JPH11502410A - 補酵素還元システムにより安定化されている試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬に関する。また、本発明においては、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中の目的物質を酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が開示される。更に、本発明においては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アンモニア及び尿素の定量法のための試薬が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 補酵素還元システムにより安定化されている試薬 本発明は、体液試料中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬に関す る。具体的には、本発明は、反応後の試料中に存在する酸化された補酵素の量が 、試料中の目的物質の濃度に相当する定量法のための試薬に関する。更に本発明 は、目的物質の定量法に関する。 本発明の試薬によって定量が可能な目的物質はトランスアミナーゼ類、アンモ ニア、尿素、乳酸デヒドロゲナーゼ、トリグリセリド類及びサリチル酸等である 。 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼは心臓、肝臓、赤血球及び骨格筋に高 濃度で存在する酵素であり、以下のような反応を触媒する： 肝細胞の破壊を生じる様々な肝臓病、例として、特に肝炎は、血清中のアスパ ラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇を伴う事が知られている。アスパ ラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇は、心筋梗塞の発症後及び筋疾患 にも見られる。 アラニンアミノトランスフェラーゼも肝臓に高濃度で存在 する酵素である。心臓、腎臓及び骨格筋にも存在するが、肝臓の場合ほど高濃度 ではない。アラニンアミノトランスフェラーゼは以下の反応を触媒する： 血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度は通常、肝臓病、特に肝炎に よって上昇する。 酵素、特に体液試料中のトランスアミナーゼ類、アスパラギン酸アミノトラン スフェラーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼの間接的定量を行なうには 、試料を含まない“ブランク（Ｂｌａｎｋ）”の測定値と、定量の対象である酵 素によって、この酵素と関連のある目的物質を変換した後の試料との測定値の比 較を必要とする場合もある。 目的物質を酵素反応により変換するためには、基質特異的な酵素（ここではト ランスアミナーゼ類）を、目的とする酵素の定量に用いる事が知られている酵素 基質と反応せしめる。そして、ブランクに対して、反応混合物の組成に生じる変 化を、吸光度の変化を測定する様々な方法を用いて計測することが可能である。 吸光度の変化は試料中に存在するトランスアミナーゼ類の量に直接対応している 。 比色定量法などの従来の方法は目的物質の定量法として適切であると認められ ているが、トランスアミナーゼ類の定量 においては、酵素反応を用いる分析法の方が遥かに正確であり、信頼性も高く、 従来の方法よりも簡便である。 試料中に存在するトランスアミナーゼ類を定量するための一般的な方法として は、酵素の連鎖反応を用いる、動力学的手法に基づく方法が挙げられる。 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の場合、ＡＳＴにより生 成されたオキサロ酢酸は、分析用の系に加えられているリンゴ酸デヒドロゲナー ゼ（ＭＤＨ）によってリンゴ酸に変換される。この反応は、補酵素であるニコチ ンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化反応（ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺になる）を伴 い、この酸化反応は波長３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計によって測定す ることにより追跡することができる。従って、上記の反応は、通常、以下に示す 連鎖反応によって進行する： 三番目の反応は、患者より得られた試料中に高濃度に含有されている可能性のあ るピルビン酸を除去するために必要である。以下の理論に基づき、試薬中に高濃 度の乳酸デヒドロゲ ナーゼ（ＬＤＨ）が加えられている。即ち、患者より得られた試料中に高濃度の ピルビン酸が存在した場合、ＮＡＤＨとＬＤＨにより試料中のピルビン酸は、目 的とする反応を妨害することのない乳酸に速やかに変換される。副反応を省くた めに試薬に添加されるＬＤＨは、不純物の混入を招くことにより、試薬の安定性 に影響を与える。 アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の定量の場合、乳酸デヒドロゲ ナーゼを含む反応混合物を用いることにより、ＡＬＴにより生成されるピルビン 酸は乳酸に変換される。この反応は、補酵素ＮＡＤＨをＮＡＤ⁺に酸化する反応 を伴うため、やはり反応の進行を波長３４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を 用いて測定することにより追跡することが可能である。従って、定量用試薬を用 いた際の連鎖反応は以下のように進行する： ＡＬＴの測定法は、試薬に加えるべき酵素がただ一種、すなわちＬＤＨしか必 要としない以外は（ＡＳＴの場合はＬＤＨとＭＤＨの２種が必要とされる点で異 なる）、ＡＳＴ定量 用試薬と同様の理論及び方法論を用いる。従って、ＡＬＴ定量用試薬に混入する 不純物は、ＡＳＴ定量用試薬に混入する不純物よりも少量となるため、一般的に 、試薬の再構成後の貯蔵寿命（ｓｈｅｌｆ ｌｉｆｅ）はＡＳＴ定量用試薬より も若干長くできると考えられる。 どちらの試薬の場合も、ＮＡＤ⁺の生成速度は、元々試料中に存在するトラン スアミナーゼ濃度に対応する。 尿素は、蛋白の異化により生じる主要な窒素含有代謝産物であり、肝臓に存在 する酵素によって合成され、主に腎臓を経て排出される。血清中の尿素濃度の上 昇は腎機能の不全、肝臓病、食生活の変化、うっ血性心不全、糖尿病及び感染症 の結果であることも考えられる。 ヒトの血清及び尿中の尿素の定量には、直接法又は間接法を用いることができ る。尿素の直接定量法においては、通常、各種のフィアロン反応（Ｆｅａｒｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）の変法を用いる。この反応系においては、ジアセチルが尿 素と反応して５４０ｎｍに強い吸収を示す発色体であるジアジン（ｃｈｒｏｍｏ ｇｅｎ ｄｉａｚｉｎｅ）を生成するので、その吸光度を分光光度計により測定 することができる。ヒトの血清及び尿に存在する尿素の定量法として最も一般的 な方法は、一組の連鎖酵素反応系を用いて間接的に尿素を測定する方法である。 反応系の第１の酵素であるウレアーゼは、尿素をアンモニウムイオンと重炭酸イ オンに変換する。反応系 の第２の酵素であるグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）はＮＡＤＨとア ンモニウムイオンからＮＡＤ⁺とグルタミン酸を生成する。この第２反応では、 ＮＡＤＨがＮＡＤ⁺へ変換されるので、波長３４０ｎｍにおける吸光度を分光光 度計で測定することにより追跡できる。又、アンモニウムイオンを電位差測定法 又は電気伝導度測定法によって測定することも可能である。 従って、一般的な尿素の定量法は以下に示す反応プロセスにより行われる： ＮＡＤＨのＮＡＤ⁺への変換に伴って生じる、３４０ｎｍにおける吸光度の低 下は、元の試料中に存在していた尿素濃度に比例する。 体内を循環するアンモニアの発生源は主に消化管である。アンモニアは肝臓で 代謝され、クレブス−ヘンセライト経路（Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ ｃ ｙｃｌｅ）によって尿素に変換される。ヒト血清中のアンモニア濃度の上昇は、 重度の肝臓障害と関連する場合が非常に多い。高アンモニア血症は中枢神経系に 対して毒性を示す。 ヒト血清中のアンモニアの定量法としては、グルタミン酸 デヒドロゲナーゼによる１段階の酵素反応を用いて直接測定するのが最も一般的 である。この反応では、アンモニア、α−ケトグルタル酸及びＮＡＤＨ（又はＮ ＡＤＰＨ）をグルタミン酸とＮＡＤ⁺（又はＮＡＤＰ⁺）に変換し、この反応を３ ４０ｎｍにおける吸光度を分光光度計を用いて測定する。試料中のアンモニア濃 度の測定は一般的に以下の反応式により行う： ＮＡＤＰＨのＮＡＤＰ⁺への変換は３４０ｎｍにおける吸光度の低下として測 定され、この測定値は患者より得られた試料中のアンモニア濃度に比例する。 上記したように、従来のトランスアミナーゼ定量用試薬は再構成後の保存安定 性に劣っていた。このような試薬、特に１液型試薬の安定性は、冷蔵状態におい て最大でも１ヶ月程度である。この不安定性の原因は試薬中の成分の劣化及び溶 液中でのＮＡＤＨの不安定性によると考えられる。溶液中のＮＡＤＨの不安定性 の主な原因は、試薬に含まれる酵素、即ち、ＡＳＴ定量用試薬の場合はＬＤＨと ＭＤＨ、ＡＬＴ定量用試薬の場合はＬＤＨの存在と直接関連している。試薬に含 まれている酵素である市販のＭＤＨ及びＬＤＨは、動物起源 の酵素であっても、微生物起源の酵素であっても、最終的に再構成された後のＮ ＡＤＨの安定性に影響を与える不純物を含み、更には試薬そのものの安定性に影 響を与える。このような不純物は通常、低濃度のＡＳＴ及びＡＬＴのような測定 の対象となる酵素や、ＮＡＤＨオキシダーゼであって、これらはいずれも試薬中 のＮＡＤＨの酸化を開始させる。 ＮＡＤＨは溶液中、特に酸性の溶媒において急速に分解するため、試薬のｐＨ もＮＡＤＨの不安定性に影響を与える。大部分のトランスアミナーゼ定量試薬は ｐＨ７．３から８．０の範囲内に調製されている。試薬のアルカリ性が強いほど 、溶液中のＮＡＤＨの安定性は向上する。 更に、アンモニア定量用試薬及び尿素定量用試薬も安定性に問題があり、一液 型試薬の冷蔵下における一般的な安定保存期間は、アンモニア定量用試薬の場合 は最大１ヶ月、尿素定量用試薬の場合は最大２ヶ月である。この不安定性の原因 は、試薬中の成分の劣化、溶液中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの不安定性、並びに 粉末状の試薬を再構成する際に用いる水に含まれるアンモニア等に起因すると考 えられる。 溶液中のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの不安定性の主な原因は、試薬に含まれる酵 素の存在と直接関係している。ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨは溶液中、特に酸性の溶 媒中で急速に分解されるため、試薬のｐＨもＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの不安定性 に影響すると考えられる。 通常、アンモニア定量用試薬には、患者の血清試料中に存在する乳酸デヒドロ ゲナーゼによる検査反応の妨害を克服する目的で（ＮＡＤＨよりも好ましくは） ＮＡＤＰＨが用いられる。患者の血清試料中に存在する乳酸デヒドロゲナーゼ及 びピルビン酸は以下に示す反応式に従ってＮＡＤＨと特異的に反応する： 市販のグルタミン酸デヒドロゲナーゼに含まれる、アンモニア定量用試薬中の ＮＡＤＰＨの酸化を開始する不純物によって、やはり溶液中のＮＡＤＰＨの安定 性も影響を受ける。同様に、市販のウレアーゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナー ゼに含まれる不純物は、尿素定量用試薬中に存在するＮＡＤＨの酸化反応を開始 する。 溶液中のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定性に関する上記の問題点を克服するた めの一つの方法は、使用の直前に還元された補酵素を溶液中で発生させる方法で ある。 上記のような方法の一つがＦ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧに よる豪州特許願ＡＵ−Ａ−６１９０６／９０に開示されており、その方法は、血 清中の重炭酸及びアンモニアを測定するための特定の酵素反応系に関するもので ある。この開示においては、目的物質、基質及び特定の酵素に よる酸化反応と同時又はその反応開始以前にｉｎ ｓｉｔｕで還元された補酵素 を発生させる。反応混合物中に酸化された補酵素の還元を可能とする酵素と酵素 基質を含むことにより、上記の方法は達成される。Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧに開示され、好ましく用いられる反応を以下に示す： 上記反応によって、還元されたニコチンアミドジヌクレオチドが得られる。 このＮＡＤＨの発生させるための反応に伴う問題点は、１液型試薬の調製が不 可能な点にある。 Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｌａ Ｒｏｃｈｅ ＡＧは試薬を２本のバイアルに分 けて調製することにより、上記の問題点の一部を克服した。アンモニア定量試薬 の場合、第１試薬はＮＡＤＰ⁺及びＧ−６−Ｐからなり、第２試薬はα−ケトグ ルタル酸、Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ及びＧＬＤＨからなる。測定反応は以下のように進 行する： 式中、（Ａ）及び（Ｂ）は選択的な、同一の工程を示す。 しかし、この検査試薬にも問題点は残る。２本の試薬バイアルが必要であるた め費用、説明書及び廃棄物が嵩む以外に、非常に厳密な量のグルコース−６−リ ン酸が必要であり、更には特定の分析装置を用いて測定しなければならない。２ 種の試薬を合一した途端に、グルコース−６−リン酸を消費しながらＮＡＤ⁺か らＮＡＤＨが発生する。従って、２種の試薬の混合後、直ちに試薬を使用しなか った場合、グルコース−６−リン酸がすべて消費され、混合された試薬の安定性 に 多大な影響を与える。試薬中に不正確又は過剰な量のグルコース−６−リン酸が 存在する場合、反応を行なうための保温時間が重要になる。測定結果は、実際よ りも低い吸光度変化となり、全体としては不正確な結果しか得られない。 目的物質の定量に関わる問題点の解決方法の一つが、既にＭｏｄｒｏｖｉｃｈ による米国特許４、３９４、４４９号に開示されている。この方法においては、 基質と酵素の組み合わせを用い、還元された補酵素をＲｏｃｈｅによる解決策と 同様の方法によって発生するが、下記の式に従い、グルコース−６−リン酸はグ ルコースより生成される： その後、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下でＮＡＤ⁺は生成さ れたグルコース−６−リン酸と反応し、ＮＡＤＨを発生する。Ｍｏｄｒｏｖｉｃ ｈの組成には、ＮＡＤＨが酸化又は分解された場合、試薬中のＮＡＤ⁺がＮＡＤ Ｈの再生を補うように、ＮＡＤＨとＮＡＤ⁺の両方が含まれている。この試薬も 二液型に調製されている。 既に、Ｋｌｏｓｅ ｅｔ ａｌの米国特許第４、０１９、９６１号の発明がそ の他の選択肢として提供されている。この発明は、様々の個別の反応工程及びＮ ＡＤＨ再生酵素システ ムを用いる。このシステムには、複数の反応工程及び分離工程を必要とするため に生じる信頼性の低下と、検査に時間がかかるという障害がある。更に、この試 薬システムはリン酸化が可能な基質にのみ適している。 上記した発明に用いられている、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの発生機構に関する 一般的な問題点は、 で表わされる反応においては、一液型試薬を調製し、一工程で反応を行なうこと が不可能な点にある。試薬に患者より得られた血清試料を添加すると、以下の２ つの反応が同時に起る： （ａ） ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）がＮＡＤ⁺（又はＮＡＤＰ⁺）に変換される 際に吸光度が減少し、 （ｂ） ＮＡＤＨ（又はＮＡＤＰＨ）がＮＡＤ⁺（又はＮＡＤＰ⁺）より発生する 際に吸光度が上昇する。 この２つの反応は同等の反応速度で起るため、測定値として得られる吸光度の変 化は実際よりも低い値となり、不正確な結果しか得ることができない。 従って、本発明の一つの目的は、従来の、補酵素の酸化を用いる酵素反応によ る血清中の目的物質の定量法の問題点、特に、試薬に含まれる成分に由来する物 質及び試薬に含まれない物質の試薬への混入に伴う問題点を実質的に克服した試 薬を提供することにある。本発明の他の一つの目的は、患者試料中の目的物質濃 度の改良された定量法であって、従来の方法における問題点、すなわち定量値の 決定要因である補酵素の早過ぎる酸化、並びに試薬の分解を最小限にとどめるた め多液型試薬の形で提供しなければならない点を改良した定量法が提供される。 本発明の他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の 目的物質の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと 通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質 の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定 化されていることを特徴とする試薬が提供される。 本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者 中のトランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬 の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択さ れた酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸 化に対して安定化されていることを特徴 とする試薬が提供される。 本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者 中のアスパラギン酸トランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬で あって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめ るように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによ って該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される 。 本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者 中のアラニントランスアミナーゼの酵素反応による定量法のための試薬であって 、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるよう に選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該 試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。 本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定することを含む、患者 中の尿素の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと 通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質 の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定 化されていることを特徴とする試薬が提供される。 本発明の更に他の１つの目的は、補酵素の酸化度を測定す ることを含む、患者中のアンモニアの酵素反応による定量法のための試薬であっ て、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるよ うに選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって 該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴とする試薬が提供される。 好ましくは、補酵素還元システムは酵素と基質を包含し、該酵素は該基質に対 して不完全な特異性を有するため、反応速度が減少する。 本発明の試薬は一液型試薬として調製されるのが好ましい。 本願明細書において、選択された酵素と基質の組み合わせに対して用いられる “不完全な特異性”とは、選択された基質が、選択された酵素の本来の基質では ないため、この基質に対する酵素の特異性が、酵素の本来の基質に対する特異性 と比較して１００％未満であることを意味する。 本発明は、お互いに対して不完全な特異性しか示さない酵素と基質を反応させ た場合、補酵素の還元速度は著しく遅いという発見に基づくものである。補酵素 の還元反応を遅くすることにより、定量用試薬の必須成分を１本の保存用バイア ル中に調製することが可能となり、低濃度の連続的な補酵素の還元反応により、 汚染に対して安定化される。還元反応速度を遅くすることにより、目的物質の測 定に影響を与えることなく、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの再生が可能となる。補酵 素の再生は試薬を使用しない間に起こり、その再生速度は再生システムに用いら れる酵素と基質の組み合わせの性質及びそれぞれの濃度を制御することにより、 厳密に調整することが可能である。 本発明の更なる態様の一つとして、補酵素の酸化度を測定することを含む、患 者中の目的物質の酵素反応による定量法のための試薬であって、該試薬の保存中 ずっと通して該補酵素の連続的な再生が３４０ｎｍで０．０１〜０．９ｍＡＢＳ ／分の範囲内の速度で起きているように選択された酵素と基質の組み合わせを包 含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていること を特徴とする試薬が提供される。 本発明の上記態様における好ましい再生速度は、室温（１８〜２５℃）、３４ ０ｎｍで０．０５〜０．９ｍＡｂｓ／分であり、さらに好ましくは０．０１〜０ ．４ｍＡｂｓ／分である。 本発明の好ましい態様においては、補酵素還元システムの酵素と基質の特異性 は、好ましくは等モル基準で１００％未満、より好ましくは５０％未満、更に好 ましくは１０％未満である。最適な条件としては、等モル基準の交差反応性が５ ％未満である酵素と基質の組み合わせを用いることができる。 本発明の試薬に用いられる補酵素は、還元されたニコチンアミドアデニンジヌ クレオチド（ＮＡＤＨ）及び還元された ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）であるが、ニコチ ンアミドヒポキサンチンジヌクレオチドリン酸又はチオＮＡＤＨ等の補酵素のア ナログも用いることのできる。 驚くべきことに、本発明の試薬の更に有利な点は、特にアンモニア定量用試薬 及び尿素定量用試薬として用いることができることである。尿素定量用試薬又は アンモニア定量用試薬のＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ濃度は、粉末状の試薬を 再構成する際に用いられる水によって混入する不純物としてのアンモニアによっ て減少する。同様に、空気中のアンモニアも時間とともに液状の尿素／アンモニ ア定量用試薬に溶解し、ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ濃度を減少させる。アン モニア定量用試薬及び尿素定量用試薬に存在する不純物としてのアンモニアは、 尿素及びアンモニアの定量を不正確にするだけでなく、ＧＬＤＨの存在下で、α −ケトグルタル酸とＮＡＤＨの反応が試料の添加以前に開始されてしまうことを 意味する。その結果、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ濃度は減少し、試料中のアンモニ ア及び尿素の定量に誤りが生じる。しかしながら、本発明においては、混在する アンモニアの除去、更にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの再生を可能とすることによ り、患者試料中のアンモニア及び尿素の正確な定量を可能とする。 血清試料中のトランスアミナーゼ定量用試薬の補酵素還元システムに用いられ る好ましい酵素は、グルコース−６−リ ン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ）又はグルコースデヒドロゲナーゼで ある。 血清試料中の尿素又はアンモニア定量用試薬の補酵素還元システムに用いられ る酵素は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ）又は グルコースデヒドロゲナーゼである。 ギ酸デヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ロイシンデヒドロゲ ナーゼ、Ｌ−アラニンデヒドロゲナーゼ、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロ ゲナーゼ、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．由 来）又はグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素も適切である。ト ランスアミナーゼ定量用試薬並びにアンモニア及び尿素定量用試薬に用いられる 酵素としては、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。この酵素 は、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｕ ｓ 又は酵母のような適切な材料より得ることができる。 上記の酵素は、微生物より抽出された酵素が好ましい。微生物由来の酵素を試 薬に用いることにより、ＮＡＤＨオキシダーゼ及びプロテアーゼのような、従来 試薬の安定性に深刻な影響を与えていた生体由来の不純物の混入が最小限に押さ えられることが見出された。更に、微生物由来の酵素は熱安 定性を有するため、試薬溶液の長期保存安定性を向上するという利点がある。 最も好ましいグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの材料はＬｅｕｃｏｎ ｏｓｔｏｃ Ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓである。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａ ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ 又はＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｕｓ由来の グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを使用した場合、反応速度が遅い。ま た、酵母より抽出されたグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼはＮＡＤＰ⁺ に特異的な酵素であるため、この酵素を使用する際には、補酵素ＮＡＤＰＨをＮ ＡＤＨの代わりに用いらければならない。本発明の試薬に存在するグルコース− ６−リン酸デヒドロゲナーゼの適切な量は、希望する再生時間により異なる。Ａ ＳＴ定量用試薬において好ましい量は２０００Ｕ／Ｌであるが、この値は時間と ともに生じる濃度の低下を考慮した値である。ＡＬＴ定量用試薬において好まし い量は２０００Ｕ／Ｌである。尿素定量用試薬において好ましい量は２０００Ｕ ／Ｌであり、アンモニア定量用試薬において好ましい量は３５００Ｕ／Ｌである 。 補酵素還元システムにおいて、お互いに対して不完全な特異性を示す酵素と基 質を選択しなければならないという観点から、本発明の試薬に用いられる適切な 基質はリボース−５−リン酸、グルコース−１−リン酸、６−フォスフォグルコ ン酸、２−デオキシグルコース−６−リン酸、２−デオキシ −２−フルオログルコース、デオキシ−２−クロログルコース−６−リン酸、２ −デオキシ−２、２−ジフルオログルコース−６−リン酸、２−Ｏ−メチルグル コース−６−リン酸、マンノース−６−リン酸、グルコサミン−６−リン酸、３ −デオキシグルコース−６−リン酸、３−デオキシ−３−フルオログルコース− ６−リン酸、３−Ｏ−メチルグルコース−６−リン酸、アロース−６−リン酸、 アフロース−６−リン酸、４−デオキシ−４−フルオログルコース−６−リン酸 、ガラクトース−６−リン酸、５−チオグルコース−６−リン酸、ホスホン酸ア ナログ、グルコース−６−スタレート、β−Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース 、２−デオキシグルコース、アラビノース、キシロース、１−ソルボース、Ｄ− マンノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ラクトース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マン ニトール、サッカロース、イノシトール及びマルトースである。 ＮＡＤＨを好ましい補酵素として用いる場合、好ましい酵素と基質の組み合わ せはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ）とＤ−グル コースである。グルコース−６−リン酸（Ｇ−６−Ｐ）とＧ−６−Ｐ−ＤＨの間 の特異性を基準として、酵素であるＧ−６−Ｐ−ＤＨと選択した基質の反応速度 が５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満である基質が 、Ｄ−グルコースの代わりとして好ましい。やはりこの場合も、必要な再生速度 という観点から本発明の試薬に用いる最も適切なＤ−グルコースの量は、約１０ ０ｍｍｏｌ／Ｌであるが、約１０００ｍｍｏｌ／Ｌまで使用することが可能であ る。高濃度で用いる場合は、Ｄ−グルコースの試薬に対する溶解度が問題となる 。 好ましい組み合わせであるＤ−グルコースとグルコース−６−リン酸デヒドロ ゲナーゼを用いた場合、リン酸カリウムイオンをリン酸二カリウムとして試薬の 組成に加えてもよい。目的とする再生速度に応じて適切なリン酸イオン濃度は異 なる。しかし、例えば、Ｄ−グルコースの濃度が約１００ｍｍｏｌ／Ｌ（しかし 、２０〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であればよい）の場合、それに対するグル コース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は約２０００Ｕ／Ｌ（しかし、５０ ０〜３５００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内であればよい）であり、適切なリン酸イオン 濃度は２．０ｍｍｏｌ／Ｌから２０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内である。リン酸イオン 濃度の上昇は再生速度を上昇する。好ましいリン酸イオン添加量は、ＡＳＴ定量 用試薬で約１０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＡＬＴ定量用試薬で約５ｍｍｏｌである。尿素定 量用試薬の場合は５ｍｍｏｌであり、アンモニア定量用用試薬でも５ｍｍｏｌで ある。 Ｄ−グルコースとグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼからなる好ましい 組み合わせが用いられた場合、又は遊離したリン酸イオンが存在しない系におい ては、リン酸イオンを試薬に添加することは必須である。具体的には、グルコー ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下で、遊離したリン酸イオンはＤ−グル コースと非特異的な複合体を形成することにより、再生反応を開始する。 Ｄ−グルコースとＧ−６−Ｐ−ＤＨの組み合わせの代わりに、下記の反応に従 ってグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤ）を好ましく用いることもできる。 （上記反応において、Ｄ−グルコースは反応性が１００％の基質である。） 酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを使用する場合、補酵素ＮＡＤの還元 には、下記の基質を用いることが好ましい。これらの基質の反応性をＤ−グルコ ースと比較したときの相対的な反応性は、次の通りである。 基質 相対的反応性 キシロース ８．９％ Ｌ−ソルボース ０．３％ Ｄ−マンノース ２．４％ Ｄ−フルクトース ０．８％ Ｄ−ガラクトース ０．１％ Ｄ−ラクトース １．２％ Ｄ−ソルビトール ０．１％ イノシトール ０．２％ マルトース ３．９％ （上記の値は、本来の基質である１β−Ｄ−グルコースの存在下でのグルコー スデヒドロゲナーゼの反応速度に対する反応速度の比を表す。） また、酵素としてグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＬＹ．ＤＨ）を使用する 場合、下記の反応： において、下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性をグリ セロールに対する反応性（１００％）と比較した相対的な反応性は、次の通りで ある。 基質 相対的反応性 グリセロール−α− モノクロロヒドリン ４８．５％ エチレングリコール ７．８％ ２，３−ブタンジオール ５２．６％ また、酵素としてロイシンデヒドロゲナーゼ（Ｌ．Ｄ）を使用する場合、下記 の反応： において、下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性をＬ− ロイシンに対する反応性（１００％）と 比較した相対的な反応性は、次の通りである。 基質 相対的反応性 Ｌ−バリン ７４％ Ｌ−イソロイシン ５８％ Ｌ−ノルバリン ４１％ Ｌ−ノルロイシン １０％ Ｌ−メチオニン ０．６％ Ｌ−システイン ０．３％ ロイシンデヒドロゲナーゼを使用する上記の反応と同様の反応系において、酵 素としてＬ−アラニンデヒドロゲナーゼ（Ａ．Ｄ）を使用する場合、下記の基質 を用いることが適当である。これらの基質の反応性をＬ−アラニンに対する反応 性（１００％）と比較した相対的な反応性は、次の通りである。 基質 相対的反応性 Ｌ−セリン ５％ また、酵素として、３α−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（Ｈ．ＤＨ ）を下記の基質と組み合わせて使用してもよい。また、コール酸に対するその反 応性も示す。 基質 相対的反応性 リトコール酸 ９６％ エチオコール酸 ６０％ 下記の反応において、酵素としてLactobacillus sp.由来のＬ−乳酸デヒドロ ゲナーゼ（ＬＤＨ）を使用する場合、 下記の基質を用いることが適当である。これらの基質の反応性を、Ｌ−乳酸に対 する反応性と比較した相対的な反応性は、次の通りである。 基質 相対的反応性 ２−オキソグルタル酸 ０．０９％ オキサロ酢酸 ３６％ 例えば、ＮＡＤＰ⁺が酵母由来の補酵素である場合、下記の基質／酵素の組み合 わせが好ましい。 Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ／ガラクトース−６−Ｐ ２５％ Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ／ １８％ ２−デオキシグルコース−６−Ｐ Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ／グルコサミン−６−Ｐ ２％ 上記の右側の数値は、Ｇ−６−Ｐ−ＤＨ／Ｇ−６−Ｐの組み合わせにおける反応 性に対する相対的な反応性を表す。 また、補酵素としてＮＡＤＰ⁺を使用し、酵素と基質の組み合わせとしてグリ セロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ とジヒドロキシアセトンリン酸を組み合わせることも可能である。 本願明細書の序文で述べたように、血清中に存在するＡＳＴの濃度を測定する ために用いられる本発明の試薬において必要とされる成分は乳酸デヒドロゲナー ゼ、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、リンゴ酸デヒ ドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、アスパラギン酸及び２−オキソグルタル酸である。Ａ ＬＴ定量用試薬においては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは必要なく、アスパラギ ン酸の代りにＬ−アラニンが必要である。尿素定量用試薬においては、上記成分 の他にウレアーゼとα−ケトグルタル酸が必要であり、アンモニア定量用試薬に おいても、α−ケトグルタル酸が上記成分の他に必要である。 アスパラギン酸は、ナトリウム塩及びカリウム塩のような様々なアスパラギン 酸塩として入手可能である。本発明に用いられるアスパラギン酸は、ナトリウム 塩よりも溶解度が高く、水和の程度が少ないと考えられるカリウム塩が好ましい 。本発明に用いることが可能なアスパラギン酸の濃度範囲は１８０〜２４０ｍｍ ｏｌ／Ｌである。最も好ましい濃度は２００ｍｍｏｌ／Ｌであり、この濃度はＩ ＦＣＣにより推奨されている濃度である。 本発明の定量用試薬にとって好ましい２−オキソグルタル酸濃度は約１〜１５ ｍｍｏｌ／Ｌであるが、２−オキソグル タル酸は３４０ｎｍの光を吸収するので、高濃度の２−オキソグルタル酸は、Ｎ ＡＤＨに基づく吸光度に対して、高いバックグラウンド値となるので、試薬に用 いることのできるＮＡＤＨの量を制限することになる。従って、試薬に含まれる ２−オキソグルタル酸の濃度を押さえることにより、大部分の分光光度計で本発 明の試薬を用いた測定が可能となる。ＡＳＴ定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬に 用いられる２−オキソグルタル酸濃度は好ましくは１２ｍｍｏｌ／Ｌであり、や はりこの値もＩＦＣＣに推奨されている値である。尿素定量用試薬及びアンモニ ア定量用試薬に用いられる２−オキソグルタル酸濃度は好ましくは７．５ｍｍｏ ｌ／Ｌである。 ＡＬＴ定量用試薬中に存在するアラニンの量は、アラニンの溶解度によりある 程度決定される。具体的には、好ましいアラニン濃度の範囲は２００〜５００ｍ ｍｏｌ／Ｌであるが、この範囲の上限に近い値においては顕著な酵素活性の増加 は見られない。アラニンの溶解度に基づく最も好ましいアラニン濃度は４００ｍ Ｍ／Ｌである。 定量用試薬中の補酵素の濃度は以下の要因によって変化する： ・ 測定に必要な直線性 ・ 使用する波長 ・ 検査試料と試薬の容量比 ・ 分析装置に用いられる分光系 一般的に、試料の容量を増加することにより、測定感度は上 昇するが、測定値の直線性は低下する。一方、試料の容量を減少することにより 測定値の直線性を上昇するが、測定感度は低下する。 吸光度測定に用いられる好ましい波長は３２０〜４００ｎｍであり、試料中の 補酵素の濃度は吸光度が２．０Ａを超えないように調整することが好ましい。本 発明に用いられる最も好ましい波長は３４０ｎｍである。 本発明に用いられるＭＤＨとしては、試薬中に不純物の混入を防ぐ目的と共に 、優れた熱安定性を有する微生物由来のＭＤＨが好ましい。本発明に用いられる ＭＤＨの濃度は２００〜８００Ｕ／Ｌであり、好ましい濃度は２５０Ｕ／Ｌであ る。 ＡＳＴ定量用試薬において、ＬＤＨは試料中のピルビン酸を除去する。ＡＳＴ 定量用試薬に含まれるＬＤＨの濃度は、試料と試薬の比が１：１０の時に、１． ０ｍｍｏｌ／Ｌの試料中のピルビン酸を１分間で除去するようなＬＤＨの濃度が 好ましい。このような条件を満たす濃度は約２０００Ｕ／Ｌである。 ＡＬＴ定量用試薬において、ＬＤＨは以下の２つの反応に関与する：（ｉ）Ａ ＬＴ測定のための２段階の酵素反応及び（ｉｉ）試料中に含まれるピルビン酸の 除去。ＡＬＴ定量用試薬に含まれるＬＤＨの濃度は、ＡＳＴ定量用試薬の場合と 同様に、１．０ｍｍｏｌ／Ｌの試料中のピルビン酸を１分間 で除去するような濃度が用いられる。反応開始１分後には、試料中のピルビン酸 による影響を受けることなく、目的とする反応を測定することができる。試料中 のピルビン酸の除去に必要なＬＤＨの最小濃度は約１５００Ｕ／Ｌであると見出 された。ＡＬＴ定量用試薬中に含まれるＬＤＨの好ましい濃度は約２０００Ｕ／ Ｌである。 尿素定量用試薬において、動力学的見地から、ｐＨ８．５の条件下において律 速酵素とならないために必要とされる最小ウレアーゼ活性は約５０００Ｕ／Ｌで ある。長期保存における安定性を高める目的で、尿素定量用試薬は上記の値を超 える量のウレアーゼを含んでいても構わない。 尿素定量用試薬とアンモニア定量用試薬における目的物質定量の好ましい方法 は動力学的原理に基づいた方法である。定量用試薬の組成物中でグルタミン酸デ ヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）は律速酵素なので、試薬中に含まれているＧＬＤＨ の活性量が直線性のある測定結果を得るために非常に重要である。要求されるＧ ＬＤＨ活性量は試薬系のｐＨによっても変化する。好適なＧＬＤＨ活性は250-I0 000Ｕ/Ｌの範囲間で変化する。動物由来の市販ＧＬＤＨ製剤は通常不安定であり 、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性の高い混入物を含有し易いので、微生物由来の酵素 が最も好ましい。尿素定量用試薬の好ましいＧＬＤＨ活性は、ｐＨ８．５０で、 約500Ｕ/Ｌであり、アンモニア定量用試薬の好ましいＧＬＤＨ活性は、ｐＨ８． ５０で、約8500Ｕ/Ｌである。 本発明の試薬は、補酵素還元システムや目的物質濃度の測定に必要なその他の 必須の基質と酵素に加えて、保存剤、キレート剤、表面活性剤、蛋白質分解酵素 阻害剤、緩衝剤、補足因子、抗菌剤等の、安定性促進機能を示し、かつ本発明の 特徴に影響を与えない成分を含有することができる。 緩衝剤は、主に、選ばれたｐＨで、最小限の２価のカチオンとしか結合せずに 良好な緩衝能力を持つことを第一の基準として選ばれる。ＡＳＴ定量用試薬とＡ ＬＴ定量用試薬のｐＨと緩衝系は、トランスアミナーゼ類の測定についての国際 臨床化学連合（ＩＦＣＣ）の勧告に従って選択される。大ま かな基準は、ある緩衝剤のｐＫａが選ばれたｐＨから±1.0ｐＨ単位以内であれ ばその緩衝剤は有効であると考えるというものである。本発明の試薬の好ましい ｐＨは、３０℃で７〜９である。アスパラギン酸トランスアミナーゼの至適触媒 活性は、３０℃でｐＨが約7.0〜8.2において見られる。ＡＳＴ定量用試薬の最適 なｐＨは２０℃で約8.1±0.1であるが、その理由は、このｐＨの範囲内ではＮＡ ＤＨが安定であるからである。ＡＬＴ定量用試薬では、最高触媒活性は、２０℃ で約7.3〜7.9のｐＨ内に見られる。ＡＬＴ定量用試薬の最も好ましいｐＨは２０ ℃で約7.7である。ここに述べた好ましいｐＨにおいては、至適酵素活性と、酵 素や補酵素の溶液中の安定性とが両立する。これより低いｐＨでは補酵素の分解 が増加する。 尿素定量用試薬に用いられる緩衝剤系としては、ｐＨが7.5〜9.5の範囲内での Ｔｒｉｓ緩衝液が使用可能と考えられるが、好ましくはｐＨ8.50のＴｒｉｓ緩衝 液である。緩衝剤濃度としては２０〜２００ｍＭの範囲内のＴｒｉｓが使用可能 であるが、効果的な緩衝能を持つ好ましい緩衝剤濃度は１００ｍＭである。この 試薬系では、ｐＨが7.5-8.5の範囲で有効な緩衝能力を示す広範囲な他の緩衝剤 が使用できる。 アンモニア定量用試薬に用いられる緩衝剤系としては、ＴｒｉｓがｐＨ7.5〜9 .5の範囲内のいずれでも使用可能と考えられるが、好ましくはｐＨ8.50〜9.0の Ｔｒｉｓ緩衝液であ る。緩衝剤濃度としては２０〜２００ｍＭの範囲内のＴｒｉｓが使用可能である が、効果的な緩衝能力を持つ好ましい緩衝剤濃度は１００ｍＭである。 ＡＳＴ定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬に適した緩衝剤の例は、ＨＥＰＥＳ、 4-モルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、2-［トリス（ヒドロキシメチル ）メチルアミノ］-1-エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ジメタノールアミン等のＧ ＯＯＤ緩衝剤、トリシン、バイシン、ＴＥＡ及びＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ及びＰＯ ＰＳＯである。本発明で用いられる好ましい緩衝剤はＴＲＩＳであり、そのＴＲ ＩＳの濃度は好ましくは３０〜１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは約７０〜１ ００ｍｍｏｌ／Ｌであり、約８０ｍｍｏｌ／Ｌが最も好ましい。緩衝剤濃度が高 くなるに従い、ＡＳＴ活性の阻害は大きくなる。リン酸緩衝剤は、ＮＡＤＨの分 解速度を増大させ、ピリドキサール-5-リン酸（Ｐ−５−Ｐ）とトランスアミナ ーゼのアポ酵素との会合を阻害するように思われる点に注目されたい。試験に用 いられる試料は、所望により、脱イオン水や食塩水のような適当な希釈剤で希釈 してもよい。アンモニア定量用試薬と尿素定量用試薬としては、上記したＡＳＴ 定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬に適した緩衝剤に加えて、ＧＯＯＤ緩衝剤、Ｃ ＡＰＳＯ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰＳＯが挙げられる。 保存剤としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ₃）、ヒドロ キシ安息香酸、ゲンタミシン、チモール及びメチルイソチアゾロンベーリンガー マンハイム社製の水銀非含有保存剤類などが好適である。保存剤の適当な添加量 は、２〜８℃で保存した時、少なくとも６〜８ヶ月は保存剤としての機能を保持 し、試薬中に存在する酵素の活性を阻害することのない量である。この基準を満 たす適当な範囲は、０．１〜１．０ｇ／Ｌである。 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸 （ＨＥＤＴＡ）等のような多種類のキレート剤が非特異的な安定剤としても好適 である。本発明のＡＳＴ定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬において、ＥＤＴＡは 、２−オキソグルタル酸を安定化するために約２．０−１０．０ｍｍｏｌ／Ｌの 濃度で好適に使用されてきた。この化合物は四ナトリウム塩としてもカリウム塩 としても入手できるが、本発明で使用するには二ナトリウム塩が好ましい。尿素 定量用試薬及びアンモニア定量用試薬においては、ＥＤＴＡは０．２ｍＭから１ ０ｍＭの範囲で用いられる。特に好ましいＥＤＴＡの濃度は１ｍＭである。 酵素安定剤も本発明の試薬に添加することができる。好ましい安定剤はプロテ アーゼ（蛋白質分解酵素）を含有しないウシ血清アルブミンである。そのほかの 好適な例は、ウシγ−グロブリン、Ｎ−アセチルシステイン及びグリセリンであ る。 所望により適当な消泡剤を添加することができる。使用できる界面活性剤の例 は、両性イオン性の界面活性剤及び非イオン性の界面活性剤であり、試薬中に存 在する酵素を阻害しない量で使用される。 本発明の他の態様として、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中 の目的物質を酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬 であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならし めるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによ って該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを 特徴とする方法が提供される。 また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のトランスアミナー ゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって 、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるよう に選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試 薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とす る方法が提供される。 また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアスパラギン酸ア ミノトランスフェラーゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を 包含する試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を 可能とならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元 システムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包 含することを特徴とする方法が提供される。 また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアラニンアミノト ランスフェラーゼを酵素反応によって定量する方法において、該補酵素を包含す る試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能と ならしめるように選択した酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システ ムによって該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含する ことを特徴とする方法が提供される。 また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中の尿素を酵素反応に よって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保存 中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵素 と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対し て安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が提供さ れる。 また、補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中のアンモニアを酵素 反応によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬 の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択し た酵素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化 に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特徴とする方法が 提供される。 本発明の方法においては、酵素と基質の組み合わせにおいて、基質に対する酵 素の特異性が不完全であることによって、酵素と基質の反応速度は遅いものであ る。 本発明の好ましい態様において、補酵素還元システムに含まれる酵素と基質の 組み合わせにおける互いの特異性は、酵素の本来の基質に対する特異性を１００ ％とした場合、５０％未満であることが好ましく、更には１０％未満であること が好ましい。より好ましくは、酵素と基質の組み合わせにおける互いの特異性は ５％未満であることが好ましく、約２％であることが最も望ましい。 補酵素、基質及び酵素は、本発明の試薬に関する上記の説明どおり、定量すべ き目的物質に応じて適宜に選択される。本発明のこの態様において、目的物質の 定量測定に用いられる補酵素還元システムの成分として好ましいものは、ＮＡＤ Ｈ、Ｇ−６−Ｐ−ＤＨおよびＤ−グルコースであり、次のような補酵素再生反応 を起こす。 Ｄ−グルコースに対するＧ−６−Ｐ−ＤＨの基質特異性が低いため、この補酵 素再生反応の速度は遅く、従って目的物 質の定量に関わる主反応と競合しない。 好適な実施態様 本発明の１つの好ましい態様によれば、ＡＬＴ定量用試薬は、本質的に下記の 成分で構成される： また、好ましくは、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、エチレンジアミン四 酢酸二ナトリウム、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含んでもよい。 本発明における処方によるＡＬＴ定量用試薬は、下記の通りである。 特に、本発明における処方による好ましいＡＬＴ定量用試薬は、下記の通りで ある。 本発明の１つの好ましい態様によれば、ＡＳＴ定量用試薬は、本質的に下記の 成分で構成される： また、好ましくは、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、エチレンジアミン四 酢酸二ナトリウム、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含んでもよい。 本発明における処方によるＡＳＴ定量用試薬は、下記の通りである。 特に、本発明における処方による好ましいＡＳＴ定量用試薬は、下記の通りで ある。 本発明の１つの好ましい態様によれば、尿素定量用試薬は、本質的に下記の成 分で構成される： 本発明における処方による尿素定量用試薬は、下記の通りである。 特に、本発明における処方による好ましい尿素定量用試薬 は、下記の通りである。 本発明の１つの好ましい態様によれば、アンモニア定量用試薬は、本質的に下 記の成分で構成される： また、好ましくは、ＴＲＩＳ緩衝液、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、エチレンジアミン四 酢酸二ナトリウム、ＡＤＰ−Ｋ、ウシ血清アルブミン及びアジ化ナトリウムを含 んでもよい。 本発明における処方によるアンモニア定量用試薬は、下記の通りである。 特に、本発明における処方による好ましい尿素定量用試薬は、下記の通りであ る。 本発明の試薬は、一液型の形態で調製することが好ましいが、二液型の形態で 調製することもできる。補酵素の再生に関する成分は、１本のバイアルのみに配 合されればよい。特に、ＩＦＣＣは、ＡＬＴ定量用試薬及びＡＳＴ定量用試薬に ついて、組成の内、２−オキソグルタル酸を他の成分とは別にして調製すること を奨励している。試薬Ａ（２−オキソグルタル酸を含んでいない）を、患者から 採取したサンプルと共に５〜１０分間インキュベートし、副反応を全て完結させ た後、２−オキソグルタル酸を加えて主反応を開始することができる。２−オキ ソグルタル酸が存在することによって、副反応の間にＡＳＴ及びＡＬＴが不活性 化しないよう保護するので、主反応の開始成分として、２−オキソグルタル酸の 代わりにアスパラギン酸又はアラニンを同様にして使用することもできる。適合 しない酵素と基質の組み合わせで構成される再生システムは、二液型の成分のう ちのＮＡＤＨを含む方へ導入するべきである。二液型試薬の場合、試料の存在下 でＰ−５−Ｐを血清に添加することによって、インキュベーションの間にアポ酵 素が活性化されるので、Ｐ−５−Ｐで完全に飽和された状態で血清中のＡＳＴ及 びＡＬＴの全触媒活性濃度を測定できる。従って、組成中にＰ−５−Ｐが含まれ ることが奨励される。二液型試薬に使用するＰ−５−Ｐ濃度は、約８０−１２０ μｍｏｌ／Ｌが好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌがより好ましい。 実施例１ 本発明における処方による４種類の定量用試薬の安定性を、下記のように試験 した。 処方： ＡＳＴ定量用試薬： ＡＬＴ定量用試薬： 保存条件： 蓋をして冷蔵（２〜８℃）する。 分光光度測定パラメータ（機種：Shimadzu PC2101）： ・反応温度 ３７℃ ・サンプル：試薬（体積比） １：１０〜１：２５ ・波長 ３４０ｎｍ ・キュベットの光路長 １ｃｍ 測定の遅滞時間（lag phase）はおよそ１分以下で、測定時間は遅滞時間後から ３分以内である。 これらの分光光度測定パラメータは、下記の値を求める際に用いた： ・３４０ｎｍでの試薬の初期吸光度 ・２０℃での再生速度（単位：Ａｂｓ／ｍｉｎ）。 コントロール標準の測定値を求めるために、コバス・ミラ（Cobas Mira）を使 用した。 下記の結果が得られた。 下記の表（表１０Ａ及び表１０Ｂ）より、ＡＳＴ定量用試薬とＡＬＴ定量用試 薬の両方について、７ヶ月に渡り、定量用試薬としての機能が保持されているこ とが分かる。各試験において、血清中のＡＳＴ及びＡＬＴ濃度の高いものと低い ものについて、新たに調製した試薬と、８℃で各々の期間保存した試薬の両方を 使用した。 上記の結果から、補酵素再生式ＡＳＴ定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬は、蓋 をして２〜８℃で保存した場合、少なくとも６〜７ヶ月は安定であることが分か る。試薬が機能するためには、初期の吸光度が１．０Ａでなければならない。７ ヶ月後も、まだ試薬の吸光度は少なくとも１．０Ａとなる。 表１０Ａ及び表１０Ｂの結果より、保存前の新しい試薬によるコントロール血 清の測定値と、８℃で２９週間にわたって保存した試薬の測定値との間に、顕著 な差異がないことが明らかである。また、表１１Ａ及び表１１Ｂの結果より、補 酵素再生技術を導入したＡＳＴ定量用試薬及びＡＬＴ定量用試薬は、８℃で３１ 週間の保存の後もまだ、試験結果が直線性を示し得る。 本発明で用いる再生システムを導入することによって、蓋をして２〜８℃で１ ヶ月から、２〜８℃で少なくとも６〜８ヶ月間保存した、血清中のＡＳＴ及びＡ ＬＴ定量用試薬の、再構成後の安定性が増加した。 実施例２ 尿素定量用試薬は、処方中のＮＡＤＨ濃度を０．３３ｍＭとしたこと及び試薬 のうちの一方についてＤ−グルコースの濃度を２０ｍＭに下げたことを除き、表 ５Ｂに示す成分により調製した。従って、処方された試薬のｐＨは８．５であっ た。コントロールとして従来の処方の尿素定量用試薬を用い た。各試薬には、不純物として０．１５ｍＭ（最終濃度）のアンモニアを混入し た。この濃度のアンモニアは、各々の試薬においてＮＡＤＰＨ ０．１５ｍＭ（ ３４０ｎｍにおける吸光度単位０．９３に相当）を消費するのに十分である。反 応完了後（即ち、試薬処方中のアンモニアの除去後）、島津製作所製分光光度計 を用い、２０℃で３４０ｎｍにおける種々の溶液（密封キュベット中）の吸光度 を測定した。 図１に示した結果は、アンモニア０．１５ｍＭ混入後の本発明の尿素定量用試 薬におけるＮＡＤ⁺からＮＡＤＨへの経時的な再生を示している。 図１において、 パネルＡは、従来の尿素定量用試薬におけるＮＡＤＨ再生を示している。 パネルＢは、リン酸ナトリウム５ｍＭ、Ｇ−６−ＰＤＨ２０００Ｕ／Ｌ及びＤ −グルコース２０ｍＭを含有する尿素定量用試薬におけるＮＡＤＨの再生を示し ている。 パネルＣは、リン酸カリウム５ｍＭ，Ｇ−６−ＰＤＨ ２０００Ｕ／Ｌ及びＤ −グルコース１００ｍＭを含有する尿素定量用試薬におけるＮＡＤＨの再生を示 している。 従来の試薬では、試薬にアンモニアを混入させた後、２０℃で４８時間経過し ても、消費されたＮＡＤＨは全く再生されなかった。 同一時間経過後、Ｄ−グルコース２０ｍＭを含有する本発 明の尿素定量用試薬は、０．２３吸光度単位，即ち０．０４ｍＭのＮＡＤＨが再 生された。 ４８時間経過後、Ｄ−グルコース１００ｍＭを含有する本発明の尿素定量用試 薬は、０．７０吸光度単位、即ち０．１１ｍＭのＮＡＤＨが再生された。 これらの結果は、前記の尿素定量用試薬が、アンモニアの混入による試薬中の ＮＡＤＨの消費を克服する能力を有することを示している。 各々の尿素定量用試薬におけるＮＡＤＨ再生の最大速度を、表１２に示す。従 来の尿素定量用試薬においては、混入した アンモニアの除去により、吸光度は経時的に緩やかに減少したが、本発明の処方 においては、ＮＡＤＨの再生速度は試薬中のＤ−グルコースの濃度の増加に伴っ て増加した。 試薬のｐＨ値が８．０〜９．３の範囲となるよう、ＴＲＩＳ／ＴＲＩＳ−ＨＣ ｌ緩衝液の比率（緩衝液の全濃度１００ｍＭ）を種々変更したことを除いて、ア ンモニア定量用試薬を、上記表６Ｂに示すような成分を用いて調製した。また、 アンモニア定量用試薬におけるＮＡＤＰＨの最終濃度０．２ｍＭとした。また、 コントロール用のアンモニア定量用試薬として、Ｄ−グルコース，リン酸カリウ ム及びＧ−６−ＰＤＨを加えない溶液も調製した。試薬には、アンモニア０．１ ｍＭ（最終濃度）を混入した。この濃度のアンモニアの混入は、各々の試薬にお いて０．１ｍＭのＮＡＤＰＨ（３４０ｎｍにおける吸光度単位０．６２に相当） を消費するのに十分である。反応完了後（即ち、試薬処方中のアンモニアの除去 後）、島津製作所製分光光度計を用い、２０℃で３４０ｎｍにおける種々の溶液 （密封キュベット中）の吸光度を測定した。 図２に示した結果は、アンモニア０．１ｍＭ混入後の、本発明の、ｐＨ８．０ 〜９．３の間のアンモニア定量用試薬におけるＮＡＤＰ⁺からのＮＡＤＰＨへの 経時的な再生を示している。 ＮＡＤＰＨの再生は、アンモニア混入後、２０℃、２４時 間以内に完了した。各々のアンモニア定量用試薬におけるＮＡＤＰＨ還元の最大 速度を表１３に示す。ｐＨ８．０である従来のアンモニア定量用試薬においては 、溶液の吸光度は０．６〜０．６５の間にとどまり、しかも徐々に減少した。本 発明の処方では、全てのｐＨ値においてＮＡＤＰＨの再生速度はほとんど同一で あった。ＮＡＤＰＨの再生速度が最大となるのはｐＨ８．５０の試薬であった。 これらの結果は、前記のアンモニア定量用試薬が、アンモニアの混入による試 薬中のＮＡＤＰＨの消費を克服する能力を有することを明確に示している。 実施例３ アンモニア及び尿素定量用試薬中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ損失速度 Ａ 尿素定量用試薬 尿素定量用試薬は、表５Ｂに示すような処方により調製したが、以下のような 点を変更した。 ＮＡＤＨの最終濃度を、０．２５ｍＭとした。尿素定量用試薬のｐＨ値は、Ｔ ＲＩＳ／ＴＲＩＳ−ＨＣｌの混合比を変えることにより調整した（緩衝液濃度１ ００ｍＭ）。コントロール用尿素定量用試薬として、Ｄ−グルコース、リン酸塩 及びＧ−６−ＰＤＨを加えない溶液も調製した。 ２０±２℃で、密閉されたキュベットで保存された試薬のサンプル溶液の３４ ０ｎｍにおける吸光度をモニターした。 ２０±２℃で一定時間モニターした、尿素定量用試薬の３４０ｎｍにおける吸 光度の減少を、表１４に示す。 補酵素還元システムが存在するか否かに関わらず、ｐＨ８．５の試薬溶液と比 較して、ｐＨ８．０の試薬溶液の吸光度はより急速に減少することが明白である 。しかし、本発明の処方においては、試薬の吸光度の減少速度も又、かなり低下 した。言い換えれば、ｐＨを高め、補酵素還元システムを導入することにより、 尿素定量用試薬中のＮＡＤＰＨの消失速度をかなり下げる事ができる。 試薬のｐＨを８．５以上に上げることにより、ＮＡＤＨの 安定性は向上するが、試薬中の市販のウレアーゼやグルタミン酸デヒドロゲナー ゼの安定性や活性が低下してゆくことに注意すべきである。従って、十分な酵素 活性や安定性を維持しつつ、適切なＮＡＤＨの安定性を確保するためには、適切 な試薬のｐＨを選択する必要がある。このことから、試薬の処方はおよそｐＨ８ ．５が好ましい。 Ｂ アンモニア定量用試薬 アンモニア定量用試薬は、表６Ｂに示すような処方により調製したが、以下の ような点を変更した。 ＮＡＤＰＨの最終濃度を、０．２ｍＭとした。アンモニア定量用試薬のｐＨ値 は、ＴＲＩＳ／ＴＲＩＳ−ＨＣｌの混合比を変えることにより調整した（緩衝液 濃度１００ｍＭ）。コントロール用アンモニア定量用試薬として、Ｄ−グルコー ス、リン酸塩及びＧ−６−ＰＤＨを加えない溶液も調製した。 ２０±２℃で、密閉されたキュベットで保存された試薬のサンプル溶液の３４ ０ｎｍにおける吸光度をモニターした。 ２０±２℃で一定時間モニターしたアンモニア定量用試薬の３４０ｎｍにおけ る吸光度の減少を、表１５に示す。 補酵素還元システムが存在するか否かに関わらず、ｐＨの低下に伴い、溶液の 吸光度がより急速に減少することは明白である。しかし、本発明の処方において は、試液の吸光度の減少速度も又、かなり低下した。言い換えれば、ｐＨを高め 、補酵素還元システムを導入することにより、アンモニア定量用試薬中のＮＡＤ ＰＨの消失速度をかなり下げる事ができる。 試薬のｐＨを上げることにより、ＮＡＤＰＨの安定性は向上するが、ｐＨを８ ．５以上に上げると試薬中の市販のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの安定性や活 性が低下してゆくことに注意すべきである。従って、十分な酵素活性や安定性を 維持しつつ、適切なＮＡＤＰＨの安定性を確保するためには、適切な試薬のｐＨ を選択する必要がある。このことから、試薬の処方はｐＨ８．５−９．５が好ま しい。 実施例４ アンモニアおよび尿素試薬の機能性 Ａ 尿素定量用試薬 尿素定量用試薬は、表５Ｂにまとめた組成に従い、Ｄ−グルコース、リン酸塩 およびＧ−６−ＰＤＨを含有する試薬及び含有しない試薬をそれぞれ調製した。 しかし、いずれの試薬構成においても、ＮＡＤＨの最終的濃度は０．２５ｍＭと した。試薬を用いた際に測定値の直線性を、Ｖｅｒｉｃｈｅｍ Ｌｅｖｅｌ が 正常値のサンプルと異常値のサンプルを 比較した。測定は下記特定のパラメーターを用いて行なわれた。 反応温度 ： ３７℃ 試料と試薬の容量比 ： １：１００ 波長 ： ３４０ｎｍ 表１６に示した結果から、本発明の尿素定量用試薬は、ｐＨ８．５０において 、試検に用いられた最も高い尿素値を示する試料（Ｖｅｒｉｃｈｅｍ ｌｅｖｅ ｌ Ｅ，３７．４ｍＭの尿素）においても測定値は直線性を示し、特定の試料濃 度における測定値の変動は５％以内であることがわかった。更に、本発明の尿素 定量用試薬は、正常値のサンプルおよび異常値のサンプルのいずれの測定におい ても、測定値の変差は誤差範囲内であった。 Ｂ アンモニア試薬 アンモニア試薬は表６Ｂにまとめた組成に従い、Ｄ−グルコース、リン酸塩お よびＧ−６−ＰＤＨを含有する試薬及び含有しない試薬をそれぞれ調製した。試 薬を用いた際に得ら ＣＯＢＡＳ ＭＩＲＡ^TM で測定した結果と比較した。測定は下記特定のパラ メーターを用いて行なわれた。 反応温度 ： ３７℃ 試料と試薬の容量比 ： １：１０ 波長 ： ３４０ｎｍ 表１７に示した結果から本発明のアンモニア定量用試薬は、ｐＨ８．５０にお いて、試検に用いられた最も高いアンモニア値を示す試料（１２００μＭのアン モニア）においても測定値は直線性を示し、特定の試料濃度における測定値の変 動は５％以内であった。 実施例５ 尿素定量用試薬は、下記の処方に従って二液型に調製することができる。混合 試薬を得るために必要なＡ液試薬とＢ液試薬の添加の相対量は、Ａ液：Ｂ液とし て５：１である。尿素定量用試薬Ａ液 尿素定量用試薬Ｂ液 アンモニア定量用試薬、二液型 アンモニア定量用試薬は、下記の処方に従って二液型に調製することができる 。 混合試薬を得るために必要なＡ液試薬とＢ液試薬の添加の相対量は、Ａ液：Ｂ 液として５：１である。ここで提供する処方例においては、ＮＡＤＨがＮＡＤＰ Ｈの代りに用いられている。従って、主分析反応の開始の前に、干渉患者試料中 のピルビン酸を除去する目的でＬＤＨがＡ液に含まれている。アンモニア定量用試薬Ａ液 アンモニア定量用試薬Ｂ液 本発明の試薬と方法の他の主要な優位性は、試薬の最も好ましい形態が一液型 試薬であることであり、それにより保存場所を減らし、かつ従来の試薬における 在庫に関する問題を解消することができる点である。さらに、本発明の試薬は様 々な測定方法に適応することができる。 本発明の試薬と方法において、補酵素の再生を遅らせるために用いることが可 能な非特異的な基質と酵素の組み合わせはぼう大に存在することを認識しなけれ ばならない。ここに記載したもの以外にも商品として入手できないものや法外に 高価なものがある。 また、本発明はＡＳＴ、ＡＬＴ、アンモニアおよび尿素以外の目的物質、たと えばＬＤＨ（ピルビン酸を乳酸に変換する）、トリグリセリド類、およびサリチ ル酸の定量に用いられる試薬の安定化に適応可能である。本発明は、本明細書中 の例示によって、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アンモニアおよび尿素の定量用試薬及び定量 方法として制限されるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ， ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジェンセン，ウェイン オーストラリア国、ブイアイシー 3168、 クレイトン、1860 プリンセス ハイウェ イ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の目的物質の酵素反応による 定量法のための試薬であって、該試薬の保存中ずっと通して該補酵素の連続的な 再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包含する補 酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていることを特徴と する試薬。 ２．該連続的な再生が１８〜２５℃で０．０１〜０．９ｍＡｂｓ／分の範囲内の 速度で起きていることを特徴とする請求項１に記載の試薬。 ３．該補酵素還元システムが酵素と基質を包含し、該酵素が該基質に対して不完 全な特異性を有していることを特徴とする請求項１又は２に記載の試薬。 ４．該酵素と基質の組み合わせがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼとＤ −グルコースとの組み合わせであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに 記載の試薬。 ５．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で５０％未満であることを特徴 とする請求項３又は４に記載の試薬。 ６．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で１０％未満であることを特徴 とする請求項３〜５のいずれかに記載の試薬。 ７．該目的物質がトランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１〜６のい ずれかに記載の試薬。 ８．該トランスアミナーゼがアスパラギン酸トランスアミナーゼであることを特 徴とする請求項７に記載の試薬。 ９．該トランスアミナーゼがアラニントランスアミナーゼであることを特徴とす る請求項７に記載の試薬。 １０．該目的物質が尿素であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載 の試薬。 １１．該目的物質がアンモニアであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか に記載の試薬。 １２．補酵素の酸化度を測定することを含む、患者中の目的物質の酵素反応によ る定量法のための試薬であって、該試薬は１液型試薬であり、且つ、保存中ずっ と通して該補酵素の 連続的な再生を可能とならしめるように選択された酵素と基質の組み合わせを包 含する補酵素還元システムによって該試薬が酸化に対して安定化されていること を特徴とする試薬。 １３．該連続的な再生が１８〜２５℃で０．０１〜０．９ｍＡｂｓ／分の範囲内 の速度で起きていることを特徴とする請求項１２に記載の試薬。 １４．該補酵素還元システムが酵素と基質を包含し、該酵素が該基質に対して不 完全な特異性を示していることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の試薬。 １５．該酵素と基質の組み合わせがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと Ｄ−グルコースとの組み合わせであることを特徴とする請求項１２〜１４のいず れかに記載の試薬。 １６．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で５０％未満であることを特 徴とする請求項１４又は１５に記載の試薬。 １７．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で１０％未満であることを特 徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載の試薬。 １８．該目的物質がトランスアミナーゼであることを特徴とする請求項１２〜１ ７のいずれかに記載の試薬。 １９．該トランスアミナーゼがアスパラギン酸トランスアミナーゼであることを 特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに記載の試薬。 ２０．該トランスアミナーゼがアラニントランスアミナーゼであることを特徴と する請求項１２〜１７のいずれかに記載の試薬。 ２１．該目的物質が尿素であることを特徴とする請求項１２〜１７のいずれかに 記載の試薬。 ２２．該目的物質がアンモニアであることを特徴とする請求項１２〜１７のいず れかに記載の試薬。 ２３．補酵素の酸化度を測定することを含む、体液試料中の目的物質を酵素反応 によって定量する方法において、該補酵素を包含する試薬であって、該試薬の保 存中ずっと通して該補酵素の連続的な再生を可能とならしめるように選択した酵 素と基質の組み合わせを包含する補酵素還元システムによっ て該試薬が酸化に対して安定化されている試薬を用いることを包含することを特 徴とする方法。 ２４．該連続的な再生が１８〜２５℃で０．０１〜０．９ｍＡｂｓ／分の範囲内 の速度で起きていることを特徴とする請求項２３に記載の方法。 ２５．該補酵素還元システムが酵素と基質を包含し、該酵素が該基質に対して不 完全な特異性を有していることを特徴とする請求項２３又は２４に記載の方法。 ２６．該酵素と基質の組み合わせがグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと Ｄ−グルコースとの組み合わせであることを特徴とする請求項２３〜２５のいず れかに記載の方法。 ２７．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で５０％未満であることを特 徴とする請求項２５又は２６に記載の方法。 ２８．該酵素の該基質に対する特異性が等モル基準で１０％未満であることを特 徴とする請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。 ２９．該目的物質がトランスアミナーゼであることを特徴とする請求項２３〜２ ８のいずれかに記載の試薬。 ３０．該目的物質がアスパラギン酸トランスアミナーゼであることを特徴とする 請求項２３〜２８のいずれかに記載の試薬。 ３１．該目的物質がアラニントランスアミナーゼであることを特徴とする請求項 ２３〜２８のいずれかに記載の試薬。 ３２．該目的物質が尿素であることを特徴とする請求項２３〜２８のいずれかに 記載の試薬。 ３３．該目的物質がアンモニアであることを特徴とする請求項２３〜２８のいず れかに記載の試薬。