JP4284384B2 - グリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明はグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、L-α-グリセロリン酸を酸化してジヒドロキシアセトンリン酸と過酸化水素を生成するL-α-グリセロリン酸オキシダーゼ(以下GPOと略す)は診断用試薬として使用され重要視されている。しかし、GPOは不安定であり特にGPO低濃度水溶液において不安定である。また、GPOを含有する組成物は凍結乾燥する場合、その間あるいは凍結乾燥後の活性が低下するものであった。
【0003】
これに対し、安定化剤としてフラビン含有物質、糖類、アルブミン、アミノ酸からなる群から選ばれた1種または2種以上の化合物を添加することで効果があることが示されている(特公昭61−23995)。また、安定化剤として酸性アミノ酸例えばグルタミン酸、アスパラギン酸を添加することで効果があることが示されている(特開昭58−86083)。また、飽和ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、ヒドロキシジカルボン酸、不飽和ジカルボン酸、カルボニルカルボン酸、またはトリカルボン酸またはそれらの水溶性塩類からなる群から選ばれた1種または2種以上の化合物を添加することで効果があるとの報告もある(特公平4−46558)。しかしながら、これらの組成物では凍結乾燥時の安定性に効果はみられるが、液状状態における安定性には尚問題が残る。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
これに対し近年、診断用試薬では液状状態で長期間安定である液状試薬が主流になり、益々液状安定性に対する要求が強くなっている。このことから、本発明が解決しようとする課題は長期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するGPOを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、GPOにピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)(以下PIPESと略す)またはその塩を共存させることにより、GPOを液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
(1)GPOにPIPESまたはその塩を共存させることを特徴とするグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法。
(2)pH6〜7.5に調製された(1)のGPOの安定化方法。
(3)PIPESまたはその塩が0.01〜1Mの濃度で用いられる(1)のGPOの安定化方法。
(4)GPOにPIPESまたはその塩を共存させることを特徴とするGPOの安定化組成物。
(5)pH6〜7.5に調製された(4)のGPOの安定化組成物。
(6)PIPESまたはその塩が0.01〜1Mの濃度で用いられる(4)のGPOの安定化組成物。
(7)中性脂肪測定試薬で用いられる(4)のグリセロリン酸オキシダーゼの安定化組成物。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定」とは、加温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味し、具体的には、35℃7日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して、75%以上(好ましくは85%以上、さらに好ましくは90%以上)維持されていることをいう。
【0008】
本発明の一実施態様として、GPOにPIPESまたはその塩を共存させることを特徴とするGPOの安定化方法がある。
【0009】
本発明に使用されるPIPESとしては、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩やアンモニウム塩の形で用いてもよい。GPOを含む溶液中の濃度としては特に限定されるものではないが、好ましくは0.01〜1M、さらに好ましくは0.025〜0.4Mの範囲で使用される。また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、GOOD緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、リン酸緩衝液は濃度、温度によってpHが変動しやすいが、安価であるという利点がある。一方、GOOD緩衝液にはMES、Bis−Tris、ADA、ACES、BES、MOPS、TES、HEPES、Tricine、Bicine、POPSO、TAPS、CHES、CAPSなどが例示される。PIPESもGOOD緩衝液として単独で用いられるが、これらその他の緩衝液と併用して用いることもできる。該緩衝液のpH調整範囲は特に限定されないが、好ましくは6〜7.5さらに好ましくは6〜6.5の範囲で調整されるのが望ましい。
【0010】
本発明に用いられるGPOとはEC1.1.3.21に分類される以下の反応を触媒する酵素である。
L-α-グリセロリン酸+O2→ジヒドロキシアセトンリン酸+H2O2
上記酵素はペディオコッカス属、アエロコッカス属、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノストック属などの微生物から採取されるもの、またはこれらの遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性質を改変したものを含有する。
GPOを含む溶液中のGPOの濃度は、酵素の起源によっても異なり、通常0.1〜20U/mLの範囲で好適に用いられるが、本発明は5U/mL以下の低濃度においても効果を発揮することができる。
【0011】
本発明において、GPO溶液には、さらに防腐剤、界面活性剤などをGPOの反応に特に悪い影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。
防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活性剤などが挙げられる。
【0012】
また、従来公知のGPO安定化剤も併用して用いることができる。従来公知のGPO安定化剤としては例えばフラビン含有物質、糖類、アルブミン等が挙げられる。
また、該GPO溶液中には診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。該診断用試薬としては、トリグリセライド測定試薬、マグネシウム測定試薬が挙げられる。
【0013】
トリグリセライド測定試薬としては、一般にGPOの他、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ATP、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色原体が含有される。マグネシウム測定試薬としては、一般にはGPOの他、グリセロールキナーゼ、ATP、ペルオキシダーゼ、色原体、キレート剤が含有される。
【0014】
本発明における上記安定化剤を含むGPO組成物は水溶液であっても、凍結乾燥したものであってもよい。
【0015】
GPOの活性測定は以下の測定条件で行うのが好ましい。
〈反応液〉
200mM PIPES緩衝液、pH6.5
600mM グリセロリン酸
1.4mM 4-アミノアンチピリン
1.0mM TOOS
11U/mL ペルオキシダーゼ
〈測定条件〉
(1)上記反応液2.5mLをキュベットにとり、30℃で約5分間予備加温する。
(2)酵素溶液0.1mLを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に30℃に制御された分光光度計で555nmの吸光度変化を3〜4分間記録し、その初期直線部分から1分間あたりの吸光度変化を求める。
(3)盲検は反応液に酵素溶液の代わりに精製水を0.1mL加えて上記同様の操作を行い1分間あたりの吸光度変化を求める。
【0016】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
【0017】
実施例1:GPO(東洋紡績製G3O−311)5U/mLを含む下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液を変えて調製し、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0018】
(試薬の調製)
下記組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
各種緩衝剤 濃度、pHは表に記載
MgCl2 1mmol/L
アデノシン3リン酸2Na塩 1mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.4mmol/L
フラビンアデニンジヌクレオチド2Na塩 8μmol/L
グリセロールキナーゼ(東洋紡社製GYK−311) 3U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡社製ASO−311) 3U/mL
カタラーゼ(東洋紡社製) 200U/mL
GPO(東洋紡社製G3O−311) 5U/mL
【0019】
結果 表1に示す。緩衝剤としてPIPESを用いた試薬でのGPO残存活性は、その他の緩衝剤を用いた場合に比較し安定であった。
【0020】
実施例2:GPO(東洋紡績製G3O−311)5U/mLを含む実施例▲1▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液をPIPES(pH6.75)とし濃度を0、25、50、100、200、400mMに変えて調製し、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0021】
【表1】
【0022】
結果 表1に示す。PIPES濃度が高いほどGPO安定性は良好であったが、低濃度でも他の緩衝剤より良好な安定性が得られた。
【0023】
実施例3:GPO(東洋紡績製G3O−311)5U/mLを含む実施例▲1▼の組成からなる中性脂肪測定試薬の第一試薬の緩衝液を50mMPIPESとし、pHを6.0、6.25、6.5、7.0、7.5、8.0に変えて調製し、35℃で7日間保存し、残存活性(溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割合)を検討した。
【0024】
【表2】
【0025】
結果 表2に示す。特にpH6〜7.5で良好な安定性が得られた。
【0026】
【発明の効果】
本発明においては、GPOを含有する組成物中にPIPESまたはその塩を共存させることにより、従来よりも液状状態で長期間安定な組成物が得られる。
Claims (2)
- グリセロリン酸オキシダーゼに0.01〜1Mのピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)またはその塩を共存させ、pH6〜7に調整することを特徴とし、さらに以下の(1)〜(7)の成分を含有する中性脂肪測定用液状試薬中での、グリセロリン酸オキシダーゼの35℃7日間保存後の残存酵素活性を、加温処理していないものと比較して75%以上に安定化させる方法。
(1)マグネシウムイオン
(2)アデノシン3リン酸またはその塩
(3)色原体
(4)フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩
(5)グリセロールキナーゼ
(6)アスコルビン酸オキシダーゼ
(7)カタラーゼ - グリセロリン酸オキシダーゼに0.01〜1Mのピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸)またはその塩を共存させ、pH6〜7に調整することを特徴とし、さらに以下の(1)〜(7)の成分を含有する中性脂肪測定用液状試薬組成物であって、グリセロリン酸オキシダーゼの35℃7日間保存後の残存酵素活性が加温処理していないものと比較して75%以上に安定化されている中性脂肪測定用液状試薬組成物。
(1)マグネシウムイオン
(2)アデノシン3リン酸またはその塩
(3)色原体
(4)フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩
(5)グリセロールキナーゼ
(6)アスコルビン酸オキシダーゼ
(7)カタラーゼ
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JP2001180548A JP4284384B2 (ja) | 2001-06-14 | 2001-06-14 | グリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 |
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