JPH027319B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はNAD及びNADPを含有する略中性溶
液の安定化法に関するものである。 NAD（ニコチンアミドアデニンジヌレオチド）
及びNADP（ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド燐酸）は、種々の脱水素酵素と共役する補酵
素であり、臨床化学分野において極めて重要な化
合物となつている。 NAD及びNADPが共役する脱水素酵素として
は、乳酸脱水素酵素、グルコース−６−燐酸脱水
素酵素、グリセロール脱水素酵素、ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、コレ
ステロール脱水素酵素、りんご酸脱水素酵素、ヒ
ドロキシステロイド脱水素酵素、ロイシン脱水素
酵素、ジアホラーゼ等が挙げられる。従つてこれ
らの脱水素酵素に前記補酵素を組合せることによ
つて、或は必要に応じて他の適当な酵素と組合わ
せることによつて、例えばグルコース、グリセリ
ン、中性脂肪、尿酸、クレアチニン、クレアチ
ン、アンモニア、尿素窒素、コレステロール、胆
汁酸、ステロイド、乳酸、ピルビン酸等の含有量
を測定したり、或はトランスアミナーゼ活性やア
ミノペプチダーゼ活性を測定することができる。
又逆の観点から、上記補酵素と適当な基質を組合
わせれば脱水素酵素活性を測定することも可能で
ある。 これらの測定は水溶液中で行なわれ、しかもそ
のPHは中性付近に調整されるが、一般に酸化型
NAD及び酸化型NADPは酸性溶液下で安定であ
り、一方還元型NADH及び還元型NADPHはア
ルカリ性領域下で安定であつて、前記中性付近に
おける安定性はいずれもせいぜい１日程度である
と考えられている。もつとも固体状の前記補酵素
群は、水分、酸化剤及び還元剤等が排除されてい
る限り良好な貯蔵安定性を示すことが知られてお
り、前記補酵素は固体状で提供されている。従つ
て使用時にこれを水溶液とし、測定系に見合つた
至適PHに調整して測定に共しているが、余分の水
溶液は１日の終了時点で廃棄するか、酸化型のも
のは酸性に変更し、又還元型のものはアルカリ性
に変更して保存安定性を高め、用時再び中性付付
近の至適PHに戻すという作業を行なつていた。し
かしこの様な方法は、測定の為の準備操作を必要
以上に複雑化するばかりであり、又保存条件の設
定を誤つた場合補酵素の安定性が低下し測定精度
そのものを低下させるという欠点があつた。 本発明はこの様な状況を憂慮してなされたもの
であつて、中性付近の溶液状態における前記補酵
素群の安定性を向上させることを目的とするもの
である。しかして該目的に適う本発明の補酵素安
定化法とは、NAD又はNADPを酸化型或は還元
型で含有するPH6.5〜80の緩衝溶液にキレート化
剤及びアジ化物（以下安定化剤と総称することが
ある）を添加することを要旨とするものである。 本発明の適用対象となる補酵素は、前記各説明
からも明白である様に、酸化型及び還元型の
NAD並びにNAPであり、該補酵素含有水溶液の
PHを6.5〜80と定めたのは、前記脱水素酵素の至
適PHがこの範囲に入ることと、該PH範囲では前記
補酵素の安定性が低く、キレート化剤とアジ化物
による安定性向上効果が顕著になるからである。
水溶液のPHを上記範囲に維持するに当つては、一
般に緩衝液の利用が推奨されるが、該緩衝液はPH
を6.5〜80に維持し得るものであれば如何なる組
成からなるもので良い。尚特に好適なものを例示
しておくと、例えば燐酸緩衝液、ほう酸緩衝液、
トリス緩衝液、グツド緩衝液、或はその他の有機
又は無機緩衝液が挙げられ、これら緩衝液の使用
濃度としては、10〜500ｍＭ適度が適当である。 又本発明で用いられるキレート化剤としては、
一般的な金属キレート剤が利用でき、金属イオン
を捕捉して不活性化できるものである限りその種
類を問わないが、代表的なものとしてはエチレン
ジアミン４酢酸並びにその塩が例示される。次に
アジ化物については、混在する微生物による補酵
素の変質・劣化を防止する機能があつて、微生物
に対する静菌的或は静菌的作用を有するもの、も
しくは微生物の活性を不活化するものである限り
どの様なものを用いても良いと考え、アジ化物、
抗生物質、サルフア剤、その他防腐剤を加えて実
験を行なつた中から特に選定したものである。即
ち前記化合物群のうち抗生物質、サルフア剤及び
その他の常用防腐剤ではほとんど安定化効果が得
られず、アジ化物だけが有効であることを見出し
たが、該アジ化物としては、アジ化ナトリウムや
アジ化カリウム等が例示される。 しかしキレート化剤及びアジ化物は、夫々単独
で用いても効果が不十分であり、併用することに
よつてはじめて成果が得られた。どの様な安定化
剤の配合割合は、安定化作用の強弱、或は安定化
剤自体の化学的安定性、更には上記各安定化剤の
組合せやPH等を考慮して定めれば良いが、一般的
な目安を述べると、キレート化剤は0.01〜10W／
Ｖ％、アジ化物は0.001〜1W／Ｖ％であり、前記
範囲未満では安定化作用が不十分であり、過剰で
あることは単に不経済となるだけであつて望まし
くない。 上記の様な安定化剤含有補酵素溶液を調整する
に当つては、PH6.5〜8.0の緩衝液に安定化剤を溶
解させ、次いで補酵素を固体状で、或は水もしく
は緩衝液に溶解させた状態で配合するか、又は補
酵素と安定化剤を固体状もしくは溶液状で前もつ
て混合しておき、次いでこれにPH6.5〜8.0の緩衝
液を加えて調整するのが良い。尚この様に調整さ
れた液は、液状のまま保存しても良いが、要すれ
ば凍結乾燥もしくは噴霧乾燥に付して固定状に変
換して保存することもできる。 本発明は上記の様に構成されているのでPH6.5
〜8.0の緩衝溶液中における補酵素の安定性は極
めて優秀なものとなり、脱水素酵素を利用した体
液中の各種成分の測定が容易且つ高精度に行なわ
れる様になり、臨床診断の分野に多大の貢献をな
すことができる様になつた。 以下実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 0.1M燐酸緩衝液（PH7.5）100mlにNAD（酸化
型）50mgを添加溶解し、これに第１表の添加物を
加え、該補酵素溶液を室温で保存して夫々の活性
残存率を測定した。またPHを8.5に調酸した0.1M
燐酸緩衝液を用いて同様の測定を行なつた。結果
は第１表に併記するが、キレート化剤とアジ化物
を併用したものでは保存安定性が著しく向上して
いるのに対し、夫々単独で使用したものやその他
の汎用防腐剤と併用したものでは、保存安定性の
向上は認めなかつた。また補酵素溶液の安定性は
PHの違いにより顕著な影響を受けることが分か
る。尚本実施例におけるNAD量の測定は、エタ
ノールを基質としてこれにアルコールデヒドロゲ
ナーゼを作用させ、残存しているNADがNADH
に変化したときの吸光度（340nｍ）の変化によ
つて求めた。

【表】 実施例 ２ 0.05Mトリス緩衝液（PH8.0）100mlに、
NADPH（還元型）15mgを添加溶解し、これに第
２表の添加物を加え、該補酵素溶液を室温で保存
した。夫々のNADPH残存は340nｍの吸光度を
直接測定することによつて求めた。結果は第２表
に併記するが、キレート化剤とアジ化物を併用し
たものだけが、、まずまずの好成積を残した。

【表】 実施例 ３ 下記組成からなる酵素製剤を調整した。 クレアチンアミジノヒドロラーゼ（シユードモナ
ス属由来） 200単位 ザルコシンオキシダーゼ（コリネバクテリウム属
由来） 30単位 ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（シユードモ
ナス属由来） ３単位 NAD（酸化型） 7.2mg 非イオン性界面活性剤 10mg アジ化ナトリウム 10mg EDTA−3Na 10mg これを0.05M燐酸緩衝液（PH7.5）に溶解し、
全量を10mlにした。上記組成における非イオン性
界面活性剤はクレアチンアミジノヒドロラーゼの
安定化を期して配合したものであるが、上記組成
からアジ化ナトリウム及びEDTA−3Naを除い
たものを同様に作成し、0.05M燐酸緩衝液に溶解
して全量を10mlをした。各々の溶液を25℃で６日
間保存したものと調製直後の液（各１ml）にクレ
アチンを含む検体50mlを添加し、37℃で10分間反
応させた。反応終了後、検体中のクレアチン量に
比例して変化したNAD量を、NADHの吸光度
（340nｍ）変化として測定することにより、検体
中のクレアチン量を求めた。一方上記酵素製剤か
らクレアチンアミジノヒドロラーゼを除いた試薬
（検体ブランク用）を調製し、上記と同様に処理
して検体ブランク値を求め、その差から真のクレ
アチン量を求めた。 結果は第３表に示す通りであり、本発明を満足
する場合は６日後も正しい測定結果を与えたが、
本発明の条件を満足しないものは、６日後の測定
が不可能であつた。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよ
   びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸か
   ら選択される１種以上の補酵素を酸化型もしくは
   還元型で含有するPH6.5〜8.0の緩衝溶液にキレー
   ト化剤及びアジ化物を安定化剤として含有させる
   ことを特徴とする補酵素の安定化法。