JPH10108696A - 尿素窒素の測定方法およびその測定用キット - Google Patents
尿素窒素の測定方法およびその測定用キットInfo
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- JPH10108696A JPH10108696A JP8261505A JP26150596A JPH10108696A JP H10108696 A JPH10108696 A JP H10108696A JP 8261505 A JP8261505 A JP 8261505A JP 26150596 A JP26150596 A JP 26150596A JP H10108696 A JPH10108696 A JP H10108696A
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 反応速度法を用いたウレアーゼ−ＧＬＤＨに
よる紫外部吸収に基づく尿素窒素の定量に際し、高濃度
の尿素窒素を含む試料において正確な測定が可能であ
り、かつマンニトール等のポリオールを含む試料におい
ても、ポリオールの影響を受けず、正確な測定が可能な
尿素窒素測定方法および測定用キットを提供する。 【解決手段】 試料中の尿素をウレアーゼで加水分解さ
せ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグル
タル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の存在
下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を作用させ、
その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の減少の速度を測
定することにより前記尿素由来の尿素窒素を測定する方
法において、スルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に
存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法
よる紫外部吸収に基づく尿素窒素の定量に際し、高濃度
の尿素窒素を含む試料において正確な測定が可能であ
り、かつマンニトール等のポリオールを含む試料におい
ても、ポリオールの影響を受けず、正確な測定が可能な
尿素窒素測定方法および測定用キットを提供する。 【解決手段】 試料中の尿素をウレアーゼで加水分解さ
せ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグル
タル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の存在
下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を作用させ、
その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の減少の速度を測
定することにより前記尿素由来の尿素窒素を測定する方
法において、スルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に
存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の尿素窒素
を測定するための方法および試薬に関する。さらに詳し
くは、本発明は高濃度の尿素窒素を含む試料においても
測定が可能であり、さらに試料中に含まれるポリオール
の影響を受けないことを特徴とする尿素窒素の測定方法
およびその測定用試薬に関する。
を測定するための方法および試薬に関する。さらに詳し
くは、本発明は高濃度の尿素窒素を含む試料においても
測定が可能であり、さらに試料中に含まれるポリオール
の影響を受けないことを特徴とする尿素窒素の測定方法
およびその測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料等に存在する尿素窒素量は、腎
不全等の腎機能障害や肝硬変等の肝障害により変動する
ことが知られており、その測定は医学的診断や病態の解
明を行う上で、さらには種々の治療の経過を判定する上
で重要な指標である。近年、尿素窒素の測定方法はその
正確性、特異性からウレアーゼ反応によって尿素を加水
分解し、生じるアンモニアにα−ケトグルタル酸（以
下、α−ＫＧという）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド還元型（以下、ＮＡＤＨという）またはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、
ＮＡＤＰＨという）およびグルタミン酸脱水素酵素（以
下、ＧＬＤＨという）を作用させ、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの減少量を紫外部の吸収変化としてとらえ測定す
る方法（以下この方法をウレアーゼ−ＧＬＤＨ法と略
す）が広く普及している。
不全等の腎機能障害や肝硬変等の肝障害により変動する
ことが知られており、その測定は医学的診断や病態の解
明を行う上で、さらには種々の治療の経過を判定する上
で重要な指標である。近年、尿素窒素の測定方法はその
正確性、特異性からウレアーゼ反応によって尿素を加水
分解し、生じるアンモニアにα−ケトグルタル酸（以
下、α−ＫＧという）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチド還元型（以下、ＮＡＤＨという）またはニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（以下、
ＮＡＤＰＨという）およびグルタミン酸脱水素酵素（以
下、ＧＬＤＨという）を作用させ、ＮＡＤＨまたはＮＡ
ＤＰＨの減少量を紫外部の吸収変化としてとらえ測定す
る方法（以下この方法をウレアーゼ−ＧＬＤＨ法と略
す）が広く普及している。
【０００３】また、自動分析装置が年々目覚ましく進歩
していることもあり、短時間で測定結果が得られ、かつ
試料中の干渉物質の影響の少ない反応速度法による尿素
窒素測定法が望まれている。
していることもあり、短時間で測定結果が得られ、かつ
試料中の干渉物質の影響の少ない反応速度法による尿素
窒素測定法が望まれている。
【０００４】ところで反応速度法は、ウレアーゼの尿素
に対するＫｍ値が測定系における尿素濃度より十分大き
い場合に可能となり高濃度の尿素を測定できる。ウレア
ーゼのＫｍ値は通常、反応速度法で測定するときには小
さすぎる場合が多いため、Ｋｍ値をみかけ上大きくする
ために阻害剤を加えることがある。このような阻害剤を
用いる尿素窒素測定方法としては、ウレアーゼ阻害剤と
してホウ酸またはその塩を用いる方法（特公平０３−６
５１６０）が知られており、この方法によれば、高濃度
の尿素を正確に測定できる。ホウ酸は、その性質から酵
素中の糖鎖との相互作用によりキレート様錯体を形成
し、その結果、阻害作用が現れるものと考えられる。
に対するＫｍ値が測定系における尿素濃度より十分大き
い場合に可能となり高濃度の尿素を測定できる。ウレア
ーゼのＫｍ値は通常、反応速度法で測定するときには小
さすぎる場合が多いため、Ｋｍ値をみかけ上大きくする
ために阻害剤を加えることがある。このような阻害剤を
用いる尿素窒素測定方法としては、ウレアーゼ阻害剤と
してホウ酸またはその塩を用いる方法（特公平０３−６
５１６０）が知られており、この方法によれば、高濃度
の尿素を正確に測定できる。ホウ酸は、その性質から酵
素中の糖鎖との相互作用によりキレート様錯体を形成
し、その結果、阻害作用が現れるものと考えられる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ところが上記のウレア
ーゼ阻害剤としてホウ酸またはその塩を用いる方法にお
いては、試料中にマンニトール等のポリオールが存在す
る場合、ホウ酸がポリオールとキレート錯体を形成し、
ウレアーゼの阻害作用が実質的に働かなくなるため、尿
素窒素の測定において測定値の上昇が認められ、正確な
測定が不可能となるという問題点があった。実際、臨床
領域においては脳圧降下剤、利尿剤としてマンニトール
製剤が使用される場合が多々あり、マンニトールは生体
内ではほとんど代謝されず糸球体で容易にろ過され、ま
た尿細管で再吸収もされないためほぼ全量が尿中に濃縮
された形で排出される。この場合のマンニトール濃度
は、２０％すなわち２００ｍｇ／ｍｌにも及ぶものと推
定される。このため、マンニトール含有試料中の尿素窒
素を測定するに際し上記の現象が大きな問題となる。
ーゼ阻害剤としてホウ酸またはその塩を用いる方法にお
いては、試料中にマンニトール等のポリオールが存在す
る場合、ホウ酸がポリオールとキレート錯体を形成し、
ウレアーゼの阻害作用が実質的に働かなくなるため、尿
素窒素の測定において測定値の上昇が認められ、正確な
測定が不可能となるという問題点があった。実際、臨床
領域においては脳圧降下剤、利尿剤としてマンニトール
製剤が使用される場合が多々あり、マンニトールは生体
内ではほとんど代謝されず糸球体で容易にろ過され、ま
た尿細管で再吸収もされないためほぼ全量が尿中に濃縮
された形で排出される。この場合のマンニトール濃度
は、２０％すなわち２００ｍｇ／ｍｌにも及ぶものと推
定される。このため、マンニトール含有試料中の尿素窒
素を測定するに際し上記の現象が大きな問題となる。
【０００６】かかる問題に鑑み、本発明の目的は、マン
ニトール等のポリオール含有試料や高濃度の尿素窒素を
含む試料においても尿素窒素を正確に測定できる方法を
提供することである。
ニトール等のポリオール含有試料や高濃度の尿素窒素を
含む試料においても尿素窒素を正確に測定できる方法を
提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは公知
方法の欠点を解決するため、ホウ酸に代わる新たなウレ
アーゼ阻害剤について鋭意検討した結果、反応速度法を
用いたウレアーゼ−ＧＬＤＨ法による尿素窒素の定量に
おいて、阻害剤としてスルフヒドリル化合物を存在させ
ることが問題解決に有効であることを見出し、本発明を
完成させた。これによりウレアーゼのＫｍ値を増大させ
ることで高濃度の尿素窒素が測定可能となり、かつ上記
マンニトール等のポリオールの影響も回避可能となっ
た。
方法の欠点を解決するため、ホウ酸に代わる新たなウレ
アーゼ阻害剤について鋭意検討した結果、反応速度法を
用いたウレアーゼ−ＧＬＤＨ法による尿素窒素の定量に
おいて、阻害剤としてスルフヒドリル化合物を存在させ
ることが問題解決に有効であることを見出し、本発明を
完成させた。これによりウレアーゼのＫｍ値を増大させ
ることで高濃度の尿素窒素が測定可能となり、かつ上記
マンニトール等のポリオールの影響も回避可能となっ
た。
【０００８】すなわち本発明は、試料中の尿素をウレア
ーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニア
に、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（Ｎ
ＡＤＰＨ）の存在下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤ
Ｈ）を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）
の減少の速度を測定することにより前記尿素由来の尿素
窒素を測定する方法において、スルフヒドリル化合物を
ウレアーゼと共に存在させることを特徴とする尿素窒素
の測定方法（以下、本発明の方法という）を第一の要旨
とする。
ーゼで加水分解させ、その分解により生じるアンモニア
に、α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（Ｎ
ＡＤＰＨ）の存在下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤ
Ｈ）を作用させ、その作用によるニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）
の減少の速度を測定することにより前記尿素由来の尿素
窒素を測定する方法において、スルフヒドリル化合物を
ウレアーゼと共に存在させることを特徴とする尿素窒素
の測定方法（以下、本発明の方法という）を第一の要旨
とする。
【０００９】また、本発明は、構成成分として i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、 ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｎ
ＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、 iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、 iv)スルフヒドリル化合物及び v)ウレアーゼを含む尿素窒素測定用キット（以下、本発
明のキットという）を第二の要旨とする。
ＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、 iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、 iv)スルフヒドリル化合物及び v)ウレアーゼを含む尿素窒素測定用キット（以下、本発
明のキットという）を第二の要旨とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明においては、尿素窒素を測
定する方法ならびに尿素窒素測定用試薬の調製は、試薬
にスルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に用いる以外
は、慣用されている技術を通常そのまま使用することが
できる。例えばウレアーゼおよびスルフヒドリル化合物
を作用させる前に、前処理として試料中に存在するアン
モニアを消去させることもできる。
定する方法ならびに尿素窒素測定用試薬の調製は、試薬
にスルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に用いる以外
は、慣用されている技術を通常そのまま使用することが
できる。例えばウレアーゼおよびスルフヒドリル化合物
を作用させる前に、前処理として試料中に存在するアン
モニアを消去させることもできる。
【００１１】本発明の方法においては測定の精度を高め
るために、尿素窒素測定の前に、α−ＫＧ及び、ＮＡＤ
Ｈ又はＮＡＤＰＨの存在下、ＧＬＤＨを作用させること
により、予め試料中のアンモニアを消去しておくことが
好ましい。なお、アンモニアを消去するための試薬構成
は、尿素窒素を測定する試薬構成と重複するので、尿素
窒素を測定するときにそのまま、アンモニアを消去する
ための試薬構成を使用することができる。
るために、尿素窒素測定の前に、α−ＫＧ及び、ＮＡＤ
Ｈ又はＮＡＤＰＨの存在下、ＧＬＤＨを作用させること
により、予め試料中のアンモニアを消去しておくことが
好ましい。なお、アンモニアを消去するための試薬構成
は、尿素窒素を測定する試薬構成と重複するので、尿素
窒素を測定するときにそのまま、アンモニアを消去する
ための試薬構成を使用することができる。
【００１２】本発明の方法において試料とは、尿素成分
を含むものであれば特に限定されないが、例えば血漿、
血清、尿、又はそれらの希釈液等を例示できる。
を含むものであれば特に限定されないが、例えば血漿、
血清、尿、又はそれらの希釈液等を例示できる。
【００１３】本発明の方法において使用することができ
るスルフヒドリル化合物としては、チオグリセロール、
チオリンゴ酸、チオグリコール酸、メルカプトエタノー
ル、３−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオ
ン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール等が挙
げられる。スルフヒドリル化合物としては、チオグリセ
ロールが好ましい。チオグリセロールは、臭いが少な
く、さらに、安定性が良いからである。
るスルフヒドリル化合物としては、チオグリセロール、
チオリンゴ酸、チオグリコール酸、メルカプトエタノー
ル、３−メルカプトプロピオン酸、チオフェノール、シ
ステイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グルタチオ
ン、ジチオスレイトール、ジチオエリスリトール等が挙
げられる。スルフヒドリル化合物としては、チオグリセ
ロールが好ましい。チオグリセロールは、臭いが少な
く、さらに、安定性が良いからである。
【００１４】スルフヒドリル化合物の濃度は、化合物の
種類、試料の種類、測定条件その他の要因により適宜調
整すべきであるが、通常０．１〜１０００ｍＭ、好まし
くは１〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０〜５００ｍＭ
の範囲である。
種類、試料の種類、測定条件その他の要因により適宜調
整すべきであるが、通常０．１〜１０００ｍＭ、好まし
くは１〜５００ｍＭ、特に好ましくは１０〜５００ｍＭ
の範囲である。
【００１５】本発明の方法で使用するα−ＫＧ、ＮＡＤ
ＨもしくはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨ、ウレアーゼの各濃度
は、試料中に予め存在するアンモニア量および測定すべ
き尿素量により変動するが、適当な濃度を適宜選択する
ことができる。例えばα−ＫＧ量は通常０．１〜５０ｍ
Ｍ、好ましくは１〜３０ｍＭの範囲である。またＮＡＤ
ＨもしくはＮＡＤＰＨ量は通常０．０５〜５ｍＭ、好ま
しくは０．１〜１ｍＭの範囲であり、測定時の吸光度限
界を超えない程度の範囲で選択すればよい。ＧＬＤＨ
は、由来は特に限定されないが牛肝臓由来や細菌由来の
ものが好ましい。ＧＬＤＨの使用濃度は０．１〜１００
単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜７０単位／ｍｌの範囲
である。ウレアーゼは、由来は特に限定されないがナタ
マメ由来や細菌由来のものがあげられ、その使用濃度は
０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０単
位／ｍｌ程度であり、スルフヒドリル化合物の添加量と
の関係に基づき適当な濃度を選択すべきである。
ＨもしくはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨ、ウレアーゼの各濃度
は、試料中に予め存在するアンモニア量および測定すべ
き尿素量により変動するが、適当な濃度を適宜選択する
ことができる。例えばα−ＫＧ量は通常０．１〜５０ｍ
Ｍ、好ましくは１〜３０ｍＭの範囲である。またＮＡＤ
ＨもしくはＮＡＤＰＨ量は通常０．０５〜５ｍＭ、好ま
しくは０．１〜１ｍＭの範囲であり、測定時の吸光度限
界を超えない程度の範囲で選択すればよい。ＧＬＤＨ
は、由来は特に限定されないが牛肝臓由来や細菌由来の
ものが好ましい。ＧＬＤＨの使用濃度は０．１〜１００
単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜７０単位／ｍｌの範囲
である。ウレアーゼは、由来は特に限定されないがナタ
マメ由来や細菌由来のものがあげられ、その使用濃度は
０．１〜１００単位／ｍｌ、好ましくは０．５〜５０単
位／ｍｌ程度であり、スルフヒドリル化合物の添加量と
の関係に基づき適当な濃度を選択すべきである。
【００１６】本発明の方法においては、尿素窒素測定時
のｐＨは、通常ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０
の範囲に調整する。なお、ｐＨの調整は、通常緩衝液に
よって行い、ここで使用できる緩衝液としては、トリス
緩衝液、塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、イミ
ダゾール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタ
ノールアミン緩衝液；ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液等が
挙げられる。
のｐＨは、通常ｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜１０
の範囲に調整する。なお、ｐＨの調整は、通常緩衝液に
よって行い、ここで使用できる緩衝液としては、トリス
緩衝液、塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、イミ
ダゾール緩衝液、ジエタノールアミン緩衝液、トリエタ
ノールアミン緩衝液；ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝液等が
挙げられる。
【００１７】以上のように本発明は、尿素窒素量をＮＡ
ＤＨもしくはＮＡＤＰＨの減少速度を指標として測定す
る反応速度法であるため、測定に要する時間は短く、か
つ紫外部吸収をもつ試料中の干渉物質等の影響をほとん
ど受けない。その上スルフヒドリル化合物は試料と混合
してもウレアーゼ阻害作用は影響を受けず、高濃度の尿
素まで正確に定量できる。さらにマンニトール等のポリ
オール含有試料においてもウレアーゼ阻害作用は失われ
ないため、従来では正確な結果が得られなかったマンニ
トール含有試料においても、正確な尿素窒素測定が可能
であり、臨床検査等において極めて有用な方法である。
ＤＨもしくはＮＡＤＰＨの減少速度を指標として測定す
る反応速度法であるため、測定に要する時間は短く、か
つ紫外部吸収をもつ試料中の干渉物質等の影響をほとん
ど受けない。その上スルフヒドリル化合物は試料と混合
してもウレアーゼ阻害作用は影響を受けず、高濃度の尿
素まで正確に定量できる。さらにマンニトール等のポリ
オール含有試料においてもウレアーゼ阻害作用は失われ
ないため、従来では正確な結果が得られなかったマンニ
トール含有試料においても、正確な尿素窒素測定が可能
であり、臨床検査等において極めて有用な方法である。
【００１８】次に、本発明の尿素窒素測定用キットは、
その構成成分として i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、 ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｎ
ＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、 iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、 iv)スルフヒドリル化合物及び v)ウレアーゼを含むものである。
その構成成分として i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、 ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｎ
ＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、 iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、 iv)スルフヒドリル化合物及び v)ウレアーゼを含むものである。
【００１９】ここで、それぞれの構成成分の由来、使用
濃度等は、本発明の方法の説明において詳述したとおり
であり、ここでは省略する。
濃度等は、本発明の方法の説明において詳述したとおり
であり、ここでは省略する。
【００２０】本発明のキットは、通常、緩衝液、α−Ｋ
Ｇ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨを含む第一試
薬と、緩衝液、α−ＫＧ、ウレアーゼ、スルフヒドリル
化合物を含む第二試薬とからなっているのが好ましい。
最初に第一試薬と試料を混合することにより、試料中に
予め存在するアンモニアを消去することができ、正確な
尿素窒素測定が可能となるからである。
Ｇ、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、ＧＬＤＨを含む第一試
薬と、緩衝液、α−ＫＧ、ウレアーゼ、スルフヒドリル
化合物を含む第二試薬とからなっているのが好ましい。
最初に第一試薬と試料を混合することにより、試料中に
予め存在するアンモニアを消去することができ、正確な
尿素窒素測定が可能となるからである。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例および比較例によりさ
らに具体的に説明する。
らに具体的に説明する。
【００２２】実施例１ 第一試薬として、 トリス緩衝液 １００ｍＭ α−ＫＧ １２ｍＭ ＮＡＤＰＨ ０．３ｍＭ ＧＬＤＨ １０Ｕ／ｍｌ を含み、かつｐＨ８．２の水溶液を用いた。
【００２３】第二試薬として、 トリス緩衝液 １００ｍＭ α−ＫＧ １２ｍＭ ウレアーゼ １０Ｕ／ｍｌ チオグリセロール ４００ｍＭ を含み、かつｐＨ８．２の水溶液を用いた。
【００２４】試料として、尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌ
の試料Ｍ0およびマンニトール２０％を含む尿素窒素５
０ｍｇ／ｄｌの試料Ｍ5を調製した。さらに試料Ｍ5をＭ
0で希釈し、マンニトール濃度が各々４、８、１２、１
６％であり、かつ尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの試料を
調製し、それぞれ試料Ｍ1、Ｍ2、Ｍ3、Ｍ4とした。
の試料Ｍ0およびマンニトール２０％を含む尿素窒素５
０ｍｇ／ｄｌの試料Ｍ5を調製した。さらに試料Ｍ5をＭ
0で希釈し、マンニトール濃度が各々４、８、１２、１
６％であり、かつ尿素窒素濃度５０ｍｇ／ｄｌの試料を
調製し、それぞれ試料Ｍ1、Ｍ2、Ｍ3、Ｍ4とした。
【００２５】吸光度測定は、日立７１５０形自動分析装
置を使用して行い、上記試料Ｍ0〜Ｍ5１２μｌに、第一
試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、続いて
第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間あ
たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は
あらかじめ作成した検量線より求めた。結果を表１およ
び図１に示す。
置を使用して行い、上記試料Ｍ0〜Ｍ5１２μｌに、第一
試薬３００μｌを加えて３７℃で５分間加温し、続いて
第二試薬７５μｌを加えて、３４０ｎｍにて単位時間あ
たりの吸光度変化を測定した。試料中の尿素窒素濃度は
あらかじめ作成した検量線より求めた。結果を表１およ
び図１に示す。
【００２６】比較例１ 実施例１で使用した第二試薬の成分中、チオグリセロー
ルの代わりにホウ酸７５ｍＭを用いた以外は、実施例１
と同様に操作して、尿素窒素濃度を求めた。結果を表１
および図１に示す。
ルの代わりにホウ酸７５ｍＭを用いた以外は、実施例１
と同様に操作して、尿素窒素濃度を求めた。結果を表１
および図１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】図１中、実施例１の測定結果は−○−で、
比較例１の測定結果は−●−で示し、縦軸に尿素窒素濃
度（ｍｇ／ｄｌ）、横軸にマンニトール濃度（％）を示
す。
比較例１の測定結果は−●−で示し、縦軸に尿素窒素濃
度（ｍｇ／ｄｌ）、横軸にマンニトール濃度（％）を示
す。
【００２９】表１及び図１の結果から、ウレアーゼ−Ｇ
ＬＤＨ法において、ウレアーゼ阻害剤として、チオグリ
セロールを用いた場合（実施例１）は、ウレアーゼ阻害
剤としてホウ酸を用いた場合（比較例１）と比べ、試料
中のマンニトールの影響を受けず、尿素窒素濃度を正確
に測定できることがわかる。
ＬＤＨ法において、ウレアーゼ阻害剤として、チオグリ
セロールを用いた場合（実施例１）は、ウレアーゼ阻害
剤としてホウ酸を用いた場合（比較例１）と比べ、試料
中のマンニトールの影響を受けず、尿素窒素濃度を正確
に測定できることがわかる。
【００３０】実施例２ 実施例１の本発明の方法と、現在信頼性が高いとされ臨
床検査等に一般的に使用されている前記特公平３−６５
１６０号公報記載の、ウレアーゼ阻害剤としてホウ酸を
用いた方法（公知方法）との相関性を調べるため、ポリ
オールを含まない血清を試料としてそれぞれ尿素窒素測
定を行った。その結果、図２に示す通り、本発明の方法
は上記公知方法と極めて有意な相関性が認められた。
床検査等に一般的に使用されている前記特公平３−６５
１６０号公報記載の、ウレアーゼ阻害剤としてホウ酸を
用いた方法（公知方法）との相関性を調べるため、ポリ
オールを含まない血清を試料としてそれぞれ尿素窒素測
定を行った。その結果、図２に示す通り、本発明の方法
は上記公知方法と極めて有意な相関性が認められた。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、反応速度法による尿素
窒素測定時に誤差を与えるマンニトール含有試料におい
ても、正確に測定が可能であり、また高濃度の尿素窒素
の測定ができる。したがって、臨床検査に寄与すること
大である。
窒素測定時に誤差を与えるマンニトール含有試料におい
ても、正確に測定が可能であり、また高濃度の尿素窒素
の測定ができる。したがって、臨床検査に寄与すること
大である。
【図１】図１は、実施例１および比較例１におけるマン
ニトールの尿素窒素測定結果に与える影響を示す図であ
る。
ニトールの尿素窒素測定結果に与える影響を示す図であ
る。
【図２】図２は、本発明の方法（縦軸）と、公知方法
（横軸）との尿素窒素測定結果における相関性を示す図
である。
（横軸）との尿素窒素測定結果における相関性を示す図
である。
Claims (4)
- 【請求項１】 試料中の尿素をウレアーゼで加水分解さ
せ、その分解により生じるアンモニアに、α−ケトグル
タル酸（α−ＫＧ）及び、ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の存在
下、グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）を作用させ、
その作用によるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
還元型（ＮＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）の減少の速度を測
定することにより前記尿素由来の尿素窒素を測定する方
法において、スルフヒドリル化合物をウレアーゼと共に
存在させることを特徴とする尿素窒素の測定方法。 - 【請求項２】 スルフヒドリル化合物がチオグリセロー
ル、チオリンゴ酸、チオグリコール酸、メルカプトエタ
ノール、３−メルカプトプロピオン酸、チオフェノー
ル、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元型グル
タチオン、ジチオスレイトールおよびジチオエリスリト
ールからなる群から選ばれる、請求項１に記載の測定方
法。 - 【請求項３】 スルフヒドリル化合物がチオグリセロー
ルである、請求項２記載の測定方法。 - 【請求項４】 構成成分として i)α−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、 ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｎ
ＡＤＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸還元型（ＮＡＤＰＨ）、 iii)グルタミン酸脱水素酵素（ＧＬＤＨ）、 iv)スルフヒドリル化合物及び v)ウレアーゼを含む尿素窒素測定用キット。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26150596A JP3674015B2 (ja) | 1996-10-02 | 1996-10-02 | 尿素窒素の測定方法およびその測定用キット |
| US08/928,255 US5888828A (en) | 1996-10-02 | 1997-09-12 | Kit for measuring urea nitrogen |
| DE19742117A DE19742117B4 (de) | 1996-10-02 | 1997-09-24 | Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff und Untersuchungssets dafür |
| CH02281/97A CH692554A5 (de) | 1996-10-02 | 1997-09-29 | Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff und Untersuchungssets dafür. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26150596A JP3674015B2 (ja) | 1996-10-02 | 1996-10-02 | 尿素窒素の測定方法およびその測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10108696A true JPH10108696A (ja) | 1998-04-28 |
| JP3674015B2 JP3674015B2 (ja) | 2005-07-20 |
Family
ID=17362845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26150596A Expired - Fee Related JP3674015B2 (ja) | 1996-10-02 | 1996-10-02 | 尿素窒素の測定方法およびその測定用キット |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3674015B2 (ja) |
| CH (1) | CH692554A5 (ja) |
| DE (1) | DE19742117B4 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126674A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-25 | 兰州百源基因技术有限公司 | 一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法 |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN104388537A (zh) * | 2014-11-28 | 2015-03-04 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种血清中尿素检测试剂 |
| CN104749124A (zh) * | 2015-04-29 | 2015-07-01 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定、抗干扰能力强的血清尿素检测方法及试剂 |
| WO2020157178A1 (en) * | 2019-01-31 | 2020-08-06 | Roche Diagnostics Gmbh | Stabilization of nadph or nadh in ammonia detection assays |
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|---|---|---|---|---|
| USRE29725E (en) * | 1966-04-26 | 1978-08-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Analytical test pack and process for analysis |
| US4189536A (en) * | 1977-11-09 | 1980-02-19 | Hycel, Inc. | Reagent systems, enzymatic assays and compositions therefor |
| US4229369A (en) * | 1979-04-25 | 1980-10-21 | Hycel, Inc. | Tris (hydroxymethyl) aminomethane salt of 2-mercaptosuccinic acid |
| US4394449A (en) * | 1980-02-13 | 1983-07-19 | Modrovich Ivan Endre | Stabilization of coenzymes in aqueous solution |
| JPS59159190A (ja) * | 1983-03-01 | 1984-09-08 | Sharp Corp | クリ−ニング装置 |
| JPH0657149B2 (ja) * | 1986-01-13 | 1994-08-03 | サッポロビール株式会社 | ウレア−ゼ及びその製造法 |
| JPH0664056B2 (ja) * | 1987-04-16 | 1994-08-22 | 富士写真フイルム株式会社 | アンモニア生成物質定量用一体型多層分析要素 |
| JP2802641B2 (ja) * | 1989-03-30 | 1998-09-24 | 株式会社ヤトロン | 尿素窒素の測定方法及び測定用試薬 |
-
1996
- 1996-10-02 JP JP26150596A patent/JP3674015B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-09-12 US US08/928,255 patent/US5888828A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-24 DE DE19742117A patent/DE19742117B4/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-29 CH CH02281/97A patent/CH692554A5/de not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112126674A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-25 | 兰州百源基因技术有限公司 | 一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法 |
| CN112126674B (zh) * | 2020-08-18 | 2024-02-06 | 兰州百源基因技术有限公司 | 一种尿素检测试剂盒、其制备方法和使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19742117B4 (de) | 2004-03-25 |
| US5888828A (en) | 1999-03-30 |
| DE19742117A1 (de) | 1998-04-09 |
| JP3674015B2 (ja) | 2005-07-20 |
| CH692554A5 (de) | 2002-07-31 |
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