JP3586737B2

JP3586737B2 - 生体物質の測定方法

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Publication number: JP3586737B2
Application number: JP17599693A
Authority: JP
Inventors: 正光高橋; 泰史白波瀬; 吉史渡津
Original assignee: 国際試薬株式会社
Priority date: 1993-06-22
Filing date: 1993-06-22
Publication date: 2004-11-10
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: JPH078297A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は生体物質の測定方法に関する。より詳細には、臨床検査などの分野で用いられ、血清、血漿、尿などの検体中の生体物質の測定（定量及び活性測定）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、臨床検査、生化学検査などの分野においては、生体物質の定量や酵素活性の測定が頻繁に行われており、この測定には反応特異性の高い酵素反応を用いた方法が汎用されている。このような酵素反応を用いた生体物質の測定法においては、例えば、▲１▼測定対象である生体物質が関与し且つ過酸化水素を生成する酵素反応系を用い、生成した過酸化水素をパーオキシダーゼの存在下、発色性物質と反応させることにより発色させ、その吸光度変化量に基づいて生体物質を測定する方法；▲２▼測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ（Ｐ）Ｈ［還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）］からＮＡＤ（Ｐ）⁺［酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）］を生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度減少量に基づいて生体物質を測定する方法などが用いられており、また▲３▼測定対象である生体物質が関与し且つＮＡＤ⁺からＮＡＤＨを生成する酵素反応系を用い、ＮＡＤＨの吸光度増加量に基づいて生体物質を測定する方法（特開平５−９５７９８号公報参照）が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
上記▲１▼の測定方法においては、検体中に存在する還元性物質（例えば、尿酸、アスコルビン酸、ビリルビン、ヘモグロビン等）や酸化性物質などにより過酸化水素の分解などが生じやすく、正確な値を与えない場合がある。一方、上記▲２▼の方法においては、十分量の基質［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、補酵素等］を反応系に添加することが困難なので定量限界が低く、また測定波長における検体の吸収（濁り、溶血、黄疸等）により測定できる範囲が狭くなるという問題がある。
このような問題から、酵素反応による生体物質の測定に際しては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する反応系を用い、生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの吸光度の上昇に基づいて生体物質を測定する方法が好適であり、自動分析にも適している。
【０００４】
しかしながら、上記▲３▼の方法では、酵素としてピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体が用いられており、当該酵素複合体は３種の酵素が非共有結合で分子集合した複合体なので、高純度の酵素複合体を得ることが困難である。また、還元作用を示すコエンザイムＡを利用しなければならず、コエンザイムＡが測定値に影響を与えるおそれがある。更に、ひとつの酵素作用としてリポアミド−ＦＡＤが関与するためにホルマザン法への応用が困難であり、また干渉を受けやすい。加えて、一般に検体にはＬＤＨ（ラクテートデヒドロゲナーゼ）が含まれており、上記▲３▼の方法では検体中のＬＤＨの干渉（即ち、ＬＤＨによる乳酸＋ＮＡＤ⁺⇔ピルビン酸＋ＮＡＤＨの酵素反応が生ずるので、ＮＡＤＨ量の変動等が起る）を考慮しなければならないという問題がある。ＬＤＨはＮＡＤ⁺には作用するがＮＡＤＰ⁺には作用しないため、基質としてＮＡＤＰ⁺を用いればＬＤＨの干渉は回避できるが、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体はＮＡＤＰ⁺に作用しないので、基質をＮＡＤＰ⁺に変更しても上記の問題を解消することはできない。
【０００５】
かかる観点から、本発明者等は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成する酵素反応であり、単独で又は他の酵素反応系と共役させることにより、生体物質の測定に広く利用できる酵素反応を鋭意検討した結果、ピルビン酸脱炭酸酵素（E.C 4.1.1.1、以下、ＰＤＣという）及びアルデヒド脱水素酵素（E.C 1.2.1.3，1.2.1.4，1.2.1.5、以下、ＡｌＤＨという）の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）^＋、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）^＋、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）^＋などのＮＡＤ（Ｐ）^＋類からその還元体であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応が極めて有用であり、かかる反応は生体物質の測定に普遍的に利用できる酵素反応であることを見出した。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決すべくなされた本発明の生体物質の測定方法は、酵素反応を用いて生体物質を測定する方法であり、当該測定方法がピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系からなるとき、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）^＋類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役させることにより、生成したピルビン酸を消費すると共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を増加させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定することからなる。
【０００７】
本発明で用いられる、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）⁺類からＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応は下記酵素反応式１及び２で示される。
【０００８】
【化１】

【０００９】
この酵素反応の基質であるピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）⁺類はそれ自体が生体物質として測定の対象とされ、また多くの生体物質は酵素反応によりこれらのいずれかの物質に変換することができるので、当該酵素反応と上記酵素反応式１及び２で示される酵素反応を共役させることにより、測定対象である生体物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。酵素反応式１及び２で示される酵素反応はそれぞれ公知であるが、酵素反応式１及び２で示される酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）⁺からＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生成させる反応を利用して生体物質を測定する例は知られていない。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１０】
上記酵素反応式１で示される酵素反応に用いられるＰＤＣは、植物及び微生物に広く存在する酵素であり、例えば、コムギ胚芽、酵母などから分離・精製することにより得ることができる。また、上記酵素反応式２で示される酵素反応に用いられるＡｌＤＨは、動物及び微生物に広く存在する酵素であり、例えば、動物肝などから分離・精製することにより得ることができる。本発明において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの由来は特に限定されない。
【００１１】
酵素反応式２に示されるように、上記ＡｌＤＨが触媒する酵素反応は、アセトアルデヒドの酸化的脱水素反応であり、この間にＮＡＤ（Ｐ）⁺類は還元されてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成する。ここにおけるＮＡＤ（Ｐ）⁺類には、通常単にＮＡＤ（Ｐ）⁺と称されるβ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺［本明細書においても、単にＮＡＤ（Ｐ）⁺と記す］の他に、例えば、α−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、デスオキシ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、イソニコチン酸ヒドラジド−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、６−アミノ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、１，Ｎ⁶−エテノ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、デアミド−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、３−ピリジンアルデヒド−ＮＡＤ（Ｐ）⁺、３−ピリジンアルデヒド−デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）⁺などが包含されるが、上記酵素反応式２の酵素反応に基づいて還元体を生成するＮＡＤ（Ｐ）⁺アナログであればこれらに限定されるものではない。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類は上記のＮＡＤ（Ｐ）⁺類の還元型を意味する。
また、酵素反応１の酵素反応はチアミンピロリン酸（ＴＰＰ）の存在下に反応が進行するので、反応系にはＴＰＰを添加するのが好ましい。更に、ＰＤＣはＭｇ²⁺により活性化されるので、反応系にはＭｇ²⁺を添加するのが好ましい。
【００１２】
上記酵素反応式１及び２に示される酵素反応は、ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）⁺類を基質とする反応であり、上記２種の物質のいずれかを基質とすることにより他の物質をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて定量することができる。また、基質であるピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）⁺類を過剰に添加することにより、補欠分子族であるＴＰＰや活性化因子であるＭｇ²⁺をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて定量することができる。
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便且つ高精度で測定することができるので吸光度測定法により行われる。測定波長はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の種類により適宜選択され、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、３−アセチル−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、デアミノ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなどの場合には３４０ｎｍ、チオ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの場合には４０５ｎｍの波長が選択される。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量の測定法として、テトラゾリウム塩を共存させてホルマザンに変換し、生成ホルマザンの呈色度を測定する方法などを用いてもよい。
【００１３】
前述のように、各種生体物質は種々の酵素反応系を用いることにより、酵素反応式１及び２の酵素反応の基質であるピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）⁺類に導くことができる。従って、これらの酵素反応系と酵素反応式１及び２で示される酵素反応系を共役させることにより、各種生体物質（基質、補欠分子族、活性化因子など）量又は生体物質としての酵素の活性を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量として測定することができる。これらの例を挙げると、基質としては、例えば、ＡＤＰ、尿素窒素、クレアチン、クレアチニン、遊離脂肪酸、シアル酸、中性脂肪、リン脂質、アミノ酸などが例示され、補欠分子族としては、例えば、ＴＰＰ、ピリドキサルリン酸、テトラヒドロ葉酸などが例示され、活性化因子としては、例えば、マグネシウムイオン、カリウムイオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、ナトリウムイオン、クロルイオン、炭酸水素イオンなどが例示され、酵素としては、例えば、ピルベートキナーゼ（ＰＫ）、コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、クレアチンホスフェートキナーゼ（ＣＰＫ）、マレートデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などが例示される。これらの基質、酵素などを用いた酵素反応であり、ピルビン酸又はＮＡＤ（Ｐ）⁺類を生成する酵素反応の例を下記に示す。なお、下記の酵素反応式中、酵素反応によりＡＤＰに導いたものについては、以後、酵素反応式３によりピルビン酸に導く。また、Ｐはリン酸残基を意味する。
【００１４】
【化２】

【００１５】
【化３】

【００１６】
【化４】

【００１７】
【化５】

【００１８】
【化６】

【００１９】
【化７】

【００２０】
【化８】

【００２１】
【化９】

【００２２】
本発明において、酵素反応を用いて生体物質を測定する方法が、ピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系からなるとき、酵素反応式１及び２で示される酵素反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役させることにより、生成したピルビン酸を消費できると共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を２倍とすることができる。この方法によれば、生成したピルビン酸による反応阻害を回避することができ、また２倍のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので測定精度の向上が図れるという効果を奏する。
【００２３】
以下、本発明の生体物質の測定方法（基質などの定量及び酵素活性）を例をもって具体的に説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。
１）酵素反応系により生成したピルビン酸及び／又は内因性のピルビン酸を、酵素反応式１及び２の酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
ピルビン酸の測定法としては、ＬＤＨを用いるＮＡＤＨの減少量測定法、パーオキシダーゼを用いた過酸化水素法などが知られているが、本発明の方法は以下の点で優れている。
▲１▼ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量を測定するので定量限界が高い。
▲２▼ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の分子吸光係数が明確なため定量が容易である。
▲３▼ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成系は、血清等の検体中の還元性物質の影響を受けない。
▲４▼ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の発色は、他の色素（例えば、キノン色素等）に比べて安定である。
【００２４】
２）酵素反応系により生成したＮＡＤ（Ｐ）⁺類及び／又は内因性のＮＡＤ（Ｐ）⁺類を、酵素反応式１及び２の酵素反応によりＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
ＮＡＤ（Ｐ）⁺類の測定法としては、種々の方法が知られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２５】
３）酵素反応式３の酵素反応と酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、酵素反応系により生成したＡＤＰ及び／又は内因性のＡＤＰを、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
ＡＤＰの測定法としては、ＰＫ、ＡＴＰ及びＰＥＰを併用したＬＤＨ法又はＰＯＰ法などが知られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２６】
４）酵素反応式７又は８の酵素反応と、酵素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のクレアチン又はクレアチニンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
クレアチン又はクレアチニンの測定法としては、Creatinine amidohydrolase(C₁)-Creatine amidinohydrolase(C₂)-Sarcosine oxidase(SOD)-POD系、C₁-C₂-SOD-Formaldehyde dehydrogenase(FDH)系などが広く用いられているが、本発明の方法によれば、上記１）に記載した効果に加え、従来法に比べて共役系の酵素反応数が少ないという利点を有する。
【００２７】
５）酵素反応式４の酵素反応と、酵素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中の尿素窒素をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
尿素窒素の測定法としては、Glutamate dehydrogenase (GLDH)-Urease法、PK-LDH-Urea amidolyase法などが知られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られ、更に検体中のアンモニアの影響を受けることもない利点を有する。
【００２８】
６）酵素反応式１４の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のシアル酸をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
シアル酸の測定法としては、LDH法、Pyruvate oxidase (POP)法、N-Acetyl-D-mannosamine dehydrogenase (AMDH)法などが知られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００２９】
７）酵素反応式１５の酵素反応と、酵素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中の中性脂肪をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
中性脂肪の測定法としては、Lipoprotein lipase (LPL)により生成するグリセロールを測定する方法に基づき、Glycerol kinase (GK)-Glycerol-3-phosphate oxidase (GPO)法、Glycerol oxidase (GOD)法、Glycerol dehydrogenase (GDH)法などが知られているが、本発明の方法によれば上記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００３０】
８）酵素反応式１３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＬＤＨの酵素活性（乳酸からピルビン酸へ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
現在用いられているＬＤＨの測定法は、ピルビン酸やＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対するＫｍが小さいために生成物阻害を受けやすく、反応直線部分が短いので正確に測定するには初速度を測定する必要がある。それに対し、本発明の方法では下記の点で優れる。
▲１▼反応生成物であるピルビン酸が酵素反応式１及び２の酵素反応により消失するので、反応直線性が向上し、長時間域での測定が可能となる。
▲２▼１モルの乳酸から２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するため感度が２倍になり、低活性の検体（特に、ＬＤＨのアイソザイム測定等）においても正確に測定することができる利点を有する。
【００３１】
９）酵素反応式１２の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＭＤＨの酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
現在、アイソザイム測定（電気泳動等）などにより、心筋梗塞や肝疾患の場合にＭＤＨが上昇することが知られており臨床的に有用である。本発明の方法によれば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成でＭＤＨ活性を測定することができ、また上記と同様に反応直線性が向上すると共に２モルのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類が生成するので、感度の向上が図れる。
【００３２】
１０）酵素反応式９の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＬＴの酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
現在使用されているＡＬＴの測定法は、ＡＬＴの作用により生成したピルビン酸を測定するＬＤＨ法やＰＯＰ法であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００３３】
１１）酵素反応式１０の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のＡＳＴの酵素活性をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。現在使用されているＡＳＴの測定法は、ＡＳＴの作用により生成したオキサロ酢酸を測定するMDH法とOxaloacetate decarboxylase (OADC)-POP法であるが、本発明の方法によれば前記１）に記載した効果と同じ効果が得られる。
【００３４】
１２）酵素反応式１及び２の酵素反応により、検体中のマグネシウムイオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
マグネシウムイオンの測定法としては、キシリジンブルー法、GK-G6PDH法などが知られているが、本発明の方法による測定によれば上記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
【００３５】
１３）酵素反応式３の酵素反応と、酵素反応式１及び２の酵素反応とを組合せ、検体中のカリウムイオンをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の増加量として測定する方法。
カリウムイオンの測定法としては炎光法、電極法等が知られている。酵素反応式３の酵素反応は活性化因子としてカリウムイオンを必要とするので、酵素反応式１及び２の酵素反応と組合せることにより、検体中のカリウムイオンを測定することができ、この方法によれば上記１）に記載した効果と同様な効果が得られる。
【００３６】
本発明において、酵素反応式１及び２で示される酵素反応の基質及びＰＤＣ及びＡｌＤＨの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、測定対象となる生体物質の種類、検体中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間及び温度などにより適宜調整されるが、ＰＤＣ及びＡｌＤＨの濃度は０．１〜１００単位／ｍｌ程度、好ましくは０．５〜３０単位／ｍｌ程度、より好ましくは１〜５単位／ｍｌ程度とされる。ピルビン酸及びＮＡＤ（Ｐ）⁺類の濃度は、これらが測定対象物質の酵素反応系から由来するときは当然にその濃度となるが、基質として反応系に添加する場合には、ピルビン酸の濃度は０．５〜１０ｍＭ程度、好ましくは１〜５ｍＭ程度、ＮＡＤ（Ｐ）⁺類の濃度は１〜１０ｍＭ程度、好ましくは２〜５ｍＭ程度とされる。また、ＴＰＰの濃度としては、0.05〜１ｍＭ程度、好ましくは０．１〜０．５ｍＭ程度とされ、Ｍｇ²⁺の濃度としては０．１〜５ｍＭ程度、好ましくは０．５〜３ｍＭ程度とされる。
【００３７】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液、モノ又はジエタノールアミン緩衝液等）を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、エンドポイト法、レートアッセイ法などの適宜な手法を用いることができる。
なお、前述したように、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を用いた方法においては、検体中にＬＤＨが存在する場合には、ＬＤＨが測定値に影響を与えるので、ＬＤＨの測定以外の場合には、反応系にＬＤＨ阻害剤（例えば、オキサミン酸及びその塩、蓚酸及びその塩等）を必ず添加する必要がある。しかし、ＮＡＤＰ⁺はＬＤＨの基質とならないので、本発明の方法においてＮＡＤＰ⁺を用いることにより、かかる問題を解消することができる。
測定対象である生体物質を含有する検体としては、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の測定方法では、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定するので測定限界が高く、また分子吸光係数が明確になっているＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を測定するので、測定値の信頼性が高い。更に、本発明の測定方法は、検体中の還元性物質などの影響を受けないという利点を有する。従って、本発明によれば、生体物質を簡便にして高精度で測定することができ、自動分析にも容易に適用することができるという効果を奏する。
【００３９】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、ＰＤＣは大腸菌由来を、ＡｌＤＨは酵母又は大腸菌由来を、ＰＫはブタ心臓由来を用いた。
【００４０】
参考例１
ピルビン酸の定量

(2)測定方法：
ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。
図１に示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００４１】
参考例２
ＡＤＰの定量

(2)測定方法：
ＡＤＰカリウムを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにＡＤＰサンプル２０μｌを加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定する。
図２に示すようにＡＤＰが定量的に測定できた。
【００４２】
参考例３
クレアチンの定量

(2)測定方法：
クレアチンを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチンサンプル２０μｌを加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定する。
図３に示すようにクレアチンが定量的に測定できた。
【００４３】
参考例４
クレアチニンの定量

(2)測定方法：
クレアチニンを約１４ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにクレアチニンサンプル２０μｌを加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照に測定する。
図４に示すようにクレアニチンが定量的に測定できた。
【００４４】
参考例５
ＮＡＤ ^＋及びＮＡＤＰ ^＋の定量

(2)測定方法：
ＮＡＤ^＋及びＮＡＤＰ^＋をそれぞれ約１４ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに、上記のＮＡＤ^＋サンプル又はＮＡＤＰ^＋サンプルを２０μｌを加え３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照に測定する。
図５及び図６に示すようにＮＡＤ（Ｐ）^＋が定量的に測定できた。
【００４５】
実施例１
ＬＤＨの測定

(3)測定方法：
測定試薬２．８ｍｌにヒト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを加え、３７℃、３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランク対照に計算する。
同様に、対照試薬２．８ｍｌにヒト由来ＬＤＨ（ＬＤ−１）２００μｌを、加え３７℃、３４０ｎｍの吸光度変化を記録し、１分間当り吸光度変化量を試薬ブランク対照に計算する。
各測定試薬での反応経過を図７に示し、また１分間当りの吸光度変化量を表１に示す。
【００４６】
【表１】

【００４７】
図７に示されるように、対照試薬での反応においては直線部分が短く、その後、生成物（ピルビン酸）阻害を受け反応が抑制される。それに対して、本発明の測定方法においては、生成ピルビン酸の影響を回避できるので直線部分が長く、また感度も高い。
現在使用されているＬＤＨ測定（乳酸→ピルビン酸)は対照試薬のように初速度しか測定することができないが、ＰＤＣ及びＡｌＤＨを共役させることにより長い範囲での測定が可能であり感度が２倍に上昇する。
ＬＤＨやＭＤＨのように、ＮＡＤ⁺又はＮＡＤＰ⁺を補酵素とし且つ反応系を共役させることによりピルビン酸生成に導ける活性測定法において、ＰＤＣ及びＡｌＤＨを共役させることは、反応直線性の向上と感度の上昇が得られ、低活性のものの測定に有利である。
【００４８】
参考例６
血中クレアチニンの測定

(2)測定方法：
血清５μｌに第１試薬３１５μｌを加え、３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、クレアチニン標準液（５ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても同様に測定し、その値を用いて血中クレアチニン濃度を算出する。
対照法としてJaffe法を用いた市販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。
その結果を表２に示す。表２に示されるようによい相関性(Y=1.02X-0.22)を示した。
【００４９】
【表２】

【００５０】
参考例７
血中尿素窒素の測定

(2)測定方法：
血清３μｌに第１試薬３６０μｌを加え、３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算出する。
対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。
その結果を表３に示す。表３に示されるようによい相関性(Y=0.97X+0.12)を示した。
【００５１】
【表３】

【００５２】
参考例８
血中シアル酸の測定

(2)測定方法：
血清７μｌに第１試薬３１５μｌを加え、３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を測定し、さらに第２試薬３５μｌを加え、３７℃、５分間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、シアル酸標準液［Ｎ−アセチルノイラミン酸(NANA)１００ｍｇ／ｄｌ］及び精製水についても同様に測定し、その値を用いて血中シアル酸濃度を算出する。
対照法としてＮＤ−ＮＡＬ−ＬＤＨ法を用いた市販品を用いて、同じ検体について測定した。
その結果を表４に示す。表４に示されるようによい相関性(Y=1.00X-0.31)を示した。
【００５３】
【表４】

【００５４】
参考例９
血中中性脂肪の測定

(2)測定方法：
血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、３７℃、５分間加温後、３４０ｎｍの吸光度（Ａ1）を測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分間加温し、３４０ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ2とＡ1より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、ＴＧ標準液（２００ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても同様に測定し、その値を用いて血中中性脂肪濃度を算出する。
対照法としてＬＰＬ−ＧＫ−ＧＰＯ法を用いた市販の試薬を用いて、同じ検体を測定した。
その結果を表５に示す。表５に示されるようによい相関性(Y=1.00X+1.21)を示した。
【００５５】
【表５】

【００５６】
実施例２
血中ＬＤＨの測定

(3)測定方法：
血清８μｌに第１試薬３２０μｌを加え、３７℃、５分間加温後、第２試薬８０μｌを加え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。
対照試薬も同様に操作するが、第２試薬添加後、３７℃で３０秒から２分までの反応直線部分(初速度)の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。その結果を表６に示す。表６に示されるようによい相関性（Y=2.03X）を示した。
【００５７】
【表６】

【００５８】
実施例３
血中ＭＤＨの測定

(3)測定方法：
血清１４μｌに第１試薬２８０μｌを加え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビン酸の消去を行う）。その後、第２試薬７０μｌを加え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。
対照試薬も同様に操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。
その結果を表７に示す。表７に示されるように、よい相関性(Y=1.99X)を示した。
【００５９】
【表７】

【００６０】
実施例４
血中ＭＤＨ測定の再現性
(1)測定試薬
実施例３に同じ。
(2)測定方法
実施例３に同じ。同一検体について、１０回測定する。
その結果を表８に示す。表８に示されるように、高感度となることにより、再現性もよくなる。
【００６１】
【表８】

【００６２】
参考例１０
血中ＡＬＴの測定

(2)測定方法：
血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を導く。
対照法としてＬＤＨ法を用いた市販の試薬を用いてＡＬＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。
その結果を表９に示す。表９に示されるようによい相関性(Y=1.02X-0.23)を示した。
【００６３】
【表９】

【００６４】
参考例１１
血中ＡＳＴの測定

(2)測定方法：
血清１５μｌに第１試薬３５０μｌを加え、３７℃、５分間加温する（この時、内因性のピルビン酸の消去を行う）。その後、第２試薬１００μｌを加え３７℃で１分から５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。同様に、精製水でも操作し、検体の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を算出する。また、ＮＡＤＰＨの見かけの分子吸光係数を用いて求めたFactor(4984)を乗じ、ＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を導く。
対照法としてＭＤＨ法を用いた市販の試薬を用いてＡＳＴ活性（ＩＵ／Ｌ）を求める。
その結果を表１０に示す。表１０に示されるようによい相関性(Y=1.00X+0.31)を示した。
【００６５】
【表１０】

【００６６】
参考例１２
ピルビン酸の定量（チオ−ＮＡＤ^＋を用いた例）

(2)測定方法：
ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。
図８に示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００６７】
参考例１３
チオ−ＮＡＤ ^＋の定量

(2)測定方法：
チオ−ＮＡＤ^＋を約７ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌにチオ−ＮＡＤ^＋サンプル１０μｌを加え、３７℃、５分間加温後の４０５ｎｍの吸光度を、試薬ブランクを対照に測定する。
図９に示すようにチオ−ＮＡＤ^＋が定量的に測定できた。
【００６８】
参考例１４
血中尿素窒素の測定（チオ−ＮＡＤＰ^＋を使用する方法）
(1)測定試薬

(2)測定方法：
血清５μｌに第１試薬３６０μｌを加え、３７℃、５分間加温後、４３６ｎｍの吸光度（Ａ1）を測定し、さらに第２試薬４０μｌを加え、３７℃、５分間加温し、４３６ｎｍの吸光度（Ａ2）を測定する。Ａ1とＡ2より吸光度変化量を計算する。血清検体に代え、尿素窒素標準液（３０ｍｇ／ｄｌ）及び精製水についても同様に測定し、その値を用いて血中尿素窒素濃度を算出する。
対照法としてＧＬＤＨ−ウレアーゼ法を用いた市販の試薬を用いて同じ検体を測定した。
その結果を表１１に示す。表１１に示されるようによい相関性(Y=1.01X-0.28)を示した。
【００６９】
【表１１】

【００７０】
参考例１５
ピルビン酸の定量（３−アセチル−ＮＡＤ^＋を使用する方法）

(2)測定方法：
ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル２０μｌを加え、３７℃、１０分間加温後の３４０ｎｍの吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。
図１０に示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００７１】
参考例１６
ピルビン酸の定量（デアミノ−ＮＡＤ^＋を使用する方法）

(2)測定方法：
ピルビン酸ナトリウムを約１３ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記ピルビン酸サンプル２０μｌを加え、３７℃、２０分間加温後の３４０ｎｍの吸光度で、試薬ブランクを対照に測定する。
図１１に示すようにピルビン酸が定量的に測定できた。
【００７２】
参考例１７
マグネシウムイオンの定量
(1)測定試薬トリス−ＨＣｌ緩衝液５０ｍＭｐＨ７．５ＴＰＰ０．２ｍＭＡｌＤＨ２．０単位／ｍｌＮＡＤＰ^＋２．５ｍＭＰＤＣ１．０単位／ｍｌピルビン酸ナトリウム４．０ｍＭ(2)測定方法：
塩化マグネシウムを約１０ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化マグネシウムサンプル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定する。
図１２に示すようにマグネシウムイオンが定量的に測定できた。
【００７３】
参考例１８
カリウムイオンの定量

(2)測定方法：
塩化カリウムを約１０ｍＭの水溶液に調製し、精製水にて５段階希釈系列のサンプルを作成する。
測定試薬１．０ｍｌに上記塩化カリウムサンプル１０μｌを加え、３７℃での２〜５分時の３４０ｎｍにおける１分間当りの吸光度変化量を試薬ブランクを対照に測定する。
図１３に示すようにカリウムイオンが定量的に測定できた。
【００７４】
参考例１９
血中コリンエステラーゼの測定

(2)測定方法：
検体４μｌに第１試薬２８０μｌを加え、３７℃、５分間加温する。つぎに第２試薬７０μｌを加え、３７℃で１分〜５分の反応直線部分の１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量（Ａ）を求める。検体の代りに精製水を用い、同様な操作を行い、１分間当りの３４０ｎｍの吸光度変化量を（Ｂ）を求め、下式によりコリンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を算出する。

ここで、検体としてコリンエステラーゼを高値に含む血清を１／１０、１／５、２／５、３／５、４／５、５／５に希釈して用い、検量線を作成した。その結果を図１４に示す。図１４に示されるように良好な直線性に示した。
次に、対照法として、ＤＭＢＴ（２，３−ジメトキシベンゾイルチオコリンヨーダイト）を用いた市販の試薬を用いて、同じ検体についてコリンエステラーゼ活性値（Ｕ／Ｌ）を求めた。その結果を表１２に示す。表１２に示されるように、よい相関性［相関係数（ｒ）＝０．９９９］を示した。
【００７５】
【表１２】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図２】本発明の方法によるＡＤＰの測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図３】本発明の方法によるクレアチンの測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図４】本発明の方法によるクレアチニンの測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図５】本発明の方法によるＮＡＤ⁺の測定の検量線を示す図である。
【図６】本発明の方法によるＮＡＤＰ⁺の測定の検量線を示す図である。
【図７】本発明の方法及び従来法によるＬＤＨの測定例を示す図である。
【図８】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてチオ−ＮＡＤ⁺を使用）。
【図９】本発明の方法によるチオ−ＮＡＤ⁺の測定の検量線を示す図である。
【図１０】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類として３−アセチル−ＮＡＤ⁺を使用）。
【図１１】本発明の方法によるピルビン酸の測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてデアミノ−ＮＡＤ⁺を使用）。
【図１２】本発明の方法によるマグネシウムイオンの測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図１３】本発明の方法によるカリウムイオンの測定の検量線を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。
【図１４】本発明の方法による血中コリンエステラーゼ活性の測定例を示す図である（ＮＡＤ（Ｐ）⁺類としてＮＡＤＰ⁺を使用）。

Claims

酵素反応を用いて生体物質を測定する方法において、当該方法がピルビン酸とＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類を生成する酵素反応又はこの酵素反応を含む反応系からなるとき、ピルビン酸脱炭酸酵素及びアルデヒド脱水素酵素の存在下、ＮＡＤ（Ｐ）^＋類をＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類に還元する反応を、上記酵素反応又は酵素反応系と共役させることにより、生成したピルビン酸を消費すると共にＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量を増加させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類の生成量に基づいて生体物質を測定することを特徴とする生体物質の測定方法。