CN112029653A - 基于CRISPR和Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统 - Google Patents

基于CRISPR和Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统。集成化检测系统包括一个集成化反应芯片、温度控制模块、光源、光学信号检测器；将核酸扩增体系均分成扩增微液滴，而后将数字化核酸扩增后的扩增微液滴和包含有CRISPR/Cas体系的检测微液滴混合进行CRISPR反应，反应结束后，通过检测光学信号实现目标物的高特异性检测，并得到待测样品中核酸分子的浓度或者拷贝数，实现目标物的高灵敏绝对定量检测。本发明既具有数字化扩增技术绝对定量的特点，又具有CRISPR/Cas高灵敏、高特异性检测的优点，将检测过程集成在一个芯片上，简化了操作步骤，同时避免了交叉污染等问题。

Description

基于CRISPR和Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测 系统
技术领域
本发明涉及核酸检测微流控技术领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统。
背景技术
自1999年Vogelstein等人提出数字聚合酶链式反应(digital Polymerase ChainReaction，dPCR)以来，已在食品安全、法医鉴定、精准医疗等研究领域显示出巨大的技术优势和应用前景。dPCR是一种核酸分子绝对定量技术，通过将一个样本分散成几十到几万份至不同的反应单元，每个单元的核酸模板数少于或者等于1个；每个单元分别进行PCR扩增，扩增结束后有核酸模板的反应单元会发出荧光信号，没有模板的反应单元没有荧光信号，因此通过对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析得到核酸分子的数量。对于常规PCR和实时荧光PCR，其定量检测都需要已知拷贝数的标准DNA制定标准曲线，然而由于样品测定条件上不会完全一致，会造成PCR扩增效率的差异，从而影响定量结果的准确性。而根据dPCR原理可知，该技术不会受标准曲线和扩增动力学影响，可以实现高灵敏度、高精准度、高耐受性的绝对定量。
由于PCR扩增技术需要对多个反应温度进行精准控制，相关研究人员也提出了基于恒温扩增技术的数字化恒温核酸技术，例如基于环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的dLAMP、基于重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)的dRPA、基于多重链置换扩增(Multiple DisplacementAmplification，MDA)的dMDA等。
不论是dPCR还是数字化恒温扩增技术，目前对于阴阳性反应单元的检测大都基于荧光分析方法，通过在样品中加入相应的荧光物质。基于核酸扩增的荧光分析法中的荧光物质主要有荧光染料、荧光探针：(1)荧光染料如SYBR系列染料、EvaGreen、FAM等；(2)荧光探针如Taqman探针。但是其中荧光染料不具有特异性，无法区分特异性扩增和非特异性扩增的产物。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，规律成簇的具有规律间隔的短回文重复序列)，是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR和Cas蛋白(CRISPR-associated protein,Cas)协同作用，组成具有核酸切割能力的CRISPR/Cas系统。基于此，可以将CRISPR/Cas作为核酸检测工具。例如，CRISPR/Cas12a系统可以根据设计的gRNA(guide Ribonucleic Acid)对目标链进行识别与捕获，其DNA(Deoxyribonucleic Acid)酶切活性被激活，从而对体系中的单链荧光探针进行高效切割，实现目标DNA的特异性检测。
目前，虽然CRISPR/Cas已经开始应用于核酸检测中，但还未将其结合数字化核酸扩增一起使用。一方面是基于数字化核酸扩增技术的检测系统往往需要液滴发生器、核酸扩增仪、液滴信号检测仪等多台仪器，集成度差，操作步骤比较繁琐，仍在待完善阶段；另一方面是由于核酸扩增技术的工作温度(例如PCR技术中需要在95℃高温时变性成单链)远高于CRISPR/Cas体系中试剂的耐受温度(一般为37℃)，若在扩增结束后再开盖加入CRISPR/Cas体系会造成气溶胶污染，对后续的检测结果容易造成假阳性。
因此本领域需要一种可以解决上述问题的方法，将数字核酸扩增技术和CRISPR/Cas一起使用，结合两者绝对定量、高灵敏、高特异性的优点，并开发一种集成化检测系统，更好地应用于核酸检测领域。
发明内容
本发明的目的，为了解决背景技术中数字化检测系统集成度差、采用CRISPR/Cas体系容易造成气溶胶污染等问题，提供一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法和集成化检测系统，利用此方法将CRISPR/Cas与数字核酸扩增技术相结合，实现对目标核酸分子的绝对定量、高特异性的检测，在避免扩增产物污染的同时简化操作步骤，实现基于数字化核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案主要包含：
一、一种基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统：
包含一个集成化反应芯片、温度控制模块、光源、光学信号检测器；所述集成化反应芯片上分布有扩增体系液滴生成区、核酸扩增区、检测体系液滴生成区、液滴融合区和光学检测区；扩增体系液滴生成区与核酸扩增区之间、核酸扩增区与液滴融合区之间、检测体系液滴生成区与液滴融合区之间以及液滴融合区与光学检测区之间均采用微通道连通；
光源与光学信号检测器分别位于光学检测区的上下两侧，温度控制模块置于所述核酸扩增区下方或上方，并对核酸扩增区实现加热。
所述的集成化反应芯片上设有快速连接结构，温度控制模块通过快速连接结构连接到所述集成化反应芯片上的核酸扩增区。
所述检测体系液滴生成区放置有一个降温设备，或者在周围布置冷却通道，冷却通道中加入冷却液。
所述的微通道的宽度为单个液滴的大小一致或微小于液滴直径，使得只能单个液滴依次通过微通道。
二、一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法：
将核酸扩增体系的溶液均分成数以万计的扩增微液滴，再选择工作环境实现扩增微液滴内的核酸扩增；同时将CRISPR/Cas体系的溶液均分成数以万计的检测微液滴；将检测微液滴与扩增微液滴分别一一进行融合，之后进行CRISPR反应，进而通过检测光学信号实现目标物的高特异性检测。
所述核酸扩增体系的溶液进入通过扩增体系液滴生成区均分成数以万计的扩增微液滴，通过温度控制模块对核酸扩增区加热；然后驱动扩增微液滴经由微通道按照固定流速进入核酸扩增区，实现数字化核酸扩增；
所述扩增体系液滴生成区通过基于T型通道法、流动聚焦法或共轴流聚焦法等方法的微管道结构，调整结构和两相流速比来控制液滴的生成。两相是指溶液/液滴与其周围的油液的两相液体。
所述扩增微液滴直径从纳米级至微米级不等，其数量可从几万颗至几百万颗不等，但是每次产生的液滴直径一致，每次制备的液滴尺寸均一性较好。
所述扩增技术可为聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、滚环扩增技术(RCA)、依赖解旋酶扩增技术(HDA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、多重链置换扩增(MDA)等。
CRISPR/Cas体系的溶液在检测体系液滴生成区中均分成数以万计的检测微液滴，其中检测微液滴包含有作为荧光探针的带有荧光基团标记的单链寡核苷酸探针；
所述检测体系液滴生成区通过基于T型通道法、流动聚焦法或共轴流聚焦法等方法的微管道结构，调整结构和两相流速比来控制液滴的生成。
所述检测微液滴其直径从纳米级至微米级不等，其数量可从几万颗至几百万颗不等，但是每次产生的液滴直径一致，且每次制备的液滴尺寸均一性较好。
所述扩增微液滴在核酸扩增区完成扩增后和所述检测微液滴按固定流速进入液滴融合区，利用液滴间的碰撞和聚合分别进行一个扩增微液滴和一个检测微液滴的一一融合形成混合微液滴，之后混合微液滴进行CRISPR反应；
CRISPR反应完全后，混合微液滴进入光学检测区，通过gRNA对混合微液滴中的目标链进行识别与捕获，其DNA酶切活性被激活；
若混合微液滴中含有目标链，则荧光探针被切割，使得荧光基团和淬灭基团分离，在光源激发下发出荧光信号，通过光学信号检测器分析单个混合微液滴的荧光信号获得阴性液滴和阳性液滴(有荧光信号)的比例，再计算核酸扩增体系中核酸分子的浓度或者拷贝数，从而获得绝对定量的检测结果。从待测样品中取部分加入核酸扩增体系中。
所述的液滴融合区为Y型或T型微通道，Y型或T型微通道的三端经各自的微通道分别和核酸扩增区、检测体系液滴生成区和光学检测区连通。
微通道中的液滴通过其周围流动的油相驱动，油相的流动速度通过微泵控制。
方法对于阴性液滴和阳性液滴比例的获得，采用以下两种不同的方式之一：
(A)混合微液滴逐个检测：
驱动混合微液滴依次流过光学检测区，在光源激发或者没有光源激发下(若不是荧光物质，则无需该激发光源)，通过光电倍增管或者光电检测器等光学信号检测器检测光信号转化为电信号，连续记录混合微液滴的光学信号，通过对电信号的波形进行滤波处理、去除基线、阈值划分的处理得到阴性液滴和阳性液滴的比例p；
阴性液滴是指不存在荧光信号的混合微液滴，即该液滴中不包含核酸分子；阳性液滴是指存在荧光信号的混合微液滴，即该液滴中至少包含一个核酸分子。
(B)所有微液滴同时检测：所有混合微液滴汇聚在光学检测区并分散排布，在光源激发或者没有光源激发下(若不是荧光物质，则无需该激发光源)，通过相机或者带有拍照功能的手机对光学检测区进行拍照获得光学图像，通过感兴趣区域获取、滤波处理、阈值分割、计数的图像处理得到阴性液滴和阳性液滴的比例p；
方法最后根据阴阳性液滴的比例p，按下述公式计算出每个混合微液滴中的平均核酸分子数λ，从而获得待测样品中核酸分子的浓度或者拷贝数：
λ＝-ln(1-p)。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明首次实现了将数字化核酸扩增技术和CRISPR/Cas结合应用于核酸检测领域，既具有数字化扩增技术绝对定量、高耐受性的特点，又具有CRISPR/Cas高灵敏、高特异性的优点。
2、本发明所提出的基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增集成化检测系统，将液滴生成、核酸扩增、荧光检测集成在一个芯片上，简化了操作步骤，同时避免了核酸扩增后二次开盖加入检测试剂而造成的交叉污染。
3、本发明仅对核酸扩增区进行温度调控，并且可以在检测体系液滴生成区增加降温设备或者冷却液，克服了高温对CRISPR/Cas体系中试剂活性的影响，保证检测的准确性。
4、本发明采用的温度控制模块可拆卸，根据所采用的扩增技术选择变温控制模块或者恒温控制模块，光学检测方法亦可在混合微液滴逐个检测和所有混合微液滴同时检测两种方式中选择，提高了系统的使用普适性。
5、本发明结构简单，体积较小，有较高的便携性，适用于野外现场使用。
附图说明
图1是本发明的检测流程图。
图2是本发明的检测原理图。
图3是本发明中的集成化反应芯片俯视图。
图4是本发明中的集成化反应芯片中冷却通道俯视图。
图5是本发明中的集成化反应芯片中液滴融合区(Y型微通道)的俯视图。
图中：核酸扩增体系1，CRISPR/Cas体系2，集成化反应芯片3，扩增体系液滴生成区4，微通道5，核酸扩增区6，检测体系液滴生成区7，液滴融合区8，光学检测区9，快速连接结构10，冷却通道11，扩增微液滴12，检测微液滴13，混合微液滴14。
具体实施方式
下面结合说明书附图，对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
具体实施包含一个集成化反应芯片3、温度控制模块、光源、光学信号检测器；如图3所示，集成化反应芯片3上分布有扩增体系液滴生成区4、核酸扩增区6、检测体系液滴生成区7、液滴融合区8和光学检测区9；扩增体系液滴生成区4与核酸扩增区6之间、核酸扩增区6与液滴融合区8之间、检测体系液滴生成区7与液滴融合区8之间以及液滴融合区8与光学检测区9之间均采用微通道5连通。
光源与光学信号检测器分别位于光学检测区9的上下两侧，温度控制模块置于核酸扩增区6的上方或下方，并对核酸扩增区6实现加热。数字化核酸扩增完成后即可关闭或者移除温度控制模块。
温度控制模块适用于PCR的变温环境、亦可实现适合于LAMP、RPA、NASBA等恒温扩增技术的恒温环境。
集成化反应芯片3上设有快速连接结构10，温度控制模块通过快速连接结构10连接到集成化反应芯片(3)上的核酸扩增区6，使得温度控制模块与核酸扩增区6通过快速连接结构10进行定位及固定。具体实施中，快速连接结构10可以为基于磁铁吸附的连接结构、基于简单旋转的卡扣结构、基于按压式自锁的卡扣结构等。
检测体系液滴生成区7在扩增的过程中放置有一个降温设备，或者在周围布置冷却通道11，如图4所示，冷却通道11中加入冷却液。这样在扩增过程中对检测体系液滴生成区7进行降温。
微通道5的宽度为单个液滴的大小一致，使得只能单个液滴依次通过微通道5。
光源可为发光二极管LED、激光二极管等。
光学信号检测器可为光电倍增管Photomultiplier，PMT、光电二极管、CCDChargeCoupled Device、带有拍照功能的手机、光学显微镜等。
降温设备，可为风扇、散热片、液体降温等。
如图5所示，液滴融合区8为Y型微通道，Y型微通道的三端经各自的微通道5分别和核酸扩增区6、检测体系液滴生成区7和光学检测区9连通。
扩增体系液滴生成区4和检测体系液滴生成区7均为液滴生成区，可采用基于T型通道法、流动聚焦法或共轴流聚焦法等方法设计的微管道结构，通过调整结构和两相流速比来控制液滴的生成及其尺寸。
核酸扩增区6与温度控制模块通过快速连接结构进行定位并固定，例如基于磁铁吸附的连接结构。温度控制模块可以根据采用的扩增技术选择，若采用聚合酶链式反应(PCR)，则温度控制模块可以选择变温控制模块或多温区控制模块；若采用恒温扩增技术如LAMP，则可选择单温区控制模块。
为了避免核酸扩增区6的温度影响CRISPR/Cas体系中试剂的活性，温度控制模块仅调控集成化反应芯片上的核酸扩增区的温度，数字化核酸扩增完成后即可关闭或者移除所述温度控制模块。
扩增微液滴12完成扩增后和检测微液滴13按一定流速进入液滴融合区8，通过合适的流道设计，两种微液滴接触并融合在一起，而后进行CRISPR反应，通过检测光学信号实现目标物检测。例如所述CRISPR/Cas体系中，包含有带有荧光标记的单链寡核苷酸探针。CRISPR反应完全后，可通过gRNA对目标链进行识别与捕获，其DNA酶切活性被激活。若混合微液滴14中含有目标链，则荧光探针被切割，使得报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，在一定波长的光源激发下发出荧光信号。
对于光学信号检测，可以采用两种不同的方式实现：
(1)混合微液滴14逐个检测：此种方式下，混合微液滴14以一定的速率一个接一个地流过光学检测区，在一定波长的光源激发下(若不是荧光物质，则无需该激发光源)，可通过PMT或者光电检测器等光学检测器将光信号转化为电信号，连续记录下混合微液滴14的光学信号，通过对信号波形进行滤波处理、去除基线、阈值划分等步骤，可以得到阴阳性液滴比例。
(2)所有微液滴同时检测：此种方式下，混合微液滴14汇聚在光学检测区，在一定波长的光源激发下(若不是荧光物质，则无需该激发光源)，可通过相机或者带有拍照功能的手机对光学检测区进行拍照，获得光学图像，通过感兴趣区域获取、滤波处理、阈值分割、计数等图像处理步骤，可以得到阴阳性液滴比例。
不论方式(1)还是方式(2)，均可得到阳性液滴的比例p，根据泊松分布原理，按下述公式可计算出每个混合微液滴14中的平均核酸分子数λ，从而获得待测样品中核酸分子的浓度或者拷贝数。
λ＝-ln(1-p)
下面结合本发明的方法与集成化检测系统，对本发明的内容及实施过程作进一步阐述：
1)待测液准备：
①根据实际所采用的扩增技术配置所需核酸扩增体系1；
②置合适浓度的CRISPR/Cas体系2；
2)将配置好的核酸扩增体系1加入集成化反应芯片3的扩增体系液滴生成区4，生成进行数字化核酸扩增所需的扩增微液滴12；
3)根据所采用的扩增技术选择合适的温度控制模块，通过快速连接结构10将集成化反应芯片3上的核酸扩增区6固定在温度控制模块上方，打开温度控制模块的电源进行加热，实现核酸扩增；
4)将配置好的CRISPR/Cas体系2加入集成化反应芯片3的检测体系液滴生成区7，生成光学检测所需的检测微液滴13，为了减小扩增加热过程对CRISPR/Cas体系2中试剂活性的影响，可以在冷却通道11中添加冷却液；
5)数字化核酸扩增后，关闭温度控制模块，扩增微液滴12与检测微液滴13以一定的流速流入液滴融合区8，如图5所示，通过Y型微通道后两种液滴分别进行一一融合，而后在混合微液滴14中进行CRISPR反应；
6)CRISPR反应完全后，获取单个混合微液滴14的光学信号，有两种实现方式：
①混合微液滴14逐个检测：此种方式下，混合微液滴14以一定的速率一个接一个地流过光学检测区，在一定波长的光源激发下，可通过PMT或者光电检测器将光信号转化为电信号记录下混合微液滴14的光学信号；
②所有微液滴同时检测：此种方式下，混合微液滴14汇聚在光学检测区，在一定波长的光源激发下，可通过相机或者带有拍照功能的手机对光学检测区进行拍照，获得光学图像；
7)根据步骤6)的两个光学信号采集方式分别对应于两种不同的光学信号处理及结果分析方法：
①得到混合微液滴14中每个液滴的光学信号后，通过对信号波形进行滤波处理、去除基线、阈值划分等步骤，可以得到阴阳性液滴比例；
②得到混合微液滴14光学图像后，通过感兴趣区域获取、滤波处理、阈值分割、计数等图像处理步骤，可以得到阴阳性液滴比例；
根据方法①或方法②得到阳性液滴的比例，按泊松分布原理可计算出待测样品中核酸分子的浓度或者拷贝数，得到检测结果；
8)取下集成化反应芯片，更换新的集成化反应芯片或者结束检测。
上述具体实施方式是用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改版，都落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统，其特征在于：包含一个集成化反应芯片(3)、温度控制模块、光源、光学信号检测器；所述集成化反应芯片(3)上分布有扩增体系液滴生成区(4)、核酸扩增区(6)、检测体系液滴生成区(7)、液滴融合区(8)和光学检测区(9)；扩增体系液滴生成区(4)与核酸扩增区(6)之间、核酸扩增区(6)与液滴融合区(8)之间、检测体系液滴生成区(7)与液滴融合区(8)之间以及液滴融合区(8)与光学检测区(9)之间均采用微通道(5)连通；光源与光学信号检测器分别位于光学检测区(9)的上下两侧，温度控制模块置于所述核酸扩增区(6)下方或上方，并对核酸扩增区(6)实现加热。
2.根据权利要求1所述的一种基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统，其特征在于：所述的集成化反应芯片(3)上设有快速连接结构(10)，温度控制模块通过快速连接结构(10)连接到所述集成化反应芯片(3)上的核酸扩增区(6)。
3.根据权利要求1所述的一种基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统，其特征在于：所述检测体系液滴生成区(7)放置有一个降温设备，或者在周围布置冷却通道(11)，冷却通道(11)中加入冷却液。
4.根据权利要求1所述的一种基于液滴式数字核酸扩增和CRISPR/Cas的集成化检测系统，其特征在于：所述的微通道(5)的宽度为单个液滴的大小一致，使得只能单个液滴依次通过微通道(5)。
5.应用于权利要求1-4任一所述集成化检测系统的一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法，其特征在于：将核酸扩增体系(1)的溶液均分成数以万计的扩增微液滴(12)，再选择工作环境实现扩增微液滴(12)内的核酸扩增；同时将CRISPR/Cas体系(2)的溶液均分成数以万计的检测微液滴(13)；将检测微液滴(13)与扩增微液滴(12)分别一一进行融合，之后进行CRISPR反应，进而通过检测光学信号实现目标物的高特异性检测。
6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法，其特征在于：所述核酸扩增体系(1)的溶液进入通过扩增体系液滴生成区(4)均分成数以万计的扩增微液滴(12)，通过温度控制模块对核酸扩增区(6)加热；然后驱动扩增微液滴(12)经由微通道(5)按照固定流速进入核酸扩增区(6)，实现数字化核酸扩增；
CRISPR/Cas体系(2)的溶液在检测体系液滴生成区(7)中均分成数以万计的检测微液滴(13)，其中检测微液滴(13)包含有作为荧光探针的带有荧光基团标记的单链寡核苷酸探针；
所述扩增微液滴(12)在核酸扩增区(6)完成扩增后和所述检测微液滴(13)按固定流速进入液滴融合区(8)，利用液滴间的碰撞和聚合分别进行一个扩增微液滴(12)和一个检测微液滴(13)的一一融合形成混合微液滴(14)，之后混合微液滴(14)进行CRISPR反应；
CRISPR反应完全后，混合微液滴(14)进入光学检测区(9)，通过gRNA对混合微液滴(14)中的目标链进行识别与捕获，DNA酶切活性被激活；若混合微液滴(14)中含有目标链，则荧光探针被切割，使得荧光基团和淬灭基团分离，在光源激发下发出荧光信号，通过光学信号检测器分析单个混合微液滴(14)的荧光信号获得阴性液滴和阳性液滴的比例，再计算核酸扩增体系中核酸分子的浓度或者拷贝数，从而获得检测结果。
7.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法，其特征在于：所述的液滴融合区(8)为Y型或T型微通道，Y型或T型微通道的三端经各自的微通道(5)分别和核酸扩增区(6)、检测体系液滴生成区(7)和光学检测区(9)连通。
8.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas的数字化核酸扩增检测方法，其特征在于：方法对于阴性液滴和阳性液滴比例的获得，采用以下两种方式之一：
(A)混合微液滴(14)逐个检测：
驱动混合微液滴(14)依次流过光学检测区(9)，在光源激发或者没有光源激发下，通过光学信号检测器检测光信号转化为电信号，通过对电信号的波形进行滤波处理、去除基线、阈值划分的处理得到阴性液滴和阳性液滴的比例p；
(B)所有微液滴同时检测：所有混合微液滴(14)汇聚在光学检测区(9)并分散排布，在光源激发或者没有光源激发下，通过相机或者带有拍照功能的手机对光学检测区(9)进行拍照获得光学图像，通过感兴趣区域获取、滤波处理、阈值分割、计数的图像处理得到阴性液滴和阳性液滴的比例p；
方法最后根据阴阳性液滴的比例p，按下述公式计算出每个混合微液滴(14)中的平均核酸分子数λ，从而获得待测样品中核酸分子的浓度或者拷贝数：
λ＝-ln(1-p)。
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