JP2002369680A - グリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法および安定化組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明はグリセロリン酸オキシダーゼの安定
化方法およびその組成物に関する。 【解決手段】 グリセロリン酸オキシダーゼにピペラジ
ン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）またはその
塩を共存させることを特徴とするグリセロリン酸オキシ
ダーゼの安定化方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はグリセロリン酸オキ
シダーゼの安定化方法およびその組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、Ｌ-α-グリセロリン酸を酸化して
ジヒドロキシアセトンリン酸と過酸化水素を生成するＬ
-α-グリセロリン酸オキシダーゼ（以下ＧＰＯと略す）
は診断用試薬として使用され重要視されている。しか
し、ＧＰＯは不安定であり特にＧＰＯ低濃度水溶液にお
いて不安定である。また、ＧＰＯを含有する組成物は凍
結乾燥する場合、その間あるいは凍結乾燥後の活性が低
下するものであった。

【０００３】これに対し、安定化剤としてフラビン含有
物質、糖類、アルブミン、アミノ酸からなる群から選ば
れた１種または２種以上の化合物を添加することで効果
があることが示されている（特公昭６１−２３９９
５）。また、安定化剤として酸性アミノ酸例えばグルタ
ミン酸、アスパラギン酸を添加することで効果があるこ
とが示されている（特開昭５８−８６０８３）。また、
飽和ジカルボン酸、芳香族ジカルボン酸、ヒドロキシジ
カルボン酸、不飽和ジカルボン酸、カルボニルカルボン
酸、またはトリカルボン酸またはそれらの水溶性塩類か
らなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物を添
加することで効果があるとの報告もある（特公平４−４
６５５８）。しかしながら、これらの組成物では凍結乾
燥時の安定性に効果はみられるが、液状状態における安
定性には尚問題が残る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これに対し近年、診断
用試薬では液状状態で長期間安定である液状試薬が主流
になり、益々液状安定性に対する要求が強くなってい
る。このことから、本発明が解決しようとする課題は長
期間安定な液状試薬として耐えうる安定性を有するＧＰ
Ｏを提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために種々検討した結果、ＧＰＯにピペラジ
ン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩ
ＰＥＳと略す）またはその塩を共存させることにより、
ＧＰＯを液状状態で長期間安定に保つことを見出し、本
発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）ＧＰＯにＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させるこ
とを特徴とするグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方
法。 （２）ｐＨ６〜７．５に調製された（１）のＧＰＯの安
定化方法。 （３）ＰＩＰＥＳまたはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度
で用いられる（１）のＧＰＯの安定化方法。 （４）ＧＰＯにＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させるこ
とを特徴とするＧＰＯの安定化組成物。 （５）ｐＨ６〜７．５に調製された（４）のＧＰＯの安
定化組成物。 （６）ＰＩＰＥＳまたはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度
で用いられる（４）のＧＰＯの安定化組成物。 （７）中性脂肪測定試薬で用いられる（４）のグリセロ
リン酸オキシダーゼの安定化組成物。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明において「安定」とは、加
温処理に対しても酵素活性が維持されていることを意味
し、具体的には、３５℃７日間保存後の残存酵素活性が
加温処理していないものと比較して、７５％以上（好ま
しくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上）維持
されていることをいう。

【０００８】本発明の一実施態様として、ＧＰＯにＰＩ
ＰＥＳまたはその塩を共存させることを特徴とするＧＰ
Ｏの安定化方法がある。

【０００９】本発明に使用されるＰＩＰＥＳとしては、
例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩やアンモ
ニウム塩の形で用いてもよい。ＧＰＯを含む溶液中の濃
度としては特に限定されるものではないが、好ましくは
０．０１〜１Ｍ、さらに好ましくは０．０２５〜０．４
Ｍの範囲で使用される。また、従来から用いられている
緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯ
Ｄ緩衝液などが挙げられる。なかでも、トリス緩衝液、
リン酸緩衝液は濃度、温度によってｐＨが変動しやすい
が、安価であるという利点がある。一方、ＧＯＯＤ緩衝
液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、
ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎ
ｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、
ＣＡＰＳなどが例示される。ＰＩＰＥＳもＧＯＯＤ緩衝
液として単独で用いられるが、これらその他の緩衝液と
併用して用いることもできる。該緩衝液のｐＨ調整範囲
は特に限定されないが、好ましくは６〜７．５さらに好
ましくは６〜６．５の範囲で調整されるのが望ましい。

【００１０】本発明に用いられるＧＰＯとはＥＣ１．
１．３．２１に分類される以下の反応を触媒する酵素で
ある。 Ｌ-α-グリセロリン酸＋Ｏ₂→ジヒドロキシアセトンリ
ン酸＋Ｈ₂Ｏ₂ 上記酵素はペディオコッカス属、アエロコッカス属、ス
トレプトコッカス属、ラクトバチルス属、ロイコノスト
ック属などの微生物から採取されるもの、またはこれら
の遺伝子を他の微生物に組み込まれた遺伝子組換え微生
物より製造されたものなどがあり、また、遺伝子的に性
質を改変したものを含有する。ＧＰＯを含む溶液中のＧ
ＰＯの濃度は、酵素の起源によっても異なり、通常０．
１〜２０Ｕ／ｍＬの範囲で好適に用いられるが、本発明
は５Ｕ／ｍＬ以下の低濃度においても効果を発揮するこ
とができる。

【００１１】本発明において、ＧＰＯ溶液には、さらに
防腐剤、界面活性剤などをＧＰＯの反応に特に悪い影響
を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、
アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げら
れる。界面活性剤としては非イオン界面活性剤、陽イオ
ン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性イオン界面活
性剤などが挙げられる。

【００１２】また、従来公知のＧＰＯ安定化剤も併用し
て用いることができる。従来公知のＧＰＯ安定化剤とし
ては例えばフラビン含有物質、糖類、アルブミン等が挙
げられる。また、該ＧＰＯ溶液中には診断用試薬として
必要な他の試薬が含まれていてもよい。該診断用試薬と
しては、トリグリセライド測定試薬、マグネシウム測定
試薬が挙げられる。

【００１３】トリグリセライド測定試薬としては、一般
にＧＰＯの他、リパーゼ、グリセロールキナーゼ、ＡＴ
Ｐ、マグネシウム、ペルオキシダーゼ、色源体が含有さ
れる。マグネシウム測定試薬としては、一般にはＧＰＯ
の他、グリセロールキナーゼ、ＡＴＰ、ペルオキシダー
ゼ、色源体、キレート剤が含有される。

【００１４】本発明における上記安定化剤を含むＧＰＯ
組成物は水溶液であっても、凍結乾燥したものであって
もよい。

【００１５】ＧＰＯの活性測定は以下の測定条件で行う
のが好ましい。 〈反応液〉 ２００ｍＭ ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５ ６００ｍＭ グリセロリン酸 １．４ｍＭ ４-アミノアンチピリン １．０ｍＭ ＴＯＯＳ １１Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ 〈測定条件〉 （１）上記反応液２．５ｍＬをキュベットにとり、３０
℃で約５分間予備加温する。 （２）酵素溶液０．１ｍＬを添加し、ゆるやかに混和
後、水を対照に３０℃に制御された分光光度計で５５５
ｎｍの吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部
分から１分間あたりの吸光度変化を求める。 （３）盲検は反応液に酵素溶液の代わりに精製水を０．
１ｍＬ加えて上記同様の操作を行い１分間あたりの吸光
度変化を求める。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、本発明は実施例により特に限定されるもので
はない。

【００１７】実施例１：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３
１１）５Ｕ／ｍＬを含む下記組成からなる中性脂肪測定
試薬の第一試薬の緩衝液を変えて調製し、３５℃で７日
間保存し、残存活性（溶解直後の活性値に対する保存後
の活性値の割合）を検討した。

【００１８】（試薬の調製）下記組成からなる中性脂肪
測定試薬の第一試薬をそれぞれ調製した。 第一試薬 各種緩衝剤 濃度、ｐＨは表に記載 ＭｇＣｌ２ １ｍｍｏｌ／Ｌ アデノシン３リン酸２Ｎａ塩 １ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン ０．４ｍｍｏｌ／Ｌ フラビンアデニンジヌクレオチド２Ｎａ塩 ８μｍｏｌ／Ｌ グリセロールキナーゼ（東洋紡社製ＧＹＫ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ３Ｕ／ｍＬ カタラーゼ（東洋紡社製） ２００Ｕ／ｍＬ ＧＰＯ（東洋紡社製Ｇ３Ｏ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ

【００１９】結果 表１に示す。緩衝剤としてＰＩＰＥ
Ｓを用いた試薬でのＧＰＯ残存活性は、その他の緩衝剤
を用いた場合に比較し安定であった。

【００２０】実施例２：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３
１１）５Ｕ／ｍＬを含む実施例の組成からなる中性脂
肪測定試薬の第一試薬の緩衝液をＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．
７５）とし濃度を０、２５、５０、１００、２００、４
００ｍＭに変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残存
活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割
合）を検討した。

【００２１】

【表１】

【００２２】結果 表１に示す。ＰＩＰＥＳ濃度が高い
ほどＧＰＯ安定性は良好であったが、低濃度でも他の緩
衝剤より良好な安定性が得られた。

【００２３】実施例３：ＧＰＯ（東洋紡績製Ｇ３Ｏ−３
１１）５Ｕ／ｍＬを含む実施例の組成からなる中性脂
肪測定試薬の第一試薬の緩衝液を５０ｍＭＰＩＰＥＳと
し、ｐＨを６．０、６．２５、６．５、７．０、７．
５、８．０に変えて調製し、３５℃で７日間保存し、残
存活性（溶解直後の活性値に対する保存後の活性値の割
合）を検討した。

【００２４】

【表２】

【００２５】結果 表２に示す。特にｐＨ６〜７．５で
良好な安定性が得られた。

【００２６】

【発明の効果】本発明においては、ＧＰＯを含有する組
成物中にＰＩＰＥＳまたはその塩を共存させることによ
り、従来よりも液状状態で長期間安定な組成物が得られ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B050 CC07 HH03 HH04 KK10 LL03 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ70 QR03 QR66 QS28 QS36 QX01

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】グリセロリン酸オキシダーゼにピペラジン
   −１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）またはその塩
   を共存させることを特徴とするグリセロリン酸オキシダ
   ーゼの安定化方法。
2. 【請求項２】ｐＨ６〜７．５に調製された請求項１記載
   のグリセロリン酸オキシダーゼの安定化方法。
3. 【請求項３】ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンス
   ルホン酸）またはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度で用い
   られる請求項１記載のグリセロリン酸オキシダーゼの安
   定化方法。
4. 【請求項４】グリセロリン酸オキシダーゼにピペラジン
   −１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）またはその塩
   を共存させることを特徴とするグリセロリン酸オキシダ
   ーゼの安定化組成物。
5. 【請求項５】ｐＨ６〜７．５に調製された請求項４記載
   のグリセロリン酸オキシダーゼの安定化組成物。
6. 【請求項６】ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンス
   ルホン酸）またはその塩が０．０１〜１Ｍの濃度で用い
   られる請求項４記載のグリセロリン酸オキシダーゼの安
   定化組成物。
7. 【請求項７】中性脂肪測定試薬で用いられる請求項４記
   載のグリセロリン酸オキシダーゼの安定化組成物。