ES2214144B1 - Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion. - Google Patents
Composicion estabilizada para ensayos fluorimetricos, colorimetricos o quimio-luminiscentes, kits que la contienen y procedimiento para su obtencion.Info
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Abstract
La composición estabilizada comprende: un componente (A) seleccionado entre (i) un compuesto que comprende un fluoróforo, (ii) un compuesto que comprende un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión específica, (iii) una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente, (iv) un conjugado que comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo miembro de dicho par de unión especifica, (v) uno o más compuestos unidos a un soporte sólido, y sus mezclas; y un componente (B) constituido por una mezcla estabilizante. De aplicación en ensayos fluorimétricos, colorimétricos o quimio-luminiscentes.
Description
Composición estabilizada para ensayos
fluorimétricos, colorimétricos o
quimio-luminiscentes, kits que la contienen y
procedimiento para su obtención.
La invención se relaciona con una composición
estabilizada, útil para la realización de ensayos fluorimétricos,
colorimétricos o quimio-luminiscentes, que comprende
los compuestos y materiales que potencialmente pueden ser
utilizados en dichos ensayos, tales como moléculas fijadas o no a
soportes sólidos, actividades enzimáticas, anticuerpos, proteínas
y marcadores fluorescentes, colorimétricos o
quimio-luminiscentes. La invención también se
refiere a un procedimiento para la obtención de dicha composición
estabilizada mediante el empleo de una mezcla estabilizante, así
como a kits que contienen dicha composición.
La utilización de sistemas de detección de
marcadores moleculares basados en fluorescencia o en reacciones de
colorimetría o quimio-luminiscencia se ha
convertido en los últimos años en una alternativa a la utilización
de isótopos radiactivos.
Las técnicas de colorimetría y
quimio-luminiscencia son sistemas de detección
indirectos basados en la modificación química de moléculas con alta
capacidad de unión a moléculas diana específicas, mediante
incorporación (conjugación) de actividades enzimáticas que, en
presencia del sustrato adecuado, catalizan una reacción que genera
un compuesto coloreado (reacciones colorimétricas) o luz
(quimio-luminiscencia). Dichas moléculas
modificadas se utilizan como sondas para la identificación de las
moléculas diana problema en mezclas complejas. Finalmente, y para
determinar la cantidad de conjugado unido, y de forma indirecta la
cantidad de moléculas diana presentes en la mezcla, se separan los
complejos molécula dianana/conjugado y se añade el sustrato de la
actividad química incorporada en el conjugado. La cantidad de
producto generado puede ser determinada en el caso de las
reacciones colorimétricas mediante la medida de los niveles de
absorbancia a determinadas longitudes de onda del espectro visible.
En el caso de las reacciones quimio-luminiscentes,
la eficiencia de la reacción se determina mediante la medida de
emisión de luz en luminómetros o mediante la impresión de placas
fotosensibles.
Existe una amplia variedad de actividades
enzimáticas susceptibles de catalizar reacciones colorimétricas y
que se han adaptado para este tipo de ensayos. Entre ellas caben
destacar, como de uso habitual, la actividad peroxidasa que utiliza
como sustrato diversas moléculas tales como
4-cloro-1-naftol,
3-amino-4-etilcarbazol,
diaminobenzidina, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina
(TMB), O-fenilendiamina (OPD),
2,2'-azino-di (ácido
3-etilbenzotiozolina-6-sulfónico)
(ABTS), 3-(p-hidroxifenilo) (HPPA), entre otras.
También, habitualmente utilizada en ensayos de colorimetría, se
encuentra la actividad fosfatasa alcalina que utiliza como
sustratos, entre otros, 3-(4-metoxiespiro[1,
2-dioxetano-3'2'-triciclo-[3.3.1^{3,7}]decan)-4-il)-fenilfosfato
(AMPPD) y p-nitrofenil-fosfato
(pNPP).
Asimismo, existen numerosos marcadores
luminiscentes, entre los que se encuentran los ésteres de
acridina, el luminol, la luciferina, etc. También se conocen
diversas actividades enzimáticas susceptibles de generar reacciones
quimio-luminiscentes, por ejemplo, las actividades
enzimáticas:
(\beta-D-galactosidasa, que
utiliza adamantil-1,2-dioxetano
aril galactósido (AMPGD) como sustrato; xantina oxidasa sobre
luminol + EDTA oro; glucosa oxidasa sobre luminol o isoluminol +
microperoxidasa; luciferasa en presencia de luciferina + ATP;
proteína verde fluorescente (GFP) en células en cultivo; etc.
Asimismo, la actividad peroxidasa aislada de rábano picante (HRP)
en presencia de luminol + perborato + 4-iodofenol
o ácido 4-hidroxicinámico; y la actividad fosfatasa
alcalina en presencia de AMPPD,
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (BCIP), bien en su forma de sal disódica o de sal de
toluidina, o en presencia de sal
nitroblue-tetrazolium (NPT), generan señales
quimio-luminiscentes.
La conjugación de la actividad enzimática puede
realizarse directamente sobre una molécula, por ejemplo, sobre un
antígeno, o sobre un anticuerpo, que reconozca directamente el
anticuerpo o antígeno problema, respectivamente. Sin embargo, es
habitual el empleo de moléculas intermediarias para conseguir la
unión entre la molécula problema y el conjugado. Entre las
moléculas intermediarias más utilizadas se encuentran las que
forman los sistemas avidina/biotina, estretavidina/biotina,
avidina/ficoeritrina,
digoxigenina/anti-digoxigenina, etc. Labiotina
(vitamina H, coenzima R) es una pequeña molécula que puede unirse
a una gran variedad de proteínas y ácidos nucleicos sin alterar
sus propiedades. Presenta, asimismo, capacidad de unión altamente
específica con avidina, una glicoproteína básica tetramérica
presente en gran abundancia en la clara de huevo, y con
estreptoavidina, su equivalente sintetizado por bacterias del género
Streptomyces. La unión del complejo avidina/biotina y
avidina/ficoeritrina es altamente estable, con una constante de
disociación de 1,0 x 10^{-15} M y una energía de disociación de 21
Kcal/mol. Debido a que la avidina y la estreptoavidina pueden
acomplejarse de forma sencilla con diversas actividades
enzimáticas implicadas en reacciones colorimétricas o
quimio-luminiscentes, el sistema biotina/avidina o
biotina/estreptoavidina es un sistema de elección como
intermediario en las reacciones de detección e identificación de
ácidos nucleicos, proteínas (incluyendo anticuerpos), antígenos,
etc. La digoxigenina es un cardenólido de bajo peso molecular que
puede ser incorporado químicamente como ligando a moléculas de ADN
y ARN sin alterar su capacidad de hibridación a secuencias de
ácidos nucleicos complementarias. En paralelo, se han desarrollado
anticuerpos anti-digoxigenina que reconocen de
forma específica este ligando y a los que se puede acomplejar gran
variedad de las actividades enzimáticas anteriormente
descritas.
Los sistemas biotina/avidina,
biotina/estreptoavidina y digoxigenina/antidigoxigenina han sido
ampliamente utilizados en el desarrollo de técnicas de detección e
identificación de secuencias específicas de ácidos nucleicos
mediante colorimetría en gran variedad de soportes incluyendo
membranas y pocillos de placas ELISA (PCR-ELISA) o
quimio-luminiscencia. Esto es debido a que la
incorporación química de moléculas de biotina o digoxigenina es
realizada de forma sencilla durante la síntesis química de
oligonucleótidos, pudiendo situar el marcaje en las posiciones
deseadas dentro de la secuencia, sin que resulte por ello alterada
la capacidad de unión del oligonucleótido marcado a secuencias
complementarias de ácidos nucleicos. Por otro lado, y dado que los
nucleótidos marcados con biotina o digoxigenina siguen reteniendo la
capacidad de ser utilizados en reacciones de elongación de
moléculas de ácidos nucleicos catalizadas por actividades ADN
polimerasas, dichos sistemas son utilizados para la síntesis de
sondas de ADN o ARN utilizables para posteriores experimentos de
hibridación.
Un caso especialmente importante dentro del campo
de detección de biomoléculas, y especialmente de secuencias
específicas de ácidos nucleicos, es el uso de marcadores
fluorescentes. Las sustancias fluorescentes presentan la capacidad
de excitarse al recibir radiación de una determinada longitud de
onda, volviendo al estado de equilibrio tras emitir radiación a
una longitud de onda diferente a la de excitación. La fluorescencia
se utiliza habitualmente en laboratorios de investigación para una
gran variedad de pruebas experimentales, tales como la detección de
moléculas de ácidos nucleicos de doble banda en geles de agarosa o
poliacrilamida mediante identificación de moléculas fluorescentes
intercalantes, tales como el bromuro de etidio, etc. En sistemas más
específicos, se incluye un marcaje fluorescente mediante
modificación química de moléculas de proteína o ácido nucleico.
Posteriormente, dichas moléculas modificadas son utilizadas como
sondas para la identificación de moléculas diana reconocidas por la
sonda. Dicha unión puede ser directa o, como en el caso de las
reacciones de colorimetría y quimio-luminiscencia,
puede hacer uso de moléculas intermediarias.
La inclusión de fluoróforos en proteínas y
polinucleótidos está muy estandarizada. El caso de los
oligonucleótidos marcados con fluoróforos es particularmente
interesante ya que es posible incluir una gran variedad de
marcadores fluorescentes durante el proceso de síntesis.
Los sistemas basados en el empleo de marcadores
fluorescentes son particularmente útiles en la identificación
simultánea de varias moléculas problema en una única mezcla de
reacción. Así, a diferencia de los sistemas colorimétricos, los
espectros de emisión de los compuestos fluorescentes son muy
definidos, cubriendo un intervalo pequeño de longitudes de onda en
tomo a la longitud de onda de máxima emisión. Esto hace que se hayan
podido diseñar toda una batería de compuestos fluorescentes que,
emitiendo en diferentes longitudes de onda, no interfieren
prácticamente entre sí. Por este motivo, es posible incluir en un
único tubo varios marcadores fluorescentes diferentes y conseguir
una identificación separada y sin solapamientos de las moléculas
problema.
La capacidad de discriminar simultáneamente
diversos marcadores fluorescentes en una misma muestra, ha
permitido el desarrollo de sistemas de secuenciación génica
mediante reacciones de amplificación o elongación de secuencias de
ADN a partir de oligonucleótidos específicos, en presencia de los
cuatro nucleótidos terminadores marcados cada uno de ellos con un
fluoróforo diferente. Finalmente, se realiza la discriminación de
cada fluoróforo en un único carril de electroforesis capilar
(sistemas de secuenciación capilar).
Posiblemente el campo de mayor desarrollo en los
últimos años es el de las reacciones de amplificación génica en
tiempo real, que han permitido añadir una dimensión cuantitativa a
la reacción de amplificación génica, la técnica más sensible para
la detección de ácidos nucleicos. Dicha técnica consiste en un
acoplamiento simultáneo de la reacción de amplificación génica y
de detección del material amplificado mediante señales de
fluorescencia en cada ciclo del proceso de amplificación. Para ello,
se han diseñado y comercializado una cantidad creciente de equipos
que realizan ambas funciones simultáneamente. La medida de la
fluorescencia incorporada en cada ciclo de amplificación permite
identificar los amplicones en la fase exponencial de amplificación,
donde todavía no tienen lugar fenómenos de saturación de la
reacción. Por este motivo el reflejo de la cantidad inicial de ADN
sustrato es mucho más exacta que en los métodos tradicionales en
los que se analiza el producto amplificado en fases más tardías de
la reacción.
El marcaje fluorescente que puede ser utilizado
en estas técnicas es muy variado y comprende tanto el empleo de
sustancias fluorescentes intercalantes en moléculas de ADN de
doble banda (dsADN), por ejemplo, bromuro de etidio, SYBR Green,
etc., como el empleo de cebadores y sondas que comprenden un
fluoróforo y, opcionalmente, una molécula moduladora de
fluorescencia (quencher), por ejemplo, sondas Taqman, Molecular
Beacon, Scorpion, FRET, etc.
Otra aplicación que ha tenido una trascendencia
especial en los últimos años, es el desarrollo de sistemas de
chips y arrays, consistentes en la fijación en sustratos sólidos de
diversa naturaleza (vidrios modificados, superficies de oro,
superficies plásticas modificadas, etc.), sobre las que se fijan
moléculas de ácidos nucleicos o proteínas, que son posteriormente
utilizados para la detección específica de biomoléculas en mezclas
complejas. La utilización de este tipo de soportes permite dos
formas de uso diferenciadas. Así, se puede fijar una única
molécula (por ejemplo ácidos nucleicos o proteínas) sobre el chip
soporte y utilizar este para el análisis de una batería amplia de
muestras problema. Este el principio de algunos sistemas de chips
comerciales, como los chips Biocore® (Izasa, España). En otros
sistemas, por el contrario, se invierte el proceso, presentándose
soportes sólidos en los que se fija previamente una batería de
moléculas (ácidos nucleicos o proteínas) que permiten identificar
en una sola prueba una variedad de moléculas de interés en
muestras biológicas complejas. Dependiendo del número de moléculas
diferentes fijadas en el soporte del chip se pueden encontrar
chips o arrays de baja, media y alta densidad. En este sentido, el
desarrollo de sistemas de aplicación robotizada que permiten
manipular volúmenes del orden de picolitros con alta precisión, ha
permitido el desarrollo de microarrays de ácidos nucleicos y
proteínas en los que se incluyen miles de moléculas diferentes. La
utilización de sistemas tan complejos de detección precisa asimismo
del desarrollo de sistemas sofisticados de análisis de resultados.
En relación con esto, se utilizan habitualmente los sistemas de
detección fluorescente (microarrays), así como los análisis de
conductividad eléctrica o modificaciones de ángulos de refracción de
luz (Biocore®), entre otros.
De lo anteriormente expuesto se comprueba que los
sistemas de marcaje de biomoléculas, como proteínas y ácidos
nucleicos, con marcadores fluorescentes, o moléculas implicadas en
el desarrollo de técnicas de análisis colorimétrico o
quimio-luminiscente, son hoy en día técnicas
habituales y esenciales en los laboratorios en los que se realizan
pruebas de diagnósticos e investigaciones biológicas. Sin embargo,
hasta el día de hoy, muchas de las técnicas implicadas continúan
requiriendo niveles altos de manipulación por parte del
investigador. Debido a la alta sensibilidad de algunos de estos
sistemas, tales como las cuantificaciones de ADN o ARN en sistemas
de amplificación en tiempo real, el factor manipulación puede
afectar la reproducibilidad de los resultados.
Por este motivo, sería importante disponer de
sistemas de reacción preformados y estabilizados que minimizaran la
manipulación de reactivos y limitaran el papel del manipulador a
la inclusión de la muestra problema. Este tipo de sistemas
conseguiría no solo incrementar la reproducibilidad de los
resultados obtenidos en experimentos independientes, y que son
cruciales a la hora de interpretar los mismos, sino que agilizaría,
por otro lado, la ejecución de una variada gama de técnicas
experimentales, de uso rutinario en el laboratorio, permitiendo
así una mayor rapidez en la obtención de resultados.
Otro problema de gran trascendencia es la
estabilización de los chips o microarrays de biomoléculas, que son
utilizados como soporte de detección en muestras biológicas
complejas. Dichos sistemas, especialmente aquellos que presentan
fijados un gran número de moléculas diferentes, cualquiera que sea
su naturales (ácidos nucleicos, proteínas u otros), exigen una
correcta estabilización de todas las moléculas incluidas en los
mismos para garantizar la correcta interpretación de los resultados
de un experimento, así como para garantizar la reproducibilidad
del sistema.
Se han desarrollado sistemas de preparación y
estabilización de actividades enzimáticas. La solicitud de patente
WO 93/00807 describe un sistema para la estabilización de
biomateriales durante el proceso de liofilización. Por otra parte,
Biotools Biotechnological & Medical Laboratorios, S.A. ha
desarrollado recientemente un sistema de gelificación de mezclas
complejas de biomoléculas que permite la estabilización de mezclas
de reacción durante largos periodos de tiempo en las más variadas
condiciones de almacenamiento (WO 02/072002). Mediante la
utilización de este sistema se han conseguido estabilizar mezclas
de reacción complejas, tales como mezclas para reacciones de
amplificación génica, que contienen todos los reactivos necesarios
para la realización del experimento alicuotados en viales
independientes "listos para usar"
(ready-to-use), en los que
únicamente es necesario reconstituir la mezcla de reacción y añadir
el ácido nucleico problema. Sin embargo, en dicha solicitud de
patente WO 02/072002 no se menciona expresamente la adición de
moléculas marcadas con un fluoróforo, o que incluyan actividades
enzimáticas susceptibles de catalizar reacciones colorimétricas o
quimio-luminiscentes, o bien moléculas
intermediarias (ligandos) en los sistemas de detección
colorimétrica o quimio-luminiscente. La inclusión de
dichas moléculas en un sistema de reacción complejo presenta
problemas adicionales, tales como el mantenimiento de las
capacidades de unión de los ligandos a sus receptores, el
mantenimiento de las actividades enzimáticas, y, en el caso de las
reacciones de fluorescencia, la no interferencia con los espectros
de emisión o absorción de los marcadores fluorescentes
incluidos.
Ahora se ha encontrado que es posible estabilizar
mezclas de reacción que contienen, al menos, un compuesto
implicado en un ensayo fluorimétrico, colorimétrico o
quimio-luminiscente seleccionado entre (i) un
compuesto que comprende un fluoróforo, (ii) un compuesto que
comprende un ligando capaz de reconocer e interaccionar con un
receptor específico, (iii) una actividad enzimática que cataliza
una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente,
(iv) un conjugado que comprende una actividad enzimática que
cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, y un miembro de un par de unión
específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo
miembro de dicho par de unión específica, (v) uno o más
compuestos, independientemente de su naturaleza, por ejemplo,
ácidos nucleicos o proteínas, unidos a uno o más soportes sólidos,
susceptibles de ser utilizados en ensayos fluorimétricos,
colorimétricos o quimio-luminiscentes, o mezclas de
los mismos, con una mezcla estabilizante que comprende (i) al
menos, un agente protector frente a la desecación; (ii) al menos,
un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo
o carboxilo y grupos amino o fosfato; y (iii) al menos, un polímero
inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide
la movilidad de los reactivos desecados. Dichas mezclas de
reacción que contienen, al menos, un compuesto implicado en un
ensayo fluorimétrico, colorimétrico o
quimio-luminiscente, opcionalmente, pueden
incluir, además, una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos, así como los componentes necesarios para la realización
de dicha reacción de polimerización.
En un aspecto, la invención proporciona una
composición estabilizada, en adelante composición de la invención,
que comprende:
\newpage
(i) un componente (A) seleccionado del grupo
formado por:
- -
- un compuesto que comprende un fluoróforo (componente A1),
- -
- un compuesto que comprende un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A2),
- -
- una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente (componente A3),
- -
- un conjugado que comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A4),
- -
- uno o más compuestos unidos a un soporte sólido (componente A5),
- -
- sus mezclas; y
(ii) un componente (B) constituido por una mezcla
estabilizante que comprende:
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3).
La composición de la invención puede contener,
opcionalmente, otros componentes, tales como agua, enzimas,
reactivos para las reacciones en las que intervienen tales enzimas,
por ejemplo, cofactores, sustratos, aditivos que mejoran las
reacciones enzimáticas, etc.
En una realización particular, la composición de
la invención comprende, además de los componentes A y B, una
enzima que cataliza la polimerización de ácidos nucleicos, junto
con la totalidad o parte de los componentes necesarios para la
realización de dicha reacción de polimerización de ácidos
nucleicos.
La composición de la invención puede obtenerse
mediante desecación por aplicación de vacío sin congelación
previa. La composición de la invención contiene un grado de
humedad igual o inferior al 30%, preferentemente, comprendido entre
1% y 20%.
La composición de la invención puede ser
utilizada en la realización de ensayos fluorimétricos,
colorimétricos o quimio-luminiscentes, en general,
y, en particular, en la detección y/o cuantificación de entidades
macrmoleculares, tales como ácidos nucleicos, proteínas,
anticuerpos, antígenos, etc., mediante el empleo de tales ensayos
fluorimétricos, colorimétricos o
quimio-luminiscentes. Ventajosamente, la composición
de la invención es del tipo "lista para usar"
(ready-to-use).
En una realización particular, la composición de
la invención es un sistema de secuenciación génica
estabilizado.
En una realización particular, la composición de
la invención se materializa en un kit que comprende todos los
componentes necesarios para la realización de una reacción de
amplificación de ácidos nucleicos del tipo "lista para usar", o
de secuenciación génica, que contiene todos los reactivos para la
identificación de un marcador predeterminado, y que se presenta
como viales de reacción independientes en los que el usuario
únicamente debe añadir la muestra problema en la cantidad y
concentración adecuadas.
En otra realización particular, la composición de
la invención se presenta en forma de un soporte sólido
(microplaca, chip, array, microarray, etc.) al que previamente se
fijan moléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, etc.) y
estabilizadas por recubrimiento con dicha mezcla estabilizante (B)
y posterior desecación. Alternativamente, en otra realización
particular, la composición de la invención se presenta en forma de
un soporte sólido (microplaca, chip, array, microarray, etc.) al
que se fijan moléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas,
etc.) previamente mezcladas con dicha mezcla estabilizante (B) y
fijadas mediante los métodos específicos utilizados para cada
soporte.
La composición de la invención contiene uno o más
de dichos componentes A1, A2, A3, A4 o A5 en la cantidad adecuada
para que pueda realizar su función en el ensayo fluorescente,
colorimétrico o quimio-luminiscente
correspondiente.
\newpage
El componente A1 (compuesto que comprende
un fluoróforo) incluye a cualquier compuesto que contiene un grupo
molecular o sustancia fluorescente.
En una realización particular, el componente A1
es un compuesto fluorescente que puede introducirse, mediante
interacción química con formación de un auténtico enlace o bien
por simple acoplamiento, e n la molécula a estudiar, sin afectar a
sus características. Ejemplos de tales compuestos fluorescentes
incluyen acridinas, tales como naranja de acridina, proflavina, a
criflavina, etc.; bromuro de etidio; SYBR Green; fluoresceína y sus
derivados (por ejemplo, carboxi, isotiocianato, etc.); rhodamina B
y sus derivados (por ejemplo, isotiocianato, etc.);
1-anilino-8-naftaleno
sulfonato (ANS);
dimetil-amino-naftaleno-5-sulfonato
(DNS) y sus derivados (por ejemplo, clorados, etc.); cloruro de
dansilo;
2-p-toluidilnaftaleno-6-sulfonato
(TNS); etc.
En otra realización particular, el componente A1
comprende un nucleótido, un oligonucleótido o un polinucleótido,
independientemente de su naturaleza (ADN, ARN, quimeras ADN/ARN,
etc.), opcionalmente modificado químicamente, que contiene un
fluoróforo, por ejemplo, un nucleótido marcado con un compuesto
fluorescente, un oligonucleótido, tal como un cebador, marcado con
un compuesto fluorescente, o un polinucleótido, tal como una
sonda, marcado con un compuesto fluorescente. Ejemplos
ilustrativos de componente A1 de acuerdo con lo anterior incluyen
desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), por ejemplo, dATP, dGTP,
dCTP, dTTP, dUTP, marcados con compuestos fluorescentes;
oligonucleótidos marcados con compuestos fluorescentes en alguno
de sus extremos, por ejemplo, con LC Red 640 en su extremo 5'; un
sistema de sondas FRET (Transferencia de Energía de Resonancia
Fluorescente) que comprende una sonda que contiene un fluoróforo
dador y otra sonda que contiene un fluoróforo aceptor, que pueden
hibridar con el producto de amplificación o con regiones adyacentes
al ADN diana y que emiten una señal fluorescente que depende de la
proximidad entre los fluoróforos, por ejemplo, un par de sondas de
oligonucleótidos capaces de hibridar con regiones adyacentes en
una muestra de ADN, una marcada con fluoresceína en su extremo 3'
terminal y la otra marcada en su extremo 5' terminal con LC Red
640; sondas Taqman (WO 98/48046) que comprenden una sonda marcada
con un compuesto fluorescente y con un compuesto modulador de la
fluorescencia (quencher), por ejemplo, una sonda que contiene un
grupo FAM (6-carboxi-fluoresceína)
en el extremo 5' terminal y un grupo TAMRA
(6-carboxi-tetrametil-rhodamina)
en el extremo 3' terminal; sondas Molecular Beacon (MB) (WO
99/22018) que comprenden una sonda marcada con un compuesto
fluorescente en un extremo y con un quencher en el otro y una
estructura de tipo horquilla cuando no está hibridada a un ácido
nucleico complementario a la secuencia de nucleótidos del bucle,
por ejemplo, una sonda MB que contiene fluoresceína en el extremo
5' terminal y DABCYL en el extremo 3' terminal; sondas Scorpion
(US 2002/0102591), consistente en la unión de una sonda MB a un
cebador utilizado en la reacción de amplificación.
En otra realización particular, el componente A1
comprende un fluoróforo y una entidad macromolecular, distinta a un
ácido nucleico, por ejemplo, un péptido, una proteína, un
antígeno, etc., tal como un anticuerpo o un antígeno marcado con un
compuesto fluorescente, por ejemplo, fluoresceína y sus derivados,
rhodamina B y sus derivados, ANS, DNS y sus derivados, TNS,
cloruro de dansilo, etc.
El componente A2 (compuesto que comprende
un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer
e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión
específica), se refiere a cualquier compuesto que contiene un primer
miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e
interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión
específica. Prácticamente cualquier par de unión específica puede
ser utilizado en la elaboración de la composición de la invención.
La composición de la invención incluirá, al menos, uno de los
miembros del par de unión específica. Ejemplos ilustrativos de
pares de unión específica incluyen aquellos pares de unión
específicos útiles para detectar entidades macromoleculares tales
como ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, antígenos,
anticuerpos, compuestos susceptibles de ser fijados por adsorción o
por unión covalente, etc., por ejemplo, los sistemas basados en
avidina o estreptavidina, tales como el par de unión específica
avidina (o estreptavidina)/biotina, avidina/ficoeritrina, etc., así
como los sistemas basados en interacciones de tipo
antígeno/anticuerpo, o fragmentos de los mismos que contienen los
sitios de reconocimiento, por ejemplo, el par de unión específica
digoxigenina/anti-digoxigenina, etc. A modo
ilustrativo, el componente A2 eventualmente presente en la
composición de la invención puede ser el utilizado en muchos
sistemas de detección de biomoléculas en sistemas ELISA, esto es,
un anticuerpo primario que reconoce un antígeno y puede ser a su
vez reconocido por un anticuerpo secundario portador de un marcaje
fluorescente o conjugado con actividades enzimáticas. Otros sistemas
alternativos posibles pueden ser un antígeno o un anticuerpo unido
a biotina, un oligonucleótido unido a digoxigenina, etc.
El componente A3 (actividad enzimática que
cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente) se refiere a cualquier
actividad enzimática susceptible de catalizar una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente en presencia del
sustrato adecuado y, por tanto, susceptible de ser utilizada en
tales reacciones. Prácticamente cualquier actividad enzimática
susceptible de catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente podría ser utilizada en la
elaboración de la composición de la invención.
Ejemplos ilustrativos de actividades enzimáticas
susceptibles de catalizar reacciones colorimétricas incluyen la
actividad peroxidasa que utiliza como sustrato, entre otros,
4-cloro-1-naftol,
3-amino-4-etilcarbazol,
diamino-benzidina,
3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB),
O-fenilendiamina (OPD),
2,2'-azino-di (ácido
3-etilbenzotiozolina-6-sulfónico)
(ABTS), 3-(p-hidroxifenilo) (HPPA); la actividad
fosfatasa alcalina que utiliza como sustrato, entre otros,
3-(4-metoxiespiro[1,2-dioxetano-3'2'-triciclo-[3.3.1^{3,7}]
decan]-4-il)-fenilfosfato
(AMPPD) y p-nitrofenil-fosfato
(pNPP); etc.
Ejemplos ilustrativos de actividades enzimáticas
susceptibles de catalizar reacciones
quimio-luiminiscentes incluyen la actividad
(\beta-D-galactosidasa que utiliza
como sustrato
adamantil-1,2-dioxetano aril
galactósido (AMPGD); la actividad xantina oxidasa sobre luminol +
EDTA oro; la actividad glucosa oxidasa sobre luminol o isoluminol +
microperoxidasa; la actividad luciferasa en presencia de luciferina
+ ATP; la proteína verde fluorescente (GFP) en cultivos celulares;
la actividad peroxidasa aislada de rábano picante (HRP) en
presencia de luminol + perborato + 4-iodofenol o de
ácido 4-hidroxicinámico; la actividad fosfatasa
alcalina (PA) en presencia de AMPPD,
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (BCIP) bien en su forma de sal disódica o de sal de
toluidina, o en presencia de sal
nitroblue-tetrazolium (NPT); etc.
El componente A4 (conjugado que comprende
una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión
específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo
miembro de dicho par de unión específica) se refiere a un
conjugado resultante de la unión de una actividad enzimática
susceptible de catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión
específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo
miembro de dicho par de unión específica. Dicha actividad enzimática
que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente puede ser cualquier actividad
enzimática susceptible de ser utilizada en dichas reacciones, por
ejemplo, cualquiera de las mencionadas en relación con el
componente A3. Asimismo, dicho miembro de un par de unión
específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo
miembro de dicho par de unión específica puede ser uno de los
miembros de los pares de unión específica mencionados en relación
con el componente A2. A modo ilustrativo, el componente A4
eventualmente presente en la composición de la invención puede ser
un conjugado de tipo avidina (o
estreptavidina)-actividad enzimática (HRP o PA)
susceptible de catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, por ejemplo, el conjugado
avidina (o estreptavidina)-peroxidasa, avidina (o
estreptavidina)-fosfatasa alcalina, un anticuerpo
con capacidad de unión a una molécula (antígeno) y que se encuentre
conjugado con una actividad enzimática, tal como HRP o PA, o una
secuencia de ácido nucleico conjugada con actividades enzimáticas
(HRP o PA) que, por complementación de bases e hibridación,
reconozca otras secuencias específicas de ácidos nucleicos.
El componente A5 (uno o más compuestos
unidos a un soporte sólido) se refiere a un soporte sólido en el
que se han inmovilizado previamente uno o más compuestos,
susceptible de ser utilizado como componente de sistemas de
detección fluorimétricos, colorimétricos,
quimio-luminiscentes, o de análisis de conductividad
eléctrica, o de análisis de cambios de índice de refracción, etc.
Dicho soporte sólido puede ser cualquier soporte sólido
susceptible de ser utilizado en dichos sistemas, preferentemente, en
sistemas de detección fluorimétricos, colorimétricos o
quimio-luminiscentes. La naturaleza del material
constituyente de dicho soporte sólido puede variar ampliamente e
incluye las modificaciones necesarias para permitir la fijación de
los compuestos, por ejemplo, plástico (microplacas ELISA), vidrios
(microarrays), superficies de oro (chips), etc., opcionalmente
tratados para permitir la adsorción o unión covalente de
macromoléculas, por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, etc. En
una realización particular, dicho componente A5 es una microplaca
de pocillos ELISA, tanto para ácidos nucleicos como para proteínas,
en la que se han fijado previamente uno o más compuestos de
interés, tales como biomoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos o
proteínas). En otra realización particular, dicho componente A5
comprende chips y microarrays que presentan, inmovilizados sobre sus
superficies, uno o más compuestos de interés, tales como
biomoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas),
independientemente de la naturaleza del material constituyente del
chip o microarray, o de las modificaciones introducidos en el
mismo, necesarias para permitir la fijación de dichos compuestos
en el soporte.
La composición de la invención comprende un
componente B constituido por B1, B2 y B3. El componente B estará
presente en la composición de la invención en la cantidad adecuada
para que pueda realizar su función en la reacción o ensayo
correspondiente.
El componente B1 (agente protector frente
a la desecación) comprende, al menos un carbohidrato no reductor
junto con, opcionalmente, un poliol. Preferentemente, dicho
carbohidrato no reductor se selecciona del grupo formado por un
disacárido no reductor, un trisacárido no reductor y sus mezclas.
Ejemplos ilustrativos de disacáridos no reductores que pueden
estar presentes en la composición de la invención incluyen al
palatinitol
(6-\alpha-D-glucopiranosil-manitol)
y la trehalosa. Asimismo, ejemplos ilustrativos de trisacáridos no
reductores incluyen la rafinosa y la melezitosa. El poliol se
selecciona, preferentemente, entre glicerol, sorbitol y sus
mezclas; ventajosamente, el poliol es glicerol. Por tanto, en una
realización particular, el componente B1 comprende un carbohidrato
no reductor seleccionado entre palatinitol, trehalosa, rafinosa,
melezitosa y sus mezclas. En otra realización particular, el
componente B1 comprende (i) un carbohidrato no reductor
seleccionado entre palatinitol, trehalosa, rafinosa, melezitosa y
sus mezclas, y (ii) un poliol seleccionado entre glicerol,
sorbitol y sus mezclas.
El componente B2 (inhibidor de las
reacciones de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y
grupos amino o fosfato) inhibe las reacciones de condensación que
pueden producirse entre los grupos reactivos carboxilo, carbonilo,
amino y fosfato que se encuentran en las macromoléculas presentes
en la composición de la invención. Dicho inhibidor puede ser un
inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo. Entre los
inhibidores competitivos se encuentran los aminoácidos, en
particular, los \alpha-aminoácidos, tal como los
\alpha-aminoácidos naturales, por ejemplo, lisina,
arginina, triptófano, etc., preferentemente, lisina. Entre los
inhibidores no competitivos, la betaína, la aminoguanidina y los
derivados de aminoguanidina han demostrado ser los más eficaces. La
elección del inhibidor no competitivo depende del carbohidrato no
reductor utilizado como agente protector frente a la desecación,
de modo que en presencia de rafinosa el inhibidor no competitivo
más efectivo es la betaína, mientras que en presencia de otros
carbohidratos no reductores los inhibidores no competitivos más
efectivos son la aminoguanidina y sus derivados.
El componente B3 (polímero inerte capaz de
generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad
de los reactivos desecados) mejora la estabilidad de la
composición de la invención al generar una malla que impide la
movilidad de los diferentes componentes que componen dicha
composición, de manera que quedan inmovilizados, en mayor o menor
medida, en las celdillas que forma el polímero, impidiéndose, por
tanto, que dichos componentes puedan aproximarse entre sí con lo
que se evitan las posibles reacciones químicas entre los posibles
grupos reactivos. El componente B3 no debe reaccionar químicamente
con ninguno de los componentes que componen la composición de la
invención y debe crear un entramado lo suficientemente fino y
moldeable como para atrapar en su malla macromoléculas
individualizadas sin distorsionar su estructura terciaria o
cuaternaria. En una realización particular, el componente B3 se
selecciona del grupo formado por polivinilpirrolidona (PVP),
polietilenglicol (PEG) de diversos grados de polimerización,
dextrano, almidón, Ficoll [polímero no iónico sintetizado a partir
de la sacarosa], glucógeno, goma arábiga y sus mezclas. En general,
el glucógeno y la goma arábiga son los polímeros inertes que han
demostrado ser más efectivos en su función protectora. La cantidad
de componente B3 presente en la composición de la invención debe
ser la suficiente como para asegurar la generación de una malla lo
suficientemente tupida que impida la movilidad de las
macromoléculas, sin que luego interfiera tras la rehidratación
(reconstitución) de la composición de la invención ni en la reacción
ni en el ensayo fluorescente, colorimétrico o
quimio-luminiscente a realizar.
Opcionalmente, la composición de la invención
puede contener una o más enzimas distintas a las actividades
enzimáticas eventualmente presentes en la composición de la
invención, junto con la totalidad o parte de los reactivos
necesarios para la realización de las reacciones en las que
intervienen tales enzimas, por ejemplo, cofactores, sustratos,
aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, etc. Prácticamente
cualquier enzima puede estar presente en la composición de la
invención; no obstante, en una realización particular, dicha
enzima es una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos, por ejemplo, enzimas (termoestables o termolábiles) de
amplificación de ácidos nucleicos, independientemente de su
naturaleza química; en este caso, la composición de la invención
puede contener, además, los componentes necesarios para la
realización de dicha reacción de polimerización de ácidos
nucleicos, como búferes de reacción, nucleótidos, cofactores
etc.
La composición de la invención presenta numerosas
aplicaciones, tanto en investigación básica como aplicada, por
ejemplo, en el análisis y estudio de todo tipo de entidades
macromoleculares ( ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, antígenos,
anticuerpos, etc.). De hecho, la composición de la invención es
particularmente útil en la realización de ensayos fluorimétricos,
colorimétricos o quimio-luminiscentes. Tales ensayos
pueden ser utilizados en la detección, identificación y/o
cuantificación de tales entidades macromoleculares. En general,
estos ensayos se pueden realizar fácilmente utilizando la
composición de la invención, que contendrá los componentes
necesarios para el fin al que va destinada, tras reconstitución de
la misma, por ejemplo, mediante rehidratación, y adición de la
muestra problema.
En una realización particular, la composición de
la invención comprende un fluoróforo intercalante entre dsADNs, o
un compuesto que comprende un fluoróforo y, opcionalmente, un
quencher, seleccionándose dicho compuesto entre un nucleótido, un
oligonucleótido y un polinucleótido, y, además, una enzima que
cataliza la polimerización de ácidos nucleicos. Dicha composición
de la invención, puede ser utilizada en la detección y/o
cuantificación de ácidos nucleicos mediante un método fluorimétrico.
A modo ilustrativo, dicha composición de la invención puede ser
utilizada:
- -
- en la amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real, independientemente del sistema elegido (por ejemplo, sondas Taqman, sondas MB, sondas Scorpion, sondas FRET, fluoróforos intercalantes, etc.) y del formato de reacción (por ejemplo, tubos de reacción convencionales o capilares, placas, etc.);
- -
- en reacciones de secuenciación de ácidos nucleicos basadas en el empleo de fluoróforos para la identificación, por ejemplo, mediante reacciones de PCR utilizando ADN polimerasas termoestables o bien mediante reacciones de elongación de ácidos nucleicos en presencia de oligonucleótidos o nucleótidos marcados con fluoróforos; o
- -
- en la identificación de fragmentos de ácidos nucleicos en ensayos basados en PCRs multiplexadas con compuestos fluorescentes para la identificación de fragmentos en sistemas de electroforesis capilar; etc.
En otra realización particular, la composición de
la invención comprende un oligonucleótido o un polinucleótido
químicamente modificado por la inclusión de un compuesto que actúa
como primer miembro de un par de unión específica capaz de
reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de
unión específica, en el que dicho segundo miembro del par de unión
específica está unido a una actividad enzimática que cataliza una
reacción colorimétrica o quimio-luminiscente.
Ejemplos ilustrativos de esta realización incluyen oligonucleótidos
o polinucleótidos unidos a digoxigenina o biotina, que actuarían
como primer par de unión, y que podría interaccionar con el
segundo par de unión, tal como un anticuerpo
anti-digoxigenina (en el caso de la digoxigenina),
o con un anticuerpo anti-biotina, con avidina o con
estreptoavidina (en el caso de la biotina). El segundo par de unión
se encontraría unido a una actividad enzimática que cataliza una
reacción colorimétrica o quimio-luminiscente. Dicha
composición puede ser utilizada en la detección y/o cuantificación
de ácidos nucleicos mediante un método colorimétrico o
quimio-luminiscente.
La detección e identificación de ácidos nucleicos
es particularmente interesante en aplicaciones de diagnóstico, por
ejemplo, en la identificación de patógenos, o en aplicaciones de
pronóstico, es decir, en la evaluación del riesgo a desarrollar una
determinada patología, por ejemplo, la detección de mutaciones
génicas asociadas a un mayor riesgo de desarrollar alguna
patología (cáncer, enfermedad de Alzheimer, etc.).
En otra realización particular, la composición de
la invención comprende un anticuerpo (que actúa como primer par de
unión) y que se une de forma específica a un segundo par de unión
(un antígeno). Dicho anticuerpo puede estar conjugado a un
compuesto fluorescente, por ejemplo, fluoresceína. Dicha composición
puede ser utilizada en la detección y/o cuantificación de
antígenos mediante un método inmunofluorescente. Alternativamente,
la composición de la invención puede contener dicho anticuerpo
conjugado a un primer miembro de un par de unión, por ejemplo,
biotina, o bien un conjugado que comprende una actividad
enzimática que cataliza una reacción colorimétrica, por ejemplo,
peroxidasa, o quimio-luminiscente, por ejemplo,
(\beta-D-galactosidasa, y un
segundo miembro de un par de unión específica (avidina o
estreptavidina) con capacidad de reconocimiento y unión a dicho
primer miembro (biotina) de dicho par de unión específica; dicha
composición puede ser utilizada en la detección y/o cuantificación
de antígenos mediante un método inmunocolorimétrico o
inmunoquimio-luminiscente. Estas composiciones son
útiles para detectar e identificar antígenos propios de tumores,
virus, etc. A modo ilustrativo, esta realización puede utilizarse
para realizar un ensayo ELISA de detección de antígenos, tanto si
se usa con digoxigenina o con biotina. La composición de la
invención podría contener o no el conjugado en el mismo vial.
En otra realización particular, la composición de
la invención comprende un antígeno susceptible de ser reconocido
específicamente por un anticuerpo, conjugado a un compuesto
fluorescente, por ejemplo, fluoresceína. Dicha composición puede ser
utilizada en la detección y/o cuantificación de anticuerpos
mediante un método inmunofluorescente. Alternativamente, la
composición de la invención puede contener dicho antígeno conjugado
a un primer miembro de un par de unión, por ejemplo, biotina, o
bien un conjugado que comprende una actividad enzimática que
cataliza una reacción colorimétrica, por ejemplo, peroxidasa, o
quimio-luminiscente, por ejemplo,
(\beta-D-galactosidasa, y un
segundo miembro de un par de unión específica (avidina o
estreptavidina) con capacidad de reconocimiento y unión a dicho
primer miembro (biotina) de dicho par de unión específica; dicha
composición puede ser utilizada en la detección y/o cuantificación
de anticuerpos mediante un método inmunocolorimétrico o
inmunoquimio-luminiscente. Estas composiciones son
útiles para detectar e identificar anticuerpos, etc. A modo
ilustrativo, esta realización puede utilizarse para realizar un
ensayo ELISA de detección de anticuerpos, tanto si se usa con
digoxigenina o con biotina. La composición de la invención podría
contener o no el conjugado en el mismo vial, pero no incluiría el
sustrato de la reacción.
En otra realización particular, la invención
consistiría en un soporte sólido, cualquiera que sea su naturaleza,
como por ejemplo microplacas ELISA y soportes de microarrays o
chips, en los que previamente se han inmovilizado una o varias
especies moleculares, cualquiera que sea su naturaleza. Dichas
especies moleculares se estabilizarían por recubrimiento del
soporte con la mezcla de estabilización. En este caso el formato de
la invención sería un soporte con moléculas unidas y estabilizadas.
Dicho soporte podría ser utilizado para el análisis colorimétrico,
fluorimétrico o quimio-luminiscente, pudiéndose
utilizar para ello, cualquiera de los sistemas estabilizados
presentados en esta patente.
En otra realización particular, la invención
consistiría en una mezcla de estabilización que se añadiría a las
moléculas previamente a su fijación en un soporte sólido,
cualquiera que sea su naturaleza, como por ejemplo microplacas ELISA
y soportes de microarrays o chips. Las moléculas así estabilizadas
se aplicarían al soporte sólido siguiendo el procedimiento
específico indicado para cada soporte. En esta realización, al
igual que en el caso anterior, el formato de la invención sería un
soporte con moléculas unidas y estabilizadas. Dicho soporte podría
ser utilizado para el análisis colorimétrico, fluorimétrico o
quimio-luminiscente, pudiéndose utilizar para ello,
cualquiera de los sistemas estabilizados presentados en esta
descripción.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit
que comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
de la invención. El contenedor puede ser cualquier recipiente
apropiado para contener la composición de la invención, por
ejemplo, un vial, un frasco, etc.
En una realización particular, el kit
proporcionado por esta invención es un kit adecuado para la
detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos por métodos
fluorimétricos, colorimétricos o
quimio-luminiscentes, en particular, para la
detección por dichos métodos de ácidos nucleicos amplificados
mediante amplificación de ácidos nucleicos en tiempo real, o en
PCRs multiplexadas, o resultantes de reacciones de secuenciación,
etc. En otra realización particular, el kit proporcionado por esta
invención es un kit adecuado para la detección y/o cuantificación
de péptidos, proteínas, antígenos o anticuerpos por métodos
fluorimétricos, colorimétricos o
quimio-luminiscentes.
Por tanto, el kit de la invención contendrá,
además de la composición de la invención (con los componentes
apropiados en función del fin al que va destinada), la totalidad o
parte de los componentes (reactivos, factores, aditivos, etc.)
necesarios para la realización de la reacción y del ensayo en
cuestión, excepto la molécula problema (ácido nucleico, péptido,
proteína, antígeno, anticuerpo, etc.).
A modo ilustrativo, la invención proporciona un
kit para la amplificación y/o detección en tiempo real de
secuencias específicas de ácidos nucleicos (ARN o ADN) que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición de
la invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición de la invención una enzima que cataliza la
polimerización de ácidos nucleicos, por ejemplo, una enzima de
amplificación génica o de transcripción en reverso acoplada a
amplificación génica, y, además, todos los reactivos necesarios,
incluyendo cebadores específicos marcados con fluoróforos o sondas
que comprenden un fluoróforo y, opcionalmente, un quencher, por
ejemplo, sondas Taqman, MB, FRET o Scorpion, excepto el ácido
nucleico problema.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit de amplificación y/o detección en tiempo real
de secuencias específicas de ácidos nucleicos (ARN o ADN) que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición de
la invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición de la invención una enzima que cataliza la
polimerización de ácidos nucleicos, por ejemplo, una enzima de
amplificación génica o de transcripción en reverso acoplada a
amplificación génica, y, además, los reactivos necesarios,
incluyendo nucleótidos marcados con marcadores fluorescentes,
excepto el ácido nucleico problema.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit de amplificación y/o detección en tiempo real
de secuencias específicas de ácidos nucleicos (ARN o ADN) que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición de
la invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición de la invención una enzima que cataliza la
polimerización de ácidos nucleicos, por ejemplo, una enzima de
amplificación génica o de transcripción en reverso acoplada a
amplificación génica, y, además, los reactivos necesarios,
incluyendo sustancias fluorescentes intercalantes en dsADNs, por
ejemplo, Sybr Green, excepto el ácido nucleico problema.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit de secuenciación de ácidos nucleicos mediante
amplificación génica que comprende, al menos, un contenedor que
contiene una composición de la invención, estabilizada y lista para
usar, comprendiendo dicha composición de la invención una enzima
que cataliza la polimerización de ácidos nucleicos, por ejemplo,
una enzima de amplificación génica, y, además, los reactivos
necesarios, incluyendo cebadores o nucleótidos terminadores marcados
con un marcador fluorescente.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit de secuenciación de ácidos nucleicos mediante
reacciones de elongación de ácidos nucleicos que comprende, al
menos, un contenedor que contiene una composición de la invención,
estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha composición de
la invención una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos, por ejemplo, una enzima de amplificación génica, y,
además, los reactivos necesarios, incluyendo cebadores o nucleótidos
terminadores marcados con un marcador fluorescente.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit para la detección de ácidos nucleicos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición de
la invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición de la invención los reactivos necesarios, incluyendo
compuestos que contienen un miembro de un par de unión específica
conjugado a una actividad enzimática que cataliza una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente, por ejemplo, un
compuesto que comprende un grupo avidina o biotina, o cualquier
otra modificación utilizada para posteriores análisis
colorimétricos o quimio-luminiscentes.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit para la detección de anticuerpos que comprende,
al menos, un contenedor que contiene una composición de la
invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición un compuesto que comprende un miembro de un par de
unión específica conjugado a una actividad enzimática que cataliza
una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente.
En otra realización particular, la invención
proporciona un kit para la detección de antígenos que comprende,
al menos, un contenedor que contiene una composición de la
invención, estabilizada y lista para usar, comprendiendo dicha
composición un compuesto que comprende un miembro de un par de
unión específica conjugado a una actividad enzimática que cataliza
una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente.
Por tanto, la presente invención proporciona
composiciones (mezclas de reacción), por ejemplo, del tipo
"lista para usar"
(ready-to-use), y kits, cerrados y
listos para uso, que incluyen (i) un compuesto que comprende un
fluoróforo, (ii) un compuesto que comprende un ligando capaz de
reconocer e interaccionar con un receptor específico, en el que
dicho ligando o dicho receptor está unido a una actividad
enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, (iii) una actividad enzimática
que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, o (iv) un conjugado que
comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de
un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión
a un segundo miembro de dicho par de unión específica. Dichas
composiciones son útiles para la realización de ensayos
fluorescentes, colorimétricos o
quimio-luminiscentes. En general, cuando la
composición de la invención comprende un miembro de un par de unión
específica, el otro miembro de dicho par de unión específica
estará contenido en otro contenedor del kit de la invención. Así
mismo, los kits destinados a la realización de los ensayos
colorimétricos o quimio-luminiscentes incluirán un
contenedor separado con el sustrato para dichas actividades
enzimáticas que catalizan una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente.
Mediante la presente invención, se simplifica el
proceso de preparación de reacciones de amplificación utilizando
marcajes fluorescentes, colorimétricos o
quimio-luminiscentes mediante el desarrollo de
sistemas de reacción listos para su uso en contenedores (viales)
independientes. El desarrollo de sistemas de reacción listos para
uso en contenedores independientes, permite agilizar la realización
de un gran número de técnicas de uso común en laboratorios de
diagnóstico y de investigación, tales como reacciones de
amplificación en tiempo real, secuenciación y marcajes con grupos
fluorescentes o intermediarios de reacciones de colorimetría y
quimio-luminiscencia.
Además de agilizar la realización del método
experimental, se incrementa la reproducibilidad de resultados y se
elimina en gran manera el factor error experimental.
En otra realización particular el kit es un
soporte sólido, tal como microplacas ELISA, soportes de microarrays
o chips, que contiene inmovilizadas y estabilizadas moléculas que
pueden ser utilizadas en ensayos de detección fluorimétrica,
colorimétrica o quimio-luminiscentes.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para preparar una composición estabilizada, con un
grado de humedad igual o inferior al 30% (composición de la
invención), que comprende
a) poner en contacto en un único contenedor:
una solución acuosa que comprende, al menos, un
componente (A) seleccionado del grupo formado por:
- -
- un compuesto que comprende un fluoróforo (componente A1),
- -
- un compuesto que comprende un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A2),
- -
- una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente (componente A3),
- -
- un conjugado que comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A4), y
- -
- sus mezclas; y
una solución acuosa que comprende un componente
(B) constituido por:
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3),
para obtener una solución acuosa que comprende
dichos componentes A y B; y
b) retirar la totalidad o parte del agua
contenida en dicha solución acuosa que contiene los componentes A y
B obtenida en la etapa a), hasta obtener una composición que
comprende dichos componentes A y B, y tiene un grado de humedad
igual o inferior al 30%.
La solución acuosa que comprende el componente A
puede prepararse fuera del contenedor y añadirse posteriormente al
mismo tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor
mediante la adición y mezcla de los distintos componentes de dicha
5 solución acuosa en el propio contenedor. Asimismo, la solución
acuosa que comprende el componente B (mezcla estabilizante) puede
preparase fuera del contenedor y añadirse posteriormente al mismo
tal cual o bien puede formarse directamente en el contenedor
mediante la adición y mezcla de los distintos componentes en el
propio contenedor.
El contenedor puede ser cualquier recipiente
apropiado, por ejemplo, un vial, de cualquier material apropiado
(vidrio, plástico, etc.)
Los componentes A1-A4 y
B1-B3 han sido descritos previamente en relación con
la composición de la invención. La composición de la invención
también puede contener, si se desea, uno o más de los componentes
opcionales mencionados previamente, tales como una o más enzimas
distintas a las actividades enzimáticas eventualmente presentes en
la composición de la invención, por ejemplo, enzimas (termoestables
o termolábiles) de amplificación de ácidos nucleicos, enzimas de
restricción, enzimas que intervienen en las reacciones de
amplificación, secuenciación o caracterización (identificación) de
ácidos nucleicos, etc., junto con la totalidad o parte de los
reactivos necesarios para la realización de las reacciones en las
que intervienen tales enzimas, por ejemplo, cofactores, sustratos,
aditivos que mejoran las reacciones enzimáticas, etc. Dichos
componentes opcionales pueden añadirse a la solución acuosa que
contiene el componente A o bien a la solución acuosa que contiene
el componente B o bien pueden añadirse a la solución acuosa
resultante de la mezcla de las soluciones acuosas que contienen los
componentes A y B.
Tras la mezcla en el contenedor de la solución
acuosa que comprende el componente A con la solución acuosa que
comprende el componente B se forma una solución acuosa que
comprende dichos componentes A y B de la que se retira la totalidad
o parte del agua contenida en dicha solución acuosa hasta alcanzar
un grado de humedad igual o inferior al 30%, obteniéndose, por
tanto, una composición estabilizada, total o parcialmente desecada,
que comprende al menos un componente A y un componente B y que
constituye la composición de la invención.
La retirada de la totalidad o parte del agua
presente en la solución acuosa resultante de mezclar las
soluciones acuosas que comprenden los componentes A y B en el
contenedor puede realizarse por cualquier método de desecación
convencional, incluyendo, por ejemplo, liofilización, desecado en
lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión
atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida,
desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta
temperatura y presión disminuida. El método de desecación
preferido es el desecado a una temperatura comprendida entre 15°C y
60°C, y presión disminuida inferior a la atmosférica. Otros
métodos, como los anteriormente nombrados, pueden ser aplicados en
la desecación, aunque su mayor coste o menor eficiencia o mayor
agresividad frente a los componentes de la mezcla de reacción a
desecar desaconsejan su utilización. En ocasiones, por ejemplo,
cuando la mezcla de reacción está contenida en un tubo capilar,
dado que la deposición de la muestra se realiza en la pared del
tubo, puede ser necesario centrifugar para conseguir que baje hasta
el fondo.
En general, el grado de desecación elegido
dependerá principalmente de factores económicos (coste del proceso,
tiempo necesario para alcanzar un determinado grado de desecación,
etc.) y de la relación existente entre el grado de desecación y la
estabilidad de la composición. Por ello, en una realización
particular, el grado de humedad remanente en la composición de la
invención está comprendido entre el 1% y el 20%. Las composiciones
completamente desecadas, es decir, con una presencia de agua
residual igual o inferior al 1%, tienden a tener una estabilidad
(durante el almacenamiento) inferior a aquéllas que contienen un
mayor porcentaje de agua, observándose en las composiciones
completamente desecadas una significativa disminución en los
rendimientos de la reacción tras rehidratación y adición del
sustrato de reacción. Aunque la composición de la invención, debido
a su estabilidad, puede ser almacenada durante una o más semanas a
temperatura ambiente (25°C), parece recomendable que se almacena a
temperaturas comprendidas entre 4°C y 10°C para asegurar su
correcta funcionalidad a lo largo del tiempo.
Durante el proceso de desecación, el componente
B1 estabiliza la estructura terciaria de las macromoléculas
presentes en la solución acuosa que comprende el componente A,
sustituyendo en esa misión a las moléculas de agua que, en solución
acuosa, forman la envoltura protectora que ayuda a mantener la
estructura tridimensional de dichas macromoléculas, bloqueando
además las reacciones que pudieran producirse entre los grupos
químicos reactivos que pudieran encontrarse en dichas
macromoléculas, con lo que ejercen, además, un efecto
estabilizante de las composiciones desecadas. El componente B2
inhibe las reacciones de condensación que pueden producirse entre
los grupos reactivos carboxilo, carbonilo, amino y fosfato que se
encuentran en las macromoléculas presentes en la composición de la
invención. El componente B3 mejora la estabilidad de la composición
de la invención al generar una malla que impide la movilidad de los
diferentes reactivos que la componen, de manera que quedan
inmovilizados en mayor o menor medida en las celdillas que forma el
polímero y, en consecuencia, estos reactivos no pueden aproximarse
entre sí, evitándose la reacción química de sus grupos reactivos
superficiales. La cantidad de polímero inerte a añadir debe ser la
suficiente como para asegurar la generación de una malla lo
suficientemente tupida que impida la movilidad de las
macromoléculas, sin que luego interfiera en las reacciones
posteriores. La actuación conjunta de los tres componentes (B1, B2
y B3) de la mezcla estabilizante (componente B) da como resultado
que la composición de la invención sea funcional tras su
almacenamiento. La adición de sólo uno o dos de los componentes
B1, B2 o B3 citados, sin la presencia de los otros dos o del
restante componente, genera composiciones que se inactivan durante
el procedimiento de obtención de la composición de la invención o
bien son inestables, desapareciendo su actividad a los pocos días
de obtener la composición de la invención, presentando, por tanto,
una estabilidad muy reducida durante el almacenamiento.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para preparar una composición estabilizada que
comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados
y estabilizados, con un grado de humedad igual o inferior al 30%,
que comprende
- poner en contacto un componente (A) consistente en un soporte sólido que contiene uno o más compuestos previamente inmovilizados sobre dicho soporte sólido con un componente (B) consistente en una mezcla estabilizante que comprende
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3); y
- retirar la totalidad o parte del agua contenida en la mezcla resultante de dichos componentes (A) y (B), hasta obtener una composición que comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados y estabilizados y dicho componente (B) y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
El componente (A) comprende un soporte sólido de
plástico, vidrio o superficies de oro, opcionalmente pretratado
para permitir la adsorción o unión covalente de compuestos. El
compuesto o compuestos inmovilizados en el soporte sólido puede ser
cualquier compuesto de interés, por ejemplo, una o más
biomoléculas, tales como ácidos nucleicos (oligo- o
polinucleótidos, etc.), péptidos, proteínas, anticuerpos, etc.
Dichos compuestos se inmovilizan por métodos convencionales sobre
dicho soporte sólido o bien los soportes sólidos cargados con uno
o más compuestos inmovilizados sobre dicho soporte sólido se
adquieren comercialmente. El componente (B) se añade sobre el
soporte sólido cargado con dicho compuesto o compuestos formando
una fina capa que recubre a dicho soporte sólido y, finalmente, se
procede a retirar la totalidad o parte del agua presente en la
mezcla resultante mediante cualquier método de desecación
convencional, incluyendo, por ejemplo, liofilización, desecado en
lecho fluido, desecado a temperatura ambiente y presión
atmosférica, desecado a temperatura ambiente y presión disminuida,
desecado a alta temperatura y presión atmosférica, desecado a alta
temperatura y presión disminuida. El método de desecación
preferido es el desecado a una temperatura comprendida entre 15°C y
60°C, y presión disminuida inferior a la atmosférica. Otros
métodos, como los anteriormente nombrados, pueden ser aplicados en
la desecación, aunque su mayor coste o menor eficiencia o mayor
agresividad frente a los componentes de la mezcla de reacción a
desecar desaconsejan su utilización.
La composición estabilizada que comprende un
soporte sólido que contiene uno o más compuestos inmovilizados y
estabilizados, con un grado de humedad igual o inferior al 30%,
obtenible según el procedimiento definido previamente, puede
utilizarse como sustrato de detección de sistemas colorimétricos,
fluorescentes o quimio-luminiscentes o bien como
sustrato de detección en un método de análisis de resultados como
medida de conductividad eléctrica o medida de índice de
refracción. Por tanto, los soportes sólidos cumplirán las
condiciones necesarias para poder ser utilizados en tales
aplicaciones.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para preparar una composición estabilizada que
comprende un soporte sólido que contiene uno o más compuestos
inmovilizados y estabilizados, con un grado de humedad igual o
inferior al 30%, que comprende
- poner en contacto (i) un soporte sólido, opcionalmente tratado para inmovilizar compuestos, con (ii) uno o más compuestos estabilizados mediante la mezcla de dicho compuesto o compuestos con un componente (B) consistente en una mezcla estabilizante que comprende
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3); y
- retirar la totalidad o parte del agua contenida en la mezcla resultante hasta obtener una composición que comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados y estabilizados y dicho componente B, y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
El soporte sólido puede ser un soporte sólido de
plástico, vidrio o superficies de oro, opcionalmente pretratado
para permitir la adsorción o unión covalente de compuestos. El
compuesto o compuestos a fijar en el soporte sólido puede ser
cualquier compuesto de interés, por ejemplo, una o más
biomoléculas, tales como ácidos nucleicos (oligo- o
polinucleótidos, etc.), péptidos, proteínas, anticuerpos, etc.
Dichos compuestos se estabilizan poniendo en contacto dichos
compuestos con dicho componente (B) y, a continuación, se añaden
sobre el soporte sólido opcionalmente tratado para inmovilizar
dichos compuestos. Posteriormente, se procede a retirar la
totalidad o parte del agua presente en la mezcla resultante
mediante cualquier método de desecación convencional, incluyendo,
por ejemplo, liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a
temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura
ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y
presión atmosférica, desecado a alta temperatura y presión
disminuida. El método de desecación preferido es el desecado a una
temperatura comprendida entre 15°C y 60°C, y presión disminuida
inferior a la atmosférica. Otros métodos, como los anteriormente
nombrados, pueden ser aplicados en la desecación, aunque su mayor
coste o menor eficiencia o mayor agresividad frente a los
componentes de la mezcla de reacción a desecar desaconsejan su
utilización.
La composición estabilizada que comprende un
soporte sólido que contiene uno o más compuestos inmovilizados y
estabilizados, con un grado de humedad igual o inferior al 30%,
obtenible según el procedimiento definido previamente, puede
utilizarse como sustrato de detección de sistemas colorimétricos,
fluorescentes o quimio-luminiscentes o bien como
sustrato de detección en un método de análisis de resultados como
medida de conductividad eléctrica o medida de índice de
refracción. Por tanto, los soportes sólidos cumplirán las
condiciones necesarias para poder ser utilizados en tales
aplicaciones.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no deben ser considerados limitativos del alcance de la misma.
La enzima ADN polimerasa termoestable usada en
este y en los siguientes ejemplos, salvo indicación en caso
contrario, es una ADN polimerasa recombinante de Thermus
thermophilus expresada en Escherichia coli, propiedad de
Biotools B&M Labs S.A., España, y purificada mediante un
método no cromatográfico desarrollado por la misma empresa
(BIOTOOLS DNA Polymerase). Tras su purificación, la enzima se guardó
a -20°C en un tampón de almacenamiento conteniendo Tris HCl 30 mM,
pH 8, glucosa 25 mM, KCl 25 mM, PMSF 0,5 mM, Tween 20 0,25% y NP40
0,25%. Se preparó un tampón de reacción conteniendo Tris HCl, pH 8,
750 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 200 mM, Tween 20 0,1% y MgCl_{2}
20 mM.
Se prepararon mezclas de reacción para la
amplificación de un fragmento de aproximadamente 750 pares de bases
(pb) correspondiente a la región codificante de la fracción 18S
del RNA ribosomal (rRNA procedente de la subunidad pequeña- "small
subunit" o "SSUrRNA") del género Plasmodium (el
tamaño amplificado presenta pequeñas variaciones dependiendo de la
especie). Para ello, en tubos de amplificación capilares,
específicos para su uso en el sistema LightCycler System (Roche
Applied Science, Mannheim, Germany) se añadió 1 microlitro de
enzima ADN polimerasa (1 U/\mul) conservada en su tampón de
almacenamiento, 2 microlitros del tampón de reacción y 1
microlitro de una disolución que contiene en proporción equimolar
los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la
reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP).
Asimismo, se añadió 1 \mul a concentración 10 mM de los
cebadores A1(^{5'}-AGT GTG TAT CAA TCG AGT
TTC-^{3'}) y A2 (^{5'}-CGC AGT
TGT TTG TCT CCA GAA-^{3'}), los oligonucleótidos
cuya función es primar la reacción de amplificación. Finalmente, se
añadió 1 \mul a concentración 10 \muM de las sondas FRET A3
(^{5'}-TGT AAC TAT TCT AGG GGA ACT-
F-^{3'}) y A4
(^{5'}-LCRed640-TTT AGC TTT TGG
CTT TAA TAC-P-^{3'}). Ambas sondas
presentan la misma polaridad e hibridan en zonas adyacentes de la
región amplificada por los primers A1 y A2, dejando únicamente dos
bases de separación entre ambas sondas al hibridar. La sonda A3 se
encuentra marcada con fluoresceína en posición 3' y la sonda A4
contiene un grupo LC Red 640 en el extremo 5' y se encuentra
fosforilada en el extremo 3' para evitar la reacción de elongación
primada por Taq polimerasa, de esta manera, al hibridar ambas
sondas los grupos fluoresceína y LC Red 640 se sitúan adyacentes
favoreciéndose el proceso de resonancia. Las sondas A3 y A4 se
diseñaron sobre una zona variable del genoma de Plasmodium,
de manera que hibridan con el producto amplificado de P.
falciparum, pero no con el producto amplificado de otras
especies de Plasmodium como P. vivaz, P.
malariae o P. ovale.
Se prepararon diversos tubos de la forma antes
descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes
adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen
en la Tabla 1. Los tubos así preparados se centrifugaron durante 10
segundos a 4000 rpm en una centrífuga de mesa (Eppendorf) para
garantizar que la mezcla quedaba en el fondo del capilar.
Finalmente, se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf
modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C,
durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos.
Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según el
volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica sobre
muestras de sangre de pacientes infectados con P.
falciparum, P. vivax, P. ovale o P.
malariae.
Para ello se añadió a cada tubo 50 ng de DNA de
cada muestra en un volumen de 20 microlitros y se procedió a
realizar los ciclos de incubación, que constaban de una incubación
inicial a 95°C durante 10 minutos, para permitir la hidratación de
la mezcla desecada y estabilizada, y, a continuación, 45 ciclos de
desnaturalización (95°C, 10 segundos), anillamiento (55°C, 5
segundos), y extensión (72°C, 10 segundos), con una razón de
transición de temperatura de 20°C/segundo en todos los casos,
utilizando un termociclador LightCycler (Roche). En paralelo, y
para comprobar la evolución de la actividad de los tubos
desecados, se amplificaron muestras de ADN utilizando una mezcla
fresca, en las mismas condiciones de amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se
analizó en todos los casos mediante visualización de la curva de
fluorescencia y determinación del "crossing point", siguiendo
las instrucciones del software del equipo, de cada uno de los tubos
de reacción, tanto frescos como desecados y estabilizados.
Se observó, en todos los casos, que aquellas
mezclas estabilizantes que contienen melezitosa o palatinitol, en
conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa
con betaína y glucógeno, presentan máxima actividad, con un
coeficiente de variación en el "crossing point" del 2% con
respecto a los valores obtenidos en las mezclas frescas. Las
muestras de pacientes infectados con P. falciparum dieron, en
todos los casos, resultados positivos, mientras que los pacientes
infectados con otras especies dieron, en todos los casos,
resultados negativos. Por el contrario, al analizar los productos
amplificados en gel de agarosa al 1,5% teñida con bromuro de
etidio, se observó que todas las muestras incluidas presentaban
una banda de amplificación de aproximadamente 750 pb. Estos
resultados confirmaban que la reacción de amplificación había
funcionado correctamente en todos los casos, y que la detección de
P. falciparum había sido específica (TABLA 1).
Los resultados obtenidos demuestran la
posibilidad de estabilizar sondas marcadas fluorescentemente sin
que afecten a su funcionalidad. Por otro lado, el hecho de que la
curva de fluorescencia sigue un comportamiento ascendente durante
el proceso, sin aparición de señal fluorescente al inicio de la
reacción, indicaría que la mezcla estabilizante utilizada no
presenta emisión de fluorescencia basal en las condiciones
ensayadas.
Para ensayar la eficiencia de sondas TaqMan
incluidas en mezclas de reacción desecadas y estabilizadas se
prepararon mezclas de reacción para la amplificación de la misma
región descrita en el Ejemplo 1, utilizando los mismos reactivos
descritos. A cada tubo de reacción capilar, específicos para su uso
en el sistema LightCycler System (Roche Applied Science, Mannheim,
Germany) se le añadió 1 microlitro de dicha enzima ADN polimerasa
(1 U/\mul) conservada en su tampón de almacenamiento, 2
microlitros del tampón de reacción, 1 microlitro de una disolución
que contiene en proporción equimolar los cuatro
desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de
amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 microlitro del
cebador A1 (^{5'}-AGT GTG TAT CAA TCG AGT
TTC-^{3'}) a una concentración 10 \muM y 1
microlitro del cebador A2 (^{5'}-CGC AGT TGT TTG
T CT C CA G AA-^{3'}) a una concentración 10 µM.
Asimismo se añadió a cada vial 1 microlitro de la sonda de
hidrólisis A5 (sonda TaqMan:
^{5'}-FAM-TTT AGC TTT TGG CTT
TAA TAC-TAMRA-^{3'}) a una
concentración 10 mM, que contiene un grupo F AM en el extremo 5' y
un grupo TAMRA en posición 3'. La sonda A5 hibrida con el genoma de
P. falciparum, pero no reconoce el producto amplificado de
otras especies de Plasmodium, como P. vivax, P.
malariae o P. ovale. Se prepararon diversos tubos de la
forma antes descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los
volúmenes adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que
se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se centrifugaron
durante 10 segundos a 4000 rpm en una centrífuga de mesa
(Eppendorf). Finalmente, se desecaron en un evaporador centrífugo
marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre
10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y
120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían
según el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica sobre
muestras de sangre de pacientes infectados con P.
falciparum, P. vivaz, P. ovale o P
malariae.
Para ello, se añadió a cada tubo 50 ng de los
DNAs problema en un volumen final de 20 microlitros. A
continuación se procedió a realizar los ciclos de incubación, que
constaban de una incubación inicial a 95°C durante 10 minutos, con
el objeto de conseguir la rehidratación de la mezcla desecada y
estabilizada, y a continuación, 45 ciclos de desnaturalización
(95°C, 10 segundos), anillamiento (55°C, 5 segundos), y extensión
(72°C, 10 segundos), con una razón de transición de temperatura de
20°C/segundo en todos los 5 casos, utilizando un termociclador
LightCycler (Roche). En paralelo, y para comprobar la evolución de
la actividad de los tubos desecados, se amplificaron muestras de
ADN utilizando una mezcla fresca, en las mismas condiciones de
amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se
analizó en todos los casos mediante visualización de la curva de
fluorescencia y determinación del "crossing point", siguiendo
las instrucciones del software del equipo, de cada uno de los tubos
de reacción, tanto frescos como estabilizados. Se observó, en
todos los casos, que aquellas mezclas estabilizantes que contienen
melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o
goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, presentan
máxima actividad, con un coeficiente de variación en el
"crossing point" del 2% con respecto a los valores obtenidos en
las mezclas frescas. Las muestras de pacientes infectados con P.
falciparum dieron, en todos los casos, resultados positivos,
mientras que los pacientes infectados con otras especies dieron, en
todos los casos, resultados negativos. Por el contrario, al
analizar los productos amplificados en gel de agarosa al 1,5%
teñida con bromuro de etidio, se observó que todas las muestras
incluidas presentaban una banda de amplificación de aproximadamente
750 pb. Estos resultados confirmaban que la reacción de
amplificación había funcionado correctamente en todos los casos, y
que la detección de P. falciparum había sido específica
(Tabla 1).
Para ensayar la eficiencia de sondas MB incluidas
en mezclas de reacción desecadas y estabilizadas se prepararon
mezclas de reacción para la amplificación de la misma región
descrita en el Ejemplo 1, utilizando los mismos reactivos descritos.
En este caso, se utilizó el equipo "DNA Engine OPTICON™ 2
System" (MJ Research). En tubos de amplificación de 0,2 ml con
tapa óptica, específicos para su uso en el sistema OPTICON se añadió
1 microlitro de ADN polimerasa (1 U/\mul) conservada en su
tampón de almacenamiento, 2,5 microlitros del tampón de reacción,
1 microlitro de una disolución que contiene en proporción
equimolar los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen
en la reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1
microlitro del cebador
A1(^{5'}-AGT GTG TAT CAA TCG AGT TTC-^{3'}) y 1 microlitro del cebador A2 (^{5'}-CGC AGT TGT TTG TCT CCA
A1(^{5'}-AGT GTG TAT CAA TCG AGT TTC-^{3'}) y 1 microlitro del cebador A2 (^{5'}-CGC AGT TGT TTG TCT CCA
\hbox{GAA- ^{3'} ),} ambos a una
concentración 10 \muM. Asimismo se añadió a cada vial 1
microlitro de la sonda MB A6(^{5'}-F-CCT GCT GTA ACT ATT CTA GGG GAA CTG CAG G-DABCYL-^{3'}) a una concentración 10 \muM, que contiene un grupo Fluoresceína (F en la secuencia) en el extremo 5' y un grupo DABCYL en el extremo 3' que actúa como quencher. Los 5 primeros nucleótidos son complementarios a los 5 últimos (marcados en negrita en la secuencia), lo que permite que el oligo adquiera una configuración en horquilla, que permite la aproximación espacial del grupo fluoresceína al quencher, inhibiendo así la emisión de fluorescencia. En presencia de la secuencia específica amplificada por los otros dos oligonucleótidos (A1 y A2) presentes en la mezcla de reacción, la región central de 21 pb del oligonucleótido A6 hibrida con los amplicones rompiendo así la estructura en horquilla y permitiendo la emisión de fluorescencia por el grupo fluoresceína, al separarse espacialmente del grupo DABCYL. La región central de la sonda A6 hibrida con el genoma de P falciparum, pero no reconoce el producto amplificado de otras especies de Plasmodium, como P. vivax, P. malariae o P. ovale.
Se prepararon diversos tubos de la forma antes
descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes
adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen
en la Tabla 1. Finalmente, se desecaron en un evaporador centrífugo
marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre
10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y
120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían
según el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica
sobre muestras de sangre de pacientes infectados con P
falciparum, P vivaz, P ovale o P
malariae.
Para ello, se añadió a cada tubo 50 ng de los
DNAs problema en un volumen final de 25 microlitros. A
continuación se procedió a realizar los ciclos de incubación, que
constaban de una incubación inicial a 95°C durante 10 minutos, para
garantizar la rehidratación de la mezcla desecada y estabilizada,
y a continuación, 45 ciclos de desnaturalización (95°C, 30
segundos), anillamiento (55°C, 30 segundos), y extensión (72°C, 30
segundos), utilizando un equipo "DNA Engine OPTICON™ 2
System". En paralelo, y para comprobar la evolución de la
actividad de los tubos desecados, se amplificaron muestras de ADN
utilizando una mezcla fresca, en las mismas condiciones de
amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se
analizó en todos los casos mediante visualización de la curva de
fluorescencia y determinación del "crossing point", siguiendo
las instrucciones del software del equipo, de cada uno de los tubos
de reacción, tanto frescos como estabilizados. Se observó, en
todos los casos, que aquellas mezclas estabilizantes que contienen
melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o
goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, presentan
máxima actividad, con un coeficiente de variación en el
"crossing point" del 2% con respecto a los valores obtenidos en
las mezclas frescas. Las muestras de pacientes infectados con
P. falciparum dieron, en todos los casos, resultados
positivos, mientras que los pacientes infectados con otras especies
dieron, en todos los casos, resultados negativos. Por el contrario,
al analizar los productos amplificados en gel de agarosa al 1,5%
teñida con bromuro de etidio, se observó que todas las muestras
incluidas presentaban una banda de amplificación de aproximadamente
750 pb. Estos resultados confirmaban que la reacción de
amplificación había funcionado correctamente en todos los casos, y
que la detección de P. falciparum había sido específica
(Tabla 1).
Para ensayar la eficiencia de sondas Scorpion
incluidas en mezclas de reacción desecadas y estabilizadas se
prepararon mezclas de reacción para la amplificación de una región
de 125 pb del gen rpo de Mycobacterium tuberculosis,
utilizando un equipo LightCycler y los mismos reactivos descritos
en el Ejemplo 1. A cada tubo de reacción capilar, específicos para
su uso en el sistema LightCycler System (Roche Applied Science,
Mannheim, Germany). En tubos de reacción capilares, específicos para
su uso en el sistema LightCycler System (Roche Applied Science,
Mannheim, Germany) se añadió 1 microlitro de dicha enzima ADN
polimerasa (1 U/\mul) conservada en su tampón de almacenamiento,
2 microlitros del tampón de reacción, 1 microlitro de una
disolución que contiene en proporción equimolar los cuatro
desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de
amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y 1 microlitro del
cebador A7(^{5'}-GAC AGC GAG CCG ATC AGA
CCG-^{3'}) a una concentración 10\muM. Asimismo
se añadió a cada vial 1 microlitro del cebador A8 (sonda Scorpion:
^{5'}-FAM-CCGCGACGGACCTCCAGCCCGGCACGCTGGCGCT
MR HEG CCCGGCGGTCTGTCACGTG-3') a una concentración
10 mM, que contiene un grupo FAM en posición 5', un grupo "methyl
red" (MR) unido a la posición 1 de la desoxirribosa de un
nucleótido central y un grupo hexetilenglycol (HEG) que actúa como
inhibidor de la elongación.
Se prepararon diversos tubos de la forma antes
descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes
adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen
en la Tabla 1. Los tubos así preparados se centrifugaron durante 10
segundos a 4000 rpm en una centrífuga de mesa (Eppendorf).
Finalmente, se desecaron en un evaporador centrífugo marca
Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y
60°C, durante un periodo tiempo comprendido entre 30 y 120
minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según
el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica
sobre muestras de sangre de pacientes infectados con M tuberculosis
y muestras de pacientes no infectados.
Para ello, se añadió a cada tubo 50 ng de DNA
problema en un volumen final de 20 microlitros. A continuación se
procedió a realizar los ciclos de incubación, que constaban de una
incubación inicial a 95°C durante 10 minutos, y, a continuación, 45
ciclos de desnaturalización (95°C, 10 segundos), anillamiento
(55°C, 5 segundos), y extensión (72°C, 10 segundos), con una razón
de transición de temperatura de 20°C/segundo en todos los casos,
utilizando un termociclador LightCycler (Roche). En paralelo, y para
comprobar la evolución de la actividad de las mezclas de reacción
desecadas y estabilizadas, se amplificaron muestras de ADN
utilizando una mezcla fresca, en las mismas condiciones de
amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se
analizó en todos los casos mediante visualización de la curva de
fluorescencia y determinación del "crossing point", siguiendo
las instrucciones del software del equipo, de cada uno de los tubos
de reacción, tanto frescos como estabilizados. Se observó, en
todos los casos, que aquellas mezclas estabilizantes que contienen
melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y glucógeno o
goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno, presentan
máxima actividad, con un coeficiente de variación en el
"crossing point" del 2% con respecto a los valores obtenidos en
las mezclas frescas (Tabla 1). Las muestras de pacientes
infectados con M tuberculosis dieron, en todos los casos,
resultados positivos, mientras que las muestras de donantes sanos
dieron, en todos los casos, resultados negativos.
Para ensayar la eficiencia de fluoróforos
intercalantes, como SYBR Green, incluidos en mezclas de reacción
desecadas y estabilizadas se prepararon mezclas de reacción para la
amplificación de un fragmento de 250 pb correspondiente a la región
E6-E7 de papilomavirus oncogénicos, utilizando los
reactivos descritos en el Ejemplo 1. En este caso, se utilizó el
equipo "DNA Engine OPTICON™ 2 System" (MJ Research). En tubos
de amplificación de 0,2 ml con tapa óptica, específicos para su uso
en el sistema OPTICON se añadió 1 microlitro de ADN polimerasa (1
U/\mul) conservada en su tampón de almacenamiento, 2,5
microlitros del tampón de reacción, 1 microlitro de una disolución
que contiene en proporción equimolar los cuatro
desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de
amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 microlitro del
cebador A9
(^{5'}-TGTCAAAAACCGTTGTGTCC-^{3'})
y 1 microlitro del cebador A10
(^{5'}-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-^{3'})
ambos a una concentración 10 \muM. Asimismo se añadió a cada
vial 0,3 microlitros de SYBR Green 1 (Molecular Probes).
Se prepararon diversos tubos de la forma antes
descrita, y a cada uno de ellos se le añadieron los volúmenes
adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen
en la Tabla 1. Finalmente, se desecaron en un evaporador centrífugo
marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre
10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y
120 minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían
según el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1 . Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica sobre
muestras de sangre de pacientes infectados con papilomavirus
oncogénicos o no oncogénicos.
A continuación se procedió a realizar los ciclos
de incubación, que constaban de una incubación inicial a 95°C
durante 10 minutos, y, a continuación, 45 ciclos de
desnaturalización (95°C, 30 segundos), anillamiento (55°C, 30
segundos), y extensión (72°C, 30 segundos), utilizando un equipo
"DNA Engine OPTICON™ 2 System". En paralelo, y para comprobar
la evolución de la actividad de los tubos desecados, se
amplificaron muestras de ADN utilizando una mezcla fresca, en las
mismas condiciones de amplificación.
El resultado de la reacción de amplificación se
analizó en todos los casos mediante visualización de la curva de
fluorescencia y determinación del "crossing point", siguiendo
las instrucciones del software del equipo, de cada uno de los tubos
de reacción, tanto frescos como desecados y estabilizados. Se
observó, en todos los casos, que aquellas mezclas estabilizantes
que contienen melezitosa o palatinitol, en conjunción con lisina y
glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa con betaína y glucógeno,
presentan máxima actividad, con un coeficiente de variación en el
"crossing point" del 2% con respecto a los valores obtenidos
en las mezclas frescas. Las muestras de pacientes infectados con
especies de HPV oncogénicas dieron, en todos los casos, resultados
positivos, mientras que las muestras de los pacientes infectados
con especies de HPV no-oncogénicas, o no infectados
con HPV, dieron en todos los casos resultados negativos.
Confirmando estos resultados, al analizar los productos
amplificados en gel de agarosa al 1,5% teñida con bromuro de etidio,
se observó que únicamente las muestras de pacientes infectados con
HPV oncogénico presentaban una banda de amplificación de
aproximadamente 250 pb. Estos resultados confirmaban que la
reacción de amplificación había funcionado correctamente en todos
los casos, y que la detección de especies de HPV oncogénicas había
sido específica (Tabla 1).
Un hecho especialmente llamativo fue el nivel de
reproducibilidad encontrado al realizar las reacciones de
amplificación con mezclas de reacción desecadas y estabilizadas,
observándose que los perfiles de fluorescencia durante el proceso de
amplificación prácticamente se superponían en dos muestras
ensayadas, mientras que las reacciones realizadas utilizando una
mezcla fresca de la misma composición rendía una mayor
variabilidad. Por otro lado, si bien las gráficas de los reactivos
de las mezclas desecadas y estabilizadas presentaban un perfil más
tumbado, especialmente en las fase final del proceso de
amplificación, los datos de "crossing point" fueron
prácticamente iguales que los obtenidos en las mezclas
frescas.
Finalmente el mantenimiento de la actividad en
las mezclas de reacción desecadas y estabilizadas que incluían la
actividad Taq polimerasa y el intercalante SYBR green, durante un
periodo de hasta un mes garantiza que, en las condiciones de
estabilización utilizadas, la coexistencia de ambas moléculas no
conlleva una pérdida de actividad de la Taq polimerasa.
Para comprobar la posibilidad de gelificar
mezclas de reacción de secuenciación de ácidos nucleicos se
utilizó el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing (DTCS)
Quick Start Kit (Beckman Coulter), que utiliza un sistema de
secuenciación por PCR en un solo tubo, mediante incorporación de 4
terminadores fluorescentes diferentes. Las reacciones de
secuenciación se analizaron posteriormente en el equipo de
secuenciación automática por electroforesis capilar CEQ 2000 XL DNA
Análisis System (Beckman Coulter).
Se prepararon mezclas de reacción que contenían 4
microlitros de DTCS Quick Start Master Mix, 1 microlitro de primer
universal M13 -47 y los volúmenes adecuados de cada una de las
mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así
preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca Eppendorf
modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y 60°C,
durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120 minutos.
Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según el volumen
final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica sobre
un plásmido pONC, que contiene clonado un fragmento de 250 pb del
genoma de papilomavirus humano en el poli-linker
del plásmido pBluescript II SK (-) siguiendo las instrucciones del
kit de secuenciación.
A continuación se procedió a realizar los ciclos
de incubación, que constaban de una incubación inicial a 95°C
durante 10 minutos, y a continuación, 30 ciclos de
desnaturalización (96°C, 20 segundos), anillamiento (55°C, 20
segundos), y extensión (60°C, 4 minutos), utilizando un
termociclador Minicycler (MJ Reasearch). En paralelo, y para
comprobar la evolución de la actividad de los tubos desecados y
estabilizados, se secuenció el mismo plásmido utilizando una
mezcla de secuenciación fresca en condiciones estándar.
Finalmente, las reacciones de secuenciación se analizaron en el
equipo CEQ 2000XL siguiendo las instrucciones del proveedor.
Los datos obtenidos reflejan que aquellas mezclas
estabilizantes que contienen melezitosa o palatinitol, en
conjunción con lisina y glucógeno o goma arábiga, o bien rafinosa
con betaína y glucógeno, fueron eficientes en las reacciones de
secuenciación. La comparación de las secuencias obtenidas con las
mezclas desecadas y estabilizadas y las mezclas de secuenciación
estándar reflejó que el rendimiento de las reacciones fue muy
similar. Así, el número de bases leídas con el sistema desecado y
estabilizado (638) fue similar al obtenido al utilizar el sistema
estándar (686). Con respecto al porcentaje de coincidencia con la
secuencia teórica, éste se analizó en las 593 bases coincidentes en
ambas lecturas, encontrándose que el comportamiento de la mezcla
desecada y estabilizada y de la mezcla estándar fue similar. Así,
el porcentaje de homología de la secuencia obtenida con la mezcla
desecada y estabilizada con respecto a la secuencia teórica fue de
572/593 (96,5%) de las bases analizadas y de 577/593 (97%) para la
mezcla estándar.
Estos resultados confirman que la estabilización
de mezclas de reacción con cuatro fluoróforos simultáneamente es
posible, sin que se vea afectada la funcionalidad del sistema.
Se analizó la posibilidad de estabilizar mezclas
de reacción que contuvieran oligonucleótidos químicamente
modificados por inclusión de grupos biotina y/o digoxigenina, y su
funcionalidad como cebadores en reacciones de amplificación génica,
así como la persistencia de su capacidad de unión a sus ligandos
(estreptoavidina y anticuerpos anti-digoxigenina,
respectivamente), habitualmente utilizados en ensayos de
colorimetría. Para ello, se diseñaron 4 oligonucleótidos que
hibridaban con el genoma de la región E6-E7 de
especies de HPV oncogénico. Dos de los oligonucleótidos,
A9(^{5'}-TGTCAAAAACCGTTGTGTCC-^{3'})
y
A11(^{5'}-Bio-TGTCAAAAACCGTTGTGTCC-^{3'}),
de polaridad positiva, eran idénticos en su secuencia, salvo que
uno de ellos (A11) incluía un grupo biotina (Bio en la secuencia)
en posición 5'. Los otros dos oligonucleótidos,
A10(^{5'}-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-^{3'})
y
A12(^{5'}-Dig-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-^{3'}), eran de polaridad inversa, y al igual que en el caso anterior la secuencia de nucleótidos de ambos era idéntica, salvo que uno de ellos (Al2) incluía un grupo digoxigenina (Dig en la secuencia) en posición 5'.
A12(^{5'}-Dig-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-^{3'}), eran de polaridad inversa, y al igual que en el caso anterior la secuencia de nucleótidos de ambos era idéntica, salvo que uno de ellos (Al2) incluía un grupo digoxigenina (Dig en la secuencia) en posición 5'.
Se prepararon 4 mezclas estabilizantes diferentes
según se describe a continuación. En tubos d e amplificación de
0,2 ml se añadió 1 microlitro de ADN polimerasa (1 U/\mul)
conservada en su tampón de almacenamiento, 5 microlitros del tampón
de reacción y 1 microlitro de una disolución que contiene en
proporción equimolar los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que
intervienen en la reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP,
dGTP y dTTP). A continuación se añadió 1 microlitro de cada cebador
a concentración 20 micromolar, siguiendo el siguiente esquema:
Mezcla estabilizante 1: Primer no modificado (A9)
+ Primer con digoxigenina (A12)
Mezcla estabilizante 2: Primer no modificado
(A10) + Primer con biotina (A11)
Mezcla estabilizante 3: Primer con digoxigenina
(A12) + Primer con biotina (A11)
Mezcla estabilizante 4: Primeros no modificados
(A9 + A10)
Los tubos así preparados se desecaron en un
evaporador centrifugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas
comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo
comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos
antes citados varían según el volumen final de mezcla a
desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
mediante la realización de la reacción de amplificación génica sobre
un plásmido pOnc, que contiene donado un fragmento de la región
E6-E7 de HPV 16, amplificada por la combinación de
cebadores A9 ó A11 + A10 ó A12. Para ello, se procedió a realizar
los ciclos de incubación, que constaban de una incubación inicial a
95°C durante 10 minutos, y, a continuación, 35 ciclos de
desnaturalización (95°C, 1 minuto), anillamiento (55°C, 1 minuto),
y extensión (72°C, 1 minuto), utilizando un termociclador Minicycler
(MJ Reasearch). Finalmente, las reacciones de amplificación se
analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%,
teñida con bromuro de etidio. La eficiencia de la reacción de
amplificación fue analizada por densitometría de las bandas
amplificadas utilizando un sistema Gelsuper (TDI).
Los resultados obtenidos demostraban que todas
las reacciones de amplificación en las que se utilizó uno o dos
oligonucleótidos marcados funcionaron correctamente, e incluso el
rendimiento final de la reacción fue mayor que el obtenido en
reacciones de amplificación realizadas con oligonucleótidos no
modificados.
Para ensayar el mantenimiento de la capacidad de
unión de los grupos biotina y digoxigenina, estabilizados por
desecación en presencia de una mezcla estabilizante, a los
ligandos habitualmente utilizados en ensayos de colorimetría
(estreptoavidina y anticuerpos anti-digoxigenina,
respectivamente), se realizó un ensayo en placa ELISA utilizando
los productos amplificados obtenidos en el Ejemplo 7.A.
Para ello, se activó una microplaca ELISA de alta
capacidad de unión (Costar) con estreptoavidina (Biospa) siguiendo
un protocolo estándar de fijación. A continuación y tras bloquear
la placa por incubación con gelatina, los productos amplificados de
las mezclas estabilizantes 1, 2 y 3 descritas en el Ejemplo 7.A se
analizaron por ensayo de colorimetría siguiendo el siguiente
esquema experimental:
A.- Productos de amplificación utilizando un
oligonucleótido marcado con digoxigenina (mezcla 1 en el Ejemplo
7.A): Se fijó la sonda biotinilada A11 a la placa y se hibridó el
producto amplificado. A continuación el híbrido se incubó con
anticuerpo-antidigoxigenina conjugada con fosfatasa
alcalina (Sigma), y se reveló colorimétricamente utilizando como
sustrato pNpp (Roche), analizándose los niveles de absorbancia a 415
nm con un equipo lector de placas (Beckman).
B.- Productos amplificados utilizando cebadores
marcados con biotina (mezcla 2 en el Ejemplo 7.A): Se fijó el
producto de amplificación a la placa a través del primer
biotinilado y a continuación se hibridó con el primer A12 marcado
con digoxigenina. Los resultados se analizaron según se describe
en el paso previo.
C.- Productos amplificados simultáneamenete con
cebadores marcados con biotina y digoxigenina (mezcla 3 en el
Ejemplo 7.A): Se fijó el producto de amplificación a la placa, a
través del primer biotinilado y directamente se incubó con el
conjugado anti-digoxigenina/PA, revelándose el
resultado según se describe en los apartados A y B de este
experimento.
En todos los casos, las reacciones de bloqueo de
placa, hibridación, lavados y revelado colorimétrico se realizaron
siguiendo el protocolo recomendado por el sistema de placas
DNA-Bind de Costar.
Los resultados del ensayo colorimétrico
demuestran que ambos grupos biotina y digoxigenina en las mezclas
de reacción desecadas y estabilizadas retienen su capacidad de
unión a estreptoavidina y anticuerpos
anti-digoxigenina respectivamente. Así, todos los
productos amplificados con primers modificados con biotina y
digoxigenina simultáneamente rendían una señal colorimétrica
intensa, reflejando la capacidad de unión del grupo biotina a la
estreptoavidina fijada en la placa, así como la unión de la
digoxigenina a su anticuerpo conjugado. Estos resultados se
confirmaron por aparición de señal colorimétrica en los productos
amplificados con biotina o digoxigenina, que dieron una señal
intensa al hibridar con su sonda específica. No se observaron
señales inespecíficas en pocillos no activados o al hibridar con
primers no específicos al producto amplificado.
Finalmente, al repetir el experimento de análisis
colorimétrico sobre amplificaciones de diluciones seriadas del
plásmido pOnc, utilizando la mezcla estabilizante 1 descrita en el
Ejemplo 7.A (amplificación con un oligonucleótido marcado con
digoxigenina) y analizado según se describe en este apartado, se
confirma que la utilización de primers marcados con biotina o
digoxigenina y estabilizados por desecación mantienen perfectamente
su capacidad de amplificación y unión a ligandos, pudiendo ser
utilizados en ensayos colorimétricos, obteniéndose un buen nivel
de reproducibilidad en diferentes experimentos (Tabla 1).
Se analizó la posibilidad de estabilizar
diferentes conjugados, como estreptoavidina conjugada con HRP
(Str-HRP) y anti-digoxigenina
conjugada con fosfatasa alcalina
(anti-DIG-PA) implicados en análisis
colorimétricos.
En tubos de 0,2 ml se añadieron 100 microlitros
de una dilución 1/250 en solución de bloqueo del conjugado
Str-HRP (Biospa). Por otro lado y en paralelo se
prepararon viales de 0,2 m1 en los que se añadió 100 microlitros de
una dilución 1/250 en solución de bloqueo de
anti-DIG-PA (Sigma). A cada uno de
los viales se les añadió los volúmenes adecuados de cada una de
las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos
así preparados se desecaron en un evaporador centrífugo marca
Eppendorf modelo 5301, a temperaturas comprendidas entre 10°C y
60°C, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 120
minutos. Las temperaturas y los tiempos antes citados varían según
el volumen final de mezcla a desecar.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se resuspendieron los tubos
desecados y estabilizados en 100 microlitros de H_{2}O destilada
estéril y se ensayó su actividad mediante la realización de la
reacción de detección colorimétrica en placa ELISA de productos
amplificados de HPV oncogénico (HPV 16), obtenidos por
amplificación del plásmido pOnc utilizando primers marcados con
digoxigenina (A12) y biotina (A11), utilizando una mezcla de
reacción desecada y estabilizada según se describe en el Ejemplo
7.A, mezcla estabilizante 3.
Para el ensayo de actividad del conjugado
anti-DIG-PA, se utilizo una placa
ELISA en la que los pocillos habían sido previamente recubiertos
por estreptoavidina. Por el contrario, para el ensayo de actividad
del conjugado Str-HRP, se utilizó una placa, cuyos
pocillos habían sido recubiertos previamente con anticuerpos
anti-DIG. Los productos amplificados fueron
incubados en cada placa para permitir la inmovilización de los
amplicones en la placa. Finalmente, se añadió a cada placa el
conjugado a ensayar y se reveló utilizando como sustrato de la
reacción pNpp en el caso de la actividad PA, o para la actividad
HRP. Finalmente los resultados se analizaron en un lector de placas,
midiendo la absorbancia a 405 nm.
Los resultados obtenidos fueron positivos en
todas las muestras desecadas y estabilizadas y similares a los
obtenidos al utilizar ambos conjugados en formato estándar no
desecado. Estos datos confirman que tanto la estreptoavidina, como
los anticuerpos anti-DIG conservaban su capacidad
de unión a sus ligandos específicos (biotina y digoxigenina,
respectivamente). Por otro lado, se confirmaba el mantenimiento de
la actividad enzimática de la peroxidasa y fosfatasa alcalina
conjugadas (Tabla 1).
Se analizó la posibilidad de sintetizar sondas
marcadas con grupos biotina o digoxigenina, para su posterior
ensayo en experimentos de hibridación molecular. Para ello, se
prepararon tubos de 0,2 ml en los que se añadieron 1 microlitro de
ADN polimerasa (1 U/\mul) conservada en su tampón de
almacenamiento, 5 microlitros del tampón de reacción, 1 microlitro
de una disolución que contiene en proporción equimolar los cuatro
desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la reacción de
amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1 microlitro del
cebador A10, a una concentración 20 \muM y del cebador A9 a una
concentración de 0,2 \muM. La concentración de los cebadores
específicos de HPV oncogénico, se desaparearon en un factor de 100
veces, con el objeto de realizar una amplificación asimétrica, en
la que se generara un exceso de una de las bandas (la banda
primada por el cebador A9) en estructura de banda simple, que
pudiera ser posteriormente utilizada como sonda de hibridación. A
simismo s e añadió a cada vial 0,3 microlitros de dUTP marcado con
digoxigenina.
A cada uno de los viales se le añadió los
volúmenes adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que
se recogen en la Tabla 1. Los tubos así preparados se desecaron en
un evaporador centrífugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas
comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo
comprendido entre 30 y 120 minutos. Las temperaturas y los tiempos
antes citados varían según el volumen final de mezcla a
desecar.
Tras su desecación, se añadió a cada tubo 10
picogramos de plásmido pOncl y se ajustó el volumen a 50
microlitros con H_{2}O destilada estéril. A continuación, se
procedió a realizar los ciclos de amplificación, que constaban de
una incubación inicial a 95°C durante 10 minutos, y, a
continuación, 35 ciclos de desnaturalización (95°C, 1 minuto),
anillamiento (55°C, 1 minuto), y extensión (72°C, 1 minuto),
utilizando un termociclador Minicycler (MJ Reasearch).
A cada uno de los tubos amplificados se le
añadieron los volúmenes adecuados de cada una de las mezclas
estabilizantes que se recogen en la Tabla 1. Los tubos así
preparados se centrifugaron durante 10 segundos a 4000 rpm en una
centrífuga de mesa (Eppendorf). Finalmente, se desecaron en un
evaporador centrifugo marca Eppendorf modelo 5301, a temperaturas
comprendidas entre 10°C y 60°C, durante un periodo de tiempo
comprendido entre 30 y 120 minutos.
Tras su desecación, los tubos fueron conservados
a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse
los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su actividad
utilizándolos como sondas para la detección por hibridación
molecular de secuencias específicas de HPV 16. Para ello, se
resuspendieron en 50 microlitros de H_{2}O destilada estéril, y
se añadieron a una placa ELISA a la que se había fijado previamente
el oligonucleótido A11(específico de HPV 16 y de polaridad
opuesta a la banda asimétrica obtenida en la reacción de
amplificación). La placa se incubó a continuación durante 30
minutos a 45°C y se reveló posteriormente tras incubar con el
conjugado anti-DIG-PA, siguiendo
las instrucciones del protocolo de hibridación recomendado en las
placas DNA-Bind.
Los resultados obtenidos fueron positivos en
todos los casos. Este experimento demostraba la posibilidad de
realizar reacciones de incorporación de nucleótidos marcados con
digoxigenina, utilizando mezclas desecadas que incluían dichos
nucleótidos. Asimismo se confirmaba la posibilidad de estabilizar
los productos amplificados y marcados con digoxigenina, y su
posterior utilización como sondas de hibridación molecular (Tabla
1).
Para ensayar la posibilidad de estabilizar ácidos
nucleicos previamente inmovilizados en microplacas ELISA para la
posterior realización de ensayos colorimétricos o fluorescentes,
se utilizaron las placas NucleoLink (Costar), que han sido
especialmente diseñadas para la inmovilización de biomoléculas en
un plástico especialmente tratado y que manteniendo un alto nivel
de transparencia, lo que permite su utilización en ensayos de
colorimetría, es asimismo resistente a temperaturas elevadas. Estas
características le hacen susceptibles de su utilización en
reacciones de amplificación génica y posterior ensayo
colorimétrico.
Se fijó a los pocillos de la placa el cebador A13
(^{5'}-P-GAGCTGTCGCTTAATTGCTC-^{3'})
complementario al genoma de HPV, fosforilado en el extremo 5' (P
en la secuencia) para permitir su fijación a los pocillos. La
fijación de la sonda se realizó siguiendo el protocolo recomendado
por el distribruidor de las placas NucleoLink. Una vez fijada la
sonda, se incluyó en cada pocillo, una mezcla que constaba de 1
microlitro de ADN polimerasa (1 U/\mul) conservada en su tampón
de almacenamiento, 5 microlitros del tampón de reacción, 1
microlitro de una disolución que contiene en proporción equimolar
los cuatro desoxirribonucleótidos (dNTPs) que intervienen en la
reacción de amplificación de ADN (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 1
microlitro del cebador A9 a una concentración 20 \muM.
Finalmente se añadió a cada pocillo los volúmenes adecuados de cada
una de las mezclas estabilizantes que se recogen en la Tabla
1.
Las placas así preparadas se desecaron en una
estufa de vacío Memmert (Modelo VO400) a 25°C y 50 mbar de presión
durante 1 hora y 30 minutos. Tras su desecación, los tubos fueron
conservados a las temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1.
Al cumplirse los tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó su
funcionalidad mediante la realización de una reacción de
amplificación. Para ello, se añadió a cada pocillo 50 microlitros
de una dilución de 0,5 pmol/microlitro de plámido pOnc. La reacción
de amplificación se llevó a cabo mediante los siguientes ciclos:
una incubación inicial a 95°C durante 10 minutos, y, a
continuación, 35 ciclos de desnaturalización (95°C, 1 minuto),
anillamiento (55°C, 1 minuto), y extensión (72°C, 1 minuto),
utilizando un termociclador Minicycler (MJ Reasearch).
Una vez realizada la reacción de amplificación se
procedió a realizar el ensayo de detección colorimétrica de la
banda amplificada y fijada en el sustrato sólido, siguiendo el
protocolo recomendado por el fabricante de las placas NucleoLink. El
oligonucleótido utilizado como sonda de hibridación fue el Al 1,
marcado con biotina. El conjugado utilizado fue
estreptoavidina-HRP, y el sustrato ABTS.
El análisis de los resultados demostró que las
placas retenían su capacidad de amplificación, lo que indicaba la
correcta estabilización de la sonda inmovilizada. Asimismo se
comprobaba que la inclusión de la mezcla de estabilización no
interfería en los posteriores ensayos colorimétricos (Tabla
1).
Para ensayar la posibilidad de estabilizar
proteínas previamente inmovilizadas en microplacas ELISA para la
posterior realización de ensayos colorimétricos o fluorescentes,
se utilizaron al igual que en el Ejemplo 10.1 las placas NucleoLink
(Costar). Para ello, se incubó cada pocillo con 1\mug de
anticuerpo anti-digoxigenina (Roche). Tras incubar
durante 30 minutos a 37°C, se añadió a cada pocillo los volúmenes
adecuados de cada una de las mezclas estabilizantes que se recogen
en la Tabla 1.
Las placas así preparadas se desecaron en una
estufa de vacío Memert a 25°C y 50 mbar de presión durante 1 hora y
30 minutos. Tras su desecación, los tubos fueron conservados a las
temperaturas y tiempos indicados en la Tabla 1. Al cumplirse los
tiempos indicados en la Tabla 1, se ensayó la estabilidad del
anticuerpo inmovilizado mediante un ensayo de colorimetría.
Un producto de amplificación del genoma de HPV,
amplificado con el par de primers A12 (marcado con digoxigenina en
el extremo 5') y A11 (marcado con biotina en el extremo 5'). El
producto amplificado se incubó durante 30 minutos en los pocillos
con el anticuerpo inmovilizado. Las productos amplificados
inmovilizados en la placa a través de la unión del grupo
digoxigenina de los amplicones y el anticuerpo
anti-digoxigenina inmovilizado, se analizó mediante
ensayo colorimétrico. Para ello, se incubó cada pocillo con
estreptoavidina conjugada con HRP, y se reveló tras lavados con
ABTS. La reacción colorimétrica se analizó finalmente mediante
medida de absorción a 415 nm.
El análisis de los resultados demostró que el
anticuerpo inmovilizado en la placa retenía su capacidad de
reconocimiento y unión del grupo digoxigenina, lo que indicaba la
correcta estabilización de la proteína inmovilizada. Asimismo se
comprobaba que la inclusión de la mezcla de estabilización no
interfería en los posteriores ensayos colorimétricos (Tabla
1).
Para ensayar la posibilidad de estabilizar ácidos
nucleicos previamente inmovilizados en soportes de vidrio
pre-tratados, el formato habitual del sistema de
microarrays, se ensayaron dos alternativas diferentes:
Estrategia 1. Estabilización de soportes con
ácidos nucleicos ya fijados: Se fijaron sondas específicas de HPV
a portas de vidrio pre-tratados con
poli-lisina, aldehído, epoxi,
super-epoxi y silano. Para ello, se aplicaron en
cada porta spots de 1 microlitro de la solución de cada
oligonucleótido a una concentración de 20 \muM, en las condiciones
indicadas para cada formato de vidrio. Los portas con los
oligonucleótidos inmovilizados fueron a continuación recubiertos
con una fina película de cada una de las mezclas estabilizantes y
desecados en una estufa de vacío a 25°C y 50 mbar de presión.
Finalmente, los portas recubiertos con la fina película desecada
se almacenaron en las condiciones y durante los tiempos indicados
en la Tabla 1.
Estrategia 2. Fijación a los portas de ácidos
nucleicos premezclados con las mezclas estabilizantes: Se preparó
una mezcla de cada una de las sondas, con los volúmenes adecuados
de las mezclas estabilizantes descritas en la Tabla 1. A
continuación se aplicaron las mezclas de oligonucleótidos a los
diferentes portas utilizando las condiciones de fijación indicadas
para cada formato de vidrio. Finalmente, los portas se secaron al
vacío en las condiciones anteriormente descritas. Tras la
desecación de los portas, éstos se almacenaron en las condiciones
y durante los tiempos indicados en la Tabla 1.
Para ensayar la viabilidad de cada uno de los
portas preparados, se realizó un ensayo colorimétrico con
formación de productos precipitantes. Para ello, los portas se
lavaron durante 5 minutos en PBS 1X a temperatura ambiente con el
objeto de eliminar la superficie protectora. A continuación, se
incubaron los portas en presencia de un producto amplificado y
previamente desnaturalizado de HPV 16 utilizando las sondas A11 y
A12. A continuación los portas se incubaron con el conjugado
estreptoavidina-HRP y se reveló con DAB.
El análisis de los resultados demostró que los
oligonucleótidos inmovilizados en los portas, cualquiera que fuera
su formato, y tanto cuando se utilizaba la estrategia de
estabilización del porta completo, como la estabilización de los
oligonucleótidos previamente a su aplicación, retenían su capacidad
de reconocimiento y unión a secuencias complementarias de ácidos
nucleicos. Asimismo se comprobó que la inclusión de la mezcla de
estabilización no interfería en los posteriores ensayos
colorimétricos (Tabla 1).
Para ensayar la posibilidad de estabilizar
proteínas previamente inmovilizadas en soportes de vidrio
pre-tratados, el formato habitual del sistema de
microarrays, se ensayaron al igual que en el experimento previo
dos alternativas diferentes:
Estrategia 1. Estabilización de soportes con
proteína previamente fijados: Se fijaron anticuerpos
anti-digoxigenina a portas de vidrio
pre-tratados con aldehído. Para ello, se aplicaron
en cada porta spots de 1 microlitro de la solución de la proteína a
una concentración de 30 ng/\mul. Los portas con la proteína
inmovilizada fueron a continuación recubiertos con una fina
película de cada una de las mezclas estabilizantes y desecados en
una estufa de vacío a 25°C y 50 mbar. Finalmente, los portas
recubiertos con la fina película desecada se almacenaron en las
condiciones y durante los tiempos indicados en la Tabla 1.
Estrategia 2. Fijación a los portas de la
proteína premezclada con las mezclas estabilizantes: Se preparó
una mezcla de cada una de las sondas, con los volúmenes adecuados de
las mezclas estabilizantes descritas en la Tabla 1. A continuación
se aplicaron las mezclas de proteína al porta tratado con
aldehído. Finalmente, los portas se secaron al vacío en las
condiciones anteriormente descritas. Tras la desecación de los
portas, éstos se almacenaron en las condiciones y durante los
tiempos indicados en la Tabla 1.
Para ensayar la viabilidad de cada uno de los
portas preparados se realizó un ensayo colorimétrico con formación
de productos precipitantes. Para ello, los portas se lavaron
durante 5 minutos en PBS 1X a temperatura ambiente con el objeto de
eliminar la superficie protectora. A continuación, se incubaron
los portas en presencia de un producto amplificado y sin
desnaturalizar de P. falciparum utilizando las sondas A11
(marcada con biotina en el extremo 5') y A12 (marcada con
digoxigenina en el extremo 5'). A continuación los portas se
incubaron con el conjugado estreptoavidina-HRP, y se
reveló con DAB.
El análisis de los resultados demostró que los
anticuerpos anti-digoxigenina inmovilizados en los
portas, tanto si se utilizaba la estrategia de estabilización del
porta completo, como la estabilización de la proteína previamente a
su aplicación, retenían su capacidad de reconocimiento y unión del
grupo digoxigenina. Asimismo se comprobó que la inclusión de la
mezcla de estabilización no interfería en los posteriores ensayos
colorimétricos (Tabla 1).
Los resultados se expresan como: Ng, resultado
negativo; +, positivo débil, por debajo del 50% de actividad de la
mezcla fresca; ++, positivo entre el 50-90% de la
actividad obtenida en la mezcla fresca; y +++, positivo con nivel
de actividad no inferior al 90% de la actividad de la mezcla
fresca.
PVP: polivinilpirrolidona. PEG: polietilenglicol;
G. arábiga: goma arábiga
| Mezcla | Ejemplos | ||||||||||||
| T(°C) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 9 | 10.1 | 10.2 | 10.3 | 10.4 | |
| Sucrosa | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Rafinosa | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Palatinitol | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Melezitosa | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Glicerol | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
TABLA 1
(continuación)
| Mezcla | Ejemplos | ||||||||||||
| T(°C) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 9 | 10.1 | 10.2 | 10.3 | 10.4 | |
| Lisina | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Glucógeno | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Trehalosa | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Sorbitol | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Trehalosa+ | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| Lisina | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Trehalosa + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| PVP | 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Sorbitol + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| PEG | 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Rafinosa + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| betaína | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Melezitosa + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| lisina | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Melezitosa + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| glucógeno | 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Mezcla | Ejemplos | ||||||||||||
| T(°C) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 9 | 10.1 | 10.2 | 10.3 | 10.4 | |
| Lisina + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| glucógeno | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | |
| Melezitosa + | 4 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| lisina + | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| PEG | 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Melezitosa + | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| lisina + | 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| PVP | 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Melezitosa + | 4 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| lisina + | 25 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| dextrano | 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Melezitosa + | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| lisina + | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| glucógeno | 45 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Melezitosa + | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| lisina+G. | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| arábiga | 45 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| Melezitosa+ | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| betaína+ | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| glucógeno | 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Rafinosa+ | 4 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| betaína+ | 25 | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
| glucógeno | 45 | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng | Ng |
| Melezitosa+ | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| glucógeno+ | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| trehalosa+lisina | 45 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| Melezitosa+ | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| G.arábiga+ | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| trehalosa+lisina | 45 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| Mezcla | Ejemplos | ||||||||||||
| T(°C) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 9 | 10.1 | 10.2 | 10.3 | 10.4 | |
| Palatinitol + | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| glucógeno+ | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| trehalosa+lisina | 45 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| Palatinitol+ | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| G.arábiga+ | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| trehalosa+lisina | 45 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| Rafinosa+ | 4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
| glucógeno + | 25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| betaína | 45 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
Claims (43)
1. Una composición estabilizada que
comprende:
- (i)
- un componente (A) seleccionado del grupo formado por:
- -
- un compuesto que comprende un fluoróforo (componente A1),
- -
- un compuesto que comprende un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A2),
- -
- una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente (componente A3),
- -
- un conjugado que comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A4),
- -
- uno o más compuestos unidos a un soporte sólido (componente A5),
- -
- sus mezclas; y
- (ii)
- un componente (B) constituido por una mezcla estabilizante que comprende
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3).
2. Composición según la reivindicación 1, que
comprende, además, un componente seleccionado entre agua, enzimas,
reactivos para las reacciones en las que intervienen tales enzimas
y mezclas de los mismos.
3. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, que comprende, además de los componentes
(A) y (B), una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos, junto con la totalidad o parte de los componentes
necesarios para la realización de dicha reacción de polimerización
de ácidos nucleicos.
4. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el grado de humedad es igual
o inferior al 30%, preferentemente, comprendido entre 1% y
20%.
5. Composición según la reivindicación 1, que
comprende un componente A1, A2, A3 o A4.
6. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A1 comprende un compuesto fluorescente; un
nucleótido marcado con un fluoróforo; un oligonucleótido que
contiene un fluoróforo y, opcionalmente, un compuesto modulador de
la fluorescencia (quencher); un polinucleótido que contiene un
fluoróforo y, opcionalmente, un compuesto modulador de la
fluorescencia (quencher); un péptido marcado con un fluoróforo; una
proteína marcada con un fluoróforo; un antígeno marcado con un
fluoróforo; o un anticuerpo marcado con un fluoróforo.
7. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A2 se selecciona entre un compuesto que
comprende biotina, ficoeritrina, digoxigenina, un anticuerpo, un
péptido, una proteína, un ácido nucleico o un compuesto susceptible
de ser fijado por adsorción o por unión covalente.
8. Composición según la reivindicación 7, en la
que dicho componente A2 se selecciona entre un anticuerpo unido a
biotina o ficoeritrina, un antígeno unido a biotina o
ficoeritrina, un oligonucleótido unido a digoxigenina y un
polinucleótido unido a digoxigenina.
9. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A3 comprende una actividad enzimática
seleccionada entre las actividades peroxidasa y fosfatasa
alcalina.
10. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A3 comprende una actividad enzimática
seleccionada entre las actividades
\beta-D-galactosidasa, xantina
oxidasa, glucosa oxidasa, luciferasa, proteína verde fluorescente
(GFP), peroxidasa y fosfatasa alcalina.
11. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A4 comprende un conjugado
avidina-actividad enzimática susceptible de
catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, un conjugado
estreptavidina-actividad enzimática susceptible de
catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente, o un conjugado
antidigoxigenina-actividad enzimática susceptible de
catalizar una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente.
12. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente A5 comprende un soporte sólido que contiene
uno o más compuestos inmovilizados sobre dicho soporte sólido,
susceptible de ser utilizado como componente de sistemas de
detección fluorimétricos, colorimétricos,
quimio-luminiscentes, de análisis de conductividad
eléctrica o de análisis de cambios de índice de refracción.
13. Composición según la reivindicación 12, en la
que dicho soporte sólido se selecciona entre soportes sólidos de
plástico, vidrios y superficies de oro, opcionalmente tratados
para permitir la adsorción o unión covalente de macromoléculas.
14. Composición según la reivindicación 12, en la
que dicho compuesto o compuestos inmovilizados sobre dicho soporte
sólido comprenden biomoléculas.
15. Composición según la reivindicación 14, en la
que dichas biomoléculas se seleccionan entre ácidos nucleicos y
proteínas.
16. Composición según la reivindicación 12, en la
que dicho componente A5 se selecciona entre microplacas de pocillos
ELISA, chips y microarrays que contienen, inmovilizados sobre sus
superficies, una o más biomoléculas seleccionadas entre ácidos
nucleicos y proteínas.
17. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente B1 comprende, al menos un carbohidrato no
reductor.
18. Composición según la reivindicación 17, en la
que dicho carbohidrato no reductor se selecciona del grupo formado
por un disacárido no reductor, un trisacárido no reductor y sus
mezclas.
19. Composición según la reivindicación 17, en la
que dicho carbohidrato no reductor se selecciona entre palatinitol,
trehalosa, rafinosa, melezitosa y sus mezclas.
20. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19, que comprende, además, un poliol.
21. Composición según la reivindicación 20, en la
que dicho poliol se selecciona entre glicerol, sorbitol y sus
mezclas.
22. Composición según la reivindicación 1, en la
que dicho componente B2 se selecciona entre un aminoácido, betaína,
aminoguanidina, derivados de aminoguanidina y sus mezclas.
23. Composición según la reivindicación 22, en la
que dicho aminoácido se selecciona entre lisina, arginina,
triptófano y sus mezclas.
24. Composición según la reivindicación 1, en la
que el componente B3 se selecciona del grupo formado por
polivinilpirrolidona (PVP), polietilenglicol (PEG) de diversos
grados de polimerización, dextrano, almidón, Ficoll, glucógeno, goma
arábiga y sus mezclas.
25. Composición según la reivindicación 3, que
comprende un fluoróforo intercalante entre dsADNs o un compuesto
que comprende un fluoróforo y, opcionalmente, un quencher,
seleccionándose dicho compuesto entre un nucleótido, un
oligonucleótido y un polinucleótido, y, además, una enzima que
cataliza la polimerización de ácidos nucleicos.
26. Composición según la reivindicación 1, que
comprende un anticuerpo conjugado a un compuesto fluorescente, o un
anticuerpo conjugado a biotina, o un conjugado que comprende una
actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente y avidina o estreptavidina.
27. Composición según la reivindicación 1, que
comprende un antígeno conjugado a un compuesto fluorescente, o un
antígeno conjugado a biotina, o un conjugado que comprende una
actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o
quimio-luminiscente y avidina o estreptavidina.
28. Un kit que comprende, al menos, un contenedor
que contiene una composición según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 27.
29. Kit según la reivindicación 28, seleccionado
entre:
un kit para la amplificación y/o detección en
tiempo real de secuencias específicas de ácidos nucleicos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
que comprende una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos y un componente A1 seleccionado entre (i) dATP, dGTP,
dCTP y dTTP o dUTP marcados con fluoróforos; (ii) un cebador
marcado con un fluoróforo; (iii) una sonda que comprende un
fluoróforo y, opcionalmente, un quencher; y (iv) un compuesto
fluorescente intercalante en dsADNs;
un kit para la secuenciación de ácidos nucleicos
mediante amplificación génica que comprende, al menos, un
contenedor que contiene una composición que comprende una enzima
que cataliza la polimerización de ácidos nucleicos y un compuesto A1
seleccionado entre (i) dATP, dGTP, dCTP y dTTP o dUTP marcados con
fluoróforos; y (ii) un cebador marcado con un fluoróforo;
un kit para la secuenciación de ácidos nucleicos
mediante reacciones de elongación de ácidos nucleicos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
que comprende una enzima que cataliza la polimerización de ácidos
nucleicos y un compuesto A1 seleccionado entre (i) dATP, dGTP, dCTP
y dTTP marcados con fluoróforos; y (ii) un cebador marcado con un
fluoróforo;
un kit para la detección de ácidos nucleicos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
según la reivindicación 1, comprendiendo dicha composición un
compuesto que comprende un miembro de un par de unión específica
conjugado a una actividad enzimática que cataliza una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente,
un kit para la detección de anticuerpos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
según la reivindicación 1, comprendiendo dicha composición un
compuesto que comprende un miembro de un par de unión específica
conjugado a una actividad enzimática que cataliza una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente, y
un kit para la detección de antígenos que
comprende, al menos, un contenedor que contiene una composición
según la reivindicación 1, comprendiendo dicha composición un
compuesto que comprende un miembro de un par de unión específica
conjugado a una actividad enzimática que cataliza una reacción
colorimétrica o quimio-luminiscente.
30. Un procedimiento para preparar una
composición estabilizada citada en la reivindicación 4, con un
grado de humedad igual o inferior al 30%, que comprende
a) poner en contacto en un único contenedor:
una solución acuosa que comprende, al menos, un
componente (A) seleccionado del grupo formado por:
- -
- un compuesto que comprende un fluoróforo (componente A1),
- -
- un compuesto que comprende un primer miembro de un par de unión específica capaz de reconocer e interaccionar con un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A2),
- -
- una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente (componente A3),
- -
- un conjugado que comprende una actividad enzimática que cataliza una reacción colorimétrica o quimio-luminiscente y un miembro de un par de unión específica con capacidad de reconocimiento y unión a un segundo miembro de dicho par de unión específica (componente A4), y
- -
- sus mezclas; y
una solución acuosa que comprende un componente
(B) constituido por
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3),
para obtener una solución acuosa que comprende
dichos componentes A y B; y
b) retirar la totalidad o parte del agua
contenida en dicha solución acuosa que contiene los componentes A
y B obtenida en la etapa a), hasta obtener una composición que
comprende dichos componentes A y B, y tiene un grado de humedad
igual o inferior al 30%.
31. Procedimiento según la reivindicación 30, en
el que la retirada de la totalidad o parte del agua presente en la
solución acuosa resultante de mezclar las soluciones acuosas que
comprenden los componentes A y B en el contenedor se realiza
mediante liofilización, desecado en lecho fluido, desecado a
temperatura ambiente y presión atmosférica, desecado a temperatura
ambiente y presión disminuida, desecado a alta temperatura y
presión atmosférica, o desecado a alta temperatura y presión
disminuida.
32. Procedimiento según la reivindicación 31, en
el que la retirada de la totalidad o parte del agua presente en la
solución acuosa resultante de mezclar las soluciones acuosas que
comprenden los componentes A y B en el contenedor se realiza
mediante desecado a una temperatura comprendida entre 15°C y 60°C,
y presión disminuida inferior a la atmosférica.
33. Un procedimiento para preparar una
composición estabilizada citada en las reivindicaciones 4 y 12 que
comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados
y estabilizados, con un grado de humedad igual o inferior al 30%,
que comprende
- poner en contacto un componente (A) consistente en un soporte sólido que contiene uno o más compuestos previamente inmovilizados sobre dicho soporte sólido con un componente (B) consistente en una mezcla estabilizante que comprende
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3);y
- retirar la totalidad o parte del agua contenida en la mezcla resultante de dichos componentes (A) y (B), hasta obtener una composición que comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados y estabilizados y dicho componente (B) y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
34. Procedimiento según la reivindicación 33, en
el que dicho componente (A) comprende un soporte sólido de
plástico, vidrio o superficies de oro, opcionalmente pretratado
para permitir la adsorción o unión covalente de compuestos.
35. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 33 ó 34, en el que dicho compuesto o compuestos
inmovilizados en el soporte sólido comprende una o más
biomoléculas.
36. Procedimiento según la reivindicación 35, en
el que dicha biomolécula se selecciona entre ácidos nucleicos,
proteínas, péptidos y anticuerpos.
37. Un procedimiento para preparar una
composición estabilizada citada en las reivindicaciones 4 y 12 que
comprende un soporte sólido que contiene uno o más compuestos
inmovilizados y estabilizados, con un grado de humedad igual o
inferior al 30%, que comprende
- poner en contacto (i) un soporte sólido, opcionalmente tratado para inmovilizar compuestos, con (ii) uno o más compuestos estabilizados mediante la mezcla de dicho compuesto o compuestos con un componente (B) consistente en una mezcla estabilizante que comprende
- -
- al menos, un agente protector frente a la desecación (componente B1),
- -
- al menos, un inhibidor de la reacción de condensación entre grupos carbonilo o carboxilo y grupos amino o fosfato (componente B2), y
- -
- al menos, un polímero inerte capaz de generar una estructura en forma de malla que impide la movilidad de los reactivos desecados (componente B3); y
- retirar la totalidad o parte del agua contenida en la mezcla resultante hasta obtener una composición que comprende un soporte sólido con uno o más compuestos inmovilizados y estabilizados y dicho componente B, y tiene un grado de humedad igual o inferior al 30%.
38. Procedimiento según la reivindicación 37, en
el que dicho soporte sólido es un soporte sólido de plástico,
vidrio o superficies de oro, opcionalmente pretratado para
permitir la adsorción o unión covalente de compuestos.
39. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 37 ó 38, en el que dicho compuesto o compuestos
estabilizados comprende una o más biomoléculas.
40. Procedimiento según la reivindicación 39, en
el que dicha biomolécula se selecciona entre ácidos nucleicos,
proteínas, péptidos y anticuerpos.
41. Un kit que contiene una composición
estabilizada que comprende un soporte sólido que contiene uno o más
compuestos inmovilizados y estabilizados, con un grado de humedad
igual o inferior al 30%, obtenible mediante el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40, como sustrato de
detección de sistemas colorimétricos, fluorescentes o
quimio-luminiscentes.
42. Un kit que contiene una composición
estabilizada que comprende un soporte sólido que contiene uno o más
compuestos inmovilizados y estabilizados, con un grado de humedad
igual o inferior al 30%, obtenible mediante el procedimiento de
cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40, como sustrato de
detección en un método de análisis de resultados como medida de
conductividad eléctrica o medida de índice de refracción.
43. Empleo de una composición según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 27, o de un kit según cualquiera de las
reivindicaciones 28, 29, 41 ó 42, en la realización de un ensayo
fluorimétrico, colorimétrico o
quimio-luminiscente.
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