JP3674018B2 - 共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法および特定物質の測定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法、特定物質の測定方法およびそれに用いるキットに関する。さらに詳しくは、本発明は試料中の特定物質を測定する系において、試料の前処理によって生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤ+と略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡＤＰ+と略記する）を、それぞれニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと略記する）に変換（還元）するために利用した共役脱水素酵素反応、特にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記する）反応、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６−ＰＧＤＨと略記する）反応又はＬ−フコース脱水素酵素（以下、ＦＣＤＨと略記する）反応を止めるのに用いる停止剤およびこの反応を停止させる方法に関するものである。
【０００２】
さらに、本発明は、試料中の特定物質からアンモニアを発生させて、そのアンモニアに基づいて特定物質を測定するに際し、試料中に最初から存在する内因性アンモニアをあらかじめ消去し、特定物質を正確に測定する方法、およびそれに用いるキットに関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
近年、病態の診断、治療効果の判定を行う上で、臨床検査は不可欠な要素となっている。この臨床検査は、生体機能の検査が目的で、（１）生体内を対象とし、直接的な生体情報を調べる検査（生理検査）と、（２）血液、尿、組織などの生体構成成分の一部を採取して、生体内変化を調べる検査（検体検査）に大別することができる。そして、後者の検体検査においては、酵素試薬が広く利用されている。
【０００４】
このように、臨床検査分野において、酵素法が広く用いられているのは、（ａ）酵素は基質特異性が高く、測定精度及び測定感度に優れている、（ｂ）測定条件が温和である、（ｃ）迅速測定が可能である、（ｄ）検体量が少なくてすむ、（ｅ）安価な検出機器（比色計または分光光度計）を利用できる、などの長所を有しているからである。
【０００５】
このような酵素法による検体検査においては、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを意味する）が波長３４０ｎｍに吸収をもつことに着目し、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+（ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を意味する）への変換反応の反応速度あるいは反応量を、波長３４０ｎｍにおける吸光度の変化から測定することにより、検体中に含まれる特定物質や、これらに関与する各種酵素の活性を測定することが、日常的に行われている。
【０００６】
例えば、試料中の特定物質として、尿素窒素を測定する場合、反応式
【化１】
で示されるように、尿素を酵素ウレアーゼで加水分解してアンモニアを生成させ、生成したアンモニアをα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを意味する）の存在下、グルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧＬＤＨと略記する）を作用させ、その作用によりＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に変換するので、該ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度あるいは減少量を測定することにより、試料中の尿素窒素を定量する方法が、一般的に行われている。
【０００７】
ところが、この場合、中間産生物質であるアンモニアが試料中にすでに存在していることがあるため、予めこのアンモニアを前処理によって消去しておく必要がある。この消去は、通常α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＧＬＤＨによって行われるが、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量が多いと、特定物質の測定に問題を起こす。そこで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を少量にして効果的にアンモニアを消去する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが不足するおそれがある。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補うため、共役脱水素酵素としてイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）を共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生する方法が知られている。そして、この後、特定物質の測定系において、上記ＩＣＤＨ反応をＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）やキレート剤を添加することで停止させることにより、特定物質を正確に測定できる方法が開示されている（特公平６−７３４７５号公報、特公平６−７３４７６号公報、特公平６−７５５１６号公報）。
【０００８】
しかしながら、これらの方法においては、特定物質を測定する際、ＡＴＰを生成するような反応系においては、ＡＴＰの添加は不都合が生じるおそれがあるし、また、キレート剤を添加して反応を停止させる場合、特定物質の測定系において、金属要求性酵素が係わっている場合には、該酵素が大きく阻害されるおそれがある。したがって、上記方法においては、適用できる特定物質の測定系が制限されるのを免れないなどの欠点を有している。
【０００９】
また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補う方法として、グルコースおよびグルコース脱水素酵素を用いるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生方法も提案されている（特開平５−１０３６９７号公報）。しかしながら、この方法においては、グルコース脱水素酵素のグルコースに対するＫm（ミカエリス定数）が１０-2モル／リットル程度と比較的大きいため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応速度が十分ではないという欠点がある。
【００１０】
さらに、上記方法と同様に、不足したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補う目的で、Ｇ６ＰＤＨ反応や６−ＰＧＤＨ反応やＦＣＤＨ反応を利用する方法も考えられるが、その場合、Ｇ６ＰＤＨ阻害剤や６−ＰＧＤＨ阻害剤やＦＣＤＨ阻害剤として通常知られているＡＴＰやＡＤＰ（アデノシン５′−二リン酸）などでは、これらの反応を完全に停止することは困難である。
【００１１】
そのため、試料中に最初から含まれているアンモニアを、ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、共役脱水素酵素及びその基質を用いて消去した後、該共役脱水素酵素を効果的に阻害し、さらに、特定物質に、特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用させることにより、試料中の特定物質を正確に測定できる新規な方法が望まれているのが現状である。
【００１２】
さらに、近年、臨床検査は、医療現場の要求により、ますます微量・迅速の方向に向っており、高感度・短時間測定は検査薬としての必須の条件となっている。反応時間の短縮のためには、酵素濃度（Ｖmax）の増加かＫm値の小さい酵素を選ぶ必要があるが、酵素濃度を高めることはコスト面から限度があり、したがって基質に対して親和性の高い酵素を使用する方向にあり、低Ｋm酵素の使用が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、特に試料中の特定物質を測定する系において、前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するために利用した基質に対する親和性の高いＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役脱水素酵素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止剤、および該共役脱水素酵素の反応を停止する方法を提供することを目的とするものである。さらに、特定物質からアンモニアを発生させ、その発生したアンモニアに基づいて特定物質を測定する場合、測定の誤差の原因となる試料中のアンモニアをあらかじめ消去することにより、試料中の特定物質を正確に測定する方法及びそれに用いるキットを提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、共役脱水素酵素反応を停止するには、界面活性剤が極めて有用であることを見出した。さらに、内因性アンモニアにα−ＫＧとＧＬＤＨとを作用させて内因性アンモニアをグルタミン酸に変換させる際、共役脱水素酵素とその基質を共存させて該アンモニアを消去し、その消去反応後に、界面活性剤の添加により共役脱水素酵素反応を停止し、その停止と同時もしくはその後に、酵素作用により試料中の特定物質からアンモニアを生成させ、生成するアンモニアにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを作用させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定することにより、試料中の特定物質を極めて精度よく測定できることを見い出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）界面活性剤を含むことを特徴とする共役脱水素酵素反応の停止剤、
（２）共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させることを特徴とする共役脱水素反応の停止方法、
（３）試料中の特定物質からアンモニアを発生させ、そのアンモニアを測定することにより、該特定物質を定量する方法において、あらかじめ、試料中に存在するアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作用により共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同時か後に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用させ、発生するアンモニアを測定することを特徴とする特定物質の測定方法、および
（４）特定物質測定用キットであって、（Ａ）グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、並びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分および界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とするキット、
を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の共役脱水素酵素反応の停止剤について説明する。
本発明の反応停止剤は界面活性剤を含むものであって、特に共役脱水素酵素反応が、Ｇ６ＰＤＨ反応、６−ＰＧＤＨ反応またはＦＣＤＨ反応である場合に有効である。
【００１７】
本発明において用いられるＧ６ＰＤＨは、反応式（ａ）
で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グルコース代謝経路の一つ）の酵素であり、細菌由来のものおよび酵母由来のものなどが知られている。細菌由来のものはＮＡＤＰ+以外に、ＮＡＤ+も補酵素として、反応式（ｂ）
で示される反応を触媒するが、酵母由来のものは、上記（ｂ）の反応は触媒しない。
【００１８】
このＧ６ＰＤＨは基質親和性が高く、Ｋmは３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
このＧ６ＰＤＨとしては、細菌由来のものは、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害され、酵母由来のものは、アニオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、いずれも好ましい。
【００１９】
また、本発明において用いられる６−ＰＧＤＨは、反応式（ｃ）または（ｄ）
で示される反応を触媒するペントースリン酸回路（グルコース代謝経路の一つ）の酵素であり、動物肝、ヒト赤血球、細菌および酵母由来のものなどが知られている。酵母由来のものは上記（ｃ）の反応は触媒するが、（ｄ）の反応は触媒しない。また、細菌由来のものには、上記（ｃ）の反応のみを触媒するもの、（ｄ）の反応のみを触媒するもの、および（ｃ）と（ｄ）の反応の両方を触媒するものがある。
【００２０】
この６−ＰＧＤＨは基質親和性が高く、Ｋmは５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
この６−ＰＧＤＨとしては、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、酵母由来のものが好ましい。
【００２１】
一方、本発明において用いられるＦＣＤＨは、反応式（ｅ）または（ｆ）
で示される反応を触媒する酵素であり、動物肝、細菌由来のものなどが知られている。
このＦＣＤＨは、基質親和性が比較的高く、Ｋmは１．９×１０-3モル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
このＦＣＤＨとしては、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、細菌由来のものが好ましい。
【００２２】
前記カチオン系界面活性剤としては、細菌由来のＧ６ＰＤＨの反応や酵母由来の６−ＰＧＤＨの反応、あるいは細菌由来のＦＣＤＨ反応を効果的に停止しうるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨや６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適である。このようなカチオン系界面活性剤としては、例えば一般式（Ｉ）
【化２】
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、それぞれ独立に炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数５〜１０のシクロアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基または炭素数７〜１０のアラルキル基、Ｘm-はｍ価の陰イオン、ｍは１または２、ｎは９〜１７の整数を示す。）
で表される第四級アンモニウム塩、あるいは一般式（II）
【化３】
（式中、Ｘq-はｑ価の陰イオン、ｑは１または２、ｐは９〜１７の整数を示す。）
で表される第四級アンモニウム塩を、Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能や溶解性などの点から、好ましく挙げることができる。
【００２３】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3で示される炭素数１〜１０のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基などが、炭素数５〜１０のシクロアルキル基としては、例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基などが、炭素数６〜１０のアリール基としては、例えばフェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基などが、炭素数７〜１０のアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２４】
また、一般式（Ｉ）における１／ｍＸm-、一般式（II）における１／ｑＸq-の例としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-のハロゲンイオン、ＮＯ3 -、１／２ＳＯ4 2-、１／２ＣＯ3 2-、ＣＨ3ＳＯ4 -、ｐ−トルエンスルホン酸イオンなどが挙げられる。
【００２５】
さらに、一般式（Ｉ）におけるｎ、一般式（II）におけるｐが８以下ではＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能が十分でない場合があるし、１８以上では溶解性が悪くなることがあり、ｎおよびｐは９〜１７の範囲がよい。ＣＨ3（ＣＨ2）n-、ＣＨ3（ＣＨ2）p-で示される基としては、例えば、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００２６】
上記一般式（Ｉ）、（II）で表される第四級アンモニウム塩の例としては、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリエチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリエチルアンモニウムクロリド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ドデシルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、デシルピリジニウムクロリド、ドデシルピリジニウムクロリド、テトラデシルピリジニウムクロリドなど、およびこれらに対応するブロミド類やヨージド類などが好ましく挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
前記カチオン系界面活性剤を含有する本発明の反応停止剤は、特に細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨの活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。したがって、このようなカチオン系界面活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨを含有する試料液に、カチオン系界面活性剤を０．６ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨの活性が、１０％以下になるようなカチオン系界面活性剤を選ぶのが有利である。
本発明の反応停止剤には、このようなカチオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤、６−ＰＧＤＨ阻害剤またはＦＣＤＨ阻害剤を含有させてもよい。
【００２８】
一方、前記アニオン系界面活性剤としては、酵母由来のＧ６ＰＤＨの反応を効果的に停止しうるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適である。このようなアニオン系界面活性剤としては、例えば一般式（III）
Ｒ4ＳＯ3 -・１／ａ（Ｍ1）a+ （III）
（式中、Ｒ4は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ1）a+はａ価の陽イオン、ａは１または２を示す。）
で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩、
一般式（IV）
【化４】
（式中、Ｒ5は炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、（Ｍ2）b+はｂ価の陽イオン、ｂは１または２を示す。）
で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩、一般式（Ｖ）
Ｒ6Ｏ−（Ｃ2Ｈ4Ｏ）c−ＳＯ3 -・１／ｋ（Ｍ3）k+ （Ｖ）
（式中、Ｒ6は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ3）k+はｋ価の陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示す。）
で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩などを好ましく挙げることができる。
【００２９】
前記一般式（III）において、Ｒ4で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、オレイル基などが挙げられ、また、（Ｍ1）a+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、などが挙げられる。
【００３０】
この一般式（III）で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩の具体例としては、デカンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナトリウム、デカンスルホン酸カリウム、ドデカンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
【００３１】
また、前記一般式（IV）において、Ｒ5で示される炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基の例としては、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられ、また、（Ｍ2）b+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
【００３２】
この一般式（IV）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩の具体例としては、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、オクチルベンゼンスルホン酸カリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
【００３３】
さらに、前記一般式（Ｖ）において、Ｒ6で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基などが挙げられ、また、（Ｍ3）k+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
【００３４】
この一般式（Ｖ）で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩の具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル硫酸カリウムなどが挙げられる。
【００３５】
本発明においては、これらのアニオン系界面活性剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記アニオン系界面活性剤を含有する本発明の反応停止剤は、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。したがって、酵母由来のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害するアニオン系界面活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの酵母由来のＧ６ＰＤＨを含有する試料液に、アニオン系界面活性剤を０．３ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨの活性が、１０％以下になるようなアニオン系界面活性剤を選ぶのが有利である。
本発明の反応停止剤には、このようなアニオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤を含有させてもよい。
【００３６】
次に、本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法について説明する。
本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法は、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法である。
【００３７】
この方法においては、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好ましく、また界面活性剤としては、試料中の特定物質を測定する系において、共役脱水素酵素を実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好ましい。
【００３８】
本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法には、（１）Ｇ６ＰＤＨ反応の停止方法と、（２）６−ＰＧＤＨ反応の停止方法と、（３）ＦＣＤＨ反応の停止方法の３つの態様がある。
【００３９】
上記（１）のＧ６ＰＤＨ反応の停止方法は、Ｇ６ＰＤＨおよびグルコース−６−リン酸の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００４０】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、Ｇ６ＰＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
なお、用いるＧ６ＰＤＨが細菌由来のものである場合には、カチオン系界面活性剤を使用し、Ｇ６ＰＤＨが酵母由来のものである場合には、アニオン系界面活性剤を使用するのが肝要である。
【００４１】
このカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤の添加量としては、Ｇ６ＰＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばカチオン系界面活性剤を使用する場合には、Ｇ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよく、アニオン系界面活性剤を使用する場合にはＧ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜１．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜０．５０ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．３ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。この界面活性剤の濃度が低すぎるとＧ６ＰＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
【００４２】
本発明における現象は、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤と酵素との相互作用により、説明しうるものと考えられる。すなわち、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、タンパク質変性作用を有し、これにより酵素は変性失活を来たす。Ｇ６ＰＤＨが失活しうる反応条件で、他に使用する共役酵素が実質上変性を受けにくい場合、Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生に使用しうるものである。
【００４３】
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００４４】
【化５】
グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）+は、Ｇ６ＰＤＨの作用により、それぞれ６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるが、界面活性剤を作用させることにより、この反応が停止する。
【００４５】
一方、前記（２）の６−ＰＧＤＨ反応の停止方法は、６−ＰＧＤＨおよび６−ホスホグルコン酸の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００４６】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤は、６−ＰＧＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
【００４７】
このカチオン系界面活性剤の添加量としては、６−ＰＧＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えば６−ＰＧＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎると６−ＰＧＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００４８】
【化６】
６−ホスホグルコン酸（６−ＰＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）+は、６−ＰＧＤＨの作用により、それぞれリブロース−５−リン酸、ＣＯ2およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるが、カチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応が停止する。
【００４９】
さらに、前記（３）のＦＣＤＨ反応の停止方法は、ＦＣＤＨおよびＬ−フコースの作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００５０】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤は、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
【００５１】
このカチオン系界面活性剤の添加量としては、ＦＣＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばＦＣＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎるとＦＣＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
【００５２】
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００５３】
【化７】
Ｌ−フコース（ＦＣ）およびＮＡＤ（Ｐ）+は、ＦＣＤＨの作用により、それぞれＬ−フコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されるが、カチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応が停止する。
【００５４】
本発明では、用いる界面活性剤が前記のように共役脱水素酵素反応を選択的に阻害することが重要である。この界面活性剤が共役脱水素酵素を阻害する理由は、現在のところ、はっきりしていないが、以下のように推察できる。
共役脱水素酵素にある種の界面活性剤を作用させると、共役脱水素酵素にその界面活性剤のいくつかが結合して複合体ができる。そのようになった共役脱水素酵素は、界面活性剤のもつ荷電により本来の共役脱水素酵素の荷電と異なる状態になる。一方、共役脱水素酵素は、イオンを有するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈにする点で、酵素反応のときは、イオン状態が特に重要と考えられる。そのため、界面活性剤に結合された共役脱水素酵素の荷電状態は、本来の共役脱水素酵素のものと異なるので、イオン状態が重要なこの酵素反応を起こしにくいと考えられる。その結果、用いる界面活性剤が共役脱水素酵素反応を選択的に阻害できると考えられる。この根拠として、界面活性剤として非イオン系界面活性剤を用いても共役脱水素酵素反応を阻害しにくいことからも支持される。
【００５５】
次に、本発明の特定物質の測定方法について説明する。
一般に、試料中の特定物質からアンモニアを発生させて、そのアンモニアを測定することにより、該特定物質を定量する方法として、発生したアンモニアに、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下にＧＬＤＨを作用させて、反応式（ｊ）
【化８】
における反応Ａで示されるＧＬＤＨ反応を起こさせ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少量を、波長３４０ｎｍの吸光度の減少速度として測定することにより、特定物質を定量する方法が知られている。
【００５６】
上記反応式（ｊ）において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−１）
【化９】
で表され、共役脱水素酵素として６−ＰＧＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−２）
【化１０】
で表される。
【００５７】
また、共役脱水素酵素としてＦＣＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−３）
【化１１】
で表される。
【００５８】
しかし、この方法においては、試料中にアンモニアが最初から存在する場合には、予めこのアンモニアを消去しておかなければ、正確に特定物質を測定することができない。そこで、前処理として、上記反応式（ｊ）における反応ＡのＧＬＤＨ反応を適用し、試料中に最初から存在するアンモニアを消去すればよい。そして、このＧＬＤＨ反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ → ＮＡＤ（Ｐ）+の変換を伴うため、ＮＡＤ（Ｐ）+ → ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応を行えば、少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの使用量で効率よくアンモニアを消去することができる。この際、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを多量に使用すると、最初から存在するアンモニアを消去した後で特定物質を測定する際に、波長３４０ｎｍ［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を測定する波長］での反応液の吸光度が大きくなりすぎて、特定物質の測定ができなくなるおそれがある。
【００５９】
本発明においては、ＮＡＤ（Ｐ）+ → ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応は、前記反応式（ｊ）における反応Ｂで示されるように、共役脱水素酵素とその基質を作用させることにより誘起される。具体的には、上記再生反応は、反応式（ｊ−１）における反応Ｂで示されるように、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）とＧ６ＰＤＨを作用させることにより誘起され、また、反応式（ｊ−２）における反応Ｂで示されるように、６−ホスホグルコン酸（６−ＰＧ）と６−ＰＧＤＨを作用させることにより誘起される。さらに、反応式（ｊ−３）における反応Ｂで示されるように、Ｌ−フコース（ＦＣ）とＦＣＤＨを作用させることにより誘起される。
【００６０】
このようにして、試料中に最初から存在するアンモニアを消去した後で、特定物質からアンモニアを発生させて、該特定物質を定量するが、その際に、測定系内に共役脱水素酵素およびその基質が存在すると、特定物質から発生したアンモニアにより、ＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に変換しても、共役脱水素酵素反応によってＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈが再生されるため、特定物質由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を正確に測定することができない。そこで、本発明では、共役脱水素酵素に界面活性剤を作用させて、共役脱水素酵素反応を停止することにより、前記反応式（ｊ）における反応Ｂが起こらず、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）+はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されないため、反応系のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量は、特定物質から発生するアンモニアのみに依存し、特定物質を正確に定量することができる。
【００６１】
このような試料中の特定物質を定量する具体的な方法としては、まず、ＧＬＤＨ、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を第一試薬、並びに特定物質からアンモニアを発生させる成分および該共役脱水素酵素の反応を阻害する界面活性剤を含有する第二試薬を調製する。なお第二試薬には、所望により、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）+などのアンモニアを測定するための成分を加えてもよい。また、第一試薬、第二試薬はアルブミン、金属イオン、糖類などを併存させて液状試薬として保存してもよい。
【００６２】
次に試料に、上記第一試薬を加えて、試料中に予め存在するアンモニアを消去したのち、これに第二試薬を加え、共役脱水素酵素反応を停止させるとともに、特定物質からアンモニアを発生させ、このアンモニアを測定することにより、特定物質を定量するといった方法を用いることができる。なお、第二試薬を加える代わりに、界面活性剤のみを添加して共役脱水素酵素反応を停止させた後で、特定物質からアンモニアを発生させる成分を添加してもよい。
【００６３】
前記特定物質の測定方法および試薬において、共役脱水素酵素およびその基質として、Ｇ６ＰＤＨとグルコース−６−リン酸を用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤（Ｇ６ＰＤＨが細菌由来の場合）またはアニオン系界面活性剤（Ｇ６ＰＤＨが酵母由来の場合）が好ましく用いられ、一方、６−ＰＧＤＨと６−ホスホグルコン酸を用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。また、ＦＣＤＨとＬ−フコースを用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。
【００６４】
本発明はまた、特定物質測定用のキットをも提供するものであり、このキットは、前記第一試薬および第二試薬を必須試薬として構成されている。
前記試料中のアンモニアを発生しうる特定物質の定量方法において、特定物質からアンモニアを発生させる方法としては、通常酵素反応を利用する方法が用いられる。その例として、下記の特定物質について説明する。
【００６５】
（１）尿素
前述のように、ウレアーゼを作用させ、加水分解することにより、アンモニアが生成する。尿素を測定する際、チオグリセロールなどのＳＨ基含有化合物をウレアーゼと共に併用すると、ウレアーゼの活性が調整され好ましい。
【００６６】
（２）クレアチン
【化１２】
クレアチンは、まずクレアチナーゼを作用させ、加水分解してザルコシンと尿素を得、次いで尿素をウレアーゼで加水分解すれば、アンモニアが生成する。
【００６７】
（３）クレアチニン
【化１３】
クレアチニンは、クレアチニンデイミナーゼを作用させて、加水分解することによりアンモニアが生成する。
また、下記のように、クレアチニナーゼで加水分解してクレアチンに誘導したのち、上記（２）と同様な操作により、アンモニアが生成する。
【００６８】
【化１４】
（４）ロイシンアミノペプチダーゼ
【化１５】
ロイシンアミノペプチダーゼは、Ｌ−ロイシンアミドに作用してアンモニアを発生する。
【００６９】
（５）Ｃａ2+
【化１６】
Ｃａ2+はａｐｏ−トランスグルタミナーゼに作用してｈｏｌｏ−トランスグルタミナーゼに変換し、このものはＺ−グルタミン（Ｚ−Ｇｌｎ）を加水分解して、Ｚ−グルタミン酸（Ｚ−Ｇｌｕ）とアンモニアを生成する。
【００７０】
本発明の試料中の特定物質を定量する方法は、上記特定物質の中で、特に尿素窒素を定量するのに適している。また、この定量方法においては、共役脱水素酵素反応を停止するために用いる界面活性剤としては、共役脱水素酵素の活性を実質上阻害するが、ＧＬＤＨおよび特定物質からアンモニアを生成するのに関与する酵素の活性を実質上阻害しないものを選択して使用することが肝要である。
【００７１】
本発明は以下のような特徴を有する。
【００７２】
（１）試料中にアンモニアが多量にあっても、共役脱水素酵素反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすく、さらに、界面活性剤が共役脱水素酵素反応を速やかに停止するので、そのアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７３】
例えば共役脱水素酵素として、Ｇ６ＰＤＨを使用する場合、このＧ６ＰＤＨは、Ｋmが３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、Ｇ６ＰＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤がＧ６ＰＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７４】
また、共役脱水素酵素として、６−ＰＧＤＨを使用する場合、６−ＰＧＤＨは、Ｋmが５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、６−ＰＧＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤が６−ＰＧＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７５】
さらに、共役脱水素酵素として、ＦＣＤＨを使用する場合、ＦＣＤＨは、Ｋmが１．９×１０-3モル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と比較的小さいので、ＦＣＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤がＦＣＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７６】
（２）特定物質測定系がＡＴＰを生成する反応系である場合でも、測定原理上、特に不都合が生じない。
（３）特定物質測定系が、金属要求性酵素を含んでいても、特に不都合が生じない。
【００７７】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【００７８】
実施例１
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
細菌由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【００７９】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６ＰＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８０】
実施例２
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００８１】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８２】
実施例３
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００８３】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８４】
比較例１
実施例１における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８５】
比較例２
実施例２における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例２と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８６】
比較例３
実施例３における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例３と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
【００８８】
表１の結果から、Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあまり阻害させず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、Ｇ６ＰＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
【００８９】
以上の結果から、細菌由来のＧ６ＰＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【００９０】
以下に、細菌由来のＧ６ＰＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例に挙げ、本発明の効果を具体的に説明する。
【００９１】
実施例４
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【００９２】
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】
表２の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【００９５】
実施例５
血清を試料とし、実施例４に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
その結果を図１に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図１から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【００９６】
実施例６
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
酵母由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【００９７】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６ＰＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【００９８】
実施例７
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００９９】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１００】
実施例８
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１０１】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１０２】
比較例４
実施例６における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例６と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０３】
比較例５
実施例７における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例７と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０４】
比較例６
実施例８における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例８と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
表３の結果から、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあまり阻害させず、高い残存活性を示すことがわかる。
【０１０７】
一方、阻害剤としてＡＴＰまたはＡＤＰを使用した場合、ＧＬＤＨの活性およびウレアーゼの活性を阻害しないだけでなくＧ６ＰＤＨの活性をも阻害しないことがわかる。
この事実により、酵母由来のＧ６ＰＤＨにより、ＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【０１０８】
以下に、酵母由来のＧ６ＰＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１０９】
実施例９
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
１−デカンスルホン酸ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
表４の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１１２】
実施例１０
血清を試料とし、実施例９に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル株式会社より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定した。
その結果を図２に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図２から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【０１１３】
実施例１１
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
酵母由来の６−ＰＧＤＨをそれぞれ１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【０１１４】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、６−ＰＧＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１５】
実施例１２
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１１６】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１７】
実施例１３
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１１８】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１９】
比較例７
実施例１１における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１１と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２０】
比較例８
実施例１２における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１２と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２１】
比較例９
実施例１３における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１３と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２２】
【表５】
【０１２３】
表５の結果から、６−ＰＧＤＨ（酵母由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、６−ＰＧＤＨに比してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、６−ＰＧＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
【０１２４】
以上の結果から、酵母由来の６−ＰＧＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【０１２５】
以下に、酵母由来の６−ＰＧＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１２６】
実施例１４
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【０１２７】
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ
６−ＰＧＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表６に示す。
【０１２８】
【表６】
【０１２９】
表６の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、６−ＰＧＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果で６−ＰＧＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１３０】
実施例１５
血清を試料とし、実施例１４に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、６−ＰＧＤＨを組込まない市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル（株）より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定した。その結果を図３に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図３から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【０１３１】
実施例１６
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
細菌由来のＦＣＤＨ（Ｌ−フコース脱水素酵素）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
Ｌ−フコース ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【０１３２】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＦＣＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３３】
実施例１７
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１３４】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３５】
実施例１８
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１３６】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３７】
比較例１０
実施例１６における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１６と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１３８】
比較例１１
実施例１７における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１７と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１３９】
比較例１２
実施例１８における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１８と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１４０】
【表７】
【０１４１】
表７の結果から、ＦＣＤＨ（細菌由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、ＦＣＤＨに比してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰおよびＡＤＰは、ＦＣＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
以上の結果から、細菌由来のＦＣＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行い得ることが強く示唆された。
【０１４２】
以下に、細菌由来のＦＣＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１４３】
実施例１９
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
試料として実施例４で調製したＡ0〜Ａ5と同じものを用いた。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
Ｌ−フコース ２０ｍＭ
ＦＣＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日立７１５０型自動分析装置を使用して行った。結果を表８に示す。
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
表８の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、ＦＣＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＦＣＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１４６】
実施例２０
血清を試料とし、実施例１９に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
【０１４７】
その結果を図４に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図４から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図２】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図３】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素として６−ＰＧＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図４】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＦＣＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、共役脱水素酵素反応の停止剤、停止方法、特定物質の測定方法およびそれに用いるキットに関する。さらに詳しくは、本発明は試料中の特定物質を測定する系において、試料の前処理によって生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチド酸化型（以下、ＮＡＤ+と略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸酸化型（以下、ＮＡＤＰ+と略記する）を、それぞれニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（以下、ＮＡＤＨと略記する）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと略記する）に変換（還元）するために利用した共役脱水素酵素反応、特にグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略記する）反応、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６−ＰＧＤＨと略記する）反応又はＬ−フコース脱水素酵素（以下、ＦＣＤＨと略記する）反応を止めるのに用いる停止剤およびこの反応を停止させる方法に関するものである。
【０００２】
さらに、本発明は、試料中の特定物質からアンモニアを発生させて、そのアンモニアに基づいて特定物質を測定するに際し、試料中に最初から存在する内因性アンモニアをあらかじめ消去し、特定物質を正確に測定する方法、およびそれに用いるキットに関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
近年、病態の診断、治療効果の判定を行う上で、臨床検査は不可欠な要素となっている。この臨床検査は、生体機能の検査が目的で、（１）生体内を対象とし、直接的な生体情報を調べる検査（生理検査）と、（２）血液、尿、組織などの生体構成成分の一部を採取して、生体内変化を調べる検査（検体検査）に大別することができる。そして、後者の検体検査においては、酵素試薬が広く利用されている。
【０００４】
このように、臨床検査分野において、酵素法が広く用いられているのは、（ａ）酵素は基質特異性が高く、測定精度及び測定感度に優れている、（ｂ）測定条件が温和である、（ｃ）迅速測定が可能である、（ｄ）検体量が少なくてすむ、（ｅ）安価な検出機器（比色計または分光光度計）を利用できる、などの長所を有しているからである。
【０００５】
このような酵素法による検体検査においては、補酵素のＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを意味する）が波長３４０ｎｍに吸収をもつことに着目し、ＮＡＤ（Ｐ）ＨからＮＡＤ（Ｐ）+（ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を意味する）への変換反応の反応速度あるいは反応量を、波長３４０ｎｍにおける吸光度の変化から測定することにより、検体中に含まれる特定物質や、これらに関与する各種酵素の活性を測定することが、日常的に行われている。
【０００６】
例えば、試料中の特定物質として、尿素窒素を測定する場合、反応式
【化１】
【０００７】
ところが、この場合、中間産生物質であるアンモニアが試料中にすでに存在していることがあるため、予めこのアンモニアを前処理によって消去しておく必要がある。この消去は、通常α−ＫＧ、ＮＡＤ（Ｐ）ＨおよびＧＬＤＨによって行われるが、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量が多いと、特定物質の測定に問題を起こす。そこで、使用するＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量を少量にして効果的にアンモニアを消去する場合、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが不足するおそれがある。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補うため、共役脱水素酵素としてイソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）を共存させ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに再生する方法が知られている。そして、この後、特定物質の測定系において、上記ＩＣＤＨ反応をＡＴＰ（アデノシン５′−三リン酸）やキレート剤を添加することで停止させることにより、特定物質を正確に測定できる方法が開示されている（特公平６−７３４７５号公報、特公平６−７３４７６号公報、特公平６−７５５１６号公報）。
【０００８】
しかしながら、これらの方法においては、特定物質を測定する際、ＡＴＰを生成するような反応系においては、ＡＴＰの添加は不都合が生じるおそれがあるし、また、キレート剤を添加して反応を停止させる場合、特定物質の測定系において、金属要求性酵素が係わっている場合には、該酵素が大きく阻害されるおそれがある。したがって、上記方法においては、適用できる特定物質の測定系が制限されるのを免れないなどの欠点を有している。
【０００９】
また、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの不足を補う方法として、グルコースおよびグルコース脱水素酵素を用いるＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生方法も提案されている（特開平５−１０３６９７号公報）。しかしながら、この方法においては、グルコース脱水素酵素のグルコースに対するＫm（ミカエリス定数）が１０-2モル／リットル程度と比較的大きいため、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応速度が十分ではないという欠点がある。
【００１０】
さらに、上記方法と同様に、不足したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補う目的で、Ｇ６ＰＤＨ反応や６−ＰＧＤＨ反応やＦＣＤＨ反応を利用する方法も考えられるが、その場合、Ｇ６ＰＤＨ阻害剤や６−ＰＧＤＨ阻害剤やＦＣＤＨ阻害剤として通常知られているＡＴＰやＡＤＰ（アデノシン５′−二リン酸）などでは、これらの反応を完全に停止することは困難である。
【００１１】
そのため、試料中に最初から含まれているアンモニアを、ＧＬＤＨ、α−ＫＧ、共役脱水素酵素及びその基質を用いて消去した後、該共役脱水素酵素を効果的に阻害し、さらに、特定物質に、特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用させることにより、試料中の特定物質を正確に測定できる新規な方法が望まれているのが現状である。
【００１２】
さらに、近年、臨床検査は、医療現場の要求により、ますます微量・迅速の方向に向っており、高感度・短時間測定は検査薬としての必須の条件となっている。反応時間の短縮のためには、酵素濃度（Ｖmax）の増加かＫm値の小さい酵素を選ぶ必要があるが、酵素濃度を高めることはコスト面から限度があり、したがって基質に対して親和性の高い酵素を使用する方向にあり、低Ｋm酵素の使用が望まれている。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、特に試料中の特定物質を測定する系において、前処理によって生成したＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換するために利用した基質に対する親和性の高いＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨなどの共役脱水素酵素の反応を、効果的に止めるのに用いる停止剤、および該共役脱水素酵素の反応を停止する方法を提供することを目的とするものである。さらに、特定物質からアンモニアを発生させ、その発生したアンモニアに基づいて特定物質を測定する場合、測定の誤差の原因となる試料中のアンモニアをあらかじめ消去することにより、試料中の特定物質を正確に測定する方法及びそれに用いるキットを提供することを目的とするものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、共役脱水素酵素反応を停止するには、界面活性剤が極めて有用であることを見出した。さらに、内因性アンモニアにα−ＫＧとＧＬＤＨとを作用させて内因性アンモニアをグルタミン酸に変換させる際、共役脱水素酵素とその基質を共存させて該アンモニアを消去し、その消去反応後に、界面活性剤の添加により共役脱水素酵素反応を停止し、その停止と同時もしくはその後に、酵素作用により試料中の特定物質からアンモニアを生成させ、生成するアンモニアにα−ＫＧ、ＧＬＤＨ及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを作用させ、そのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を測定することにより、試料中の特定物質を極めて精度よく測定できることを見い出した。本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、
（１）界面活性剤を含むことを特徴とする共役脱水素酵素反応の停止剤、
（２）共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させることを特徴とする共役脱水素反応の停止方法、
（３）試料中の特定物質からアンモニアを発生させ、そのアンモニアを測定することにより、該特定物質を定量する方法において、あらかじめ、試料中に存在するアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作用により共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同時か後に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用させ、発生するアンモニアを測定することを特徴とする特定物質の測定方法、および
（４）特定物質測定用キットであって、（Ａ）グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、並びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分および界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とするキット、
を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、本発明の共役脱水素酵素反応の停止剤について説明する。
本発明の反応停止剤は界面活性剤を含むものであって、特に共役脱水素酵素反応が、Ｇ６ＰＤＨ反応、６−ＰＧＤＨ反応またはＦＣＤＨ反応である場合に有効である。
【００１７】
本発明において用いられるＧ６ＰＤＨは、反応式（ａ）
【００１８】
このＧ６ＰＤＨは基質親和性が高く、Ｋmは３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
このＧ６ＰＤＨとしては、細菌由来のものは、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害され、酵母由来のものは、アニオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、いずれも好ましい。
【００１９】
また、本発明において用いられる６−ＰＧＤＨは、反応式（ｃ）または（ｄ）
【００２０】
この６−ＰＧＤＨは基質親和性が高く、Ｋmは５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
この６−ＰＧＤＨとしては、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、酵母由来のものが好ましい。
【００２１】
一方、本発明において用いられるＦＣＤＨは、反応式（ｅ）または（ｆ）
このＦＣＤＨは、基質親和性が比較的高く、Ｋmは１．９×１０-3モル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）である。
このＦＣＤＨとしては、カチオン系界面活性剤により、比較的容易に酵素活性が阻害される点から、細菌由来のものが好ましい。
【００２２】
前記カチオン系界面活性剤としては、細菌由来のＧ６ＰＤＨの反応や酵母由来の６−ＰＧＤＨの反応、あるいは細菌由来のＦＣＤＨ反応を効果的に停止しうるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨや６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適である。このようなカチオン系界面活性剤としては、例えば一般式（Ｉ）
【化２】
で表される第四級アンモニウム塩、あるいは一般式（II）
【化３】
で表される第四級アンモニウム塩を、Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能や溶解性などの点から、好ましく挙げることができる。
【００２３】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3で示される炭素数１〜１０のアルキル基としては、直鎖状、分岐状のいずれであってもよく、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基などが、炭素数５〜１０のシクロアルキル基としては、例えばシクロペンチル基、シクロヘキシル基などが、炭素数６〜１０のアリール基としては、例えばフェニル基、トリル基、キシリル基、ナフチル基などが、炭素数７〜１０のアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、たがいに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２４】
また、一般式（Ｉ）における１／ｍＸm-、一般式（II）における１／ｑＸq-の例としては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-のハロゲンイオン、ＮＯ3 -、１／２ＳＯ4 2-、１／２ＣＯ3 2-、ＣＨ3ＳＯ4 -、ｐ−トルエンスルホン酸イオンなどが挙げられる。
【００２５】
さらに、一般式（Ｉ）におけるｎ、一般式（II）におけるｐが８以下ではＧ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨ、ＦＣＤＨの阻害能が十分でない場合があるし、１８以上では溶解性が悪くなることがあり、ｎおよびｐは９〜１７の範囲がよい。ＣＨ3（ＣＨ2）n-、ＣＨ3（ＣＨ2）p-で示される基としては、例えば、デシル基、ドデシル基、テトラデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基などが挙げられる。
【００２６】
上記一般式（Ｉ）、（II）で表される第四級アンモニウム塩の例としては、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリエチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリエチルアンモニウムクロリド、ドデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ドデシルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、テトラデシルジエチルベンジルアンモニウムクロリド、デシルピリジニウムクロリド、ドデシルピリジニウムクロリド、テトラデシルピリジニウムクロリドなど、およびこれらに対応するブロミド類やヨージド類などが好ましく挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
前記カチオン系界面活性剤を含有する本発明の反応停止剤は、特に細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨの活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。したがって、このようなカチオン系界面活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨまたは細菌由来のＦＣＤＨを含有する試料液に、カチオン系界面活性剤を０．６ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨ、６−ＰＧＤＨまたはＦＣＤＨの活性が、１０％以下になるようなカチオン系界面活性剤を選ぶのが有利である。
本発明の反応停止剤には、このようなカチオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤、６−ＰＧＤＨ阻害剤またはＦＣＤＨ阻害剤を含有させてもよい。
【００２８】
一方、前記アニオン系界面活性剤としては、酵母由来のＧ６ＰＤＨの反応を効果的に停止しうるものであればよく、特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該Ｇ６ＰＤＨを実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好適である。このようなアニオン系界面活性剤としては、例えば一般式（III）
Ｒ4ＳＯ3 -・１／ａ（Ｍ1）a+ （III）
（式中、Ｒ4は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ1）a+はａ価の陽イオン、ａは１または２を示す。）
で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩、
一般式（IV）
【化４】
で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩、一般式（Ｖ）
Ｒ6Ｏ−（Ｃ2Ｈ4Ｏ）c−ＳＯ3 -・１／ｋ（Ｍ3）k+ （Ｖ）
（式中、Ｒ6は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ3）k+はｋ価の陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示す。）
で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩などを好ましく挙げることができる。
【００２９】
前記一般式（III）において、Ｒ4で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ヘキサデシル基、オクタデシル基、オレイル基などが挙げられ、また、（Ｍ1）a+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、などが挙げられる。
【００３０】
この一般式（III）で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩の具体例としては、デカンスルホン酸ナトリウム、ドデカンスルホン酸ナトリウム、デカンスルホン酸カリウム、ドデカンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
【００３１】
また、前記一般式（IV）において、Ｒ5で示される炭素数６〜１５の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基の例としては、オクチル基、ノニル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられ、また、（Ｍ2）b+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
【００３２】
この一般式（IV）で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩の具体例としては、オクチルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、オクチルベンゼンスルホン酸カリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸カリウムなどが挙げられる。
【００３３】
さらに、前記一般式（Ｖ）において、Ｒ6で示される炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基の例としては、オクチル基、デシル基、ラウリル基、ミリスチル基、パルミチル基、ステアリル基、オレイル基などが挙げられ、また、（Ｍ3）k+の例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。
【００３４】
この一般式（Ｖ）で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩の具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンステアリルエーテル硫酸カリウム、ポリオキシエチレンオレイルエーテル硫酸カリウムなどが挙げられる。
【００３５】
本発明においては、これらのアニオン系界面活性剤は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
前記アニオン系界面活性剤を含有する本発明の反応停止剤は、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害して、該Ｇ６ＰＤＨの反応を効率よく停止させるものが好適である。したがって、酵母由来のＧ６ＰＤＨの活性を効果的に阻害するアニオン系界面活性剤としては、例えば０．０１Ｕ／ｍｌの酵母由来のＧ６ＰＤＨを含有する試料液に、アニオン系界面活性剤を０．３ｇ／１００ｍｌ濃度になるように加え、３７℃で４分間加温処理した後の該Ｇ６ＰＤＨの活性が、１０％以下になるようなアニオン系界面活性剤を選ぶのが有利である。
本発明の反応停止剤には、このようなアニオン系界面活性剤以外に、本発明の目的が損なわれない範囲で、所望により、他のＧ６ＰＤＨ阻害剤を含有させてもよい。
【００３６】
次に、本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法について説明する。
本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法は、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により、ＮＡＤ+またはＮＡＤＰ+を、それぞれＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに変換させ、次いで界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法である。
【００３７】
この方法においては、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好ましく、また界面活性剤としては、試料中の特定物質を測定する系において、共役脱水素酵素を実質上失活させる以外は、他に実質上影響を及ぼさないものが好ましい。
【００３８】
本発明の共役脱水素酵素反応の停止方法には、（１）Ｇ６ＰＤＨ反応の停止方法と、（２）６−ＰＧＤＨ反応の停止方法と、（３）ＦＣＤＨ反応の停止方法の３つの態様がある。
【００３９】
上記（１）のＧ６ＰＤＨ反応の停止方法は、Ｇ６ＰＤＨおよびグルコース−６−リン酸の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００４０】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、Ｇ６ＰＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
なお、用いるＧ６ＰＤＨが細菌由来のものである場合には、カチオン系界面活性剤を使用し、Ｇ６ＰＤＨが酵母由来のものである場合には、アニオン系界面活性剤を使用するのが肝要である。
【００４１】
このカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤の添加量としては、Ｇ６ＰＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばカチオン系界面活性剤を使用する場合には、Ｇ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよく、アニオン系界面活性剤を使用する場合にはＧ６ＰＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜１．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜０．５０ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．３ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。この界面活性剤の濃度が低すぎるとＧ６ＰＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
【００４２】
本発明における現象は、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤と酵素との相互作用により、説明しうるものと考えられる。すなわち、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤は、タンパク質変性作用を有し、これにより酵素は変性失活を来たす。Ｇ６ＰＤＨが失活しうる反応条件で、他に使用する共役酵素が実質上変性を受けにくい場合、Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤ（Ｐ）Ｈ再生に使用しうるものである。
【００４３】
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００４４】
【化５】
【００４５】
一方、前記（２）の６−ＰＧＤＨ反応の停止方法は、６−ＰＧＤＨおよび６−ホスホグルコン酸の作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００４６】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤は、６−ＰＧＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
【００４７】
このカチオン系界面活性剤の添加量としては、６−ＰＧＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えば６−ＰＧＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎると６−ＰＧＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００４８】
【化６】
【００４９】
さらに、前記（３）のＦＣＤＨ反応の停止方法は、ＦＣＤＨおよびＬ−フコースの作用により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換させ、次いでカチオン系界面活性剤を作用させることにより、この反応を停止させる方法であって、上記ＮＡＤ（Ｐ）+の由来については特に制限はないが、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものが好適である。
【００５０】
ＮＡＤ（Ｐ）+が、このように、試料中の特定物質を測定する系において、該試料の前処理により生成したものである場合、使用するカチオン系界面活性剤は、ＦＣＤＨを実質上失活させる以外は、該系における他のものに実質上影響を及ぼさないものが好適である。
【００５１】
このカチオン系界面活性剤の添加量としては、ＦＣＤＨ反応を停止させるのに十分な量であり、かつ測定系における他のものに実質上影響を及ぼさない濃度範囲であればよく、特に制限はないが、例えばＦＣＤＨ １．０Ｕ／ｍｌに対し、終濃度が、通常０．０１〜２．００ｇ／１００ｍｌ、好ましくは、０．０５〜１．００ｇ／１００ｍｌ、より好ましくは０．１〜０．５ｇ／１００ｍｌになるように選ぶのがよい。また、２種以上のカチオン系界面活性剤を組み合わせて使用する場合、その合計量が上記濃度範囲にあればよい。このカチオン系界面活性剤の濃度が低すぎるとＦＣＤＨ反応の停止が不十分となり、好ましくないし、また必要以上に添加すると測定系における他のものに悪影響を及ぼすおそれがあり、好ましくない。
【００５２】
このような本発明の停止方法における反応を式で示すと次のように表すことができる。
【００５３】
【化７】
【００５４】
本発明では、用いる界面活性剤が前記のように共役脱水素酵素反応を選択的に阻害することが重要である。この界面活性剤が共役脱水素酵素を阻害する理由は、現在のところ、はっきりしていないが、以下のように推察できる。
共役脱水素酵素にある種の界面活性剤を作用させると、共役脱水素酵素にその界面活性剤のいくつかが結合して複合体ができる。そのようになった共役脱水素酵素は、界面活性剤のもつ荷電により本来の共役脱水素酵素の荷電と異なる状態になる。一方、共役脱水素酵素は、イオンを有するＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈにする点で、酵素反応のときは、イオン状態が特に重要と考えられる。そのため、界面活性剤に結合された共役脱水素酵素の荷電状態は、本来の共役脱水素酵素のものと異なるので、イオン状態が重要なこの酵素反応を起こしにくいと考えられる。その結果、用いる界面活性剤が共役脱水素酵素反応を選択的に阻害できると考えられる。この根拠として、界面活性剤として非イオン系界面活性剤を用いても共役脱水素酵素反応を阻害しにくいことからも支持される。
【００５５】
次に、本発明の特定物質の測定方法について説明する。
一般に、試料中の特定物質からアンモニアを発生させて、そのアンモニアを測定することにより、該特定物質を定量する方法として、発生したアンモニアに、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下にＧＬＤＨを作用させて、反応式（ｊ）
【化８】
【００５６】
上記反応式（ｊ）において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−１）
【化９】
【化１０】
【００５７】
また、共役脱水素酵素としてＦＣＤＨを用いた場合には、反応式（ｊ）は、下記の反応式（ｊ−３）
【化１１】
【００５８】
しかし、この方法においては、試料中にアンモニアが最初から存在する場合には、予めこのアンモニアを消去しておかなければ、正確に特定物質を測定することができない。そこで、前処理として、上記反応式（ｊ）における反応ＡのＧＬＤＨ反応を適用し、試料中に最初から存在するアンモニアを消去すればよい。そして、このＧＬＤＨ反応においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ → ＮＡＤ（Ｐ）+の変換を伴うため、ＮＡＤ（Ｐ）+ → ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応を行えば、少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの使用量で効率よくアンモニアを消去することができる。この際、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを多量に使用すると、最初から存在するアンモニアを消去した後で特定物質を測定する際に、波長３４０ｎｍ［ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を測定する波長］での反応液の吸光度が大きくなりすぎて、特定物質の測定ができなくなるおそれがある。
【００５９】
本発明においては、ＮＡＤ（Ｐ）+ → ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生反応は、前記反応式（ｊ）における反応Ｂで示されるように、共役脱水素酵素とその基質を作用させることにより誘起される。具体的には、上記再生反応は、反応式（ｊ−１）における反応Ｂで示されるように、グルコース−６−リン酸（Ｇ６Ｐ）とＧ６ＰＤＨを作用させることにより誘起され、また、反応式（ｊ−２）における反応Ｂで示されるように、６−ホスホグルコン酸（６−ＰＧ）と６−ＰＧＤＨを作用させることにより誘起される。さらに、反応式（ｊ−３）における反応Ｂで示されるように、Ｌ−フコース（ＦＣ）とＦＣＤＨを作用させることにより誘起される。
【００６０】
このようにして、試料中に最初から存在するアンモニアを消去した後で、特定物質からアンモニアを発生させて、該特定物質を定量するが、その際に、測定系内に共役脱水素酵素およびその基質が存在すると、特定物質から発生したアンモニアにより、ＮＡＤ（Ｐ）ＨがＮＡＤ（Ｐ）+に変換しても、共役脱水素酵素反応によってＮＡＤ（Ｐ）+からＮＡＤ（Ｐ）Ｈが再生されるため、特定物質由来のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量を正確に測定することができない。そこで、本発明では、共役脱水素酵素に界面活性剤を作用させて、共役脱水素酵素反応を停止することにより、前記反応式（ｊ）における反応Ｂが起こらず、その結果、ＮＡＤ（Ｐ）+はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換されないため、反応系のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの変化量は、特定物質から発生するアンモニアのみに依存し、特定物質を正確に定量することができる。
【００６１】
このような試料中の特定物質を定量する具体的な方法としては、まず、ＧＬＤＨ、α−ケトグルタル酸、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を第一試薬、並びに特定物質からアンモニアを発生させる成分および該共役脱水素酵素の反応を阻害する界面活性剤を含有する第二試薬を調製する。なお第二試薬には、所望により、α−ＫＧ、ＧＬＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）+などのアンモニアを測定するための成分を加えてもよい。また、第一試薬、第二試薬はアルブミン、金属イオン、糖類などを併存させて液状試薬として保存してもよい。
【００６２】
次に試料に、上記第一試薬を加えて、試料中に予め存在するアンモニアを消去したのち、これに第二試薬を加え、共役脱水素酵素反応を停止させるとともに、特定物質からアンモニアを発生させ、このアンモニアを測定することにより、特定物質を定量するといった方法を用いることができる。なお、第二試薬を加える代わりに、界面活性剤のみを添加して共役脱水素酵素反応を停止させた後で、特定物質からアンモニアを発生させる成分を添加してもよい。
【００６３】
前記特定物質の測定方法および試薬において、共役脱水素酵素およびその基質として、Ｇ６ＰＤＨとグルコース−６−リン酸を用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤（Ｇ６ＰＤＨが細菌由来の場合）またはアニオン系界面活性剤（Ｇ６ＰＤＨが酵母由来の場合）が好ましく用いられ、一方、６−ＰＧＤＨと６−ホスホグルコン酸を用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。また、ＦＣＤＨとＬ−フコースを用いた場合には、前述のように界面活性剤として、カチオン系界面活性剤が好ましく用いられる。
【００６４】
本発明はまた、特定物質測定用のキットをも提供するものであり、このキットは、前記第一試薬および第二試薬を必須試薬として構成されている。
前記試料中のアンモニアを発生しうる特定物質の定量方法において、特定物質からアンモニアを発生させる方法としては、通常酵素反応を利用する方法が用いられる。その例として、下記の特定物質について説明する。
【００６５】
（１）尿素
前述のように、ウレアーゼを作用させ、加水分解することにより、アンモニアが生成する。尿素を測定する際、チオグリセロールなどのＳＨ基含有化合物をウレアーゼと共に併用すると、ウレアーゼの活性が調整され好ましい。
【００６６】
（２）クレアチン
【化１２】
【００６７】
（３）クレアチニン
【化１３】
また、下記のように、クレアチニナーゼで加水分解してクレアチンに誘導したのち、上記（２）と同様な操作により、アンモニアが生成する。
【００６８】
【化１４】
【化１５】
【００６９】
（５）Ｃａ2+
【化１６】
【００７０】
本発明の試料中の特定物質を定量する方法は、上記特定物質の中で、特に尿素窒素を定量するのに適している。また、この定量方法においては、共役脱水素酵素反応を停止するために用いる界面活性剤としては、共役脱水素酵素の活性を実質上阻害するが、ＧＬＤＨおよび特定物質からアンモニアを生成するのに関与する酵素の活性を実質上阻害しないものを選択して使用することが肝要である。
【００７１】
本発明は以下のような特徴を有する。
【００７２】
（１）試料中にアンモニアが多量にあっても、共役脱水素酵素反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすく、さらに、界面活性剤が共役脱水素酵素反応を速やかに停止するので、そのアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７３】
例えば共役脱水素酵素として、Ｇ６ＰＤＨを使用する場合、このＧ６ＰＤＨは、Ｋmが３．５×１０-5モル／リットル（グルコース−６−リン酸）、４．２×１０-6モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、Ｇ６ＰＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤またはアニオン系界面活性剤がＧ６ＰＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７４】
また、共役脱水素酵素として、６−ＰＧＤＨを使用する場合、６−ＰＧＤＨは、Ｋmが５．４×１０-5モル／リットル（６−ホスホグルコン酸）、２．０×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と小さいので、６−ＰＧＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤が６−ＰＧＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７５】
さらに、共役脱水素酵素として、ＦＣＤＨを使用する場合、ＦＣＤＨは、Ｋmが１．９×１０-3モル／リットル（Ｌ−フコース）、１．６×１０-5モル／リットル（ＮＡＤＰ+）と比較的小さいので、ＦＣＤＨ反応により、ＮＡＤ（Ｐ）+をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに変換しやすい上、カチオン系界面活性剤がＦＣＤＨ反応を速やかに停止する。したがって、試料中に最初から存在するアンモニアを少量のＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いて速やかに消去でき、その後の試料中の特定物質の測定を正確に行うことができる。
【００７６】
（２）特定物質測定系がＡＴＰを生成する反応系である場合でも、測定原理上、特に不都合が生じない。
（３）特定物質測定系が、金属要求性酵素を含んでいても、特に不都合が生じない。
【００７７】
【実施例】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。
【００７８】
実施例１
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
細菌由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【００７９】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６ＰＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８０】
実施例２
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００８１】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８２】
実施例３
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００８３】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表１に示す。
【００８４】
比較例１
実施例１における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８５】
比較例２
実施例２における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例２と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８６】
比較例３
実施例３における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例３と同様にして実施した。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
表１の結果から、Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあまり阻害させず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、Ｇ６ＰＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
【００８９】
以上の結果から、細菌由来のＧ６ＰＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【００９０】
以下に、細菌由来のＧ６ＰＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例に挙げ、本発明の効果を具体的に説明する。
【００９１】
実施例４
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【００９２】
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
表２の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【００９５】
実施例５
血清を試料とし、実施例４に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
その結果を図１に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図１から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【００９６】
実施例６
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
酵母由来のＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【００９７】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、Ｇ６ＰＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【００９８】
実施例７
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【００９９】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１００】
実施例８
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
１−デカンスルホン酸ナトリウム ０．６ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてアニオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１０１】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、アニオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表３に示す。
【０１０２】
比較例４
実施例６における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例６と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０３】
比較例５
実施例７における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例７と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０４】
比較例６
実施例８における第二試薬において、１−デカンスルホン酸ナトリウムの代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例８と同様にして実施した。結果を表３に示す。
【０１０５】
【表３】
表３の結果から、特に酵母由来のＧ６ＰＤＨ活性は、アニオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、Ｇ６ＰＤＨに比してあまり阻害させず、高い残存活性を示すことがわかる。
【０１０７】
一方、阻害剤としてＡＴＰまたはＡＤＰを使用した場合、ＧＬＤＨの活性およびウレアーゼの活性を阻害しないだけでなくＧ６ＰＤＨの活性をも阻害しないことがわかる。
この事実により、酵母由来のＧ６ＰＤＨにより、ＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【０１０８】
以下に、酵母由来のＧ６ＰＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１０９】
実施例９
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
グルコース−６−リン酸 ２０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
１−デカンスルホン酸ナトリウム １５ｍｇ／ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表４に示す。
【０１１０】
【表４】
表４の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、Ｇ６ＰＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＧ６ＰＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１１２】
実施例１０
血清を試料とし、実施例９に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル株式会社より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定した。
その結果を図２に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図２から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【０１１３】
実施例１１
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
酵母由来の６−ＰＧＤＨをそれぞれ１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【０１１４】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、６−ＰＧＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１５】
実施例１２
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１１６】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１７】
実施例１３
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１１８】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表５に示す。
【０１１９】
比較例７
実施例１１における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１１と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２０】
比較例８
実施例１２における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１２と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２１】
比較例９
実施例１３における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１３と同様にして実施した。結果を表５に示す。
【０１２２】
【表５】
表５の結果から、６−ＰＧＤＨ（酵母由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、６−ＰＧＤＨに比してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰまたはＡＤＰは、６−ＰＧＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
【０１２４】
以上の結果から、酵母由来の６−ＰＧＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行いうることが強く示唆された。
【０１２５】
以下に、酵母由来の６−ＰＧＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１２６】
実施例１４
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ含み、かつアンモニアを含まない試料Ａ0および尿素窒素を２５ｍｇ／ｄｌ、アンモニアを５００ｍｇ／ｄｌ含む試料Ａ5を調製した。さらに試料Ａ5をＡ0で希釈し、アンモニア濃度がそれぞれ１００、２００、３００、４００ｍｇ／ｄｌであり、かつ尿素窒素濃度２５ｍｇ／ｄｌの試料を調製し、それぞれＡ1、Ａ2、Ａ3、Ａ4とした。
【０１２７】
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
６−ホスホグルコン酸 ２０ｍＭ
６−ＰＧＤＨ（酵母由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日立７１５０形自動分析装置を使用して行った。結果を表６に示す。
【０１２８】
【表６】
表６の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、６−ＰＧＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果で６−ＰＧＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１３０】
実施例１５
血清を試料とし、実施例１４に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、６−ＰＧＤＨを組込まない市販のイソクエン酸脱水素酵素法（ニットーボーメディカル（株）より販売されているＮ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ Ｄタイプを使用）で尿素窒素を測定した。その結果を図３に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図３から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【０１３１】
実施例１６
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
細菌由来のＦＣＤＨ（Ｌ−フコース脱水素酵素）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
［トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液］
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰ+ ４ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
Ｌ−フコース ２０ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても、同様に調製した。
【０１３２】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で４分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＦＣＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３３】
実施例１７
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ＧＬＤＨ（細菌由来）を４Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
塩化アンモニウム ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１３４】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ＧＬＤＨ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３５】
実施例１８
以下のようにして試料および試薬を調製した。
試料：
ウレアーゼ（ナタマメ由来）を１Ｕ／ｍｌ含む水溶液。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．５ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １６Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
尿素 ３ｍＭ
各種カチオン系界面活性剤 １．２ｇ／１００ｍｌ
また、対照としてカチオン系界面活性剤無添加の第二試薬についても同様に調製した。
【０１３６】
試料４μｌに第一試薬２００μｌを加え、３７℃で５分間加温後、第二試薬２００μｌを加えて、３７℃で１分間放置した。その後、３４０ｎｍの波長で１分間当たりの吸光度変化量を測定した。なお、ウレアーゼ活性は、カチオン系界面活性剤無添加の場合の吸光度変化量を１００％として求めた。結果を表７に示す。
【０１３７】
比較例１０
実施例１６における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１６と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１３８】
比較例１１
実施例１７における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１７と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１３９】
比較例１２
実施例１８における第二試薬において、カチオン系界面活性剤の代わりに、ＡＴＰまたはＡＤＰをそれぞれ５０ｍＭ用いた以外は、実施例１８と同様にして実施した。結果を表７に示す。
【０１４０】
【表７】
表７の結果から、ＦＣＤＨ（細菌由来）活性は、カチオン系界面活性剤により大きく阻害されるが、尿素窒素の測定のための反応に関与する酵素であるＧＬＤＨ、ウレアーゼの活性は、ＦＣＤＨに比してあまり阻害されず、高い残存活性を示すことが分かる。また、ＡＴＰおよびＡＤＰは、ＦＣＤＨの阻害剤として不適当であることが分かる。
以上の結果から、細菌由来のＦＣＤＨによりＮＡＤＰＨを再生し、ＮＡＤＰＨを初期レベルに保持した状態で測定反応を行い得ることが強く示唆された。
【０１４２】
以下に、細菌由来のＦＣＤＨを試薬として用い、アンモニアを試料中に夾雑させた場合における尿素窒素測定を例にあげ、本発明の効果を具体的に説明する。
【０１４３】
実施例１９
以下のように試料および試薬を調製した。
試料：
試料として実施例４で調製したＡ0〜Ａ5と同じものを用いた。
第一試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ
ＧＬＤＨ（細菌由来） １０Ｕ／ｍｌ
Ｌ−フコース ２０ｍＭ
ＦＣＤＨ（細菌由来） ３Ｕ／ｍｌ
第二試薬：
トリス緩衝液（ｐＨ７．８） １００ｍＭ
α−ＫＧ １０ｍＭ
ウレアーゼ（ナタマメ由来） １０Ｕ／ｍｌ
ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド ３ｇ／１００ｍｌ
チオグリセロール ４００ｍＭ
上記試料Ａ0〜Ａ5それぞれ３μｌに、第一試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、次いで第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間当たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は、予め作成しておいた検量線より求めた。なお、これらの測定は、日立７１５０型自動分析装置を使用して行った。結果を表８に示す。
【０１４４】
【表８】
表８の結果から分かるように、第一試薬を添加して前処理反応を行うことにより、アンモニアが消去され、同時に消費されたＮＡＤＰＨは、ＦＣＤＨの働きで再生されたため、ＮＡＤＰＨの不足が解消され、第二試薬添加後はアンモニアの影響を受けずに、尿素窒素を測定することが可能となった。この際、本発明の効果でＦＣＤＨ反応は停止し、尿素窒素から生成するアンモニアにより、ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰ+への変換反応のみが進行するので、正確な測定結果が得られた。
【０１４６】
実施例２０
血清を試料とし、実施例１９に準拠した方法（本発明に係る方法）で尿素窒素を測定するとともに、従来のＩＣＤＨ法により尿素窒素を測定した。なお、ＩＣＤＨ法は、ニットーボーメディカル（株） Ｎ−アッセイ ＢＵＮ−Ｌ（Ｄタイプ）を用いた。
【０１４７】
その結果を図４に示す。横軸は従来法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）、縦軸は本発明に係る方法による尿素窒素の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
図４から分かるように、本発明に係る方法は、従来法と極めて有意な相関図が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図２】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＧ６ＰＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図３】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素として６−ＰＧＤＨ（酵母由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
【図４】尿素窒素の測定において、共役脱水素酵素としてＦＣＤＨ（細菌由来）を用いた本発明の方法と市販キットを用いた従来法との相関性の１例を示す図である。
Claims (4)
- 試料中の特定物質からアンモニアを発生させ、このアンモニアを測定することにより、該特定物質を定量する方法において、あらかじめ、試料中に存在するアンモニアを、グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質の作用により消去し、次いで界面活性剤の作用により共役脱水素酵素反応を停止させ、その作用と同時か後に、該特定物質からアンモニアを発生させる成分を作用させ、発生するアンモニアを測定すること及び
前記共役脱水素酵素がグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６−ＰＧＤＨ）又はＬ−フコース脱水素酵素（ＦＣＤＨ）であり、
前記界面活性剤は、前記共役脱水素酵素が細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨ又は細菌由来のＦＣＤＨである場合、一般式（Ｉ）
で表される第四級アンモニウム塩、あるいは一般式（ II ）
で表される第四級アンモニウム塩であり、
前記界面活性剤は、前記共役脱水素酵素が酵母由来のＧ６ＰＤＨである場合、一般式（ III ）
Ｒ ４ ＳＯ ３ − ・１／ａ（Ｍ １ ） ａ＋ （ III ）
（式中、Ｒ ４ は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ １ ） ａ＋ はａ価の陽イオン、ａは１または２を示す。）
で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩、一般式（ IV ）
で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩、あるいは一般式（Ｖ）
Ｒ ６ Ｏ−（Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｃ −ＳＯ ３ − ・１／ｋ（Ｍ ３ ） ｋ＋ （Ｖ）
（式中、Ｒ ６ は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ ３ ） ｋ＋ はｋ価の陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示す。）
で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩であることを特徴とする特定物質の測定方法。 - 特定物質が尿素であり、かつ、特定物質からアンモニアを発生させる成分がウレアーゼである請求項１に記載の特定物質の測定方法。
- 特定物質測定用キットであって、（Ａ）グルタミン酸脱水素酵素、α−ケトグルタル酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型、共役脱水素酵素およびこの共役脱水素酵素の基質を含む試薬、並びに（Ｂ）特定物質からアンモニアを発生させる成分および界面活性剤を含む試薬を必須構成試薬とすること及び
前記共役脱水素酵素がグルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素（６−ＰＧＤＨ）又はＬ−フコース脱水素酵素（ＦＣＤＨ）であり、
前記界面活性剤は、前記共役脱水素酵素が細菌由来のＧ６ＰＤＨ、酵母由来の６−ＰＧＤＨ又は細菌由来のＦＣＤＨである場合、一般式（Ｉ）
で表される第四級アンモニウム塩、あるいは一般式（ II ）
で表される第四級アンモニウム塩であり、
前記界面活性剤は、前記共役脱水素酵素が酵母由来のＧ６ＰＤＨである場合、一般式（ III ）
Ｒ ４ ＳＯ ３ − ・１／ａ（Ｍ １ ） ａ＋ （ III ）
（式中、Ｒ ４ は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ １ ） ａ＋ はａ価の陽イオン、ａは１または２を示す。）
で表されるアルキル（またはアルケニル）スルホン酸塩、一般式（ IV ）
で表されるアルキルベンゼンスルホン酸塩、あるいは一般式（Ｖ）
Ｒ ６ Ｏ−（Ｃ ２ Ｈ ４ Ｏ） ｃ −ＳＯ ３ − ・１／ｋ（Ｍ ３ ） ｋ＋ （Ｖ）
（式中、Ｒ ６ は炭素数８〜２０の直鎖状若しくは分岐状のアルキル基またはアルケニル基、（Ｍ ３ ） ｋ＋ はｋ価の陽イオン、ｋは１または２、ｃは１以上の整数を示す。）
で表されるポリオキシエチレンアルキル（またはアルケニル）エーテル硫酸塩であること を特徴とするキット。 - 特定物質が尿素であり、かつ、特定物質からアンモニアを発生させる成分がウレアーゼである請求項３に記載のキット。
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