓冲液后进行超声裂解。再将上述细菌裂解液在4℃下离心处理，离心转速为8000转每分钟，利用含镍的亲和树脂(Ni-NTA agarose，购自济南Abiotech公司)孵育所获得的上清液。使用洗涤液(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，20mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)洗涤上述结合在亲和树脂的蛋白，并进一步将其洗脱在洗脱液中(20mM Tris-HCl，150mMNaCl，500mM咪唑，10％甘油，pH 7.5)。随后，使用ULP1重组酵母SUMO蛋白酶1消化掉蛋白上的His6-SUMO标签，并将此步骤获得蛋白进行肝素琼脂糖凝胶(Heparin agarose，济南Abiotech公司提供)纯化。再将上述蛋白进行洗涤(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，10％甘油，pH 7.5)和洗脱(20mM Tris-HCl，1M NaCl，10％甘油，pH 7.5)，最终将所得到的蛋白溶解到蛋白储存液(20mM Tris-HCl，1M NaCl，50％甘油，pH 7.5)中并在-80℃保存备用。
实施例2、单分子RNA检测能力验证
为验证本发明提供的技术方案进行单分子RNA检测的可行性，验证实验操作步骤如下：
(1)针对microRNA-17序列(如序列表的序列1所示)设计crRNA-miR-17(如序列表的序列2所示)：GACCACCCCAAAAAUGAAGG GGACUAAAAC CCUGCACUGU AAGCACUUUG，下划线所示碱基序列与microRNA-17序列互补配对。
(2)配制Cas13反应体系9μL，其组分主要包含如20nM实施例1制备的LbuCas13a蛋白、10nM crRNA-miR-17、300nM FQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(3)将1μL浓度为100fM的microRNA-17作为靶标(购自宝生物工程(大连)有限公司)与上述Cas13反应体系混合，随即形成大量直径为30μm的油包水离散微液滴，微液滴的数目不少于20000个。
上述(3)中用于形成油包水液滴的油相的主要成分为包含3％(v/v)的ABIL EM 90(鲸蜡基聚乙二醇/聚丙二醇-10/1二甲基硅氧烷醇)和0.1％(w/w)Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的矿物油。
(4)将上述(3)中所形成的液滴平铺在容器中，在垂直重力方向的液滴堆叠层数不超过2层，以构建液滴阵列；
(5)将上述(4)形成的液滴阵列置于控温加热装置上，在本实施例中采用加热装置为ITO导电玻璃加热器，维持液滴阵列温度为37℃；
(6)上述液滴阵列及ITO导电玻璃加热器至于倒置荧光显微镜的载物台上，测量明场视野下微液滴的平均直径D，并监测荧光视野内液滴的数目变化。
随着孵育时间的延长，液滴出现阳性信号的典型荧光图像如图2所示，且液滴阳性率的增长情况如图3所示。需要指出的是，对于终浓度为10fM的microRNA-17(拷贝浓度约为6.02×103copies/μL),每个液滴内包含至多一个靶分子的概率为99.67％，也就是说如果某个液滴内包含靶分子那么这个液滴内有一个靶分子的概率为99.67％，且预期的液滴阳性率应为8.4％.而实验结果显示，在孵育时间接近1小时的时候，液滴阳性率不再随孵育时间的延长而增加，且此时液滴的阳性率趋近于预期液滴阳性率。图4显示在液滴孵育过程中，阳性液滴与阴性液滴的平均荧光强度差异，该实验结果显示本发明提供的技术方案可以在1小时内获得良好的液滴荧光信号对比度，这种显著的液滴荧光阴阳性信号对比度(约20倍)非常有利于对液滴荧光信号二值化判定。本实施例的结果表明，本发明提出的技术方案可以在1小时内实现液滴单分子RNA检测，且液滴荧光信号二值化判定明确。
实施例3、利用梯度稀释micro RNA-17样品验证定量检测能力
(1)将已知浓度的microRNA-17合成靶标(购自宝生物工程(大连)有限公司)10倍梯度稀释，制备成浓度分别为1pM、100fM、10fM、1fM、100aM、10aM的定量标准品，同时以无模板的DEPC水作为阴性对照。
(2)配制反应体系，其组分主要包含20nM如实施例1制备的LbuCas13a蛋白、10nMcrRNA-miR-17、300nM FQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(3)将步骤(1)的定量标准品与上述步骤(2)的反应体系混合，随即形成大量直径为30μm的油包水离散微液滴，微液滴的数目不少于20000个。
上述(3)中用于形成油包水液滴的油相的主要成分为包含3％(v/v)的ABIL EM 90和0.1％(w/w)Triton X-100的矿物油。
(4)将上述(3)中所形成的液滴平铺在容器中，在垂直重力方向的液滴堆叠层数不超过2层，以构建液滴阵列；
(5)将上述(4)形成的液滴阵列置于控温加热装置上，所使用的加热装置可以是金属浴设备、水浴锅、温箱或核酸扩增仪，优选为金属浴设备。在本实施例中采用金属浴；
(6)维持液滴承载容器的温度为37℃，持续恒温时间为1小时；
(7)将已完成步骤(6)的液滴承载容器至于荧光显微镜下扫描成像和测量液滴平均直径D。
(8)设定液滴信号判定阈值为S/N≥3，其中S为液滴信号强度，N为平均背景信号。根据液滴的荧光强度阈值将液滴信号二值化，荧光强度高于判定阈值即为阳性“1”，否则判定为阴性“0”。待测样品中目标RNA含量的计算可以通过统计阳性液滴的总数或统计阳性液滴数目在液滴总数所占的比例得到，也可以利用泊松分布原理进行计算。本实施例采用泊松分布原理对目标RNA含量进行计算。具体计算公式如下：
Figure BDA0002826174900000081
其中p为阳性液滴数在液滴总数所占的比例，
Figure BDA0002826174900000082
不同定量标准品对应的终点液滴荧光图像如图5所示，荧光采集的参数为:曝光时间4s，ISO 800，显微物镜放大倍数10×。该图直观地显示：液滴阳性率随着输入样品中靶分子浓度的升高也不断增加。进一步地，统计上述各个浓度样品对应的阳性率，结合相应的液滴平均直径测量值，由泊松分布算法计算出的样品靶标浓度如图6所示。对测量值与预期值进行线性拟合可见:本方法提供的技术方案可以动态检测靶标浓度范围在10aM-107aM的样品，线性定量靶标浓度为10aM-105aM的样品并且具有极好的线性度(0.99999)。
实施例4、定量检测血清中的肿瘤标志物micro RNA-21的相对含量
(1)针对microRNA-21序列(如序列表中序列3所示)设计相应的crRNA-miR-21(如序列表中序列4所示)，GACCACCCCAAAAAUGAAGG GGACUAAAAC UAACAUCACU CUGAUAAGCU A；针对microRNA-39序列(如序列表中序列5所示)设计相应的crRNA-miR-39(如序列表中序列6所示)，GACCACCCCAAAAAUGAAGG GGACUAAAAC CAAGCTGATT TACACCCGGT GA。
(2)按照试剂盒操作说明使用天根miRcute血清/血浆miRNA提取试剂盒提取待测6例乳腺癌患者及5例健康志愿者血清中的总microRNA。在提取前，以体积比1：100的比例向待测血清标本中添加已知含量的microRNA-39。
(3)配制反应体系，其组分主要包含20nM如实施例1制备的LbuCas13a蛋白、10nMcrRNA-miR-21或crRNA-miR-39、300nM FQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(4)将包含micro RNA-39的总microRNA样品与上述(3)反应体系混合，随即形成大量直径为20μm的油包水离散微液滴，微液滴的数目不少于60000个。
(5)上述(4)中用于形成油包水液滴的油相的主要成分为包含3％(v/v)的ABIL EM90和0.1％(w/w)Triton X-100的矿物油。
(6)驱动上述(5)中所形成的液滴沿通道持续经过温度为37℃恒温加热柱，设定通道长度及液滴的流动线速度，确保液滴经历37℃温区的时间不少于45分钟；
(7)驱动完成上述(6)液滴通过激光诱导荧光检测器，逐次采集每一个液滴的荧光强度信号并统计液滴总数。
(8)根据液滴的荧光强度阈值将液滴信号二值化，统计液滴总数和阳性液滴数。
本实施例通过添加已知含量的microRNA-39，根据microRNA-21和microRNA-39的液滴阳性比率确定原始血清标本中的microRNA-21的相对含量，以提高检测结果的准确度。检测结果如图7所示，乳腺癌患者血清中的microRNA-21平均含量相较于健康志愿者血清中的microRNA-21含量普遍偏高约为2.9倍。该结果提示，本发明所述方案的一种应用场景包括定量检测血清中的肿瘤标志物在内的液体活检应用。
对比实施例、与宏观体积中的Cas13a反应实时定量检测能力的比较
为了体现本发明提供的技术方案对Cas13a体系检测灵敏度和定量能力的巨大提升作用，利用与实施例2相同的Cas13体系在宏观反应体积中对梯度稀释的microRNA-17样品进行实时定量检测实验。
(1)将已知浓度的microRNA-17合成靶标(购自宝生物工程(大连)有限公司)10倍梯度稀释，制备成浓度分别为1nM、500pM、100pM、50pM、1pM、500fM和100fM的定量标准品，同时以无模板的DEPC水作为阴性对照。
(1)在100μL PCR管中配制Cas13a反应体系22.5μL，其组分主要包含20nM如实施例1制备的LbuCas13a蛋白、10nM crRNA-miR-17、300nM FQ 5U RNA荧光报告探针(FAM-UUUUU-BHQ1)和1×反应缓冲液，其中反应缓冲液包含10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2，50mM KCl，溶液pH 8.9。
(3)分别将2.5μL上述microRNA-17样品加入到Cas13a反应体系中，混合均匀后放入实时定量PCR仪(TakaRa)中37℃恒温孵育1小时，在孵育过程中每分钟对PCR管采集一次荧光信号，获得荧光强度随时间变化的曲线如图8所示。该结果显示，宏观体积中的Cas13a体系对microRNA-17的检测限为500fM(100fM样品的荧光曲线与无模板对照的荧光曲线几乎重合)。相比于本发明提供的微小体积限域Cas13反应相比，宏观体积的Cas13a实时定量检测的灵敏度至少低1万倍，且无法进行精确定量检测。
以上所述实施例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0002826174900000121
Figure BDA0002826174900000131
序 列 表
<110> 广州市第一人民医院（广州消化疾病中心、广州医科大学附属市一人民医院、华南理工大学附属第二医院）、华南师范大学
<120> 一种免扩增的RNA定量检测方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
CAAAGUGCUU ACAGUGCAGG UAG 23
<210> 2
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAAC CCUGCACUGU AAGCACUUUG 50
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
UAGCUUAUCA GACUGAUGUU GA 22
<210> 4
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAAC UAACAUCACU CUGAUAAGCU A 51
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
UCACCGGGUG UAAAUCAGCU UG 22
<210> 6
<211> 52
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
GACCACCCCA AAAAUGAAGG GGACUAAAAC CAAGCTGATT TACACCCGGT G A 52

Claims (10)

1.一种免扩增的RNA定量检测方法，包括以下步骤：
S1：设计与目标RNA碱基互补配对且含5’端重复序列茎环结构的crRNA序列；
S2：配制Cas13反应体系；
S3：将待测物与所述Cas13反应体系混合，将该混合体系分散到大量尺寸均一且体积不超过纳升极的微反应单元，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；
S4：完成孵育反应后读取微反应单元信号，设定判定阴性/阳性信号的强度阈值，计算待测样品中目标RNA的含量。
2.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述的Cas13反应体系配制包括以下组分：Cas13效应蛋白、crRNA、RNA报告探针和反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为10nM-100nM，crRNA在反应体系的终浓度为5nM-200nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为200nM-1000nM。
4.根据权利要求2所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，Cas13效应蛋白在反应体系的终浓度为20nM，crRNA在反应体系的终浓度为10nM，RNA报告探针在反应体系的终浓度为300-500nM。
5.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S2中所述Cas13反应体系中，反应缓冲液pH为8.9，包括以下组分：10mM Tris-HCl、1.5mM MgCl2、50mM KCl。
6.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中所述的混合体系分散到大量体积均一的微反应单元的方式包括微腔室阵列方式和微液滴乳化方式。
7.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中的微反应单元的有效体积不超过20nL，包含目标RNA的待测物与预混反应液混合到分配到足够数目微反应单元之间的延迟时间不超过15分钟。
8.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S3中，所形成的微反应单元的孵育温度为25-40℃，孵育反应时间不超过90分钟。
9.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为统计阳性液滴的总数，或者统计阳性液滴数目在液滴总数所占的比例。
10.根据权利要求1所述的免扩增的RNA定量检测方法，其特征在于，步骤S4中，计算待测样品中目标RNA的含量的方法为利用泊松分布原理计算待测标本中目标RNA的原始浓度。
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