CN110157778A

CN110157778A - 一种用于核酸扩增产物防污染检测的crispr试剂体系的储存方法及检测管

Info

Publication number: CN110157778A
Application number: CN201910460153.7A
Authority: CN
Inventors: 吴坚; 钱程
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2019-08-23

Abstract

本发明提供了一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，利用糖分子作为稳定剂与CRISPR试剂体系混合，通过玻璃化处理使之呈薄膜状，并粘附在反应管盖内壁上，实现长期保存。本发明还提供了一种可以长期稳定储存的CRISPR试剂的核酸扩增反应的检测管，采用核酸扩增反应的反应管并设置有管盖，所述管盖内部贴附有CRISPR试剂玻璃化并干燥后形成的膜。本发明在避免核酸扩增后二次开盖的同时，使CRISPR试剂在保证其效力的情况下稳定的与核酸扩增体系共存于同一反应管内。通过这种方式，可以实现试剂在室温下长时间的稳定储存，摆脱了现配现用带来的繁琐操作。

Description

一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法及检测管

技术领域

本发明属于试剂玻璃化储存领域，其具体涉及到一种利用糖分子对易变性失活的CRISPR反应试剂体系进行玻璃化处理，以使其稳定的与核酸扩增体系共同储存于同一反应管内实现高特异性的靶标核酸检测，从而避免因开盖引起的核酸扩增子污染问题，且可以实现长期稳定的储存。

背景技术

试剂玻璃化是诸多生物材料，如血液、细胞、蛋白质等长期储存的常用方法。然而，这些生物材料在这一处理过程中由于其本身性质的不稳定并不能获得理想的效果，导致失去原有的分子结构或者生物化学活性。这个问题可以通过在体系中添加糖类、盐类、表面活性剂等原料来提高整体的稳定性。就蛋白质而言，这些添加剂主要是对于其结构中氢键起到稳定作用，因为这会防止在玻璃化过程中蛋白质的构象变化。

一般而言，为了实现生化试剂的长期储存会对其采用玻璃化冷冻干燥的方法进行脱水处理，它是通过在生化试剂中添加结构稳定剂并且进行脱水化处理，以完整的保存这些生化活性原料的分子结构和活性。

CRISPR/Cas体系是目前最为流行的基因编辑工具，在CRISPR试剂体系中起到关键性作用的是第二类Cas蛋白Cas12a(cpf1)，该蛋白的最佳工作温度为 37℃，在略高的环境下就会显著降低活性并最终失活。此外，在体系中还常添加有极短的带有荧光标记的单链寡核苷酸探针和gRNA，这些都是具有生物活性、对光热敏感且性质不稳定易降解的材料。目前，对于CRISPR试剂体系的利用，一般是采取现配现用的原则，在较低环境温度下进行各原料的添加配比，并立即投入使用，以防止蛋白的失活或是其他原料的变性。这种方式对于需要大批量应急使用的场合是十分不便利的，如果可以对CRISPR试剂体系进行很稳定的长期储存，这对于它的利用情况及便利性会有很大的提升和改进。

CRISPR/Cas12a体系由于其具有高特异性的双链识别效应且可激活其单链切割功能，在核酸扩增检测体系中的应用也越来越多。利用特殊设计的gRNA 对目标链的识别与捕获进而成功激活其单链DNA的切割功能，对体系中的单链荧光探针进行高效切割，就可以实现对目标DNA链的特异性检测。

在将CRISPR试剂与核酸扩增反应一起使用时，由于核酸扩增的工作温度远高于CRISPR试剂中Cas12a的耐受温度，为了防止Cas12a蛋白的活性丧失，一般采用先扩增然后再开盖加入CRISPR体系的方法来克服，但由于二次的开盖操作会不可避免的造成大量核酸扩增子的溢出，造成核酸扩增子污染，这对于后续的检测操作会带来假阳性的影响，十分影响结果的判定。

为解决这些技术问题，现有手段是通过在体系中加入一些纳米颗粒，依靠纳米颗粒的高导热性，在复性过程中避免分子结构的损坏以延长储存时间。但是这些加入的纳米颗粒本身就会对Cas蛋白造成抑制作用或是其他阻碍，因此这不是一种可以广泛采取的方法。

因此，本领域亟待需要一种完善的储存方法，以实现对CRISPR试剂各种敏感组分长期稳定的有效储存，提高整体的使用效率与便携性。使CRISPR真正无障碍的和核酸扩增体系结合，从而发挥其最大价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法。利用这种方法实现CRISPR试剂的长时间稳定储存，结合核酸扩增技术实现对目标DNA的高特异性快速检测，且可避免期间的扩增子污染问题。为此，本发明采用以下技术方案：

一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，其特征在于，利用糖分子作为稳定剂与CRISPR试剂体系混合，通过玻璃化处理使之呈薄膜状，并粘附在反应管盖内壁上，实现长期保存。在这种状态下，CRISPR试剂不会因为反应管底部的局部高温而失活或是变性。在核酸扩增反应完成后，通过简单的震荡离心操作，使顶部玻璃化的CRISPR试剂复溶，与底部的核酸扩增体系充分混合，之后就可以进行CRISPR反应，从而对扩增产物进行高特异性的快速检测。

具体地，CRISPR试剂与核酸扩增体系于起始时刻就加入反应管中。先将 CRISPR试剂添加在管盖内侧(如附图1)，CRISPR试剂中预先加入一定配比的海藻糖和普鲁兰多糖混合物。在一定条件下进行脱水干燥使其玻璃化，之后将核酸扩增体系加入到反应管底部。这样，一个可以长期稳定储存的CRISPR体系结合核酸扩增反应的检测管就完成了。

由此，本发明的第二个方面是提供一种可以长期稳定储存CRISPR试剂的核酸扩增反应的检测管。为此本发明的技术方案是：

一种可以长期稳定储存的CRISPR试剂的核酸扩增反应的检测管，其特征在于所述检测管采用核酸扩增反应的反应管并设置有管盖，所述管盖内部贴附有 CRISPR试剂玻璃化并干燥后形成的膜。

在实际使用时，向管中加入待检的核酸，盖上反应管，即可开始进行上述检测操作。在这种处理方式下，可以避免二次开盖引起的扩增子污染问题，同时也可以最大限度的保持CRISPR试剂的活性。并且，在这样的方式下，CRISPR试剂可以实现长时间的稳定储存。由于其牢固的粘附在管盖内壁上，可以进行远距离的运输，这相比于现配现用的CRISPR工作条件实现了巨大的提升以及提高了便利性和实用性。这种检测管可以事先大规模的生产以应对临时的大量需求，并且可以长期稳定储存不会造成浪费。

对于上述的核酸扩增体系，可以是聚合酶链式反应(PCR)或是其他等温扩增方法，如:环介导的等温扩增(LAMP)等。

对于上述的核酸扩增体系，一般配制体积为25μL。

对于上述的CRISPR体系，一般配制体积为4.5μL。

对于所述的稳定剂，糖分子可以是单一糖分子或多种糖分子的混合物。糖分子可以是海藻糖(Trehalose)、普鲁兰多糖(Pullulan)或者两者的混合物。

对于上述的海藻糖，其配制质量分数可以在0.1％-5％。

对于上述的普鲁兰多糖，其配制质量分数可以在1％-20％。

对于上述的海藻糖和普鲁兰多糖，在单独使用时，可以根据CRISPR体积进行择量添加混合，以上述4.5μL的标准CRISPR试剂体积为例，其配比体积可以为海藻糖1-20μL、普鲁兰多糖1-20μL。

在混合使用时，混合物与CRISPR试剂的添加体积比可以在4:9-80:9之间。

优选地，包括但不限于使用两者的混合物或者仅添加其中任一直接用于试剂的玻璃化。

对于上述的海藻糖和普鲁兰多糖，无特殊的分子结构限定，包括D-或者L- 型均可。

其具体地，在此方法下玻璃化后的干燥试剂会逐渐形成薄膜状并且牢牢的黏附在反应管中，在进行剧烈震荡的情况下也不会发生剥落，可以适用于远距离的运输和恶劣条件下的储存。

其具体地，这种玻璃化后的CRISPR体系牢牢粘附在管盖内壁上，在轻微震荡离心操作下可以于底部的核酸扩增反应液混合，充分溶解后即可实现复性，且可以保留原有的分子结构和生物化学活性。

对于CRISPR试剂玻璃化后的干燥手段可采用：在尽量避光的环境下进行真空干燥约12h(环境温度不超过37摄氏度)或者冷冻干燥。若无上述设备也可以在自然通风条件下进行风干，但要注意避光，以防止CRISPR试剂中的荧光探针受强光照射而分解。实际操作中的干燥时间根据添加体系可进行动态调整以最后完全形成干燥薄膜状物质所需时间为基本干燥时间。

对于CRISPR试剂玻璃化并干燥形成的膜的复溶，利用反应管底部的核酸扩增试剂作为水环境，通过颠倒混合、振荡和离心操作，使管盖内上壁的膜状物质充分溶解。复溶完全的标志是盖子上不再可见薄膜状物质，溶液颜色由无色透明变为粉红色。复溶完全后即可用于后续反应。

其具体地，这种附着有玻璃化CRISPR试剂的核酸检测管在稳定性评估中体现出良好的性能，在37℃环境下储存，每隔24h进行复性后的效能评估，在7 天(相当于4℃存储1年)的测试中未见明显的效能下降。

其具体地，这种将CRISPR体系进行玻璃化保存的方法可以大大提高它的利用效率和便携性，并可以实现长期的储存于长距离的运输；此外，这种玻璃化的储存方法组分简单，成本低廉，操作简单适合普遍的实验室进行使用；此外，这种玻璃化的保存方法也适用于其他多种CRISPR试剂反应体系。

本发明克服了现有技术的不足，在避免核酸扩增后二次开盖的同时，使 CRISPR试剂在保证其效力的情况下稳定的与核酸扩增体系共存于同一反应管内。通过这种方式，可以实现试剂在室温下长时间的稳定储存，摆脱了现配现用带来的繁琐操作。

附图说明

图1为本发明的原理示意图，CRISPR试剂与糖分子保护剂混合后的物质“1”先添加在反应管盖内壁(见1a部分)，呈现液滴状。在一定条件下干燥玻璃化后形成薄膜状物质粘附在内壁上(见1b部分)。核酸扩增体系“2”添加在反应管底部。该反应管可以在室温状态下长期稳定保存并直接用于靶标核酸的检测。

图2为本发明的效果测试图，使用本发明的策略在玻璃化后储存1月后与现配现用的策略对于同一检测对象的荧光积累曲线如图2所示，曲线1为现配现用的策略，曲线2为本发明的策略。可以看出在本发明的操作策略下，可以保证与现配现用策略具有相当的检测灵敏度和峰值荧光，说明本发明的策略可以胜任及代替繁琐的现配现用手段。

具体实施方案

本发明所涉及到的对CRISPR试剂进行玻璃化以实现长期稳定保存的方法主要包含利用两种糖分子的混合物或其中任一，海藻糖和普鲁兰多糖。将两者在一定的配比下与CRISPR试剂进行混合，然后进行脱水干燥使其玻璃化并黏附在反应管中从而实现长期稳定的储存。利用这种玻璃化的储存方式结合核酸扩增体系实现对目标DNA的高特异性和无污染检测。

下面结合具体实施例，对本发明的内容及实施过程作进一步阐述。

实施例1:利用海藻糖和普鲁兰多糖与CRSIPR试剂混合后玻璃化以实现在同一反应管内长时间的室温下稳定储存。用该长时间储存后的反应管结合LAMP 核酸扩增体系对南美白对虾体内IHHNV病毒进行检测以测试其保存效果。

LAMP核酸扩增体系：总体积为25μL，各组分的浓度如下：Bst DNA聚合酶16U，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄ 2.0mM， 0.1％Triton@x-100，dNTP 1.4mM，Betaine 5.0M，FIP/BIP各0.8μM，F3/B3 各0.1μM，BF/LF各0.2μM。

基于Cas12a蛋白的CRISPR体系：总体积为20μL，各组分的浓度如下: Tris-HCl10mM、NaCl 50mM、MgCl₂ 10mM、100μg/mL BSA、Cas12a 0.75μM、 gRNA(针对IHHNV特异性区域设计)1.5μM、单链荧光探针2.5μM、RNA inhibitor 10U。

LAMP体系各引物及gRNA序列：

F3:

TACTGCATAC ACGTCAGG

B3:

GGAGGAGTTT GAGAGTTGTC

BIP：

GAGAAGGCTT GGAGAAATTC CCGAATTGCT TCGAGAACGC

FIP：

TCAAGACCCT AAACCCACTA CCCCTCGTCT GAAAACTGGA

LF：

AACGAAACTC ACTCCAGC

LB：

CTTCAGACAT ATTAAGAAGT TG

gRNA：

UAAUUUCUAC UAAGUGUAGA UGACCUGGGG UGAGAAGGCU UG

海藻糖和普鲁兰多糖保护剂:海藻糖(1％，w/w)2μL、普鲁兰多糖(10％， w/w)20μL混合后添加到上述CRISPR体系中。

将上述CRISPR体系与保护剂混合后，添加到反应管内壁上，在真空干燥箱中进行脱水干燥，待完全脱水成膜状后即可取出，该膜状混合物可牢牢粘附于管盖内侧实现室温下长期保存。将上述LAMP核酸检测体系添加在反应管底，加入检测对象后先进行LAMP核酸扩增。扩增完成后，利用简单的振荡离心操作，使管盖内壁上膜状的CRISPR体系复溶，充分溶解后继续进行CRISPR检测，整个过程不再二次开盖。

此外，我们同时考察了在本发明策略下，室温储存1个月后与传统的现配方法对同一目标实际检测效果对比。检测过程除了玻璃化过程外完全相同。从结果来看，从图2荧光曲线可以出，2号曲线(本发明)与1号曲线(现配现用)从荧光积累速率与荧光峰值高低上没有太大区别，说明本方法可以胜任及代替繁琐的现配现用操作方法。

实施例2:利用单一海藻糖与CRISPR试剂混合后玻璃化以实现长时间稳定储存。

基于Cas12a蛋白的CRISPR体系:总体积为20μL，各组分的浓度如下: Tris-HCl10mM、NaCl 50mM、MgCl₂ 10mM、100μg/mL BSA、Cas12a 0.75μM、 gRNA 1.5μM、单链荧光探针2.5μM、RNA inhibitor 10U。

海藻糖保护剂:海藻糖(1％，w/w)2μL，添加到上述CRISPR体系中。

将上述两者体系混合后，添加到反应管内壁上，在真空干燥箱中进行脱水干燥，待完全脱水成膜状后即可取出，该膜状混合物可牢牢粘附于管盖内侧实现室温下长期保存。

实施例3:利用单一普鲁兰多糖与CRISPR试剂混合后玻璃化以实现长时间稳定储存。

普鲁兰多糖保护剂:普鲁兰多糖(10％，w/w)20μL，添加到上述CRISPR 体系中。

实施例4:在上述实施例1中，海藻糖和普鲁兰多糖保护剂的配比:海藻糖 (1％，w/w)1μL、普鲁兰多糖(10％，w/w)20μL混合后添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例1进行。

实施例5:在上述实施例1中，海藻糖和普鲁兰多糖保护剂的配比:海藻糖 (1％，w/w)1μL、普鲁兰多糖(10％，w/w)1μL混合后添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例1进行。

实施例6:在上述实施例1中，海藻糖和普鲁兰多糖保护剂的配比:海藻糖 (1％，w/w)10μL、普鲁兰多糖(10％，w/w)1μL混合后添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例1进行。

实施例7:在上述实施例1中，海藻糖和普鲁兰多糖)保护剂的配比:海藻糖(1％，w/w)20μL、普鲁兰多糖(10％，w/w)1μL混合后添加到CRISPR 体系中。其余操作参照实施例1进行。

实施例8:在上述实施例1中，海藻糖和普鲁兰多糖保护剂的配比:海藻糖 (1％，w/w)20μL、普鲁兰多糖(10％，w/w)20μL混合后添加到CRISPR 体系中。其余操作参照实施例1进行。

实施例9:在上述实施例2中，海藻糖保护剂的配比:海藻糖(1％，w/w)1 μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例10:在上述实施例2中，海藻糖保护剂的配比:海藻糖(1％，w/w) 10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例11:在上述实施例2中，海藻糖保护剂的配比:海藻糖(1％，w/w) 20μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例12:在上述实施例2中，海藻糖保护剂的配比:海藻糖配比为(0.1％， w/w)10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例13:在上述实施例2中，海藻糖保护剂的配比:海藻糖配比为(5％， w/w)10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例14:在上述实施例3中，普鲁兰多糖保护剂的配比:普鲁兰多糖(10％， w/w)1μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例2进行。

实施例15:在上述实施例3中，普鲁兰多糖保护剂的配比:普鲁兰多糖(10％， w/w)10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例3进行。

实施例16:在上述实施例3中，普鲁兰多糖保护剂的配比:普鲁兰多糖(10％， w/w)20μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例3进行。

实施例17:在上述实施例3中，普鲁兰多糖保护剂的配比:普鲁兰多糖配比为(1％，w/w)10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例3进行。

实施例18:在上述实施例3中，普鲁兰多糖保护剂的配比:普鲁兰多糖配比为(20％，w/w)10μL添加到CRISPR体系中。其余操作参照实施例3进行。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 1

tactgcatac acgtcagg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 3

ggaggagttt gagagttgtc 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 3

gagaaggctt ggagaaattc ccgaattgct tcgagaacgc 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 4

tcaagaccct aaacccacta cccctcgtct gaaaactgga 40

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 5

aacgaaactc actccagc 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 6

cttcagacat attaagaagt tg 22

<210> 7

<211> 42

<212> RNA

<213> 对虾病毒(IHHNV)

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga ugaccugggg ugagaaggcu ug 42

Claims

1.一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，其特征在于，利用糖分子作为稳定剂与CRISPR试剂体系混合，通过玻璃化处理使之呈薄膜状，并粘附在反应管盖内壁上，实现长期保存。

2.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，其特征在于对于所述的稳定剂，糖分子可以是单一糖分子或多种糖分子的混合物。

3.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，其特征在于对于所述的稳定剂，糖分子可以是海藻糖(Trehalose)、普鲁兰多糖(Pullulan)或者两者的混合物；

对于上述的海藻糖，其配制质量分数在0.1％-5％。对于上述的普鲁兰多糖，其配制质量分数在1％-20％；

在体积为4.5μL的标准CRISPR试剂体系中，当两种糖分子单独使用作为稳定剂时，其添加体积为海藻糖1-20μL、普鲁兰多糖1-20μL；当两者混合使用作为稳定剂时，混合物与CRISPR试剂体系的添加体积比可以在4:9-80:9之间。

4.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增产物防污染检测的CRISPR试剂体系的储存方法，其特征在于，在进行核酸扩增反应时，在反应管中加入核酸扩增体系并盖上所述含有玻璃化的CRISPR试剂体系的反应管盖，在核酸扩增反应结束后，不经二次开盖，通过颠倒、离心、振荡等操作使管盖上玻璃化的CRISPR试剂体系复溶于核酸扩增体系中，即可继续进行检测，防止二次开盖带来的扩增子污染问题。

5.一种可以长期稳定储存CRISPR试剂体系的核酸扩增反应的检测管，其特征在于所述检测管采用核酸扩增反应的反应管并设置有管盖，所述管盖内部贴附有CRISPR试剂体系玻璃化并干燥后形成的膜。