JP4413340B2 - 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 - Google Patents
酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4413340B2 JP4413340B2 JP31490799A JP31490799A JP4413340B2 JP 4413340 B2 JP4413340 B2 JP 4413340B2 JP 31490799 A JP31490799 A JP 31490799A JP 31490799 A JP31490799 A JP 31490799A JP 4413340 B2 JP4413340 B2 JP 4413340B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- adp
- cysteine
- ribose
- urea
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素の安定化方法及びその応用に関し、さらに詳しくはＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵素例えばウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素の保存時又は反応時の安定化が確保された酵素の安定化方法及び測定試薬に関する。又、本発明は安定化された尿素測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素としては種々のものが知られており、例えばグルコース−６−リン酸脱水素酵素等がある。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素反応系に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化することが多いが、その原因についてはこれまでよく知られていなかった。
【０００３】
ウレアーゼは尿素窒素の測定において尿素をアンモニアと二酸化炭素（ＣＯ２）に分解するのに用いられている。尿素はアミノ酸の脱アミノ化によって生じたアンモニアとＣＯ２とから主として肝で尿素サイクルによって合成され、血中では血漿と血球の水分中に平等に含有されている。尿素窒素（以下、ＢＵＮと略称することがある）は、正常では、血清中の蛋白以外の窒素化合物である非蛋白窒素（以下、ＮＰＮと略称することがある）の約５０％であるが、尿毒症では８０〜９０％に達する。ＢＵＮの測定はＮＰＮとほとんど同じ臨床的意義をもっているが、病態における変動が大きく、測定法が簡単であることからＢＵＮ測定が主として行われている。
【０００４】
ＢＵＮの測定用試薬の測定法としては、ネスラー法（Ｃ．Ｊ．Ｇｅｎｔｚｋｏｗ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４３，５３１−５４４（１９４２））、比色法（Ａ．Ａ． Ｏｒｍｓｂｙ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４６，５９５−６０４（１９４２））、 カラー法（Ｒ．Ｌ．Ｓｅａｒｃｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，１２，１７０−１７５（１９６５））、 インドフェノール法（Ａ．Ｌ．Ｃｈａｎｅｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，８，１３０−１３２（１９６２））、グルタミン酸脱水素酵素法（Ｂ．Ａ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，２５，２６−３０（１９７９））がある。通常、グルタミン酸脱水素酵素法が用いられている。
【０００５】
一方、修飾によりタンパク質の性質の変化あるいは機能の低下ないしは喪失がおきることが多くのタンパク質において知られている。例えば、ヘキソースによるタンパク質の糖質化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が多くの疾病の病理や老化過程に関与していることが示唆されている（Ｄ．Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅｎｔｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｔｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１５２８−１５３４（１９９３））。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
例えばウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化する原因物質をつきとめ、この原因物質を除去することなく、あるいは補酵素等を精製することなく、簡単にその不安定化作用を回避する手段が望まれている。
【０００７】
また、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系の応用の一例である、ウレアアミドリアーゼを用いた尿素窒素測定方法において用いられる酵素を安定化すること、及びそのような酵素反応を利用した尿素窒素測定試薬の保存時又は反応時における安定性を向上させることが望まれている。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素の保存時又は反応時の不安定化を回避する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系において、酵素の安定化手段が導入された測定試薬ならびに、特に尿素窒素測定試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は鋭意検討した結果、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも一種の、保存時又は反応時の不安定化は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の分解生成物が原因で起きていること、これら分解生成物のうち、特にＡＤＰ−リボースが原因物質であること、ＡＤＰ−リボースによる酵素の不安定化は酵素タンパク質のＡＤＰ−リボースによる修飾によるものであり、各種の酵素を利用した測定法の場合、このような酵素の不安定化は測定結果の信頼性を損なうので、例えば、尿素窒素の測定法において、尿素を分解する酵素の安定性が重要であることを見出した。
【００１１】
本発明の一は、ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬に関し、さらに詳しくはウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系を用いる試薬においてＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる該酵素の不安定化を阻止する手段を導入することからなる。
【００１２】
さらに、本発明の別の一はＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の分解生成物あるいはＡＤＰ−リボースによるこれら酵素（ＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵素）の不安定化がＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を共存させることにより回避されることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の酵素の不安定化を阻止する手段は、ＡＤＰ−リボースによる作用を阻止することであり、その阻止の手段とは該酵素の安定化に有効な量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させるものである。
【００１４】
本発明の酵素の例としてはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。しかし、ＡＤＰ−リボースによって影響をうける酵素であれば、これらに限定されるものではなく、広く適用可能である。
【００１５】
本発明の酵素の安定化方法は、β−ＮＡＤ（Ｐ）＋等と、その分解生成物により阻害作用を受ける酵素を含む酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段を導入することであり、その手段の一例として有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を添加することで、前記β−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物による前記酵素不安定化作用を回避するものである。
【００１６】
本発明の安定化された試薬は、ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬である。ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系とは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ，ＦＡＤ等を補酵素として使用する反応系である。酵素の例としてはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。
【００１７】
酵素の不安定化を阻止する手段の一例としては、有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物安定化剤として使用するものである。
【００１８】
上記ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段としてＬ−システインを用いる場合は、Ｌ−システインが酸化されてシスチンになり沈澱を生成することを回避するための安定化補助手段を導入することが好ましく、該安定化補助手段としては酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物が好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系の例としては、ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた複合酵素系がある。この酵素反応系では、図１に示すように、次のように反応がおきる。
【００２０】
まず、（１）ＡＴＰとマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及びカリウムイオン（Ｋ＋）の存在下でウレアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）が尿素に作用してこれをアンモニアとＣＯ２とに分解し、その際ＡＴＰがＡＤＰに加水分解される。次に、（２）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びＭｇ２＋の存在下、グルコースを基質としてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）が生成し、ＡＤＰはさらにＡＭＰに加水分解する。さらに、（３）補酵素β−ＮＡＤＰ＋の存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＤＰＨ）の作用でＧ６Ｐから６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンが生成し、その際、酸化型補酵素β−ＮＡＤＰ＋は還元型補酵素β−ＮＡＤＰＨに変化する。この補酵素の変化量を３４０ｎｍにおける吸光度の測定を行い、その変化から尿素窒素量を得ることができる。
【００２１】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋（併せてＮＡＤ（Ｐ）＋と略称することがある）を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素、例えばウレアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）は、保存時又は該酵素反応系において不安定化する現象がみられる。本発明者等による検討の結果、かかる不安定化は酵素自体が不安定であることに加え、β−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋の分解生成物が主たる原因となっていることが判明した。
【００２２】
例えば、ＵＲＬ酵素溶液にβ−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋を３ｍＭ添加して３０℃、５日間保存すると、無添加の場合に比較して残存活性（％）が低下したが、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）をそれぞれ添加した場合は残存活性（％）は低下しないか又は若干低下したにすぎない（図３）。そこで、β−ＮＡＤ＋の分解生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー）を用いて分析したところ、ＡＤＰ−リボースが無視できない量存在することを確認し、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質であるとの示唆を得た。これを検証するために、ＡＤＰ−リボースをＵＲＬ酵素溶液に添加したところ、ＮＡＤ＋分解生成物を添加した場合と同等のいちじるしい残存活性（％）の低下がみられた。このため、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質であることが確認された（図３）。
【００２３】
同様に、ＡＤＰ−ＨＫも上記反応系において残存活性低下がみられることを確認した。
【００２４】
さらに検討した結果、本発明者等は、ＡＤＰ−リボースによる上述の酵素の不安定化は特定の化合物を酵素と共存させることで回避し得ることを見出した。このような化合物としては、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン、及びセミカルバジド、ヒドロキシルアミンのようなヒドラジン類縁体があり、特にＬ−システインとヒドロキシルアミンが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ等の不安定化を回避するのに使用できる安定化剤としては、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体、例えば塩酸ヒドロキシルアミン、塩酸セミカルバジド等があげられる。これらの安定化剤の使用量は酵素反応の温度、用いるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度等に応じて変わり、予備試験を行うことにより適宜決めることができるが、一般に０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは１〜２５ｍＭである。安定化剤としてＬ−システインを用いる場合、Ｌ−システインの安定化補助剤として酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物を用いることが好ましい。
【００２６】
本発明による尿素窒素の測定は用手法、自動分析法のいずれによってもよい。
【００２７】
Ｌ−システイン、システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体は非酵素的にＡＤＰ−リボースと結合し、ＡＤＰ−リボースの酵素に対する修飾作用（ＡＤＰ−リボシル化作用）を阻害するものと考えられる。理論に縛られるつもりはないが、この阻害作用は、システイン、ヒドラジン又はそれらの類縁体のＡＤＰ−リボース又はその構造類似物に対する非酵素的結合によるものと考えられる。いずれにしても、酵素タンパク質がＡＤＰ−リボース又はその構造類似物と結合する部位に対するＡＤＰ−リボース又はその構造類似物のアクセスがこれらの化合物により妨げられる結果、タンパク質の修飾が阻害され、酵素タンパク質の不安定化又は失活が回避されるものと考えられる。
【００２８】
このように、ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＤＰ−ＨＫに限らず、ＡＤＰ−リボースにより修飾されて不安定化又は失活する酵素であれば、Ｇ１ｕＤＨ（グルタミン酸脱水素酵素）、ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＨＫ（ヘキソキナーゼ）、ＭＤＨ（リンゴ酸脱水素酵素）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）など上述の本発明による安定化剤を酵素と共存させることで不安定化を回避することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３０】
実施例１ 尿素窒素測定試薬の組成
図１の反応系による尿素窒素の測定に用いる試薬の組成の一例をあげると次の通りである。第一試薬及び第二試薬のそれぞれの成分を下記の濃度になるように精製水に溶解して調製した。
【００３１】
【表１】
ＨＥＰＥＳ： Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸
ＴＡＰＳ： Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００３２】
実施例２ ＵＲＬの安定性試験
ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３．３ｍＭ）とＬ−システイン（０ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，１５ｍＭ，２０ｍＭ，２５ｍＭ，３０ｍＭ，３５ｍＭ，４０ｍＭ，４５ｍＭ，又は５０ｍＭ）を添加した以外は実施例１と同様の組成の第一試薬を調製し、−８０℃、２〜８℃又は３０℃の各温度で７日間保存した場合について、ＵＲＬの残存活性（％）を求めた（−８０℃での残存活性を１００％とした）ところ、図２に示す結果が得られた。２〜８℃では約１５ｍＭで残存活性がほぼ１００％に達する。３０℃では約５ｍＭで残存活性が約５０％に達し、約３７ｍＭで１００％に達する。従って、温度によってＬ−システインの使用量は変わるが、約１５〜４０ｍ以上で残存活性がよく、３０℃以下で保存した場合は約３７ｍＭで残存活性が１００％になる。他の化合物も同様の傾向を示した。
【００３３】
実施例３〜６ ＵＲＬの安定性試験
ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。実施例１に示す第一試薬において、Ｌ−システイン及びβ−ＮＡＤＰ＋を除いたもの（無添加）、Ｌ−システインを除き、β−ＮＡＤＰ＋の代わりにβ−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）、ＡＤＰ−リボース（０．３ｍＭ）、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）、β−ＮＡＤＰ＋（１ｍＭ）を添加したものを作成し、３０℃・５日間保存した場合のＵＲＬの安定性について検討した。その結果を図３に示す。この結果から明らかなように、ニコチンアミド、アデノシン、ＡＤＰは無添加とほぼ同じ安定性を示したのに対し、β−ＮＡＤ＋、ＡＤＰ−リボース、β−ＮＡＤＰ＋を添加することによりＵＲＬの顕著な不安定化が起こった。β−ＮＡＤ＋が加水分解されるとＡＤＰ−リボースとニコチンアミドを生じるが、この内ＡＤＰ−リボースにより顕著に不安定化されたことから、ＡＤＰ−リボースにより酵素の不安定化が引き起こされると考えられる。
【００３４】
更に、実施例１に示す第一試薬において、β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）を添加し、Ｌ−システインを８ｍＭ、２０ｍＭ添加したもの（実施例３）及び、Ｌ−システインの代わりにセミカルバジド（実施例４）、ヒドラジン（実施例５）、ヒドロキシルアミン（実施例６）をそれぞれ、８ｍＭ、２０ｍＭ添加したものを３０℃・５日間保存したときのＵＲＬの安定性を検討した。その結果を図３に示す。
【００３５】
これらの結果から、明らかなように、安定化剤はいずれの濃度でも６０％以上の残存活性を示した。Ｌ−システインとセミカルバジドは２０ｍＭの濃度で７０％を越える残存活性を示し、ヒドロキシルアミンは８ｍＭの濃度で約７７％の残存活性を示した。
【００３６】
実施例７〜９ ＵＲＬの安定性試験
Ｌ−システイン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例７）、塩酸セミカルバジド（０．２％、１％）（実施例８）、塩酸ヒドロキシルアミン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例９）を用いて実施例２と同様にして第一試薬をそれぞれ調製した。対照として上述の安定化剤を含まずＮＡＤＰの代わりにＡＤＰ−リボース（４０μＭ）を含む以外は実施例２と同じ組成のもの、及び安定化剤もＡＤＰ−リボースも含まないものを調製した。これらの試薬を用いて２〜８℃、２５℃又は３７℃の各温度で５日間保存した場合のＵＲＬの安定性について検討した。
【００３７】
得られた結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
＊残存活性は各々を２−８℃で保存したものを１００％として算出した。
【００３９】
実施例１０〜１３ Ｇ６ＰＤＨの安定性試験
Ｇ６ＰＤＨの安定性試験を次のようにして行った。実施例１に示す第一試薬において、Ｌ−システインを２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの（実施例１０）及びＬ−システインの代わりにヒドラジン（実施例１１）、ヒドロキシルアミン（実施例１２）、セミカルバジド（実施例１３）を、それぞれ２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの更に、前記試薬からβ−ＮＡＤＰ＋を除いたものを作成し、３７℃・４日間保存したときのＧ６ＰＤＨの安定性を検討した。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００４１】
表３の結果から明らかなように、安定化剤及びβ−ＮＡＤＰのいずれも添加しなかったときは残存活性が９６．４％であったが、β−ＮＡＤＰが２．５ｍＭ存在すると残存活性は６９．５％に低下した。これに対して、安定化剤としてＬ−システイン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドが存在すると、β−ＮＡＤＰ無添加の場合は残存活性は安定化剤添加量が２．５ｍＭ、１０ｍＭのいずれにおいても無添加の場合とほぼ同じである。これに対して、２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰ存在化ではβ−ＮＡＤＰ無添加の場合に比べて安定化剤の安定化効果は若干の低下がみられるものの、安定化剤が存在せず２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰが存在する場合に比べていちじるしい安定化効果がみられた。
【００４２】
実施例１４ ＡＤＰ−ＨＫの安定性試験
表１に示す試薬組成でＬ−システインを添加したものと添加していないものを作成し、ＡＤＰ−ＨＫの安定性を検討した。各温度で３０日間保存したときの酵素残存活性（％）を表４に示す。
【表４】
ＡＤＰ−ＨＫ：ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
【００４３】
２５℃及び３０℃でＡＤＰ−ＨＫを保存すると酵素残存活性はそれぞれ６８、５９％に低下する。Ｌ−システイン添加により残存活性はそれぞれ９１、８２％と維持された。
【００４４】
実施例１５ １−チオグリセロールによるＬ−システインの酵素安定化作用の増強試験
Ｌ−システインは実施例２及び図２に示すように、保存時における安定化剤としての作用が保存温度により異なり、３０℃では１０ｍＭ以下の低濃度で効果が低い。表５に示すように 尿素窒素測定用の試薬にＬ−システイン０，２，４，６，８，１０ｍＭを安定化剤として単独添加し、３７℃で１１日間保存した場合、酵素（ＵＲＬ）の残存活性は、それぞれ２，１２，１５，１９，２８，４２％であった。１−チオグリセロールは本酵素系では単独では酵素安定化作用をほとんど示さないが、Ｌ−システインとともにその補助剤として試薬に加えると、Ｌ−システインの酵素安定化作用を著しく増強した。２ｍＭ Ｌ−システイン存在下の酵素残存活性が１−チオグリセロール１０ｍＭ添加により６４％に、２５ｍＭ添加により８７％に増加した。さらに、Ｌ−システイン１０ｍＭ存在下では１０ｍＭ以上の１−チオグリセロール添加により酵素残存活性はほぼ１００％となった。従って、Ｌ−システインを前記酵素の安定化剤として使用する場合、１−チオグリセロールをその安定化補助物質として用いることで著しい効果が得られる。
【表５】
【００４５】
実施例１６〜２０ Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＨＫ、ＭＤＨ、ＬＤＨの安定性試験（１）
０．１％ＢＳＡ、３．３ｍＭ β−ＮＡＤ及び安定化剤として１０ｍＭ Ｌ−システイン塩酸塩及び３３ｍＭ １−チオグリセロール、１０ｍＭ塩酸ヒドラジン、１０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミンをそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０を負荷液とした。それそれの負荷液に１．０Ｕ／ｍＬになるようにＧ１ｕＤＨ（実施例１６）、ＰＫ（実施例１７）、ＨＫ（ヘキソキナーゼ）（実施例１８）、ＭＤＨ（実施例１９）、ＬＤＨ（実施例２０）をそれぞれ溶解し、ＨＫ、ＭＤＨは３０℃で７日間負荷を行い、一方Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＬＤＨは３７℃で７日間の負荷を行い、それぞれ安定性を検討した。また、対照として安定化物質及び不安定化物質を含まないものも検討した。負荷前の活性を１００％とした時の酵素の残存率を表６に示す。
【表６】
実施例２１〜２５ Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＨＫ、ＭＤＨ、ＬＤＨの安定性試験（２）
実施例２１〜２５としてそれぞれ実施例１６〜２０の３．３ｍＭ β−ＮＡＤの代わりに０．３３ｍＭ ＡＤＰ−リボースを用いて、実施例１６〜２０と同様に安定性の検討を行った。その結果を酵素の残存率として表７に示す。
残存率を表７に示す。
【表７】
【００４６】
【発明の効果】
本発明に従い、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素と、安定化剤としてＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させることで、系外にβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物とシステイン等の化合物との複合体を取り出すことなく、簡単に酵素の修飾を防止でき、酵素の不安定化を回避することができるので、試薬測定の自動化が可能である。また、本発明を尿素窒素の測定試薬キットに適用する場合は、試薬に用いるβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋を精製することなく、そのまま使用できるので試薬製造のプロセスを減らすことができ、コスト的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に従う尿素窒素測定方法に用いる複合酵素系の反応（測定原理）を説明する反応行程図である。
【図２】異なる温度におけるＬ−システインとウレアアミドリアーゼ残存活性（％）との関係を示すグラフである。
【図３】ウレアアミドリアーゼに対する安定化剤の効果を示すグラフである。
【符号の説明】
ＵＲＬ ウレアアミドリアーゼ
ＡＤＰ−ＨＫ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【発明の属する技術分野】
本発明は酵素の安定化方法及びその応用に関し、さらに詳しくはＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵素例えばウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素の保存時又は反応時の安定化が確保された酵素の安定化方法及び測定試薬に関する。又、本発明は安定化された尿素測定試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素としては種々のものが知られており、例えばグルコース−６−リン酸脱水素酵素等がある。ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素反応系に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化することが多いが、その原因についてはこれまでよく知られていなかった。
【０００３】
ウレアーゼは尿素窒素の測定において尿素をアンモニアと二酸化炭素（ＣＯ２）に分解するのに用いられている。尿素はアミノ酸の脱アミノ化によって生じたアンモニアとＣＯ２とから主として肝で尿素サイクルによって合成され、血中では血漿と血球の水分中に平等に含有されている。尿素窒素（以下、ＢＵＮと略称することがある）は、正常では、血清中の蛋白以外の窒素化合物である非蛋白窒素（以下、ＮＰＮと略称することがある）の約５０％であるが、尿毒症では８０〜９０％に達する。ＢＵＮの測定はＮＰＮとほとんど同じ臨床的意義をもっているが、病態における変動が大きく、測定法が簡単であることからＢＵＮ測定が主として行われている。
【０００４】
ＢＵＮの測定用試薬の測定法としては、ネスラー法（Ｃ．Ｊ．Ｇｅｎｔｚｋｏｗ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４３，５３１−５４４（１９４２））、比色法（Ａ．Ａ． Ｏｒｍｓｂｙ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，１４６，５９５−６０４（１９４２））、 カラー法（Ｒ．Ｌ．Ｓｅａｒｃｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，１２，１７０−１７５（１９６５））、 インドフェノール法（Ａ．Ｌ．Ｃｈａｎｅｙ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，８，１３０−１３２（１９６２））、グルタミン酸脱水素酵素法（Ｂ．Ａ．Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ ｅｔｃ．， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．，２５，２６−３０（１９７９））がある。通常、グルタミン酸脱水素酵素法が用いられている。
【０００５】
一方、修飾によりタンパク質の性質の変化あるいは機能の低下ないしは喪失がおきることが多くのタンパク質において知られている。例えば、ヘキソースによるタンパク質の糖質化（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）が多くの疾病の病理や老化過程に関与していることが示唆されている（Ｄ．Ｃｅｒｖａｎｔｅｓ−Ｌａｕｒｅｎｔｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍｉｎｔｅｒ，Ｅ．Ｌ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，１５２８−１５３４（１９９３））。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
例えばウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系に用いられる酵素が保存時又は反応時に不安定化する原因物質をつきとめ、この原因物質を除去することなく、あるいは補酵素等を精製することなく、簡単にその不安定化作用を回避する手段が望まれている。
【０００７】
また、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系の応用の一例である、ウレアアミドリアーゼを用いた尿素窒素測定方法において用いられる酵素を安定化すること、及びそのような酵素反応を利用した尿素窒素測定試薬の保存時又は反応時における安定性を向上させることが望まれている。
【０００８】
従って、本発明の目的は、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素の保存時又は反応時の不安定化を回避する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼのような酵素を含む酵素反応系において、酵素の安定化手段が導入された測定試薬ならびに、特に尿素窒素測定試薬を提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は鋭意検討した結果、ウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも一種の、保存時又は反応時の不安定化は、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の分解生成物が原因で起きていること、これら分解生成物のうち、特にＡＤＰ−リボースが原因物質であること、ＡＤＰ−リボースによる酵素の不安定化は酵素タンパク質のＡＤＰ−リボースによる修飾によるものであり、各種の酵素を利用した測定法の場合、このような酵素の不安定化は測定結果の信頼性を損なうので、例えば、尿素窒素の測定法において、尿素を分解する酵素の安定性が重要であることを見出した。
【００１１】
本発明の一は、ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬に関し、さらに詳しくはウレアアミドリアーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素の少なくとも一種を含む酵素反応系を用いる試薬においてＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる該酵素の不安定化を阻止する手段を導入することからなる。
【００１２】
さらに、本発明の別の一はＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の分解生成物あるいはＡＤＰ−リボースによるこれら酵素（ＡＤＰ−リボースにより不安定化される酵素）の不安定化がＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を共存させることにより回避されることを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の酵素の不安定化を阻止する手段は、ＡＤＰ−リボースによる作用を阻止することであり、その阻止の手段とは該酵素の安定化に有効な量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させるものである。
【００１４】
本発明の酵素の例としてはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。しかし、ＡＤＰ−リボースによって影響をうける酵素であれば、これらに限定されるものではなく、広く適用可能である。
【００１５】
本発明の酵素の安定化方法は、β−ＮＡＤ（Ｐ）＋等と、その分解生成物により阻害作用を受ける酵素を含む酵素反応系に、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段を導入することであり、その手段の一例として有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物を添加することで、前記β−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物による前記酵素不安定化作用を回避するものである。
【００１６】
本発明の安定化された試薬は、ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系において、ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる測定反応系に関与する酵素の不安定化を阻止する手段を導入することを特徴とする生体内成分の測定試薬である。ＡＤＰ−リボースが測定反応系の分解産物として産生される生体内成分の測定反応系とは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ，ＦＡＤ等を補酵素として使用する反応系である。酵素の例としてはウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、及び乳酸脱水素酵素から選ばれる少なくとも一種の酵素を含むものであってもよい。
【００１７】
酵素の不安定化を阻止する手段の一例としては、有効量のＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物安定化剤として使用するものである。
【００１８】
上記ＡＤＰ−リボースによる修飾によっておこる酵素の不安定化を阻止する手段としてＬ−システインを用いる場合は、Ｌ−システインが酸化されてシスチンになり沈澱を生成することを回避するための安定化補助手段を導入することが好ましく、該安定化補助手段としては酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物が好ましい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系の例としては、ウレアアミドリアーゼ、ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素を用いた複合酵素系がある。この酵素反応系では、図１に示すように、次のように反応がおきる。
【００２０】
まず、（１）ＡＴＰとマグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）及びカリウムイオン（Ｋ＋）の存在下でウレアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）が尿素に作用してこれをアンモニアとＣＯ２とに分解し、その際ＡＴＰがＡＤＰに加水分解される。次に、（２）ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）及びＭｇ２＋の存在下、グルコースを基質としてグルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）が生成し、ＡＤＰはさらにＡＭＰに加水分解する。さらに、（３）補酵素β−ＮＡＤＰ＋の存在下でグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＤＰＨ）の作用でＧ６Ｐから６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンが生成し、その際、酸化型補酵素β−ＮＡＤＰ＋は還元型補酵素β−ＮＡＤＰＨに変化する。この補酵素の変化量を３４０ｎｍにおける吸光度の測定を行い、その変化から尿素窒素量を得ることができる。
【００２１】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋（併せてＮＡＤ（Ｐ）＋と略称することがある）を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素、例えばウレアアミドリアーゼ（ＵＲＬ）、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）は、保存時又は該酵素反応系において不安定化する現象がみられる。本発明者等による検討の結果、かかる不安定化は酵素自体が不安定であることに加え、β−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋の分解生成物が主たる原因となっていることが判明した。
【００２２】
例えば、ＵＲＬ酵素溶液にβ−ＮＡＤ＋又はβ−ＮＡＤＰ＋を３ｍＭ添加して３０℃、５日間保存すると、無添加の場合に比較して残存活性（％）が低下したが、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）をそれぞれ添加した場合は残存活性（％）は低下しないか又は若干低下したにすぎない（図３）。そこで、β−ＮＡＤ＋の分解生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー）を用いて分析したところ、ＡＤＰ−リボースが無視できない量存在することを確認し、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質であるとの示唆を得た。これを検証するために、ＡＤＰ−リボースをＵＲＬ酵素溶液に添加したところ、ＮＡＤ＋分解生成物を添加した場合と同等のいちじるしい残存活性（％）の低下がみられた。このため、ＡＤＰ−リボースがＵＲＬの不安定化の原因物質であることが確認された（図３）。
【００２３】
同様に、ＡＤＰ−ＨＫも上記反応系において残存活性低下がみられることを確認した。
【００２４】
さらに検討した結果、本発明者等は、ＡＤＰ−リボースによる上述の酵素の不安定化は特定の化合物を酵素と共存させることで回避し得ることを見出した。このような化合物としては、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン、及びセミカルバジド、ヒドロキシルアミンのようなヒドラジン類縁体があり、特にＬ−システインとヒドロキシルアミンが好ましい。これらは単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ等の不安定化を回避するのに使用できる安定化剤としては、Ｌ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体、例えば塩酸ヒドロキシルアミン、塩酸セミカルバジド等があげられる。これらの安定化剤の使用量は酵素反応の温度、用いるＮＡＤ（Ｐ）＋の濃度等に応じて変わり、予備試験を行うことにより適宜決めることができるが、一般に０．１〜５０ｍＭであり、好ましくは１〜２５ｍＭである。安定化剤としてＬ−システインを用いる場合、Ｌ−システインの安定化補助剤として酸化防止剤、例えばＬ−システインを除くスルフヒドリル化合物を用いることが好ましい。
【００２６】
本発明による尿素窒素の測定は用手法、自動分析法のいずれによってもよい。
【００２７】
Ｌ−システイン、システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体は非酵素的にＡＤＰ−リボースと結合し、ＡＤＰ−リボースの酵素に対する修飾作用（ＡＤＰ−リボシル化作用）を阻害するものと考えられる。理論に縛られるつもりはないが、この阻害作用は、システイン、ヒドラジン又はそれらの類縁体のＡＤＰ−リボース又はその構造類似物に対する非酵素的結合によるものと考えられる。いずれにしても、酵素タンパク質がＡＤＰ−リボース又はその構造類似物と結合する部位に対するＡＤＰ−リボース又はその構造類似物のアクセスがこれらの化合物により妨げられる結果、タンパク質の修飾が阻害され、酵素タンパク質の不安定化又は失活が回避されるものと考えられる。
【００２８】
このように、ＵＲＬ、Ｇ６ＰＤＨ、ＡＤＰ−ＨＫに限らず、ＡＤＰ−リボースにより修飾されて不安定化又は失活する酵素であれば、Ｇ１ｕＤＨ（グルタミン酸脱水素酵素）、ＰＫ（ピルビン酸キナーゼ）、ＨＫ（ヘキソキナーゼ）、ＭＤＨ（リンゴ酸脱水素酵素）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）など上述の本発明による安定化剤を酵素と共存させることで不安定化を回避することができる。
【００２９】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００３０】
実施例１ 尿素窒素測定試薬の組成
図１の反応系による尿素窒素の測定に用いる試薬の組成の一例をあげると次の通りである。第一試薬及び第二試薬のそれぞれの成分を下記の濃度になるように精製水に溶解して調製した。
【００３１】
【表１】
ＴＡＰＳ： Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸
Ｇ６ＰＤＨ： グルコース−６−リン酸脱水素酵素
【００３２】
実施例２ ＵＲＬの安定性試験
ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３．３ｍＭ）とＬ−システイン（０ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，１５ｍＭ，２０ｍＭ，２５ｍＭ，３０ｍＭ，３５ｍＭ，４０ｍＭ，４５ｍＭ，又は５０ｍＭ）を添加した以外は実施例１と同様の組成の第一試薬を調製し、−８０℃、２〜８℃又は３０℃の各温度で７日間保存した場合について、ＵＲＬの残存活性（％）を求めた（−８０℃での残存活性を１００％とした）ところ、図２に示す結果が得られた。２〜８℃では約１５ｍＭで残存活性がほぼ１００％に達する。３０℃では約５ｍＭで残存活性が約５０％に達し、約３７ｍＭで１００％に達する。従って、温度によってＬ−システインの使用量は変わるが、約１５〜４０ｍ以上で残存活性がよく、３０℃以下で保存した場合は約３７ｍＭで残存活性が１００％になる。他の化合物も同様の傾向を示した。
【００３３】
実施例３〜６ ＵＲＬの安定性試験
ＵＲＬの安定性試験を次のようにして行った。実施例１に示す第一試薬において、Ｌ−システイン及びβ−ＮＡＤＰ＋を除いたもの（無添加）、Ｌ−システインを除き、β−ＮＡＤＰ＋の代わりにβ−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）、ＡＤＰ−リボース（０．３ｍＭ）、ニコチンアミド（１ｍＭ）、アデノシン（１ｍＭ）、ＡＤＰ（１ｍＭ）、β−ＮＡＤＰ＋（１ｍＭ）を添加したものを作成し、３０℃・５日間保存した場合のＵＲＬの安定性について検討した。その結果を図３に示す。この結果から明らかなように、ニコチンアミド、アデノシン、ＡＤＰは無添加とほぼ同じ安定性を示したのに対し、β−ＮＡＤ＋、ＡＤＰ−リボース、β−ＮＡＤＰ＋を添加することによりＵＲＬの顕著な不安定化が起こった。β−ＮＡＤ＋が加水分解されるとＡＤＰ−リボースとニコチンアミドを生じるが、この内ＡＤＰ−リボースにより顕著に不安定化されたことから、ＡＤＰ−リボースにより酵素の不安定化が引き起こされると考えられる。
【００３４】
更に、実施例１に示す第一試薬において、β−ＮＡＤＰ＋の代わりに、β−ＮＡＤ＋（３ｍＭ）を添加し、Ｌ−システインを８ｍＭ、２０ｍＭ添加したもの（実施例３）及び、Ｌ−システインの代わりにセミカルバジド（実施例４）、ヒドラジン（実施例５）、ヒドロキシルアミン（実施例６）をそれぞれ、８ｍＭ、２０ｍＭ添加したものを３０℃・５日間保存したときのＵＲＬの安定性を検討した。その結果を図３に示す。
【００３５】
これらの結果から、明らかなように、安定化剤はいずれの濃度でも６０％以上の残存活性を示した。Ｌ−システインとセミカルバジドは２０ｍＭの濃度で７０％を越える残存活性を示し、ヒドロキシルアミンは８ｍＭの濃度で約７７％の残存活性を示した。
【００３６】
実施例７〜９ ＵＲＬの安定性試験
Ｌ−システイン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例７）、塩酸セミカルバジド（０．２％、１％）（実施例８）、塩酸ヒドロキシルアミン（４ｍＭ、２０ｍＭ）（実施例９）を用いて実施例２と同様にして第一試薬をそれぞれ調製した。対照として上述の安定化剤を含まずＮＡＤＰの代わりにＡＤＰ−リボース（４０μＭ）を含む以外は実施例２と同じ組成のもの、及び安定化剤もＡＤＰ−リボースも含まないものを調製した。これらの試薬を用いて２〜８℃、２５℃又は３７℃の各温度で５日間保存した場合のＵＲＬの安定性について検討した。
【００３７】
得られた結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
実施例１０〜１３ Ｇ６ＰＤＨの安定性試験
Ｇ６ＰＤＨの安定性試験を次のようにして行った。実施例１に示す第一試薬において、Ｌ−システインを２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの（実施例１０）及びＬ−システインの代わりにヒドラジン（実施例１１）、ヒドロキシルアミン（実施例１２）、セミカルバジド（実施例１３）を、それぞれ２．５ｍＭ、１０ｍＭ添加したもの更に、前記試薬からβ−ＮＡＤＰ＋を除いたものを作成し、３７℃・４日間保存したときのＧ６ＰＤＨの安定性を検討した。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】
表３の結果から明らかなように、安定化剤及びβ−ＮＡＤＰのいずれも添加しなかったときは残存活性が９６．４％であったが、β−ＮＡＤＰが２．５ｍＭ存在すると残存活性は６９．５％に低下した。これに対して、安定化剤としてＬ−システイン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドが存在すると、β−ＮＡＤＰ無添加の場合は残存活性は安定化剤添加量が２．５ｍＭ、１０ｍＭのいずれにおいても無添加の場合とほぼ同じである。これに対して、２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰ存在化ではβ−ＮＡＤＰ無添加の場合に比べて安定化剤の安定化効果は若干の低下がみられるものの、安定化剤が存在せず２．５ｍＭのβ−ＮＡＤＰが存在する場合に比べていちじるしい安定化効果がみられた。
【００４２】
実施例１４ ＡＤＰ−ＨＫの安定性試験
表１に示す試薬組成でＬ−システインを添加したものと添加していないものを作成し、ＡＤＰ−ＨＫの安定性を検討した。各温度で３０日間保存したときの酵素残存活性（％）を表４に示す。
【表４】
【００４３】
２５℃及び３０℃でＡＤＰ−ＨＫを保存すると酵素残存活性はそれぞれ６８、５９％に低下する。Ｌ−システイン添加により残存活性はそれぞれ９１、８２％と維持された。
【００４４】
実施例１５ １−チオグリセロールによるＬ−システインの酵素安定化作用の増強試験
Ｌ−システインは実施例２及び図２に示すように、保存時における安定化剤としての作用が保存温度により異なり、３０℃では１０ｍＭ以下の低濃度で効果が低い。表５に示すように 尿素窒素測定用の試薬にＬ−システイン０，２，４，６，８，１０ｍＭを安定化剤として単独添加し、３７℃で１１日間保存した場合、酵素（ＵＲＬ）の残存活性は、それぞれ２，１２，１５，１９，２８，４２％であった。１−チオグリセロールは本酵素系では単独では酵素安定化作用をほとんど示さないが、Ｌ−システインとともにその補助剤として試薬に加えると、Ｌ−システインの酵素安定化作用を著しく増強した。２ｍＭ Ｌ−システイン存在下の酵素残存活性が１−チオグリセロール１０ｍＭ添加により６４％に、２５ｍＭ添加により８７％に増加した。さらに、Ｌ−システイン１０ｍＭ存在下では１０ｍＭ以上の１−チオグリセロール添加により酵素残存活性はほぼ１００％となった。従って、Ｌ−システインを前記酵素の安定化剤として使用する場合、１−チオグリセロールをその安定化補助物質として用いることで著しい効果が得られる。
【表５】
実施例１６〜２０ Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＨＫ、ＭＤＨ、ＬＤＨの安定性試験（１）
０．１％ＢＳＡ、３．３ｍＭ β−ＮＡＤ及び安定化剤として１０ｍＭ Ｌ−システイン塩酸塩及び３３ｍＭ １−チオグリセロール、１０ｍＭ塩酸ヒドラジン、１０ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミンをそれぞれ含む５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０を負荷液とした。それそれの負荷液に１．０Ｕ／ｍＬになるようにＧ１ｕＤＨ（実施例１６）、ＰＫ（実施例１７）、ＨＫ（ヘキソキナーゼ）（実施例１８）、ＭＤＨ（実施例１９）、ＬＤＨ（実施例２０）をそれぞれ溶解し、ＨＫ、ＭＤＨは３０℃で７日間負荷を行い、一方Ｇ１ｕＤＨ、ＰＫ、ＬＤＨは３７℃で７日間の負荷を行い、それぞれ安定性を検討した。また、対照として安定化物質及び不安定化物質を含まないものも検討した。負荷前の活性を１００％とした時の酵素の残存率を表６に示す。
【表６】
実施例２１〜２５としてそれぞれ実施例１６〜２０の３．３ｍＭ β−ＮＡＤの代わりに０．３３ｍＭ ＡＤＰ−リボースを用いて、実施例１６〜２０と同様に安定性の検討を行った。その結果を酵素の残存率として表７に示す。
残存率を表７に示す。
【表７】
【発明の効果】
本発明に従い、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とする酵素を含む酵素反応系に用いられる酵素と、安定化剤としてＬ−システイン、Ｌ−システイン類縁体、ヒドラジン及びヒドラジン類縁体からなる群から選ばれる少なくとも１種の化合物とを共存させることで、系外にβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋分解生成物とシステイン等の化合物との複合体を取り出すことなく、簡単に酵素の修飾を防止でき、酵素の不安定化を回避することができるので、試薬測定の自動化が可能である。また、本発明を尿素窒素の測定試薬キットに適用する場合は、試薬に用いるβ−ＮＡＤ（Ｐ）＋を精製することなく、そのまま使用できるので試薬製造のプロセスを減らすことができ、コスト的にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施形態に従う尿素窒素測定方法に用いる複合酵素系の反応（測定原理）を説明する反応行程図である。
【図２】異なる温度におけるＬ−システインとウレアアミドリアーゼ残存活性（％）との関係を示すグラフである。
【図３】ウレアアミドリアーゼに対する安定化剤の効果を示すグラフである。
【符号の説明】
ＵＲＬ ウレアアミドリアーゼ
ＡＤＰ−ＨＫ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ
Ｇ６ＰＤＨ グルコース−６−リン酸脱水素酵素
Claims (3)
- ウレアアミドリアーゼを含む尿素窒素測定試薬の安定化方法であって、Ｌ−システイン、ヒドラジン、セミカルバジド及びヒドロキシルアミンから選ばれる少なくとも１種の化合物を含有させることを特徴とする、尿素窒素測定試薬の安定化方法。
- Ｌ−システイン、ヒドラジン、セミカルバジド及びヒドロキシルアミンから選ばれる少なくとも１種の化合物と、ウレアアミドリアーゼを含有する尿素窒素測定試薬。
- 酸化防止剤を含有する請求項２に記載の尿素窒素測定試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31490799A JP4413340B2 (ja) | 1998-12-25 | 1999-11-05 | 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP37064998 | 1998-12-25 | ||
| JP10-370649 | 1998-12-25 | ||
| JP31490799A JP4413340B2 (ja) | 1998-12-25 | 1999-11-05 | 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000236874A JP2000236874A (ja) | 2000-09-05 |
| JP2000236874A5 JP2000236874A5 (ja) | 2006-12-14 |
| JP4413340B2 true JP4413340B2 (ja) | 2010-02-10 |
Family
ID=26568108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31490799A Expired - Fee Related JP4413340B2 (ja) | 1998-12-25 | 1999-11-05 | 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4413340B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011024513A (ja) * | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Nitto Boseki Co Ltd | ドライケミストリーによるデヒドロゲナーゼまたは対応する基質の測定方法およびそれに用いる検査器具 |
| JP2011103826A (ja) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Nitto Boseki Co Ltd | Ａｄｐまたは酵素反応でａｄｐを発生する特定物質のドライケミストリーによる測定方法およびそれに用いる検査器具 |
| JP5843072B2 (ja) * | 2010-04-30 | 2016-01-13 | 日東紡績株式会社 | 特定物質の測定方法および特定物質測定用キット |
| CN110702676A (zh) * | 2019-11-14 | 2020-01-17 | 北京华宇亿康生物工程技术有限公司 | 一种稳定性好的检测1，5-ag的试剂盒及方法 |
-
1999
- 1999-11-05 JP JP31490799A patent/JP4413340B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000236874A (ja) | 2000-09-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blumenthal et al. | Functional arginine residues involved in coenzyme binding by glutamate dehydrogenases | |
| Kemp | Inhibition of muscle pyruvate kinase by creatine phosphate | |
| JP4413340B2 (ja) | 酵素の安定化方法及び安定化された測定試薬 | |
| JP2854995B2 (ja) | 尿酸測定用試薬組成物 | |
| JP3619865B2 (ja) | 液体の安定なチオール活性化剤 | |
| US6162615A (en) | Stabilized coenzyme solutions and their use thereof for the determination of dehydrogenases or the substrate thereof in an alkaline medium | |
| JP3310295B2 (ja) | グルコース測定用試薬 | |
| JP3310296B2 (ja) | クレアチンキナーゼ測定用試薬 | |
| Roux et al. | Circular dichroism and nucleotide and phosphate-induced conformational changes of mitochondrial adenosine triphosphatase | |
| JPH05308968A (ja) | 液状の尿酸オキシダーゼ酵素の安定化方法 | |
| US7300769B2 (en) | Stabilized coenzyme solutions for determining dehydrogenase activity | |
| JP3682729B2 (ja) | 尿素窒素測定用試薬 | |
| JPS59151899A (ja) | 測定用組成物 | |
| JP2000032980A (ja) | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの安定化方法およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ含有組成物 | |
| JP4558119B2 (ja) | クレアチンキナーゼ検出用の液状試薬 | |
| JP4050384B2 (ja) | ヘキソキナーゼ又はグルコキナーゼの安定化法及び試薬組成物 | |
| JP3161316B2 (ja) | クレアチンキナーゼ活性測定用液状試薬 | |
| Chiaki et al. | The effects of cephem antibiotics and related compounds on the aldehyde dehydrogenase in rat liver mitochondria | |
| JPH0130839B2 (ja) | ||
| JP4284384B2 (ja) | グリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 | |
| JPH0195779A (ja) | 安定な酵素組成物および酵素組成物の安定化方法 | |
| JP3521620B2 (ja) | 生体成分測定方法 | |
| JPH027319B2 (ja) | ||
| JPH11165A (ja) | ウレアーゼ阻害剤 | |
| Onigbinde et al. | Mechanism of differential inhibition of lactate dehydrogenase isoenzymes in the BMC LD-1 assay |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20050928 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061031 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061031 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090806 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091001 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20091026 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091118 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121127 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121127 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20151127 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |