JP3682729B2 - 尿素窒素測定用試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、尿素窒素（以下、ＵＮと略称する）測定用試薬組成物に関する。更に詳しくは、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用の改良された液状試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化を図るため、凍結乾燥品にし、使用時に溶解使用するのが主流になっている。しかしながら、このような臨床検査施設では、多項目を測定し、検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になる事が多い。そのため、使用時に試薬を調製する必要のない、溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＵＮ測定用試薬に関しても例外ではなく、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
現在、よく用いられているＵＮ測定方法は、（１）検体試料をα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧと略称する）又はその塩、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略称する）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略称する）の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧｌＤＨと略称する）を作用させ、検体試料中に最初から存在する微量の内因性アンモニアを予め除去する予備工程と、（２）その反応液にウレアーゼを加え、検体試料中の尿素をアンモニアに分解し、このアンモニアの生成量に対応するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略称する〕の減少速度を測定する主工程とからなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度からＵＮ量を求めることを特徴とするＵＮ測定方法である。
【０００４】
この測定方法の主工程の基礎となる反応式を以下に示す。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
前記ＵＮ測定方法に用いられるＵＮ測定用試薬は、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する予備工程反応を実施するための第一溶液と、ウレアーゼを含有する第二溶液とから構成するのが一般的であるが、第一溶液に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨの溶液中での安定性の条件が異なるため、溶液状態で長期間安定に保存することができるＵＮ測定用試薬の開発は困難であった。
例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、アルカリ性領域で安定で、ｐＨ８．５〜１１．０が好ましく、ＧｌＤＨは、中性から弱アルカリ性領域で安定で、ｐＨ６．５〜９．５が好ましく、α−ＫＧは、広いｐＨ領域で安定であることがわかっている。そこで、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが安定で、且つＧｌＤＨも安定である条件は、弱アルカリ性からアルカリ性領域、特にｐＨ８．５〜９．５が好ましいことが予想される。しかしながら、後述する比較例に示すように、ｐＨ条件のみでは、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨの全てを十分に安定化することはできなかった。
従って、本発明の目的は、溶液中においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨを共存させた条件で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨとα−ＫＧとを共に安定化させ、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、少なくとも、（ａ）α−ケトグルタル酸又はその塩、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、（ｃ）グルタミン酸脱水素酵素、（ｄ）牛血清アルブミン、（ｅ）アデノシン−５’−三リン酸、（ｆ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする脱水素酵素、並びに（ｇ）前記脱水素酵素（ｆ）の基質を含有する第一試薬と、少なくとも、（ｈ）ウレアーゼを含有する第二試薬とからなり、それぞれ液状試薬であることを特徴とする尿素窒素測定用試薬に関する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
第一試薬に含まれるα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）又はその塩は、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、更に好ましくは、１．０〜１０ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ未満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなる。用いることのできるα−ＫＧの塩は、グルタミン酸脱水素酵素の基質となるものである限り特に限定されないが、例えば、アルカリ金属（特にナトリウム、カリウム）との塩を用いるのが好ましい。
【０００８】
第一試薬に含まれるグルタミン酸脱水素酵素（ＧｌＤＨ）は、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは、１０〜５０Ｕ／ｍｌの濃度の範囲で用いる。１Ｕ／ｍｌ未満だと反応速度が遅くなり、１００Ｕ／ｍｌを越えると、プロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがある。
用いることのできるＧｌＤＨは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモニアを基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）に属する微生物由来のＧｌＤＨを好適に使用することができる。
【０００９】
第一試薬に含まれる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、好ましくは０．１〜１．０ｍＭ、更に好ましくは、０．２〜０．５ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ未満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、１．０ｍＭを越えると吸光度が分光光度計の限界を越える。ＮＡＤＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＨを用い、ＮＡＤＰＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＰＨを用い、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを両方共に補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを用いる。
【００１０】
第一試薬に、少なくとも一方、又は両方同時に含まれる牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）及びアデノシン−５’−三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）は、ＧｌＤＨを安定化させる作用がある。それぞれ単独でも安定化作用があり、ＢＳＡとＡＴＰとを共存させると相加的な効果を得ることができる。ＢＳＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１重量％〜１．０重量％の範囲で用いることができる。０．０１重量％未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、１．０重量％を越えると試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことがある。ＡＴＰを単独で用いる場合は、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で用いることができる。０．１ｍＭ未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。ＢＳＡとＡＴＰとを共存させる場合には、好ましくはＢＳＡ０．００５重量％以上とＡＴＰ０．０５ｍＭ以上、更に好ましくはＢＳＡ０．０５％〜１．０重量％とＡＴＰ０．２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で用いることができる。ＢＳＡが０．００５重量％未満でＡＴＰが０．０５ｍＭ未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、ＢＳＡが１．０重量％を越え、ＡＴＰが５０ｍＭを越えると、試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことや、溶解性が悪くなることがある。
【００１１】
第一試薬に含まれる緩衝液は、特に限定されないが、ｐＨ８．５〜９．５の範囲の任意の緩衝液を、測定条件に応じて選択することが可能である。例えば、トリエタノールアミン若しくはその塩酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、又はグッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えば、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ）等の緩衝液を用いることが可能であり、特に、トリエタノールアミン塩酸塩が好ましい。
【００１２】
また、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称する）又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと略称する）を補酵素とする脱水素酵素及びその基質の組合せを第一試薬に含ませることにより、保存期間中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑えることができる。それらの組合せは特に限定されないが、例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略称する）及びグルコース−６−リン酸（以下、Ｇ６Ｐと略称する）又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、バリウム塩）、イソクエン酸脱水素酵素（以下、ＩＣＤＨと略称する）及びイソクエン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、又はＧｌＤＨ及びＬ−グルタミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩）を用いることができる。
ＮＡＤ又はＮＡＤＰ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）と略称する〕を補酵素とする脱水素酵素が、金属イオン等の補因子を必要とする場合、適当な補因子を加えることが好ましい。例えば、ＩＣＤＨ及びイソクエン酸又はその塩を用いる場合、マグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオンを加えることが好ましい。
【００１３】
ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素及び基質は、微量でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑制することができる。例えば、Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐ又はその塩を用いる場合、Ｇ６ＰＤＨ活性は、０．００１Ｕ／ｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．０１Ｕ／ｌ〜１．０Ｕ／ｌが好ましい。Ｇ６Ｐ又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果があり、特に０．１ｍＭ〜１０ｍＭが好ましい。Ｇ６ＰＤＨ活性が１．０Ｕ／ｌを越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによりアンモニア生成させ、アンモニアの生成速度に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。Ｇ６Ｐが１０ｍＭを越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによりアンモニア生成させ、アンモニアの生成速度に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。なお、Ｇ６ＰＤＨとしては、Ｇ６Ｐ又はその塩を基質とし、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするものである限り特に限定されないが、例えば、酵母（ｙｅａｓｔ）、ロイコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＧ６ＰＤＨを好適に使用することができる。
【００１４】
ＩＣＤＨ、マグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオン及びイソクエン酸又はその塩を用いる場合、ＩＣＤＨ活性は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌが好ましい。金属イオンとして塩化マグネシウムを用いる場合、０．１ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。イソクエン酸又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。ＩＣＤＨ活性が１００Ｕ／ｌを越えるとプロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがあり、塩化マグネシウムが５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがあり、イソクエン酸又はその塩が５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。
ＩＣＤＨ活性が高くなると、ＵＮ反応時のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。この場合、第２試薬にＩＣＤＨの活性が無くなるように阻害剤を添加することができる。ＩＣＤＨ阻害剤としては、具体的には、キレート剤（特開昭６２−６６９９号公報）、胆汁酸又はその塩類（特開平６−７１６２号公報）を添加することができる。なお、ＩＣＤＨとしては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、イソクエン酸又はその塩を基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、ウシ心臓等の動物組織や酵母由来のＩＣＤＨを好適に使用することができる。
【００１５】
ＧｌＤＨ及びＬ−グルタミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）を用いる場合、ＧｌＤＨ活性は、０．１Ｕ／ｍｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に１．０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌが好ましい。Ｌ−グルタミン酸又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。ＧｌＤＨ活性が１００Ｕ／ｌを越えるとプロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがあり、Ｌ−グルタミン酸又はその塩が５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。なお、ＧｌＤＨとしては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモニアを基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）に属する微生物を好適に使用することができる。
【００１６】
ウレアーゼを含有する第二試薬のｐＨは、中性が好ましく、特にｐＨ６．０〜８．０が好ましい。ｐＨが６．０未満や８．０より大きいと、ウレアーゼの安定性は良くない。ウレアーゼ濃度は、好ましくは０．１〜５．０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２．０Ｕ／ｍｌの範囲で用いることができる。なお、ウレアーゼとしては、尿素を加水分解し、アンモニアを生成するものである限り特に限定されないが、ナタマメやバクテリア由来のものを用いることができる。
また、必要に応じて、アセトヒドロキサム酸（以下、ＡＨＡと略称する）（特公平２−２５５０９号公報）やＢＳＡを共存させてウレアーゼを更に安定化することができる。ＡＨＡやＢＳＡはそれぞれ単独でも安定化作用があり、ＡＨＡとＢＳＡとを共存させると相加的な効果を得ることができる。ＡＨＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、更に好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲で用いることができる。０．０１ｍＭ未満だとウレアーゼを安定化する効果が不十分になることがあり、１０ｍＭを越えるとウレアーゼの必要量が増え、コストの面で好ましくない。ＢＳＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１〜１重量％の範囲で用いることができる。０．０１重量％未満だとウレアーゼを安定化する効果が不十分になることがあり、１重量％を越えると試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことや、溶解性が悪くなることがある。更に、ＡＨＡとＢＳＡとを共存させる場合においても、至適量はそれぞれ単独で用いる場合と同じ量であり、至適量からはずれたときの問題も同様に起こる。
【００１７】
本発明の尿素窒素測定用試薬は、尿素をウレアーゼによってアンモニアに分解し、α−ケトグルタル酸又はその塩及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の減少量を測定することからなる尿素窒素測定法の測定用試薬として用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＧｌＤＨ活性の残存率測定
表１に示した組成の本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬１と称する）、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬２）、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＡＴＰを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬３）、並びに表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＢＳＡを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬４）を調製し、更に、比較のために、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ、ＢＳＡ及びＡＴＰを除いた尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、比較用第一試薬１）を調製した。また、本発明の尿素窒素測定用試薬の第二試薬を表２に示した組成に従って調製した。調製後、それぞれの第一試薬及び第二試薬を溶液状態で１０℃で保存し、調製直後、更に保存開始から１月後、２月後、４月後及び６月後に、以下に示す方法により、それぞれの第一試薬に残存するＧｌＤＨ活性を測定した。
【００１９】
【表１】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．２０） ５０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３４ｍＭ
ＧｌＤＨ ２０Ｕ／ｍｌ
α−ＫＧ ５．０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ ０．１Ｕ／ｌ
Ｇ６Ｐ １．０ｍＭ
ＢＳＡ ０．２％
ＡＴＰ １．０ｍＭ
ＮａＮ3 ０．０５％
【００２０】
【表２】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．８０） ０．１Ｍ
ウレアーゼ １．３Ｕ／ｍｌ
ＡＨＡ ０．４ｍＭ
ＢＳＡ ０．２％
【００２１】
ＧｌＤＨ活性測定に用いるために、表３に示した組成の試薬Ａ及び表４に示した組成の試薬Ｂを調製した。
【００２２】
【表３】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．４ｍＭ
α−ＫＧ ５．０ｍＭ
ＥＤＴＡ２Ｎａ １．０ｍＭ
ＮａＮ3 ０．０５％
（注：ＥＤＴＡ２Ｎａは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムである）
【００２３】
【表４】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ
塩化アンモニウム ５．０ｍＭ
【００２４】
前記の試薬Ａ３２０μｌに、前記の第一試薬２μｌを加え、３７℃で５分間加温した後、更に前記の試薬Ｂ８０μｌを加えて、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定し、ＧｌＤＨ活性を求めた。調製直後の吸光度変化を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後のＧｌＤＨ活性の残存率（％）を表５に示す。比較用第一試薬では、６月後にＧｌＤＨ活性が半分にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、ＧｌＤＨ活性の残存率ははるかに高かった。
【００２５】
【表５】
【００２６】
実施例２：ＮＡＤＰＨの残存率測定
前記実施例１で調製したそれぞれの第一試薬について、３４０ｎｍの吸光度を測定し、ＮＡＤＰＨの残存量を求めた。調製直後の吸光度を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後のＮＡＤＰＨの残存率（％）を表６に示す。比較用第一試薬では、６月後にＮＡＤＰＨ残存量が６７％にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、ＮＡＤＰＨの残存率は高かった。
【００２７】
【表６】
【００２８】
実施例３：ＵＮ量測定値の残存率
尿素窒素量が１５０ｍｇ／ｄｌである尿素水溶液を調製し、被検試料として用いた。被験試料４μｌと前記実施例１で調製した第一試薬３２０μｌとを攪拌混合し、３７℃で５分間加温した後、前記実施例１で調製した第二試薬８０μｌを添加し、３７℃で撹拌混合した。第二試薬を添加して１分後から３分後の３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定した。調製直後の吸光度変化量を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後の吸光度変化量（％）を表７に示す。比較用第一試薬では、６月後に吸光度変化量は半分以下にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、吸光度変化量ははるかに高かった。
【００２９】
【表７】
【００３０】
【発明の効果】
本発明の尿素窒素測定用試薬は、溶液状態で、長期間安定に保存することができる。すなわち、本発明によれば、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び／又はアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を添加することにより、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを同時に液状で長期間安定に保存することができる。また、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ〔ＮＡＤ（Ｐ）〕を補酵素とする脱水素酵素及びその基質を、更に添加することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑えることができる。
【産業上の利用分野】
本発明は、尿素窒素（以下、ＵＮと略称する）測定用試薬組成物に関する。更に詳しくは、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用の改良された液状試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
病院の検査室や検査センターで使用されている臨床検査薬のうち、不安定な酵素などを使用している試薬は、安定化を図るため、凍結乾燥品にし、使用時に溶解使用するのが主流になっている。しかしながら、このような臨床検査施設では、多項目を測定し、検体数も多いため、凍結乾燥品の溶解作業が負担になる事が多い。そのため、使用時に試薬を調製する必要のない、溶液状態で長期間安定な測定用試薬の開発が望まれている。ＵＮ測定用試薬に関しても例外ではなく、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用試薬の開発が望まれている。
【０００３】
現在、よく用いられているＵＮ測定方法は、（１）検体試料をα−ケトグルタル酸（以下、α−ＫＧと略称する）又はその塩、及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと略称する）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略称する）の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素（以下、ＧｌＤＨと略称する）を作用させ、検体試料中に最初から存在する微量の内因性アンモニアを予め除去する予備工程と、（２）その反応液にウレアーゼを加え、検体試料中の尿素をアンモニアに分解し、このアンモニアの生成量に対応するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと略称する〕の減少速度を測定する主工程とからなり、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度からＵＮ量を求めることを特徴とするＵＮ測定方法である。
【０００４】
この測定方法の主工程の基礎となる反応式を以下に示す。
【発明が解決しようとする課題】
前記ＵＮ測定方法に用いられるＵＮ測定用試薬は、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する予備工程反応を実施するための第一溶液と、ウレアーゼを含有する第二溶液とから構成するのが一般的であるが、第一溶液に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨの溶液中での安定性の条件が異なるため、溶液状態で長期間安定に保存することができるＵＮ測定用試薬の開発は困難であった。
例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、アルカリ性領域で安定で、ｐＨ８．５〜１１．０が好ましく、ＧｌＤＨは、中性から弱アルカリ性領域で安定で、ｐＨ６．５〜９．５が好ましく、α−ＫＧは、広いｐＨ領域で安定であることがわかっている。そこで、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈが安定で、且つＧｌＤＨも安定である条件は、弱アルカリ性からアルカリ性領域、特にｐＨ８．５〜９．５が好ましいことが予想される。しかしながら、後述する比較例に示すように、ｐＨ条件のみでは、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨの全てを十分に安定化することはできなかった。
従って、本発明の目的は、溶液中においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨを共存させた条件で、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ及びＧｌＤＨとα−ＫＧとを共に安定化させ、溶液状態で長期間安定なＵＮ測定用試薬を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明は、少なくとも、（ａ）α−ケトグルタル酸又はその塩、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、（ｃ）グルタミン酸脱水素酵素、（ｄ）牛血清アルブミン、（ｅ）アデノシン−５’−三リン酸、（ｆ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする脱水素酵素、並びに（ｇ）前記脱水素酵素（ｆ）の基質を含有する第一試薬と、少なくとも、（ｈ）ウレアーゼを含有する第二試薬とからなり、それぞれ液状試薬であることを特徴とする尿素窒素測定用試薬に関する。
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
第一試薬に含まれるα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）又はその塩は、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、更に好ましくは、１．０〜１０ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ未満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなる。用いることのできるα−ＫＧの塩は、グルタミン酸脱水素酵素の基質となるものである限り特に限定されないが、例えば、アルカリ金属（特にナトリウム、カリウム）との塩を用いるのが好ましい。
【０００８】
第一試薬に含まれるグルタミン酸脱水素酵素（ＧｌＤＨ）は、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは、１０〜５０Ｕ／ｍｌの濃度の範囲で用いる。１Ｕ／ｍｌ未満だと反応速度が遅くなり、１００Ｕ／ｍｌを越えると、プロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがある。
用いることのできるＧｌＤＨは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモニアを基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）に属する微生物由来のＧｌＤＨを好適に使用することができる。
【０００９】
第一試薬に含まれる還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、好ましくは０．１〜１．０ｍＭ、更に好ましくは、０．２〜０．５ｍＭの濃度の範囲で用いる。０．１ｍＭ未満だとＵＮ値の高い検体で不足してしまい、１．０ｍＭを越えると吸光度が分光光度計の限界を越える。ＮＡＤＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＨを用い、ＮＡＤＰＨを補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＰＨを用い、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨを両方共に補酵素とするＧｌＤＨを使用する場合にはＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを用いる。
【００１０】
第一試薬に、少なくとも一方、又は両方同時に含まれる牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略称する）及びアデノシン−５’−三リン酸（以下、ＡＴＰと略称する）は、ＧｌＤＨを安定化させる作用がある。それぞれ単独でも安定化作用があり、ＢＳＡとＡＴＰとを共存させると相加的な効果を得ることができる。ＢＳＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１重量％〜１．０重量％の範囲で用いることができる。０．０１重量％未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、１．０重量％を越えると試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことがある。ＡＴＰを単独で用いる場合は、好ましくは０．１ｍＭ以上、更に好ましくは０．５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で用いることができる。０．１ｍＭ未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。ＢＳＡとＡＴＰとを共存させる場合には、好ましくはＢＳＡ０．００５重量％以上とＡＴＰ０．０５ｍＭ以上、更に好ましくはＢＳＡ０．０５％〜１．０重量％とＡＴＰ０．２５ｍＭ〜５０ｍＭの範囲で用いることができる。ＢＳＡが０．００５重量％未満でＡＴＰが０．０５ｍＭ未満だとＧｌＤＨを安定化させる作用が不充分になり、ＢＳＡが１．０重量％を越え、ＡＴＰが５０ｍＭを越えると、試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことや、溶解性が悪くなることがある。
【００１１】
第一試薬に含まれる緩衝液は、特に限定されないが、ｐＨ８．５〜９．５の範囲の任意の緩衝液を、測定条件に応じて選択することが可能である。例えば、トリエタノールアミン若しくはその塩酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、又はグッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝液（例えば、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ）等の緩衝液を用いることが可能であり、特に、トリエタノールアミン塩酸塩が好ましい。
【００１２】
また、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称する）又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰと略称する）を補酵素とする脱水素酵素及びその基質の組合せを第一試薬に含ませることにより、保存期間中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑えることができる。それらの組合せは特に限定されないが、例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ６ＰＤＨと略称する）及びグルコース−６−リン酸（以下、Ｇ６Ｐと略称する）又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、バリウム塩）、イソクエン酸脱水素酵素（以下、ＩＣＤＨと略称する）及びイソクエン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、又はＧｌＤＨ及びＬ−グルタミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩）を用いることができる。
ＮＡＤ又はＮＡＤＰ〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）と略称する〕を補酵素とする脱水素酵素が、金属イオン等の補因子を必要とする場合、適当な補因子を加えることが好ましい。例えば、ＩＣＤＨ及びイソクエン酸又はその塩を用いる場合、マグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオンを加えることが好ましい。
【００１３】
ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とする脱水素酵素及び基質は、微量でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑制することができる。例えば、Ｇ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐ又はその塩を用いる場合、Ｇ６ＰＤＨ活性は、０．００１Ｕ／ｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．０１Ｕ／ｌ〜１．０Ｕ／ｌが好ましい。Ｇ６Ｐ又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果があり、特に０．１ｍＭ〜１０ｍＭが好ましい。Ｇ６ＰＤＨ活性が１．０Ｕ／ｌを越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによりアンモニア生成させ、アンモニアの生成速度に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。Ｇ６Ｐが１０ｍＭを越えると、検体試料中の尿素をウレアーゼによりアンモニア生成させ、アンモニアの生成速度に対するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。なお、Ｇ６ＰＤＨとしては、Ｇ６Ｐ又はその塩を基質とし、ＮＡＤ（Ｐ）を補酵素とするものである限り特に限定されないが、例えば、酵母（ｙｅａｓｔ）、ロイコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＧ６ＰＤＨを好適に使用することができる。
【００１４】
ＩＣＤＨ、マグネシウムイオン又はマンガンイオンなどの金属イオン及びイソクエン酸又はその塩を用いる場合、ＩＣＤＨ活性は、０．０１Ｕ／ｍｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に０．１Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌが好ましい。金属イオンとして塩化マグネシウムを用いる場合、０．１ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。イソクエン酸又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。ＩＣＤＨ活性が１００Ｕ／ｌを越えるとプロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがあり、塩化マグネシウムが５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがあり、イソクエン酸又はその塩が５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。
ＩＣＤＨ活性が高くなると、ＵＮ反応時のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少速度を遅らせることがある。この場合、第２試薬にＩＣＤＨの活性が無くなるように阻害剤を添加することができる。ＩＣＤＨ阻害剤としては、具体的には、キレート剤（特開昭６２−６６９９号公報）、胆汁酸又はその塩類（特開平６−７１６２号公報）を添加することができる。なお、ＩＣＤＨとしては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、イソクエン酸又はその塩を基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、ウシ心臓等の動物組織や酵母由来のＩＣＤＨを好適に使用することができる。
【００１５】
ＧｌＤＨ及びＬ−グルタミン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）を用いる場合、ＧｌＤＨ活性は、０．１Ｕ／ｍｌ以上でＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑える効果があり、特に１．０Ｕ／ｍｌ〜１００Ｕ／ｍｌが好ましい。Ｌ−グルタミン酸又はその塩は、０．０５ｍＭ以上で効果がみられ、特に０．５ｍＭ〜５０ｍＭが好ましい。ＧｌＤＨ活性が１００Ｕ／ｌを越えるとプロテアーゼや他の脱水素酵素のコンタミネーションによる、組成成分の劣化が起こることがあり、Ｌ−グルタミン酸又はその塩が５０ｍＭを越えると溶解性が悪くなることがある。なお、ＧｌＤＨとしては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを補酵素とし、α−ケトグルタル酸とアンモニアを基質とするものであれば、由来は特に限定されない。具体的には、例えば、酵母やプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）に属する微生物を好適に使用することができる。
【００１６】
ウレアーゼを含有する第二試薬のｐＨは、中性が好ましく、特にｐＨ６．０〜８．０が好ましい。ｐＨが６．０未満や８．０より大きいと、ウレアーゼの安定性は良くない。ウレアーゼ濃度は、好ましくは０．１〜５．０Ｕ／ｍｌ、更に好ましくは０．５〜２．０Ｕ／ｍｌの範囲で用いることができる。なお、ウレアーゼとしては、尿素を加水分解し、アンモニアを生成するものである限り特に限定されないが、ナタマメやバクテリア由来のものを用いることができる。
また、必要に応じて、アセトヒドロキサム酸（以下、ＡＨＡと略称する）（特公平２−２５５０９号公報）やＢＳＡを共存させてウレアーゼを更に安定化することができる。ＡＨＡやＢＳＡはそれぞれ単独でも安定化作用があり、ＡＨＡとＢＳＡとを共存させると相加的な効果を得ることができる。ＡＨＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１〜１０ｍＭ、更に好ましくは０．１〜１ｍＭの範囲で用いることができる。０．０１ｍＭ未満だとウレアーゼを安定化する効果が不十分になることがあり、１０ｍＭを越えるとウレアーゼの必要量が増え、コストの面で好ましくない。ＢＳＡを単独で用いる場合は、好ましくは０．０１重量％以上、更に好ましくは０．１〜１重量％の範囲で用いることができる。０．０１重量％未満だとウレアーゼを安定化する効果が不十分になることがあり、１重量％を越えると試薬の粘性が高くなり、反応の再現性が良くないことや、溶解性が悪くなることがある。更に、ＡＨＡとＢＳＡとを共存させる場合においても、至適量はそれぞれ単独で用いる場合と同じ量であり、至適量からはずれたときの問題も同様に起こる。
【００１７】
本発明の尿素窒素測定用試薬は、尿素をウレアーゼによってアンモニアに分解し、α−ケトグルタル酸又はその塩及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の存在下に、グルタミン酸脱水素酵素を作用させ、前記還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の減少量を測定することからなる尿素窒素測定法の測定用試薬として用いることができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ＧｌＤＨ活性の残存率測定
表１に示した組成の本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬１と称する）、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ及びＧ６Ｐを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬２）、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＡＴＰを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬３）、並びに表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ及びＢＳＡを除いた本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、本発明第一試薬４）を調製し、更に、比較のために、表１に示した組成からＧ６ＰＤＨ、Ｇ６Ｐ、ＢＳＡ及びＡＴＰを除いた尿素窒素測定用試薬の第一試薬（以下、比較用第一試薬１）を調製した。また、本発明の尿素窒素測定用試薬の第二試薬を表２に示した組成に従って調製した。調製後、それぞれの第一試薬及び第二試薬を溶液状態で１０℃で保存し、調製直後、更に保存開始から１月後、２月後、４月後及び６月後に、以下に示す方法により、それぞれの第一試薬に残存するＧｌＤＨ活性を測定した。
【００１９】
【表１】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ９．２０） ５０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．３４ｍＭ
ＧｌＤＨ ２０Ｕ／ｍｌ
α−ＫＧ ５．０ｍＭ
Ｇ６ＰＤＨ ０．１Ｕ／ｌ
Ｇ６Ｐ １．０ｍＭ
ＢＳＡ ０．２％
ＡＴＰ １．０ｍＭ
ＮａＮ3 ０．０５％
【００２０】
【表２】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ７．８０） ０．１Ｍ
ウレアーゼ １．３Ｕ／ｍｌ
ＡＨＡ ０．４ｍＭ
ＢＳＡ ０．２％
【００２１】
ＧｌＤＨ活性測定に用いるために、表３に示した組成の試薬Ａ及び表４に示した組成の試薬Ｂを調製した。
【００２２】
【表３】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ
ＮＡＤＰＨ ０．４ｍＭ
α−ＫＧ ５．０ｍＭ
ＥＤＴＡ２Ｎａ １．０ｍＭ
ＮａＮ3 ０．０５％
（注：ＥＤＴＡ２Ｎａは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムである）
【００２３】
【表４】
トリエタノールアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．２０） ５０ｍＭ
塩化アンモニウム ５．０ｍＭ
【００２４】
前記の試薬Ａ３２０μｌに、前記の第一試薬２μｌを加え、３７℃で５分間加温した後、更に前記の試薬Ｂ８０μｌを加えて、３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定し、ＧｌＤＨ活性を求めた。調製直後の吸光度変化を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後のＧｌＤＨ活性の残存率（％）を表５に示す。比較用第一試薬では、６月後にＧｌＤＨ活性が半分にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、ＧｌＤＨ活性の残存率ははるかに高かった。
【００２５】
【表５】
実施例２：ＮＡＤＰＨの残存率測定
前記実施例１で調製したそれぞれの第一試薬について、３４０ｎｍの吸光度を測定し、ＮＡＤＰＨの残存量を求めた。調製直後の吸光度を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後のＮＡＤＰＨの残存率（％）を表６に示す。比較用第一試薬では、６月後にＮＡＤＰＨ残存量が６７％にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、ＮＡＤＰＨの残存率は高かった。
【００２７】
【表６】
実施例３：ＵＮ量測定値の残存率
尿素窒素量が１５０ｍｇ／ｄｌである尿素水溶液を調製し、被検試料として用いた。被験試料４μｌと前記実施例１で調製した第一試薬３２０μｌとを攪拌混合し、３７℃で５分間加温した後、前記実施例１で調製した第二試薬８０μｌを添加し、３７℃で撹拌混合した。第二試薬を添加して１分後から３分後の３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を測定した。調製直後の吸光度変化量を１００％とし、１０℃で１月、２月、４月及び６月間保存した後の吸光度変化量（％）を表７に示す。比較用第一試薬では、６月後に吸光度変化量は半分以下にまで減少したのに対し、本発明の尿素窒素測定用試薬の第一試薬である本発明第一試薬１〜４では、吸光度変化量ははるかに高かった。
【００２９】
【表７】
【発明の効果】
本発明の尿素窒素測定用試薬は、溶液状態で、長期間安定に保存することができる。すなわち、本発明によれば、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを含有する溶液に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）及び／又はアデノシン−５’−三リン酸（ＡＴＰ）を添加することにより、α−ＫＧ又はその塩、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、及びＧｌＤＨを同時に液状で長期間安定に保存することができる。また、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ〔ＮＡＤ（Ｐ）〕を補酵素とする脱水素酵素及びその基質を、更に添加することによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈの減少を抑えることができる。
Claims (1)
- 少なくとも、（ａ）α−ケトグルタル酸又はその塩、（ｂ）還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、（ｃ）グルタミン酸脱水素酵素、（ｄ）牛血清アルブミン、（ｅ）アデノシン−５’−三リン酸、（ｆ）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とする脱水素酵素、並びに（ｇ）前記脱水素酵素（ｆ）の基質を含有する第一試薬と、少なくとも、（ｈ）ウレアーゼを含有する第二試薬とからなり、それぞれ液状試薬であることを特徴とする尿素窒素測定用試薬。
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| JP08198095A JP3682729B2 (ja) | 1995-03-14 | 1995-03-14 | 尿素窒素測定用試薬 |
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