JP4746926B2 - グルコース−６−リン酸脱水素酵素含有試薬及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨとする）を含有する臨床検査用試薬及び試薬中のＧ６ＰＤＨを安定化する方法に関する。

Ｇ６ＰＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）やニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）などの補酵素の存在下でグルコース−６−リン酸（以下、Ｇ６Ｐとする）を酸化して６−ホスホノグルコノ−δ−ラクトン及び還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）又は還元型ＮＡＤＰ（ＮＡＤＰＨ）を生成する反応又はその逆反応を触媒する酵素である。この触媒作用を利用して、Ｇ６ＰＤＨは様々な臨床検査用試薬に用いられている。しかしながら試薬中のＧ６ＰＤＨは不安定であるため、試薬にＧ６ＰＤＨの安定化剤を含有させる必要がある。

このような安定化剤を含む試薬として、例えば特許文献１に記載のクレアチンキナーゼ（以下、ＣＫとする）活性測定用試薬が知られている。この試薬には、Ｇ６ＰＤＨを安定化するための安定化剤としてヒドロキシルアミン類又はアルデヒド捕捉剤が含有されている。

特開平７−５９５６６

本発明の目的は、従来知られているＧ６ＰＤＨの安定化剤よりＧ６ＰＤＨの保存安定性を向上させることのできる安定化剤を含むＧ６ＰＤＨ含有試薬を提供すること、及び前記安定化剤を用いてＧ６ＰＤＨを安定化するＧ６ＰＤＨ安定化方法を提供することである。

本発明は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）と、一般式（Ｉ）

で表される安定化剤とを含有するＧ６ＰＤＨ含有試薬を提供する。

また、本発明は、試薬中のグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を安定化する方法であって、Ｇ６ＰＤＨと、一般式（Ｉ）

で表される安定化剤とを共存させることを特徴とするＧ６ＰＤＨ安定化方法を提供する。

本発明によると、Ｇ６ＰＤＨを安定化させる安定化剤を含む、保存安定性の優れたＧ６ＰＤＨ含有試薬を提供することができる。また、試薬中のＧ６ＰＤＨを安定化する方法を提供することができる。

本実施形態のＧ６ＰＤＨ含有試薬は、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）と、一般式（Ｉ）

で表される安定化剤とを含有する。

「安定化剤」とは、Ｇ６ＰＤＨ試薬中でＧ６ＰＤＨと共存させることによりＧ６ＰＤＨの失活を抑制し、保存安定性を向上させることのできる物質のことである。また、本明細書においては「安定化剤」は、安定化剤の塩や誘導体をも含む。

安定化剤の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩あるいはシュウ酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等の有機酸塩またはナトリウム塩、カリウム塩等の塩基付加塩が挙げられる。

本実施形態では、安定化剤として、一般式（Ｉ）の化合物（アミノグアニジン）を用いる。

試薬中の安定化剤の濃度としては、Ｇ６ＰＤＨを安定化できる濃度であれば特に限定されない。また、試薬中のＧ６ＰＤＨの濃度としては特に限定されないが、好ましくは１０〜１００００Ｕ／Ｌ、より好ましくは１００〜１００００Ｕ／Ｌである。

Ｇ６ＰＤＨとしては、微生物（例えば、Leuconostoc mesenteroides, Bacillus stearothermophiolus, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas fluorescensなど）、酵母、動植物などに由来するものであってもよく、遺伝子組み換え技術を用いて生成されたものであってもよい。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬の溶液状態におけるｐＨとしては、Ｇ６ＰＤＨを不安定化させるｐＨでなければ特に限定されないが、５．０〜９．０であることが好ましい。このｐＨを維持するために、試薬に緩衝剤を含有させることが好ましい。緩衝剤としては、例えばトリス−塩酸緩衝剤、イミダゾール−酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グッド緩衝剤などを用いることができる。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬は、各成分を凍結乾燥させた状態であってもよいが、溶媒に溶解させた溶液状態であることが好ましい。
また、Ｇ６ＰＤＨ含有試薬は第一試薬及び第二試薬の二試薬からなることが好ましい。この場合、第一試薬及び／又は第二試薬が凍結乾燥した状態であってもよいが、両方の試薬が溶液状態であることが好ましい。Ｇ６ＰＤＨ及び上記安定化剤は第一試薬及び第二試薬の何れに含まれていてもよく、両方に含まれていてもよい。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬は臨床検査に用いられる。試料にＧ６ＰＤＨ含有試薬を混合させることにより、吸光度の変化などをモニターして試料中の特定の物質の含有量や活性などを測定することができる。試料としては、例えば、血清、血漿、血液、髄液、尿、精液などが挙げられるが、血漿又は血清を用いることが好ましい。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬を用いて定量又は活性測定し得る物質としては、反応系にＧ６ＰＤＨの基質であるグルコース−６−リン酸（以下、Ｇ６Ｐとする）を用いていれば特に限定されない。定量し得る物質としては、例えば、中性脂肪、無機リン酸、ラクトース、マルトース、グリコーゲン、スターチ、シュークロース、グルコース、フルクトース、マンノース、クレアチンリン酸、Ｇ６Ｐ、フルクトース−６−リン酸、マルトース−６−リン酸、フルクトース−２−リン酸、Ｌ−ソルボース−６−リン酸、グルコース−１−リン酸、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ウリジン三リン酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコースなどが挙げられる。また、活性測定し得る物質としては、例えば、ＣＫ、ＣＫＭＢ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、アミログルコシダーゼ、インベルターゼ、トランスアルドラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、フルクトースジフォスファターゼなどが挙げられる。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬によってＣＫの活性を測定することができる。
ＣＫとは二つのサブユニットからなる二量体のリン酸化酵素である。ＣＫのサブユニットにはＢ型（脳型）及びＭ型（筋型）の二種類が存在する。ＣＫには、二種類のサブユニットの組み合わせによって三種類のアイソザイム（ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ及びＣＫ−ＢＢ）が存在し、ＣＫ−ＭＭは骨格筋に多く含まれ、ＣＫ−ＭＢは心筋に多く含まれ、ＣＫ−ＢＢは脳に多く含まれる。心筋梗塞や筋ジストロフィーなどの疾患によって疾患の原因部位に存在するＣＫアイソザイムが血液中に逸脱するため、臨床検査において血清などの試料に含まれるＣＫアイソザイムの活性値は上記疾患を診断する際の重要な指標となる。

以下にＣＫの活性測定に用いられるＧ６ＰＤＨ含有試薬について説明する。
ＣＫ活性測定のためのＧ６ＰＤＨ含有試薬には緩衝剤、ＳＨ基を有する化合物（以下、ＳＨ化合物とする）、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、マグネシウムイオン及びクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。またこの場合、測定に供される試料としては、血清や血漿などを用いることができる。

試料とＧ６ＰＤＨ含有試薬とを混合すると、試料に含まれるＣＫがＳＨ化合物によって活性化される。ＣＫは血液中に逸脱すると速やかに不活性化されるため、ＣＫの活性を測定するためにはＳＨ化合物によってＣＫを活性化する必要がある。ＳＨ化合物としては、ＣＫを活性化できるものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン及びチオグリセロールなどを用いることができる。これらのＳＨ化合物は、二種類以上を組み合わせて用いてもよいが、単独で用いることが好ましい。ＳＨ化合物の試薬中の濃度は、５〜２５０ｍＭ、好ましくは５〜７０ｍＭ、より好ましくは１０〜２５ｍＭである。

ＣＫを含む試料に上記成分を含むＧ６ＰＤＨ含有試薬を添加することにより、図１に示すような反応系が構築される。図１において、ＳＨ化合物によって活性化されたＣＫは、クレアチンリン酸及びＡＤＰからクレアチン及びＡＴＰを生成する反応を触媒する（反応１）。試薬に含まれるＨＫ又はＧＫは、試薬に含まれるグルコース及び反応１で生成したＡＴＰからＧ６Ｐ及びＡＤＰを生成させる(反応２)。さらに試薬に含まれるＧ６ＰＤＨは、反応２で生成したＧ６Ｐ及びＮＡＤ又はＮＡＤＰから６−ホスホグルコノ−δ−ラクトン及びＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させる（反応３）。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが生成すると試料とＧ６ＰＤＨ含有試薬との混合液の波長３４０ｎｍ付近での吸光度が上昇する。この吸光度の上昇をモニターすることにより、試料中のＣＫの活性を測定することができる。

Ｇ６ＰＤＨ含有試薬は第一試薬と第二試薬とからなることが好ましい。上記成分のうち、第一試薬に、緩衝剤、Ｇ６ＰＤＨ、安定化剤、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、ヘキソキナーゼ（ＨＫ）又はグルコキナーゼ（ＧＫ）、グルコース、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、マグネシウムイオン及びＳＨ化合物を含有させ、第二試薬にはクレアチンリン酸を含有させることが好ましい。

上述したように、Ｇ６ＰＤＨは不安定であるためＣＫ活性測定用のＧ６ＰＤＨ含有試薬にＧ６ＰＤＨの安定化剤を含有させることができる。しかしながら、現在安定化剤として知られている化合物はＳＨ化合物を劣化させるためＧ６ＰＤＨの保存安定性を向上させるのに必要な量を添加できず、十分にＧ６ＰＤＨを安定化させることができない。本実施形態の安定化剤は、Ｇ６ＰＤＨと試薬中に共存させることによって、ＳＨ化合物を劣化させることなく十分にＧ６ＰＤＨの保存安定性を高めることができる。

上記成分の他に、防腐剤、キレート剤などを適宜試薬に添加してもよい。防腐剤としては例えばアジ化ナトリウムなどを用いることができる。キレート剤は試料中の金属イオンによるＣＫ活性の阻害を抑制するために用いられ、具体的にはＥＤＴＡなどを用いることができる。

また、界面活性作用を有する化合物を試薬に添加してもよい。例えば、アルブミン、非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などを用いることができ、具体的にはＢＳＡ、トライトン類、エマルゲン類などを用いることができる。

試料にはアデニレートキナーゼが含まれていることがある。アデニレートキナーゼは特に溶血試料に多く含まれており、ＣＫの活性測定に悪影響を及ぼす。この悪影響を回避するため、試薬にアデニレートキナーゼの作用を阻害する阻害剤を加えることが好ましい。阻害剤の種類としてはアデニレートキナーゼの作用を阻害するものであれば特に限定されないが、例えばアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）やＰ１Ｐ５ジアデノシン−５’−ペンタリン酸（ＡＰ５Ａ）などを用いることができる。

さらに、ダブルカイネティック法で活性測定することによりアデニレートキナーゼの悪影響を回避することも可能である。ダブルカイネティック法では、先ずアデニレートキナーゼの活性を測定し、その後クレアチンリン酸を添加し、ＣＫによる酵素反応を開始させて試料に含まれるキナーゼの活性（ＣＫの活性とアデニレートキナーゼの活性との和）を測定する。これらの測定結果の差がＣＫの活性値となる。

なお、上述したＣＫ活性測定用のＧ６ＰＤＨ含有試薬に、ＣＫのＭ型サブユニットを特異的に認識する抗体（以下、抗ＣＫ−Ｍ抗体とする）を含有させることにより、試料中のＣＫ−ＭＢの活性を測定することが可能となる(Wurzburg et al., 1977, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 15:131-135)。抗ＣＫ−Ｍ抗体としては、Ｍ型サブユニットを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体やモノクローナル抗体でもよく、これらを混合して用いてもよい。また、抗体のフラグメント及びその誘導体を用いることもできる。抗体のフラグメント及びその誘導体としては、具体的にはＦａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ）_２及びｓＦｖフラグメントなど（Blazar et al., 1997, J. Immunol., 159: 5821-5833及びBird et al., 1988, Science, 242: 423-426）が例示される。抗体のサブクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭなどでもよい。

（実施例１）
＜試薬の調整＞
下記に示す組成でＣＫ活性測定用のＧ６ＰＤＨ含有試薬を調製した。各成分の濃度は試薬中の濃度を示す。

イミダゾール １２５ｍＭ
ＥＤＴＡ ２．５ｍＭ
酢酸マグネシウム １２．５ｍＭ
ＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＡＭＰ ６．２５ｍＭ
ＡＰ５Ａ １２．５μＭ
グルコース ２５ｍＭ
ＮＡＤＰ ２．５ｍＭ
ＮＡＣ ２５ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ １８７５Ｕ／Ｌ
ヘキソキナーゼ ３７５０Ｕ／Ｌ
なお、試薬のｐＨは６．６に調整された。

ＣＫ活性測定試薬は上記試薬（第一試薬）とクレアチンリン酸を含む試薬（第二試薬）とからなるが、本実施例では上記試薬に温度負荷をかけてＧ６ＰＤＨ及びＮＡＣの安定性を分析しているため、第二試薬は用いない。

上記組成にアミノグアニジンを添加して、アミノグアニジン濃度の異なる三種類の試薬を調整した。これらの試薬のアミノグアニジン濃度はそれぞれ、１０ｍＭ、２０ｍＭ及び４０ｍＭであった。これらの試薬に対して３７℃で５日間温度負荷をかけた後、Ｇ６ＰＤＨの残存活性の測定及びＮＡＣのＳＨ基の残存量の定量を行なった。

Ｇ６ＰＤＨの活性は以下のようにして測定された。先ずグリシルグリシンを０．１Ｍ含む溶液（ｐＨ８．５）に２０ｍＭの塩化マグネシウム、０．６ｍＭのＮＡＤＰ及び０．５ｍＭのＧ６Ｐを溶解させた溶液を調整した。この溶液３００μｌとＧ６ＰＤＨ含有試薬１μｌとを混合すると、Ｇ６ＰＤＨの活性によってＮＡＤＰＨが生成する。ＮＡＤＰＨが生成すると、波長３４０ｎｍにおける吸光度が上昇するため、これを測定することによりＧ６ＰＤＨの活性を算出した。

ＳＨ基の定量は、ＤＴＮＢ（5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)）を用いて行なった。試薬にＤＴＮＢを添加すると、ＮＡＣが存在する場合はＮＡＣのＳＨ基の量に相当する量のジスルフィド結合が切れて5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じる。5-Mercapto-2-nitrobenzoic acidが生じると、波長４１２ｎｍにおける吸光度が上昇するため、これを測定することにより試薬中のＳＨ基を定量した。

（比較例１〜３）
比較例１として、上記組成にアミノグアニジンではなく、Ｇ６ＰＤＨ安定化剤として知られているアセトヒドラジンを添加して、アセトヒドラジン濃度の異なる二種類の試薬を調整すること以外は実施例１と同様にしてＧ６ＰＤＨの残存活性の測定及びＮＡＣのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬においてアセトヒドラジン濃度は２０ｍＭ及び４０ｍＭであった。
また、比較例２として、アミノグアニジンではなく、Ｇ６ＰＤＨ安定化剤として知られているヒドラジンを添加して、ヒドラジン濃度の異なる二種類の試薬を調整すること以外は実施例１と同様にしてＧ６ＰＤＨの残存活性の測定及びＮＡＣのＳＨ基の残存量の定量を行なった。それぞれの試薬においてヒドラジン濃度は２０ｍＭ及び４０ｍＭであった。
また、比較例３として、安定化剤を添加せずにＧ６ＰＤＨの残存活性の測定及びＮＡＣのＳＨ基の残存量の定量を行なった。

実施例１及び比較例１〜３の測定結果を下記表１に示す。なお、表１においてＧ６ＰＤＨの残存活性及びＮＡＣの残存量は百分率で示されている。これらの値は温度負荷をかけずに実施例１に記載の方法で測定したＧ６ＰＤＨの活性値及びＮＡＣのＳＨ基の量に対する値である。

比較例１より、温度負荷によってＧ６ＰＤＨの活性が失われており、さらにＮＡＣは劣化されてＳＨ基の量が減少した。
比較例２より、Ｇ６ＰＤＨの活性の低下はある程度抑制されているが、ＮＡＣが劣化したためにＳＨ基の量が大きく減少した。
比較例３より、ＮＡＣが劣化せずＳＨ基の量は減少していないが、安定化剤を添加していないためにＧ６ＰＤＨの活性が失われた。
実施例１においては、ＳＨ基の量を減少させることなく、Ｇ６ＰＤＨの活性を保つことができた。

以上より、安定化剤としてＧ６ＰＤＨ含有試薬にアミノグアニジンを添加すると、ＮＡＣを劣化させることなくＧ６ＰＤＨの活性が保たれ、Ｇ６ＰＤＨの保存安定性を向上できることが判った。

（実施例２）
実施例１で用いたＧ６ＰＤＨ含有試薬にアミノグアニジンを２０ｍＭの濃度で添加し、３７℃で３０日間温度負荷をかけ、Ｇ６ＰＤＨの活性測定及びＮＡＣのＳＨ基の定量を行なった。活性測定及び定量は実施例１と同様の方法により、温度負荷前、温度負荷開始から７日後、温度負荷開始から１４日後、温度負荷開始から２０日後及び温度負荷開始から３０日後に行なった。

（比較例２）
Ａ社、Ｂ社、Ｃ社、Ｄ社、Ｅ社及びＦ社から発売されているＣＫ活性測定用試薬の第一試薬（試薬Ａ〜試薬Ｆ）に対してそれぞれ３７℃で温度負荷をかけ、Ｇ６ＰＤＨの活性測定及びＮＡＣのＳＨ基の定量を行なった。活性測定及び定量は実施例２と同様にして行なった。
また、対照として実施例１で調整した試薬（対照試薬：アミノグアニジン無添加）に３７℃で温度負荷をかけ、Ｇ６ＰＤＨの活性測定及びＮＡＣのＳＨ基の定量を行なった。活性測定及び定量は実施例２と同様にして行なった。

実施例２及び比較例２のＧ６ＰＤＨの活性測定結果を表２及び図２に示す。また、実施例２及び比較例２のＳＨ基の定量結果を表３及び図３に示す。

表２及び図２より、市販の試薬Ａ〜Ｆ及び対照試薬のうち、何れの試薬においても、温度負荷をかけるとＧ６ＰＤＨの活性が著しく低下したが、アミノグアニジンを添加した実施例２の試薬では３０日間の温度負荷後でも６６．９％の残存活性を示した。また、表３及び図３より、試薬Ａ〜Ｆ及び対照試薬に比べて実施例２の試薬はＳＨ基の残存量が多かった。

以上より、安定化剤としてアミノグアニジンを添加したＧ６ＰＤＨ含有試薬は、アミノグアニジン無添加の試薬及び市販の試薬に比べてＧ６ＰＤＨ及びＮＡＣの保存安定性が高いことが判った。

ＣＫ活性測定の反応系を示した模式図である。 Ｇ６ＰＤＨの残存活性を示すグラフである。 ＳＨ基の残存量を示すグラフである。

Claims (4)

1. グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）と、
   一般式（Ｉ）
   

   

   で表される安定化剤と、
   を含有するＧ６ＰＤＨ含有試薬。
2. ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼ、グルコース、アデノシン二リン酸、マグネシウムイオン、ＳＨ基を有する化合物及びクレアチンリン酸からなる群より選ばれる少なくとも一つの化合物をさらに含有する請求項１記載のＧ６ＰＤＨ含有試薬。
3. 前記ＳＨ基を有する化合物が、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、システアミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン及びチオグリセロールからなる群より選択される少なくとも一つである請求項２記載のＧ６ＰＤＨ含有試薬。
4. 試薬中のグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）を安定化する方法であって、
   Ｇ６ＰＤＨと、
   一般式（Ｉ）
   

   

   で表される安定化剤と、
   を共存させることを特徴とするＧ６ＰＤＨ安定化方法。

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