JP3159274B2 - 尿素窒素測定用組成物 - Google Patents
尿素窒素測定用組成物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は尿素窒素測定用組成物、
更に詳しくは液体、特に血液及び尿中の尿素窒素の測定
用組成物に関するものである。
更に詳しくは液体、特に血液及び尿中の尿素窒素の測定
用組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、尿素窒素の定量法としては、ウレ
アーゼ−インドフェノール法、尿素アミドリアーゼ−ピ
ルビン酸オキシダーゼ法、ウレアーゼ−グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ法が主に使用されている。しかしなが
ら、ウレアーゼ−インドフェノール法では反応触媒とし
て使用するニトロプルシドナトリウムが劇薬であること
と、発色試薬による測定ライン汚染が問題であり、尿素
アミドリアーゼ−ピルビン酸オキシダーゼ法では溶存酸
素の不足から高値直線性が不良となる点が問題であっ
た。また、ウレアーゼ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
法では、ウレアーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの
Ｋｍが十分に大きくないために、高値直線性が不良とな
るという問題点があった。これまでにウレアーゼ−グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ法の改良法として、ウレアー
ゼの抗阻害物質としてヒドロキシウレア（クリニカルケ
ミストリー、２５巻、１７２１頁、１９７９年）、ホウ
酸（特開昭５９−１５１９００）、アセトヒドロキサム
酸（特開平２−２５５０９９）等を使用してウレアーゼ
の見かけのＫｍ値を大きくし、尿素窒素の測定範囲を広
げるという方法が報告されている。しかし、これらの抗
阻害剤を用いて尿素窒素測定用の試薬を調製すると、試
薬の保存安定性、特にウレアーゼの安定性が十分ではな
く、保存に伴い感度の著しい低下が見られることが判明
した。
アーゼ−インドフェノール法、尿素アミドリアーゼ−ピ
ルビン酸オキシダーゼ法、ウレアーゼ−グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ法が主に使用されている。しかしなが
ら、ウレアーゼ−インドフェノール法では反応触媒とし
て使用するニトロプルシドナトリウムが劇薬であること
と、発色試薬による測定ライン汚染が問題であり、尿素
アミドリアーゼ−ピルビン酸オキシダーゼ法では溶存酸
素の不足から高値直線性が不良となる点が問題であっ
た。また、ウレアーゼ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
法では、ウレアーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの
Ｋｍが十分に大きくないために、高値直線性が不良とな
るという問題点があった。これまでにウレアーゼ−グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ法の改良法として、ウレアー
ゼの抗阻害物質としてヒドロキシウレア（クリニカルケ
ミストリー、２５巻、１７２１頁、１９７９年）、ホウ
酸（特開昭５９−１５１９００）、アセトヒドロキサム
酸（特開平２−２５５０９９）等を使用してウレアーゼ
の見かけのＫｍ値を大きくし、尿素窒素の測定範囲を広
げるという方法が報告されている。しかし、これらの抗
阻害剤を用いて尿素窒素測定用の試薬を調製すると、試
薬の保存安定性、特にウレアーゼの安定性が十分ではな
く、保存に伴い感度の著しい低下が見られることが判明
した。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
現状に鑑み、定量性、正確性、安定性、高値直線性に優
れた尿素窒素の酵素的測定用組成物を提供することであ
る。
現状に鑑み、定量性、正確性、安定性、高値直線性に優
れた尿素窒素の酵素的測定用組成物を提供することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために、鋭意検討したところ、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼの抗阻害剤を用いると良好な結果を得
られることを見い出し、本発明を完成した。 すなわ
ち、本発明は（ａ）ウレアーゼ、（ｂ）α−ケトグルタ
ル酸、（ｃ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、（ｄ）グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼおよび（ｅ）グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
素測定用組成物である。
を達成するために、鋭意検討したところ、グルタミン酸
デヒドロゲナーゼの抗阻害剤を用いると良好な結果を得
られることを見い出し、本発明を完成した。 すなわ
ち、本発明は（ａ）ウレアーゼ、（ｂ）α−ケトグルタ
ル酸、（ｃ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、（ｄ）グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼおよび（ｅ）グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
素測定用組成物である。
【０００５】上記の測定用組成物は、下記反応を利用す
るものである。
るものである。
【０００６】
【化１】
【０００７】本発明に用いられるウレアーゼ（ＥＣ
３．５．１．５）の起源は特に限定されるものではな
い。例えば、ナタマメ由来、微生物由来のものが用いら
れ、好適にはナタマメ由来のものが使用される。
３．５．１．５）の起源は特に限定されるものではな
い。例えば、ナタマメ由来、微生物由来のものが用いら
れ、好適にはナタマメ由来のものが使用される。
【０００８】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼは特に限定されるものではなく、ＮＡＤＨを補
酵素とするもの（ＥＣ １．４．１．３）であっても、
ＮＡＤＰＨを補酵素とするもの（ＥＣ １．４．１．
４）であってもよい。
ゲナーゼは特に限定されるものではなく、ＮＡＤＨを補
酵素とするもの（ＥＣ １．４．１．３）であっても、
ＮＡＤＰＨを補酵素とするもの（ＥＣ １．４．１．
４）であってもよい。
【０００９】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼの起源は特に限定されるものではない。例え
ば、牛肝臓由来、微生物由来のものが用いられ、好適に
はプロテウス属由来のものが使用される。
ゲナーゼの起源は特に限定されるものではない。例え
ば、牛肝臓由来、微生物由来のものが用いられ、好適に
はプロテウス属由来のものが使用される。
【００１０】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ阻害剤はグルタミン酸デヒドロゲナーゼに直接
作用し、酵素の基質（アンモニア）に対する親和性を調
節する物質、すなわち抗阻害剤であれば特に限定される
ものではない。例えば、カルシウムイオン、マンガンイ
オン等の重金属イオンが好適に使用される。これらの重
金属イオンは塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形で使
用される。
ゲナーゼ阻害剤はグルタミン酸デヒドロゲナーゼに直接
作用し、酵素の基質（アンモニア）に対する親和性を調
節する物質、すなわち抗阻害剤であれば特に限定される
ものではない。例えば、カルシウムイオン、マンガンイ
オン等の重金属イオンが好適に使用される。これらの重
金属イオンは塩化物、炭酸塩、硫酸塩、酢酸塩の形で使
用される。
【００１１】本発明の試薬のｐＨは緩衝液によりｐＨ５
〜１１に保たれているのが好ましい。緩衝液は如何なる
ものでもよく、例えばトリス緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液、
イミダゾール緩衝液が挙げられる。
〜１１に保たれているのが好ましい。緩衝液は如何なる
ものでもよく、例えばトリス緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液、
イミダゾール緩衝液が挙げられる。
【００１２】本発明の試薬は必要により、界面活性剤、
防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤
としては、ＮａＮ3 、キレート剤、抗生物質が好適に用
いられる。
防腐剤、安定化剤等を加えてもよい。界面活性剤として
は、非イオン性界面活性剤が好適に用いられる。防腐剤
としては、ＮａＮ3 、キレート剤、抗生物質が好適に用
いられる。
【００１３】試薬構成としては、体液中のアンモニアを
グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはその他のアンモニ
ア消去系の酵素を用いて消去した後に、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を添加する２試薬系が好ましい。
グルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはその他のアンモニ
ア消去系の酵素を用いて消去した後に、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を添加する２試薬系が好ましい。
【００１４】試薬の形状としては、液状試薬であって
も、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせ
てもよい。
も、凍結乾燥製剤であってもよく、溶解液を組み合わせ
てもよい。
【００１５】本発明に用いられるグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼの濃度は、０．０１〜１０Ｕ／ｍｌの範囲で好
適に用いられる。本発明に用いられるウレアーゼの使用
濃度は、１〜１０００Ｕ／ｍｌ の範囲で好適に用いら
れる。α- ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨの使
用濃度としては、、α- ケトグルタル酸は０．１〜１０
０ｍＭ、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは０．１〜１ｍＭの
範囲が好適に用いられる。グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ阻害剤の使用濃度は、例えば重金属イオンの濃度は１
〜１００ｍＭの範囲が好適に用いられる。
ゲナーゼの濃度は、０．０１〜１０Ｕ／ｍｌの範囲で好
適に用いられる。本発明に用いられるウレアーゼの使用
濃度は、１〜１０００Ｕ／ｍｌ の範囲で好適に用いら
れる。α- ケトグルタル酸、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨの使
用濃度としては、、α- ケトグルタル酸は０．１〜１０
０ｍＭ、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨは０．１〜１ｍＭの
範囲が好適に用いられる。グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼ阻害剤の使用濃度は、例えば重金属イオンの濃度は１
〜１００ｍＭの範囲が好適に用いられる。
【００１６】本発明の尿素窒素測定用組成物を用いて、
尿素窒素を測定する方法は、前記のごとく試料をウレア
ーゼとグルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を含有する該試薬と反応させて消
費されるＮＡＤＰＨ、またはＮＡＤＨを紫外部の吸光度
の減少で測定する方法である。本発明の組成物を用いて
測定する条件としては、特に厳密に規制するものではな
いが、反応温度は、１０〜４０℃の間で、３７℃また
は、３０℃が好適に用いられる。測定波長としては，３
４０ｎｍ付近で測定されることが望ましい。
尿素窒素を測定する方法は、前記のごとく試料をウレア
ーゼとグルタミン酸デヒドロゲナーゼとグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ阻害剤を含有する該試薬と反応させて消
費されるＮＡＤＰＨ、またはＮＡＤＨを紫外部の吸光度
の減少で測定する方法である。本発明の組成物を用いて
測定する条件としては、特に厳密に規制するものではな
いが、反応温度は、１０〜４０℃の間で、３７℃また
は、３０℃が好適に用いられる。測定波長としては，３
４０ｎｍ付近で測定されることが望ましい。
【００１７】
【実施例】以下、本発明を実施例により詳細に説明す
る。 実施例１ 被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有する試薬Ａおよ
び試薬Ｂを用いて下記方法により測定した。 試薬Ａ 試薬１ トリス緩衝液 ０．１Ｍ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 １５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来）
る。 実施例１ 被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有する試薬Ａおよ
び試薬Ｂを用いて下記方法により測定した。 試薬Ａ 試薬１ トリス緩衝液 ０．１Ｍ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 １５ ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来）
【００１８】 試薬２ トリス緩衝液 １０ｍＭ （ｐＨ６．５） ＥＤＴＡ・２Ｋ ０．１Ｍ ＣａＣｌ2 ２５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ３０ｋＵ／Ｌ （ナタマメ由来）
【００１９】 試薬Ｂ 試薬１ トリス緩衝液 ０．１Ｍ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 １５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／Ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来）
【００２０】 試薬２ トリス緩衝液 １０ｍＭ （ｐＨ６．５） ＥＤＴＡ・２Ｋ ０．１Ｍ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ３０ｋＵ／Ｌ （ナタマメ由来）
【００２１】測定方法 尿素窒素水溶液３００ｍｇ／ｄｌの１０段階希釈液を試
料とし、各５０μｌを採取し、これに試薬１を３ｍｌを
加え、３７℃、５分間加温した後、更に試薬２を１ｍｌ
加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍにて測
定した。なお、ブランクは尿素窒素含有被検液の代わり
に蒸留水を用いた。図１にカルシウムイオンを含有する
試薬Ａとカルシウムイオンを含有しない試薬Ｂの希釈直
線性を示す。図１から明らかなように、カルシウムイオ
ンを添加した試薬Ａは、高濃度の尿素窒素に対しても直
線性が高く、感度よく測定できる。
料とし、各５０μｌを採取し、これに試薬１を３ｍｌを
加え、３７℃、５分間加温した後、更に試薬２を１ｍｌ
加えて、単位時間当りの吸光度変化を３４０ｎｍにて測
定した。なお、ブランクは尿素窒素含有被検液の代わり
に蒸留水を用いた。図１にカルシウムイオンを含有する
試薬Ａとカルシウムイオンを含有しない試薬Ｂの希釈直
線性を示す。図１から明らかなように、カルシウムイオ
ンを添加した試薬Ａは、高濃度の尿素窒素に対しても直
線性が高く、感度よく測定できる。
【００２２】実施例２ 被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有する試薬Ｃ及び
試薬Ｄを用いて下記方法により測定した。 試薬Ｃ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ５００Ｕ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ７．５ｋＵ／ｌ （ナタマメ由来）
試薬Ｄを用いて下記方法により測定した。 試薬Ｃ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ５００Ｕ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ＭｎＣｌ2 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ７．５ｋＵ／ｌ （ナタマメ由来）
【００２３】 試薬Ｄ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ５００Ｕ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ７．５ｋＵ／ｌ （ナタマメ由来）
【００２４】測定方法 尿素窒素水溶液３００ｍｇ／ｄｌの１０段階希釈液を試
料とし、各５０μｌを採取し、これに上記試薬４ｍｌを
加えて、３７℃で５分間反応させて、単位時間当りの吸
光度変化を３４０ｎｍにて測定した。なお、ブランクは
尿素窒素含有被験液の代わりに蒸留水を用いた。図２に
マンガンイオンを含有する試薬Ｃとマンガンイオンを含
有しない試薬Ｄの希釈直線性を示す。図２から明らかな
ように、マンガンイオンを添加した試薬Ｃは、高濃度の
尿素窒素に対しても直線性が高く、感度よく測定でき
る。
料とし、各５０μｌを採取し、これに上記試薬４ｍｌを
加えて、３７℃で５分間反応させて、単位時間当りの吸
光度変化を３４０ｎｍにて測定した。なお、ブランクは
尿素窒素含有被験液の代わりに蒸留水を用いた。図２に
マンガンイオンを含有する試薬Ｃとマンガンイオンを含
有しない試薬Ｄの希釈直線性を示す。図２から明らかな
ように、マンガンイオンを添加した試薬Ｃは、高濃度の
尿素窒素に対しても直線性が高く、感度よく測定でき
る。
【００２５】実施例３ 次の組成を有する試薬Ｅおよび試薬Ｆを調製し、冷蔵保
管（１週間）した後、ウレアーゼ活性とグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を測定した。各酵素活性は調製直後
の値を１００として比較した。 試薬Ｅ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ＣａＣｌ2 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ７．５ｋＵ／ｌ （ナタマメ由来）
管（１週間）した後、ウレアーゼ活性とグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ活性を測定した。各酵素活性は調製直後
の値を１００として比較した。 試薬Ｅ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １０００Ｕ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ＣａＣｌ2 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ７．５ｋＵ／ｌ （ナタマメ由来）
【００２６】 試薬Ｆ トリス緩衝液 ５０ｍＭ （ｐＨ７．０） α- ケトグルタル酸 ３．５ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １５ｋＵ／ｌ （Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．由来） ＥＤＴＡ・２Ｋ ２５ｍＭ ホウ酸 ０．６ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ウレアーゼ ３００Ｕ／ｌ （ナタマメ由来）
【００２７】第１表にカルシウムイオン（グルタミン酸
デヒドロゲナーゼ阻害剤）を含有する試薬Ｅとホウ酸
（ウレアーゼ阻害剤）を含有する試薬Ｆのウレアーゼ活
性とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す。
デヒドロゲナーゼ阻害剤）を含有する試薬Ｅとホウ酸
（ウレアーゼ阻害剤）を含有する試薬Ｆのウレアーゼ活
性とグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を示す。
【００２８】
【表１】 表１の結果によれば、本発明のグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ阻害剤を使用した試薬Ｅは、保存してもウレアー
ゼ活性、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少が少
なく、安定であることが判明した。
ナーゼ阻害剤を使用した試薬Ｅは、保存してもウレアー
ゼ活性、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性の減少が少
なく、安定であることが判明した。
【００２９】
【発明の効果】本発明により、高濃度の尿素窒素を含む
溶液であっても尿素窒素量を短時間に正確かつ簡単に定
量することができ、また尿素窒素測定試薬の保存安定性
を向上させることができる。
溶液であっても尿素窒素量を短時間に正確かつ簡単に定
量することができ、また尿素窒素測定試薬の保存安定性
を向上させることができる。
【図１】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としてカ
ルシウムイオンを使用した場合としない場合の３００ｍ
ｇ／ｄｌ尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。
ルシウムイオンを使用した場合としない場合の３００ｍ
ｇ／ｄｌ尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。
【図２】グルタミン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤としてマ
ンガンイオンを使用した場合としない場合の３００ｍｇ
／ｄｌ尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。
ンガンイオンを使用した場合としない場合の３００ｍｇ
／ｄｌ尿素窒素水溶液の希釈直線性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/00 - 1/66
Claims (1)
- 【請求項１】 （ａ）ウレアーゼ、（ｂ）αケトグルタ
ル酸、（ｃ）ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、（ｄ）グルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼおよび（ｅ）グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ阻害剤を含有することを特徴とする尿素窒
素測定用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00596293A JP3159274B2 (ja) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | 尿素窒素測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00596293A JP3159274B2 (ja) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | 尿素窒素測定用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209795A JPH06209795A (ja) | 1994-08-02 |
| JP3159274B2 true JP3159274B2 (ja) | 2001-04-23 |
Family
ID=11625514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00596293A Expired - Fee Related JP3159274B2 (ja) | 1993-01-18 | 1993-01-18 | 尿素窒素測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3159274B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113957121B (zh) * | 2021-10-11 | 2024-04-26 | 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) | 一种尿素测定试剂盒 |
-
1993
- 1993-01-18 JP JP00596293A patent/JP3159274B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06209795A (ja) | 1994-08-02 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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