JPH08196297A - 尿素窒素測定用組成物 - Google Patents
尿素窒素測定用組成物Info
- Publication number
- JPH08196297A JPH08196297A JP7012621A JP1262195A JPH08196297A JP H08196297 A JPH08196297 A JP H08196297A JP 7012621 A JP7012621 A JP 7012621A JP 1262195 A JP1262195 A JP 1262195A JP H08196297 A JPH08196297 A JP H08196297A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- value
- composition
- alanine dehydrogenase
- urea nitrogen
- urease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 少なくともアンモニアに対するＫｍ値が１０
ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ及び尿
素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値
の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる尿
素窒素測定用組成物。 【効果】 好適には酸性ウレアーゼ活性１に対してアラ
ニンデヒドロゲナーゼ活性１〜１０の活性比の尿素窒素
測定用組成物の調製を可能となし、かつ高濃度の尿素窒
素を含む溶液であっても尿素窒素を短時間に正確かつ簡
便に定量することが可能で、長期保存安定性に非常に優
れた尿素窒素測定試薬を提供することができる。
ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ及び尿
素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値
の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる尿
素窒素測定用組成物。 【効果】 好適には酸性ウレアーゼ活性１に対してアラ
ニンデヒドロゲナーゼ活性１〜１０の活性比の尿素窒素
測定用組成物の調製を可能となし、かつ高濃度の尿素窒
素を含む溶液であっても尿素窒素を短時間に正確かつ簡
便に定量することが可能で、長期保存安定性に非常に優
れた尿素窒素測定試薬を提供することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンモニアに対するＫ
ｍ値が１０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナ
ーゼと尿素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼ
の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる尿
素窒素測定用組成物、更に詳しくは生体体液、特に血清
または尿中の尿素窒素測定用組成物に関する。
ｍ値が１０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナ
ーゼと尿素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼ
の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる尿
素窒素測定用組成物、更に詳しくは生体体液、特に血清
または尿中の尿素窒素測定用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体体液などの検体、例えば血清または
尿中の尿素窒素は、種々の腎機能障害および肝実質障害
時の指標としてきわめて重要な意義を持つ。尿素窒素の
測定にウレアーゼとアラニンデヒドロゲナーゼを用いる
方法は知られている（特開昭６３−３１５９３４号公
報）。この公知方法におけるアラニンデヒドロゲナーゼ
は、一般に至適ｐＨが９〜１０付近にあることから、ウ
レアーゼとしてｐＨ８付近にて作用せしめる必要があっ
た。かつ従来用いられているウレアーゼ、アラニンデヒ
ドロゲナーゼは熱安定性及び保存安定性が十分でなく、
また両酵素のＫｍ値の差が十分に大きくないため、高濃
度の尿素に対して反応速度法（レートアッセイ）におけ
る高値直線性が不良となるという問題点があり臨床診断
の分野における使用は困難であった。
尿中の尿素窒素は、種々の腎機能障害および肝実質障害
時の指標としてきわめて重要な意義を持つ。尿素窒素の
測定にウレアーゼとアラニンデヒドロゲナーゼを用いる
方法は知られている（特開昭６３−３１５９３４号公
報）。この公知方法におけるアラニンデヒドロゲナーゼ
は、一般に至適ｐＨが９〜１０付近にあることから、ウ
レアーゼとしてｐＨ８付近にて作用せしめる必要があっ
た。かつ従来用いられているウレアーゼ、アラニンデヒ
ドロゲナーゼは熱安定性及び保存安定性が十分でなく、
また両酵素のＫｍ値の差が十分に大きくないため、高濃
度の尿素に対して反応速度法（レートアッセイ）におけ
る高値直線性が不良となるという問題点があり臨床診断
の分野における使用は困難であった。
【０００３】また従来より尿素窒素の定量法として用い
られているウレアーゼ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
法では、ウレアーゼの拮抗阻害物質であるヒドロキシウ
レア（クリニカルケミストリ−、２５巻、１７２１頁、
１９７９年）、ホウ酸（特公平３−６５１６０号公
報）、アセトヒドロキサム酸（特開平２−２５５０９９
号公報）を使用、あるいはグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの阻害物質であるカルシウムイオンやマンガンイオン
等の重金属イオン（特開平６−２０９７９５号公報）を
使用してＫｍ値を調節し尿素窒素の測定範囲を広げると
いう方法が報告されている。しかし、ウレアーゼ阻害物
質を用いて調製した尿素窒素測定用試薬では、試薬、特
にウレアーゼの保存安定性が十分でなく、保存に伴い感
度が著しく低下し、安定な試薬の調製が困難であった。
られているウレアーゼ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
法では、ウレアーゼの拮抗阻害物質であるヒドロキシウ
レア（クリニカルケミストリ−、２５巻、１７２１頁、
１９７９年）、ホウ酸（特公平３−６５１６０号公
報）、アセトヒドロキサム酸（特開平２−２５５０９９
号公報）を使用、あるいはグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの阻害物質であるカルシウムイオンやマンガンイオン
等の重金属イオン（特開平６−２０９７９５号公報）を
使用してＫｍ値を調節し尿素窒素の測定範囲を広げると
いう方法が報告されている。しかし、ウレアーゼ阻害物
質を用いて調製した尿素窒素測定用試薬では、試薬、特
にウレアーゼの保存安定性が十分でなく、保存に伴い感
度が著しく低下し、安定な試薬の調製が困難であった。
【０００４】また、このようなウレアーゼ阻害剤を用い
た組成物では、一般に用いるウレアーゼ活性に比べてア
ラニンデヒドロゲナーゼやグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの活性として１０〜２０倍程度の大量を用いなければ
ならないとの欠点があった。さらに試薬中の成分数を増
やすことは不安定化因子を増やす可能性を含んでおり、
経済的にみても少量の酵素量や必要最低限度の成分数で
試薬を構成することが望ましい。
た組成物では、一般に用いるウレアーゼ活性に比べてア
ラニンデヒドロゲナーゼやグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの活性として１０〜２０倍程度の大量を用いなければ
ならないとの欠点があった。さらに試薬中の成分数を増
やすことは不安定化因子を増やす可能性を含んでおり、
経済的にみても少量の酵素量や必要最低限度の成分数で
試薬を構成することが望ましい。
【０００５】一般に臨床診断用酵素含有組成物は凍結乾
燥品や凍結品、液状品として流通されている。このうち
凍結乾燥品については凍結乾燥品としての保存安定性に
は優れているものの溶解時における容量誤差や活性変
動、操作の煩雑さが問題となる。また溶解後の安定性が
低く１日〜２日の使用に限られる。これに対し液状品や
凍結品は溶解液（通常は水系溶媒）に溶かす必要がない
ため操作が簡便であり、溶解時の誤差がなく溶解過程に
おける酵素活性の変動もない。凍結品の場合は使用に際
して解凍操作が必要であるのに対し、液状品は、新たに
調製することなく、そのまま使用することができるため
臨床生化学検査分野でもその比率が高まりつつある。
燥品や凍結品、液状品として流通されている。このうち
凍結乾燥品については凍結乾燥品としての保存安定性に
は優れているものの溶解時における容量誤差や活性変
動、操作の煩雑さが問題となる。また溶解後の安定性が
低く１日〜２日の使用に限られる。これに対し液状品や
凍結品は溶解液（通常は水系溶媒）に溶かす必要がない
ため操作が簡便であり、溶解時の誤差がなく溶解過程に
おける酵素活性の変動もない。凍結品の場合は使用に際
して解凍操作が必要であるのに対し、液状品は、新たに
調製することなく、そのまま使用することができるため
臨床生化学検査分野でもその比率が高まりつつある。
【０００６】従来ナタマメ由来のウレアーゼが工業的に
生産され、臨床検査試薬として広く利用されている。し
かし、欠点として精製されてない状態では十分に保存安
定であるのに対し、精製された状態では安定性が著しく
減少する点が挙げられている。特に尿素窒素測定試薬に
は高度に精製されたウレアーゼが必要となるが、この不
十分な安定性のために安定な試薬組成物としての供給は
非常に困難である。更に室温または溶液状態で貯蔵する
となお著しく活性損失が起きる。
生産され、臨床検査試薬として広く利用されている。し
かし、欠点として精製されてない状態では十分に保存安
定であるのに対し、精製された状態では安定性が著しく
減少する点が挙げられている。特に尿素窒素測定試薬に
は高度に精製されたウレアーゼが必要となるが、この不
十分な安定性のために安定な試薬組成物としての供給は
非常に困難である。更に室温または溶液状態で貯蔵する
となお著しく活性損失が起きる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は高濃度
の尿素を含む生体体液などの検体についても正確かつ高
感度に測定することが可能で、更に保存安定性に優れ実
用性に富む尿素窒素の酵素的測定用組成物を提供するこ
とである。
の尿素を含む生体体液などの検体についても正確かつ高
感度に測定することが可能で、更に保存安定性に優れ実
用性に富む尿素窒素の酵素的測定用組成物を提供するこ
とである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記事情
に鑑み鋭意検討したところアンモニアに対するＫｍ値が
１０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ
と、そのＫｍ値に対して１／１０以下のＫｍ値を有し、
かつ酸性領域に至適ｐＨを有する酸性ウレアーゼを組み
合わせることにより、特に阻害剤等を一切必要とせずに
高濃度領域の尿素窒素の測定を高精度に行うことが可能
となり、更に驚くべきことに酸性ウレアーゼを用いたも
のであるにもかかわらずｐＨ７〜９においても良好に測
定を行い得るもので、更にまた長期保存安定性に優れる
という従来予想し得なかった性能を有する尿素窒素測定
用組成物が得られることを見い出した。
に鑑み鋭意検討したところアンモニアに対するＫｍ値が
１０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ
と、そのＫｍ値に対して１／１０以下のＫｍ値を有し、
かつ酸性領域に至適ｐＨを有する酸性ウレアーゼを組み
合わせることにより、特に阻害剤等を一切必要とせずに
高濃度領域の尿素窒素の測定を高精度に行うことが可能
となり、更に驚くべきことに酸性ウレアーゼを用いたも
のであるにもかかわらずｐＨ７〜９においても良好に測
定を行い得るもので、更にまた長期保存安定性に優れる
という従来予想し得なかった性能を有する尿素窒素測定
用組成物が得られることを見い出した。
【０００９】本発明は上記の知見に基づいて完成された
ものであり、少なくともアンモニアに対するＫｍ値が１
０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ及び
尿素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ
値の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる
尿素窒素測定用組成物である。本発明に用いるアラニン
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１）としてはア
ンモニアに対するＫｍ値が１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好まし
くは１０ｍＭ〜３０ｍＭであり、さらに好ましくは１０
ｍＭ〜２５ｍＭの酵素であれば何らその起源を限定する
ものではない。さらにこのアラニンデヒドロゲナーゼと
しては、例えば２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中、６５℃１５分間の熱安定性において１００％残
存活性を有するものであれば好ましい。例えば微生物由
来のものが用いられ最適にはスポロラクトバチルス（Ｓ
ｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（特
開平２−９２２８０号公報）が用いられ、さらに本発明
においては尿素窒素測定に当たって悪影響を及ぼさない
範囲でのＫｍ値を多少逸脱するアラニンデヒドロゲナー
ゼであっても本発明に使用できる限り本発明に包含され
るものである。
ものであり、少なくともアンモニアに対するＫｍ値が１
０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ及び
尿素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ
値の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してなる
尿素窒素測定用組成物である。本発明に用いるアラニン
デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．４．１．１）としてはア
ンモニアに対するＫｍ値が１０ｍＭ〜５０ｍＭ、好まし
くは１０ｍＭ〜３０ｍＭであり、さらに好ましくは１０
ｍＭ〜２５ｍＭの酵素であれば何らその起源を限定する
ものではない。さらにこのアラニンデヒドロゲナーゼと
しては、例えば２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中、６５℃１５分間の熱安定性において１００％残
存活性を有するものであれば好ましい。例えば微生物由
来のものが用いられ最適にはスポロラクトバチルス（Ｓ
ｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のもの（特
開平２−９２２８０号公報）が用いられ、さらに本発明
においては尿素窒素測定に当たって悪影響を及ぼさない
範囲でのＫｍ値を多少逸脱するアラニンデヒドロゲナー
ゼであっても本発明に使用できる限り本発明に包含され
るものである。
【００１０】本発明に用いる尿素に対するＫｍ値がアラ
ニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値の１／１０以下である酸
性ウレアーゼ（ＥＣ ３．５．１．５）としては、酸性
領域に至適ｐＨを有しており、尿素に対するＫｍ値が、
例えばアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値上限５０ｍＭ
に照らして５ｍＭ以下であり、またＫｍ値下限１０ｍＭ
に照らして１ｍＭ以下であることを意味するもので、好
ましくは５ｍＭ以下、好適には１ｍＭ以下であり、さら
に最適には０．０５ｍＭ〜１ｍＭ、より最適には０．１
ｍＭ〜１ｍＭの酵素であれば何らその起源を限定するも
のではない。
ニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値の１／１０以下である酸
性ウレアーゼ（ＥＣ ３．５．１．５）としては、酸性
領域に至適ｐＨを有しており、尿素に対するＫｍ値が、
例えばアラニンデヒドロゲナーゼのＫｍ値上限５０ｍＭ
に照らして５ｍＭ以下であり、またＫｍ値下限１０ｍＭ
に照らして１ｍＭ以下であることを意味するもので、好
ましくは５ｍＭ以下、好適には１ｍＭ以下であり、さら
に最適には０．０５ｍＭ〜１ｍＭ、より最適には０．１
ｍＭ〜１ｍＭの酵素であれば何らその起源を限定するも
のではない。
【００１１】さらにこの酸性ウレアーゼとしては、例え
ば１０ｍＭＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ７．５）中７０℃１５
分間の熱安定性において１００％残存活性を有するもの
であれば好ましい。例えば微生物由来のものが用いられ
最適にはラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）由来のもの
（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
７，３７９（１９７９）、特開昭６３−１９６２８９号
公報、特開平１−２４０１８７号公報）が使用される。
ば１０ｍＭＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘ
ｙｅｔｈｙｌ）−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｓｕｌｆｏ
ｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ７．５）中７０℃１５
分間の熱安定性において１００％残存活性を有するもの
であれば好ましい。例えば微生物由来のものが用いられ
最適にはラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏ
ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）由来のもの
（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３
７，３７９（１９７９）、特開昭６３−１９６２８９号
公報、特開平１−２４０１８７号公報）が使用される。
【００１２】本発明の尿素窒素測定用組成物のｐＨは緩
衝液により例えばｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７〜
ｐＨ８に保たれているのが望ましい。緩衝液は如何なる
ものでも良く、例えばＧＯＯＤ緩衝液、トリエタノール
アミン緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。本発明の尿
素窒素測定用組成物は必要により界面活性剤、防腐剤、
活性化剤、安定化剤等を加えても良い。防腐剤として
は、アジ化ナトリウム、キレート剤、抗生物質が好適に
用いられる。活性化剤としては塩化ナトリウムが好適に
用いられる。安定化剤としては、牛血清アルブミンが好
適に用いられる。
衝液により例えばｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７〜
ｐＨ８に保たれているのが望ましい。緩衝液は如何なる
ものでも良く、例えばＧＯＯＤ緩衝液、トリエタノール
アミン緩衝液、トリス緩衝液が挙げられる。本発明の尿
素窒素測定用組成物は必要により界面活性剤、防腐剤、
活性化剤、安定化剤等を加えても良い。防腐剤として
は、アジ化ナトリウム、キレート剤、抗生物質が好適に
用いられる。活性化剤としては塩化ナトリウムが好適に
用いられる。安定化剤としては、牛血清アルブミンが好
適に用いられる。
【００１３】試薬構成としては、検体中に存在する内因
性の遊離アンモニアを予めアンモニア消去系の酵素、例
えばアンモニアをアミン供与体として反応し得るアラニ
ンデヒドロゲナーゼやグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
あるいはその固定化カラムなどを用いて消去した後に本
発明の尿素窒素測定用組成物による測定を行うのが望ま
しい。
性の遊離アンモニアを予めアンモニア消去系の酵素、例
えばアンモニアをアミン供与体として反応し得るアラニ
ンデヒドロゲナーゼやグルタミン酸デヒドロゲナーゼ、
あるいはその固定化カラムなどを用いて消去した後に本
発明の尿素窒素測定用組成物による測定を行うのが望ま
しい。
【００１４】本発明に用いられる酸性ウレアーゼの濃度
は０．５Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５
Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。本発明
に用いられるアラニンデヒドロゲナーゼの濃度は０．０
１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１Ｕ／ｍ
ｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。アラニンデヒド
ロゲナーゼの基質であるピルビン酸の濃度は、０．１ｍ
Ｍ〜２００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの
範囲で用いられる。アラニンデヒドロゲナーゼの補酵素
である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）またはその誘導体、好適にはＮＡＤＨ、チ
オ−ＮＡＤＨの濃度は０．１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは
０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で用いられる。また必要に応
じて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）阻害剤、例えばオ
キザミン酸、シュウ酸等を１０ｍＭ〜７０ｍＭ添加する
と血清中ＬＤＨの影響を受けない。
は０．５Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５
Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。本発明
に用いられるアラニンデヒドロゲナーゼの濃度は０．０
１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．１Ｕ／ｍ
ｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲で用いられる。アラニンデヒド
ロゲナーゼの基質であるピルビン酸の濃度は、０．１ｍ
Ｍ〜２００ｍＭ、好ましくは０．１ｍＭ〜１００ｍＭの
範囲で用いられる。アラニンデヒドロゲナーゼの補酵素
である還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）またはその誘導体、好適にはＮＡＤＨ、チ
オ−ＮＡＤＨの濃度は０．１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは
０．１ｍＭ〜１ｍＭの範囲で用いられる。また必要に応
じて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）阻害剤、例えばオ
キザミン酸、シュウ酸等を１０ｍＭ〜７０ｍＭ添加する
と血清中ＬＤＨの影響を受けない。
【００１５】本発明における尿素窒素測定用組成物を用
いて尿素窒素を測定する方法は、前記のごとく検体、例
えば１μｌ〜５０μｌを少なくとも酸性ウレアーゼとア
ラニンデヒドロゲナーゼを含有する一試薬系尿素窒素測
定用組成物、例えば１００μｌ〜６００μｌと反応させ
るか、または少なくともアラニンデヒドロゲナーゼ、基
質であるピルビン酸および還元型補酵素含有試薬５０μ
ｌ〜３００μｌを検体と反応せしめて内因性遊離アンモ
ニアを消去処理した後少なくとも酸性ウレアーゼ含有試
薬５０μｌ〜３００μｌを加えてアラニンデヒドロゲナ
ーゼと酸性ウレアーゼとを作用せしめて反応せしめる二
試薬系にて反応させ、次いで反応において消費される還
元型の補酵素の量を公知手段、例えばＮＡＤＨを紫外部
の吸光度の減少で測定する方法が簡便である。
いて尿素窒素を測定する方法は、前記のごとく検体、例
えば１μｌ〜５０μｌを少なくとも酸性ウレアーゼとア
ラニンデヒドロゲナーゼを含有する一試薬系尿素窒素測
定用組成物、例えば１００μｌ〜６００μｌと反応させ
るか、または少なくともアラニンデヒドロゲナーゼ、基
質であるピルビン酸および還元型補酵素含有試薬５０μ
ｌ〜３００μｌを検体と反応せしめて内因性遊離アンモ
ニアを消去処理した後少なくとも酸性ウレアーゼ含有試
薬５０μｌ〜３００μｌを加えてアラニンデヒドロゲナ
ーゼと酸性ウレアーゼとを作用せしめて反応せしめる二
試薬系にて反応させ、次いで反応において消費される還
元型の補酵素の量を公知手段、例えばＮＡＤＨを紫外部
の吸光度の減少で測定する方法が簡便である。
【００１６】本発明の組成物を用いて測定する条件とし
ては、特に厳密に規制されるものではないが、反応温度
は酵素活性の発現する温度約２０℃〜４０℃の間で行え
ばよく、３７℃が好適に用いられる。測定波長としては
ＮＡＤＨの場合は３４０ｎｍ付近で測定されることが望
ましい。このような尿素窒素測定用組成物において、検
体の尿素窒素測定に当たって一検体（一テスト）当り、
アラニンデヒドロゲナーゼ濃度が好ましくは０．１Ｕ／
ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲であり、酸性ウレアーゼ濃度
が最適には０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの範囲であり、
酸性ウレアーゼ活性１に対してアラニンデヒドロゲナー
ゼ活性１〜１０の比率からなる組成物として調製して用
いることが最適であり、検体中尿素窒素が１０ｍｇ／ｄ
ｌ以下の低濃度範囲から３００ｍｇ／ｄｌ以上の高濃度
範囲まで直線性をもって良好に定量し得るものである。
ては、特に厳密に規制されるものではないが、反応温度
は酵素活性の発現する温度約２０℃〜４０℃の間で行え
ばよく、３７℃が好適に用いられる。測定波長としては
ＮＡＤＨの場合は３４０ｎｍ付近で測定されることが望
ましい。このような尿素窒素測定用組成物において、検
体の尿素窒素測定に当たって一検体（一テスト）当り、
アラニンデヒドロゲナーゼ濃度が好ましくは０．１Ｕ／
ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲であり、酸性ウレアーゼ濃度
が最適には０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌの範囲であり、
酸性ウレアーゼ活性１に対してアラニンデヒドロゲナー
ゼ活性１〜１０の比率からなる組成物として調製して用
いることが最適であり、検体中尿素窒素が１０ｍｇ／ｄ
ｌ以下の低濃度範囲から３００ｍｇ／ｄｌ以上の高濃度
範囲まで直線性をもって良好に定量し得るものである。
【００１７】上記の如くの組成物は凍結品、凍結乾燥品
として溶解液を組み合わせてもよいが、保存安定性に非
常に優れているため簡便性を考慮して近年主流に成りつ
つある液状品として調製されるのが最も好ましい。
として溶解液を組み合わせてもよいが、保存安定性に非
常に優れているため簡便性を考慮して近年主流に成りつ
つある液状品として調製されるのが最も好ましい。
【００１８】
【実施例】以下、実施例を示してこの発明を更に詳細か
つ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限定
されるものではない。
つ具体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限定
されるものではない。
【００１９】
【実施例１】酸性ウレアーゼ溶液（ラクトバチルス・フ
ァーメンタム由来：尿素に対するＫｍ値０．５ｍＭ±
０．２ｍＭ）１Ｕ／ｍｌを１０ｍＭＢＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）で調製し、１５分間加熱処理後その残存活性を
下記の試薬を用いて測定した結果、図１に示す結果が得
られた。酵素活性は少なくとも７０℃までは安定であっ
た。
ァーメンタム由来：尿素に対するＫｍ値０．５ｍＭ±
０．２ｍＭ）１Ｕ／ｍｌを１０ｍＭＢＥＳ緩衝液（ｐＨ
７．５）で調製し、１５分間加熱処理後その残存活性を
下記の試薬を用いて測定した結果、図１に示す結果が得
られた。酵素活性は少なくとも７０℃までは安定であっ
た。
【００２０】 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ α−ケトグルタル酸 １０ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ 尿素 １０ｍＭ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ ３０Ｕ／ｍｌ （プロテウス・エスピー（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．）由来） なお、上記組成物において、１分間に１μｍｏｌの尿素
を加水分解する酵素活性を１Ｕとした。
を加水分解する酵素活性を１Ｕとした。
【００２１】
【実施例２】アラニンデヒドロゲナーゼ溶液（スポロラ
クトバチルス由来：アンモニアに対するＫｍ値２０ｍＭ
±５ｍＭ）１Ｕ／ｍｌを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で調製し、１５分間加熱処理後その残存
活性を下記の試薬を用いて測定した結果、図２に示す結
果が得られた。酵素活性は少なくとも６５℃までは安定
であった。
クトバチルス由来：アンモニアに対するＫｍ値２０ｍＭ
±５ｍＭ）１Ｕ／ｍｌを２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）で調製し、１５分間加熱処理後その残存
活性を下記の試薬を用いて測定した結果、図２に示す結
果が得られた。酵素活性は少なくとも６５℃までは安定
であった。
【００２２】 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 塩化アンモニウム ２００ｍＭ なお、上記組成物において、ＮＡＤＨの存在下、１分間
に１μｍｏｌのピルビン酸をアラニンとなす酵素活性を
１Ｕとした。
に１μｍｏｌのピルビン酸をアラニンとなす酵素活性を
１Ｕとした。
【００２３】
【実施例３】被検体中の尿素窒素濃度を次の組成を有す
る試薬を用いて下記方法により測定した。 測定方法 尿素窒素水溶液３００ｍｇ／ｍｌの１０段階希釈液を試
料とし、各５μｌを採取し、これに試薬１を１５０μｌ
加え、３７℃５分間加温した後、更に試薬２を１００μ
ｌ加えて、単位時間当たりの吸光度変化を３４０ｎｍに
て測定した。尚ブランクは尿素窒素含有被検液の代わり
に蒸留水を用いた。
る試薬を用いて下記方法により測定した。 測定方法 尿素窒素水溶液３００ｍｇ／ｍｌの１０段階希釈液を試
料とし、各５μｌを採取し、これに試薬１を１５０μｌ
加え、３７℃５分間加温した後、更に試薬２を１００μ
ｌ加えて、単位時間当たりの吸光度変化を３４０ｎｍに
て測定した。尚ブランクは尿素窒素含有被検液の代わり
に蒸留水を用いた。
【００２４】 試薬１ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ アラニンデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ （スポロラクトバチルス由来） 試薬２ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ 牛血清アルブミン ０．１％ 酸性ウレアーゼ ２Ｕ／ｍｌ （ラクトバチルス・ファーメンタム由来）
【００２５】
【比較例】前記試薬１中のアラニンデヒドロゲナーゼの
代わりにバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼ、試薬２中の酸性ウレア
ーゼの代わりにナタマメ由来のウレアーゼを用いて試薬
を調製し、同様の操作を行った。
代わりにバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由
来のアラニンデヒドロゲナーゼ、試薬２中の酸性ウレア
ーゼの代わりにナタマメ由来のウレアーゼを用いて試薬
を調製し、同様の操作を行った。
【００２６】以上の結果を図３に示した。図中−○−は
本発明に基づく結果であり、−●−は比較例に基づく結
果である。この図３に示す通り、本発明は極めて良好な
直線性を示すものでレートアッセイに有効であることが
判明し、またこの結果からも１０ｍｇ／ｄｌの低濃度範
囲でも良好に定量し得たことは明らかであった。さらに
上記測定から、アラニンデヒドロゲナーゼの使用可能な
Ｋｍ値は１０ｍＭ〜５０ｍＭ、酸性ウレアーゼのＫｍ値
は０．０５ｍＭ〜５ｍＭの範囲であれば良好に本発明を
達成し得るものである。
本発明に基づく結果であり、−●−は比較例に基づく結
果である。この図３に示す通り、本発明は極めて良好な
直線性を示すものでレートアッセイに有効であることが
判明し、またこの結果からも１０ｍｇ／ｄｌの低濃度範
囲でも良好に定量し得たことは明らかであった。さらに
上記測定から、アラニンデヒドロゲナーゼの使用可能な
Ｋｍ値は１０ｍＭ〜５０ｍＭ、酸性ウレアーゼのＫｍ値
は０．０５ｍＭ〜５ｍＭの範囲であれば良好に本発明を
達成し得るものである。
【００２７】
【実施例４】次の組成を有する試薬を調製し、冷蔵保存
（４℃、１カ月間）した後、酸性ウレアーゼ活性とアラ
ニンデヒドロゲナーゼ活性をそれぞれ実施例１、２に示
した試薬を用いて測定した。各酵素活性は調製直後の値
を１００として比較した。 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ アラニンデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ （スポロラクトバチルス由来） 牛血清アルブミン ０．１％ アジ化ナトリウム ０．０３％ 酸性ウレアーゼ ２Ｕ／ｍｌ （ラクトバチルス・ファーメンタム由来）
（４℃、１カ月間）した後、酸性ウレアーゼ活性とアラ
ニンデヒドロゲナーゼ活性をそれぞれ実施例１、２に示
した試薬を用いて測定した。各酵素活性は調製直後の値
を１００として比較した。 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ アラニンデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ （スポロラクトバチルス由来） 牛血清アルブミン ０．１％ アジ化ナトリウム ０．０３％ 酸性ウレアーゼ ２Ｕ／ｍｌ （ラクトバチルス・ファーメンタム由来）
【００２８】
【比較例】前記試薬の酸性ウレアーゼの代わりにナタマ
メ由来のウレアーゼを用いて試薬を調製し同様の操作を
行った。以上の本発明の組成物及び比較例の組成物の残
存活性を表１に示した。
メ由来のウレアーゼを用いて試薬を調製し同様の操作を
行った。以上の本発明の組成物及び比較例の組成物の残
存活性を表１に示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】表１に示した通り本発明の組成物中の酵素
活性は冷蔵１カ月後でもほとんど低下しておらず、極め
て高い保存安定性を示すことが判明した。
活性は冷蔵１カ月後でもほとんど低下しておらず、極め
て高い保存安定性を示すことが判明した。
【００３１】
【実施例５】次の組成を有する試薬を調製し、３７℃、
３カ月間保存した後、尿素窒素として５０ｍｇ／ｄｌの
標準試料を用いて保存後の酵素的反応性について定量測
定を行った。なお、算出に当たって、調製直後の値を１
００％として比較した。 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ アラニンデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ （スポロラクトバチルス由来） 牛血清アルブミン ０．１％ アジ化ナトリウム ０．０３％ 酸性ウレアーゼ ２Ｕ／ｍｌ （ラクトバチルス・ファーメンタム由来） 以上の結果を表２に示した。
３カ月間保存した後、尿素窒素として５０ｍｇ／ｄｌの
標準試料を用いて保存後の酵素的反応性について定量測
定を行った。なお、算出に当たって、調製直後の値を１
００％として比較した。 試薬 ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ５０ｍＭ ピルビン酸 １０ｍＭ 塩化ナトリウム ５０ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３ｍＭ アラニンデヒドロゲナーゼ ５Ｕ／ｍｌ （スポロラクトバチルス由来） 牛血清アルブミン ０．１％ アジ化ナトリウム ０．０３％ 酸性ウレアーゼ ２Ｕ／ｍｌ （ラクトバチルス・ファーメンタム由来） 以上の結果を表２に示した。
【００３２】
【表２】
【００３３】この表２に示した通り本発明の組成物の反
応性は３カ月後でもほとんど低下しておらず、少なくと
も調製時の酵素的反応性の少なくとも９５％以上、好適
には９９％以上の反応性を保持するもので、極めて高い
保存安定性を示すことが判明した。
応性は３カ月後でもほとんど低下しておらず、少なくと
も調製時の酵素的反応性の少なくとも９５％以上、好適
には９９％以上の反応性を保持するもので、極めて高い
保存安定性を示すことが判明した。
【００３４】
【発明の効果】本発明により、好適には酸性ウレアーゼ
活性１に対してアラニンデヒドロゲナーゼ活性１〜１０
の活性比の尿素窒素測定用組成物の調製を可能となし、
かつ高濃度の尿素窒素を含む溶液であっても尿素窒素を
短時間に正確かつ簡便に定量することが可能で、長期保
存安定性に非常に優れた尿素窒素測定試薬を提供するこ
とができる。
活性１に対してアラニンデヒドロゲナーゼ活性１〜１０
の活性比の尿素窒素測定用組成物の調製を可能となし、
かつ高濃度の尿素窒素を含む溶液であっても尿素窒素を
短時間に正確かつ簡便に定量することが可能で、長期保
存安定性に非常に優れた尿素窒素測定試薬を提供するこ
とができる。
【図１】図１は、酸性ウレアーゼの熱安定性を示す。
【図２】図２は、アラニンデヒドロゲナーゼの熱安定性
を示す。
を示す。
【図３】図３は、３００ｍｇ／ｄｌ尿素窒素（１０段階
希釈）を定量測定した結果を示す。
希釈）を定量測定した結果を示す。
Claims (10)
- 【請求項１】 少なくともアンモニアに対するＫｍ値が
１０ｍＭ〜５０ｍＭであるアラニンデヒドロゲナーゼ及
び尿素に対するＫｍ値がアラニンデヒドロゲナーゼのＫ
ｍ値の１／１０以下である酸性ウレアーゼを含有してな
る尿素窒素測定用組成物。 - 【請求項２】 酸性ウレアーゼが０．０５ｍＭ〜５ｍＭ
のＫｍ値である請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 酸性ウレアーゼが０．１ｍＭ〜１ｍＭの
Ｋｍ値である請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】 酸性ウレアーゼが１０ｍＭＢＥＳ緩衝液
（ｐＨ７．５）中、７０℃１５分間の熱安定性において
残存活性として１００％有してなる請求項１記載の組成
物。 - 【請求項５】 アラニンデヒドロゲナーゼが２０ｍＭト
リス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、６５℃１５分間の
熱安定性において残存活性として１００％有してなる請
求項１記載の組成物。 - 【請求項６】 組成物が凍結乾燥、凍結、液体状組成物
である請求項１記載の組成物。 - 【請求項７】 請求項１記載の組成物においてピルビン
酸、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含
有してなる請求項１記載の組成物。 - 【請求項８】 アラニンデヒドロゲナーゼ濃度が０．０
１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌ、酸性ウレアーゼ濃度が
０．５Ｕ／ｍｌ〜５００Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸濃度が
０．１ｍＭ〜２００ｍＭ、還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド濃度が０．１ｍＭ〜５ｍＭである請求
項７記載の組成物。 - 【請求項９】 請求項８記載の組成物において、一検体
当りの尿素窒素測定に当たって、アラニンデヒドロゲナ
ーゼ濃度が０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌの範囲であ
り、酸性ウレアーゼ濃度が０．５Ｕ／ｍｌ〜５Ｕ／ｍｌ
の範囲であり、酸性ウレアーゼ活性１に対してアラニン
デヒドロゲナーゼ活性１〜１０の比率からなる組成物で
ある請求項８記載の組成物。 - 【請求項１０】 少なくとも３７℃、１カ月間の保存に
おいて、調製時の酵素的反応性の少なくとも９５％以上
を保持することを特徴とする請求項１記載の組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7012621A JPH08196297A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | 尿素窒素測定用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7012621A JPH08196297A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | 尿素窒素測定用組成物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196297A true JPH08196297A (ja) | 1996-08-06 |
Family
ID=11810456
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7012621A Withdrawn JPH08196297A (ja) | 1995-01-30 | 1995-01-30 | 尿素窒素測定用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08196297A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012503981A (ja) * | 2008-09-30 | 2012-02-16 | フレセニアス メディカル ケア ホールディングス インコーポレイテッド | 共有結合的に固定化した酵素及びその製造方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05120499A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Omron Corp | 表裏判別装置 |
| JPH05151428A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-18 | Glory Ltd | 娯楽施設におけるカード及びその利用方法 |
| JPH0583867U (ja) * | 1992-03-31 | 1993-11-12 | 長野日本無線株式会社 | 記憶カード |
-
1995
- 1995-01-30 JP JP7012621A patent/JPH08196297A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05120499A (ja) * | 1991-10-29 | 1993-05-18 | Omron Corp | 表裏判別装置 |
| JPH05151428A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-18 | Glory Ltd | 娯楽施設におけるカード及びその利用方法 |
| JPH0583867U (ja) * | 1992-03-31 | 1993-11-12 | 長野日本無線株式会社 | 記憶カード |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2012503981A (ja) * | 2008-09-30 | 2012-02-16 | フレセニアス メディカル ケア ホールディングス インコーポレイテッド | 共有結合的に固定化した酵素及びその製造方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0575610B1 (en) | Highly sensitive determination of ammonia, alpha-amino acid or alpha-keto acid and composition therefor | |
| JP3588124B2 (ja) | 補酵素還元システムにより安定化されている試薬 | |
| JPH08196297A (ja) | 尿素窒素測定用組成物 | |
| US5587296A (en) | Reagent for assaying glucose | |
| EP0089210B1 (en) | Reagent for assaying cholinsterase | |
| JPH0391494A (ja) | 分析対象濃度の酵素的測定方法 | |
| US5721111A (en) | Method for determination of urea nitrogen | |
| JP3159274B2 (ja) | 尿素窒素測定用組成物 | |
| JPH06153991A (ja) | ホスファターゼ測定試薬 | |
| EP0387697A2 (en) | Determination of aminotranferases | |
| KONDO et al. | Bacterial glucokinase as an enzymic reagent of good stability for measurement of creatine kinase activity | |
| JP3682729B2 (ja) | 尿素窒素測定用試薬 | |
| JPH0889292A (ja) | キサンチンデヒドロゲナーゼの安定化方法 | |
| JPS6342519B2 (ja) | ||
| JP3614967B2 (ja) | アンモニウムイオンの消去方法及び試料中の特定成分を定量する方法 | |
| JPH08248028A (ja) | 生理活性物質測定用液状試薬 | |
| AU710552B2 (en) | Reagent stabilized using coenzyme reduction system | |
| JPH07115997A (ja) | Ｇｐｔ測定用試薬 | |
| JP3729900B2 (ja) | 尿素窒素の定量方法 | |
| JPH09295A (ja) | アンモニア消去試薬 | |
| JPH02255098A (ja) | グアニジノ酢酸の定量法 | |
| JP6672581B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼの安定化方法 | |
| JP2980811B2 (ja) | アンモニウムイオンの定量方法 | |
| JPH0759596A (ja) | マグネシウム測定方法およびその試薬 | |
| JPH07115998A (ja) | Ｇｏｔ測定用試薬 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20020402 |