DE19742117A1

DE19742117A1 - Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff und Untersuchungssets dafür

Info

Publication number: DE19742117A1
Application number: DE19742117A
Authority: DE
Inventors: Hirotoshi Tanaka; Ryo Kojima; Katsuhiro Katayama
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: JPH10108696A; CH692554A5; DE19742117B4; JP3674015B2; US5888828A

Description

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff in einer Probe und ein Reagens für diesen Zweck. Genauer betrifft sie ein Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff, das geeignet ist für die Messung einer Probe, die eine hohe Konzentration an Harnstoffstickstoff enthält, und das ferner frei ist von Einflüssen, die durch in der Probe enthaltene Polyole hervorgerufen werden, sowie ein Reagens für die obige Messung.

Stand der Technik

Es ist bekannt, daß die Menge an Harnstoffstickstoff in einer Bioprobe usw. in Abhängigkeit von funktionellen Nierenerkrankungen wie Nierenversagen oder funktionellen hepatischen Erkrankungen wie Hepatozirrhose veränderlich ist, und deren Messung ist ein wichtiger Anzeiger für die medizinische Diagnose und zur Verdeutlichung des Krankheitszustandes, sowie zur Bestimmung des Verlaufes verschiedener therapeutischer Behandlungen. In den letzten Jahren wurde aufgrund der Genauigkeit und Spezifizität weitverbreitet ein Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff verwendet (nachfolgend als "Urease-GLDH-Verfahren" bezeichnet), worin Harnstoff durch Urease-Reaktion hydrolysiert wird, α-Ketoglutarsäure (nachfolgend als "α-KG" bezeichnet), entweder die reduzierte Form von Nicotinamid adenin-dinukleotid (nachfolgend als "NADH" bezeichnet) oder die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinukleotid phosphat (nachfolgend als "NADPH" bezeichnet) und Glutamatdehydrogenase (nachfolgend als "GLDH" bezeichnet) werden mit dem gebildeten Ammonium umgesetzt, und die Menge der NADH- oder NADPH-Abnahme wird gemessen als Veränderung der Absorption eines UV-Anteils.

Ferner haben sich automatische Analysegeräte in den letzten Jahren in bemerkenswerter Weise weiterentwickelt, und daher ist es wünschenswert, ein Verfahren zur Messung von Halogenatomstickstoff mittels eines Reaktionsgeschwindigkeitsverfahrens zu entwickeln, mit dem ein Meßergebnis innerhalb einer kurzen Zeit erhalten werden kann, und die Messung nahezu frei ist von Einflüssen, die durch eine interferierende Substanz in der Probe hervorgerufen wird.

Bisher ist das Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren anwendbar, wenn der Km-Wert von Urease zu Harnstoff ausreichend größer ist als die Harnstoffkonzentration in dem Meßsystem, und es kann eine hohe Harnstoffkonzentration gemessen werden. Wenn die Messung nach dem Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren durchgeführt wird, ist der Km-Wert der Urease im allgemeinen in vielen Fällen zu klein, und daher wird zur Erhöhung des scheinbaren Km-Wertes in einigen Fällen ein Inhibitor zugegeben. Als Harnstoffstickstoff-Meßverfahren unter Anwendung des obigen Inhibitors ist ein Verfahren bekannt, worin Borsäure oder deren Salze als Urease-Inhibitor verwendet werden (JP-B-03-65160). Dieses Verfahren ist zur genauen Messung einer hohen Harnstoffkonzentration anwendbar. Es wird angenommen, daß Borsäure durch gegenseitige Aktivitäten mit einer Zuckerkette in einem Enzym einen Chelat-Komplex bildet, und folglich eine inhibierende Wirkung zeigt.

Das obige Verfahren unter Verwendung von Borsäure oder deren Salzen als Urease-Inhibitor weist jedoch das folgende Problem auf. Wenn Polyole wie Mannitol usw. in der Probe vorhanden sind, bildet Borsäure einen Chelat-Komplex mit dem Polyol und die Inhibitionswirkung bezüglich der Urease tritt weitestgehend nicht auf. Bei der Messung von Harnstoffstickstoff wird daher ein Anstieg des gemessenen Wertes beobachtet, und es ist keine genaue Messung möglich. Tatsächlich werden Mannitol-Zubereitungen regelmäßig als Hirnhypotensiva oder Diuretika für klinische Behandlungen verwendet. Mannitol wird im Organismus nicht metabolisiert und leicht im Glomerulus filtriert, so daß es nicht im Harnkanälchen reabsorbiert wird, so daß nahezu die gesamte Menge in konzentrierter Form mit dem Urin ausgeschieden wird. In diesem Falle wird angenommen, daß die Mannitol-Konzentration bis zu 20% betragen kann, d. h. 200 mg/ml. Wenn eine mannitolhaltige Probe auf Harnstoffstickstoff untersucht wird, ruft das obige Phänomen ein ernsthaftes Problem hervor.

Zusammenfassung der Erfindung

Angesichts der obigen Probleme ist ein erfindungsgemäßes Ziel, ein Verfahren zur genauen Messung von Harnstoffstickstoffin einer Probe bereitzustellen, die Polyole wie Mannitol usw. enthält, oder in einer Probe, die eine hohe Konzentration an Harnstoffstickstoff enthält.

Zur Überwindung der Nachteile der bekannten Verfahren haben die hiesigen Erfinder sorgfältige Studien bezüglich eines neuen Urease-Inhibitors durchgeführt, der die Borsäure ersetzen kann. Als Ergebnis wurde herausgefunden, daß bei der qualitativen Bestimmung von Harnstoffstickstoff durch ein Urease-GLDH-Verfahren unter Anwendung des Reaktionsgeschwindigkeitsverfahrens die Gegenwart einer Sulfhydryl-Verbindung als Inhibitor zur Überwindung der Probleme wirksam ist, und die vorliegende Erfindung wurde demgemäß vervollständigt. In Gegenwart dieser Substanz wird der Km-Wert von Urease erhöht, so daß eine hohe Konzentration an Harnstoffstickstoff gemessen werden kann, und der Einfluß, der durch die obigen Polyole wie beispielsweise Mannitol usw. hervorgerufen wird, kann vermieden werden.

Folglich ist das erste erfindungsgemäße Ziel ein Verfahren zur Messung von Harnstoffstickstoff, umfassend die Hydrolyse von Harnstoff in einer Probe mit Urease, Umsetzung von Glutamatdehydrogenase (GLDH) mit Ammoniak, das durch die Hydrolyse gebildet wird, in Gegenwart von α-Ketoglarsäure (α-KG) und die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin dinukleotid (NADH) oder die reduzierte Form von Nicotinamid adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH) und Messung der Abnahmegeschwindigkeit der reduzierten Form von Nicotinamid adenin-dinukleotid (NADH) oder der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH), wodurch der aus dem Harnstoff stammende Harnstoffstickstoff gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sulfhydryl-Verbindung gleichzeitig mit der Urease anwesend ist. (Im nachfolgenden als "das erfindungsgemäße Verfahren" bezeichnet.)

Ferner ist das zweite erfindungsgemäße Ziel ein Set zur Messung von Harnstoffstickstoff, das als Bestandteile folgendes umfaßt:

i) α-Ketoglutarsäure (α-KG),
ii) die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin- dinukleotid (NADH) oder die reduzierte Form von Nicotinamid- adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH),
iii) Glutamatdehydrogenase (GLDH),
iv) eine Sulfhydryl-Verbindung, und
v) Urease

(nachfolgend als "das erfindungsgemäße Set" bezeichnet).

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Einflüsse, die durch Mannitol auf die Ergebnisse von Harnstoffstickstoffmessungen in Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel 1 hervorgerufen werden.

Fig. 2 zeigt eine Korrelation der Ergebnisse der Harnstoffstickstoffmessungen durch das erfindungsgemäße Verfahren (Ordinatenachse) und durch ein bekanntes Verfahren (Abszissenachse).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß kann Harnstoffstickstoff in der gleichen Weise gemessen und ein Reagens für die Messung von Harnstoffstickstoff in der gleichen Weise hergestellt werden wie in herkömmlichen Techniken, mit dem Unterschied, daß das Reagens eine Sulfhydryl-Verbindung zusammen mit Urease enthält. Beispielsweise kann Ammoniak, das in einer Probe vorhanden ist, in einer Vorbehandlung entfernt werden, bevor es der Urease und der Sulfhydry-Verbindung ermöglicht wird zu reagieren.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es zur Erhöhung der Genauigkeit der Messung bevorzugt, Ammoniak aus einer Probe zu entfernen, bevor die Messung von Harnstoffstickstoff durch Reaktion von GLDH mit dem Ammoniak in Gegenwart von α-KG und NADH oder NADPH erfolgt. Da die Struktur eines Reagens für die Eliminierung von Ammoniak mit der Struktur für das Reagens zur Messung von Harnstoffstickstoff überlappt, kann das Reagens zur Eliminierung von Ammoniak direkt für Messung von Harnstoffstickstoff verwendet werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Probe nicht besonders beschränkt, sofern sie eine Harnstoff-Komponente enthält. Beispiele für die Probe schließen Plasma, Serum, Urin und eine Lösung, die durch Verdünnung von diesen hergestellt wird, ein.

Die Sulfhydryl-Verbindung, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, schließt Thioglycerol, Thioapfelsäure, Thioglykolsäure, Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropionsäure, Thiophenol, Cystein, N-Acetylcyctein, die reduzierte Form von Glutathion, Dithiothreitol und Dithioerythritol ein. Thioglycerol ist als Sulfhydryl-Verbindung bevorzugt, da Thioglycerol weniger Geruch erzeugt und stabil ist.

Die Konzentration der Sulfhydryl-Verbindung sollte in Abhängigkeit von der Art der Verbindung, der Art der Probe, den Meßbedingungen und anderen Faktoren sauber eingestellt werden, und sie liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 1 000 mM, vorzugsweise 1 bis 500 mM, besonders bevorzugt 10 bis 500 mM.

Die Konzentration von α-Kg, entweder NADH oder NADPH, GLDH und Urease, die dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, variiert in Abhängigkeit von der Menge an Ammoniak, die zu Beginn in der Probe vorhanden ist, und der Menge an Harnstoff, die gemessen werden soll, und geeignete Konzentrationen davon können nach den jeweiligen Erfordernissen ausgewählt werden. Beispielsweise ist die Menge von α-KG im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 50 mM, vorzugsweise 1 bis 30 mM. Die Menge an NADH oder NADPH ist im allgemeinen im Bereich von 0,05 bis 5 mM, vorzugsweise 0,1 bis 1 mM, und die Menge davon wird innerhalb eines Bereiches eingestellt, in dem die Grenze der Absorbanz nicht überschritten wird. Obwohl nicht sonderlich eingeschränkt, wird GLDH vorzugsweise aus Rinderleber oder Bakterien gewonnen. Die Konzentration von GLDH ist im Bereich von 0,1 bis 100 Einheiten/ml (u/ml), vorzugsweise 0,5 bis 70 Einheiten/ml. Der Ursprung der Urease ist nicht sonderlich beschränkt. Die Urease schließt solche ein, die aus Jackbohnen (jack bean) und Bakterien erhalten wird. Die Konzentration an Urease ist 0,1 bis 100 Einheiten/ml, vorzugsweise 0,5 bis 50 Einheiten/ml, und die geeignete Konzentration davon sollte in Abhängigkeit von der Menge der Sulfhydry-Verbindung ausgewählt werden.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist der pH-Wert bei der Messung von Harnstoffstickstoff auf einen pH-Wert von 6 bis 10 eingestellt, vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 10. Der pH-Wert wird mit einer allgemeinen Pufferlösung eingestellt, und die verwendbare Pufferlösung wird ausgewählt aus einer Tris-Pufferlösung, einer Salzsäure-Pufferlösung, einer Phosphorsäure-Pufferlösung, einer Carbonsäure-Pufferlösung, einer Imidazol-Pufferlösung, einer Diethanolamin-Pufferlösung, einer Triethanolamin-Pufferlösung und Good′s-Pufferlösungen wie beispielsweise HEPES.

Da die vorliegende Erfindung wie oben beschrieben ein Reaktionsgeschwindigkeitsverfahren zur Messung einer Harnstoffstickstoff-Menge unter Ausnutzung der Abnahmegeschwindigkeit von NADH oder NADPH als Anzeiger ist, wird die Messung innerhalb eines kurzen Zeitraumes durchgeführt, und wird kaum durch interferierende Substanzen in der Probe mit einer Absorption im UV-Bereich beeinflußt. Darüber hinaus wird, wenn die Sulfhydryl-Verbindung mit der Probe vermischt wird, deren Urease-inhibierende Wirkung nicht beeinflußt, und selbst eine hohe Harnstoffkonzentration kann quantitativ genau bestimmt werden. Ferner wird auch in einer Probe, die Polyole wie beispielsweise Mannitol enthält, die Urease-inhibierende Wirkung nicht ausgelöscht, so daß auch eine Probe genau auf Harnstoffstickstoff untersucht werden kann, die Mannitol enthält, von der es bisher unmöglich war, ein genaues Ergebnis zu erhalten, und das erfindungsgemäße Verfahren ist in klinischen Tests sehr nützlich.

Das erfindungsgemäße Set zur Messung von Harnstoffstickstoff umfaßt als Bestandteile

i) α-Ketoglutarsäure (α-KG),
ii) die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin dinukleotid (NADH) oder die reduzierte Form von Nicotinamid adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH),
iii) Glutamatdehydrogenase (GLDH),
iv) eine Sulfhydryl-Verbindung, und
v) Urease.

Der Ursprung, die Konzentration usw. von jedem Bestandteil sind detailliert bei der Beschreibung des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, und werden daher hier weggelassen.

Im allgemeinen ist das erfindungsgemäße Set vorzugsweise eine Kombination aus einem ersten Reagens, das eine Pufferlösung, α-KG, entweder NADH oder NADPH und GLDH enthält, und ein zweites Reagens, das eine Pufferlösung, Urease und eine Sulfhydryl-Verbindung enthält. Der Grund hierfür ist, daß, wenn das erste Reagens zuerst mit der Probe vermischt wird, in der Probe vorhandenes Ammoniak vorab entfernt werden kann, so daß der Harnstoffstickstoff genau gemessen werden kann. Das zweite Reagens kann α-KG enthalten.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detailliert unter Bezugnahme auf Beispiele und Vergleichsbeispiele weiter beschrieben.

Beispiel 1

Als erstes Reagens wurde ein wäßrige Lösung verwendet, die folgendes enthielt, und einen pH-Wert von 8,2 aufwies:

Tris-Pufferlösung\|100 mM
α-KG	12 mM
NADPH	0,3 mM
GLDH	10 U/ml

Als zweites Reagens wurde eine wäßrige Lösung verwendet, die folgendes enthielt, und einen pH-Wert von 8,2 aufwies:

Tris-Pufferlösung\|100 mM
α-KG	12 mM
Urease	10 U/ml
Thioglycerol	400 mM

Als Proben wurde eine Probe M₀ hergestellt, die eine Harnstoffstickstoff-Konzentration von 50 mg/dl aufwies, und eine Probe M₅, die 20% Mannitol und eine Harnstoffstickstoff-Konzentration von 50 mg/dl aufwies. Ferner wurde die Probe M₅ mit der Probe M₀ unter Herstellung von Proben mit Mannitol-Konzentrationen von 4, 8, 12 und 16% und Harnstoffstickstoff-Konzentrationen von jeweils 50 mg/dl verdünnt, und diese Proben wurden als Proben M₁, M₂, M₃ und M₄ verwendet.

Das erste Reagens wurde in einer Menge von 300 µl zur 12 µl von jeder der obigen Proben M₀ bis M₅ zugegeben, und die Mischungen wurden für 5 min auf 37°C erwärmt. Dann wurden 75 µl des zweiten Reagens zu jeder der Mischungen zugegeben, und die Mischungen wurden hinsichtlich der Veränderung der Absorbans bei 340 nm pro Zeiteinheit mit einem automatischen Analysengerät, Modell 7150 von Hitachi Ltd., gemessen. Die Harnstoffstickstoff-Konzentration in jeder Probe wurde auf Basis einer zuvor hergestellten Eichkurve bestimmt. Tabelle 1 und Fig. 1 zeigen die Ergebnisse.

Vergleichsbeispiel 1

Harnstoffstickstoff-Konzentrationen wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt, mit dem Unterschied, daß das Thioglycerol in dem zweiten Reagens, das in Beispiel 1 verwendet wurde, durch 75 mM Borsäure ersetzt wurde. Tabelle 1 und Fig. 1 zeigen Ergebnisse.

Tabelle 1

(Einfluß von Mannitol)

Einheit: mg/dl

In Fig. 1 sind die Ergebnisse von Beispiel 1 durch -O- angezeigt, diejenigen aus Vergleichsbeispiel 1 sind durch -⚫- angezeigt, die Ordinatenachse zeigt die Harnstoffstickstoff-Konzentrationen (mg/dl), und die Abszissenachse zeigt Mannitolkonzentrationen (%).

Die Ergebnisse in Tabelle und Fig. 1 zeigen das folgende. Das Urease-GLDH-Verfahren unter Verwendung von Thioglycerol als Urease-Inhibitor (Beispiel 1) zeigt keinen Einfluß, der durch Mannitol in den Proben hervorgerufen wird, und erlaubt genaue Messung der Harnstoffstickstoff-Konzentrationen im Vergleich zu dem Verfahren, worin Borsäure als Urease-Inhibitor verwendet wird (Vergleichsbeispiel 1).

Beispiel 2

Blutserum, das kein Polyol enthielt, wurde als Probe verwendet. Die Proben wurden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen, sowie nach dem Verfahren (bekanntes Verfahren) unter Verwendung von Borsäure als Urease-Inhibitor, das in der obigen JP-B-3-65160 beschrieben ist und von dem davon ausgegangen wird, daß es eine hohe Verläßlichkeit besitzt und das allgemein in klinischen Tests angewandt wird, und die Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem obigen bekannten Verfahren untersucht. Als Ergebnis wurde herausgefunden, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine bemerkenswert signifikante Korrelation zu dem obigen bekannten Verfahren aufweist.

Erfindungsgemäß kann eine Probe, die Mannitol enthält, das bei der Stickstoffharnstoffmessung auf Grundlage eines Reaktionsgeschwindigkeitsverfahrens einen Fehler hervorruft, genau gemessen werden, und ferner kann eine Probe mit einer hohen Konzentration an Harnstoffstickstoff gemessen werden. Die vorliegende Erfindung stellt daher einen Beitrag für klinische Tests dar.

Claims

1. Verfahren zur Messung von Stickstoffharnstoff, umfassend die Hydrolyse von Harnstoff in einer Probe mit Urease, Umsetzung von Glutamatdehydrogenase (GLDH) mit Ammoniak, das durch die Hydrolyse gebildet wird, in Gegenwart von α-Ketoglutarsäure (α-KG) und der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) oder der reduzierten Form von Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH), und Messung der Abnahmegeschwindigkeit der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinukleotids (NADH) oder der reduzierten Form des Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphats (NADPH), wodurch der aus dem Harnstoff stammende Harnstoffstickstoff gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sulfhydryl-Verbindung zusammen mit der Urease vorhanden ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Sulfhydryl-Verbindung ausgewählt ist aus Thioglycerol, Thioapfelsäure, Thioglykolsäure, Mercaptoethanol, 3-Mercaptopropionsäure, Thiophenol, Cystein, N-Acetylcystein, der reduzierten Form von Gluathion, Dithiothreitol und Dithioerythritol.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Konzentration der Sulfhydryl-Verbindung 0,1 bis 1000 mM beträgt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Ammoniak in einer Probe vor der Messung des Harnstoffstickstoffs entfernt wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin die Entfernung des Ammoniaks durchgeführt wird durch Reaktion von GLDH mit dem Ammoniak in Gegenwart von α-KG und NADH oder NADPH.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Reagens zur Entfernung des Ammoniaks direkt zur Messung des Harnstoffstickstoffs verwendet wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Probe ausgewählt ist aus Plasma, Serum, Urin und einer Lösung, die jeweils durch Verdünnung davon erhalten wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Menge an α-KG 0,1 bis 50 mM beträgt, die Menge an NADH oder NADPH ist 0,05 bis 5 mM, und die Konzentration an GLDH ist 0,1 bis 100 Einheiten/ml.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der pH-Wert bei der Messung des Harnstoffstickstoffs auf 6 bis 10 eingestellt ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der pH-Wert eingestellt wird mit einer Pufferlösung, ausgewählt aus einer Tris-Pufferlösung, einer Salzsäure-Pufferlösung, einer Phosphorsäure-Pufferlösung, einer Carbonsäure-Pufferlösung, einer Imidazol-Pufferlösung, einer Diethanolamin-Pufferlösung, einer Triethanolamin-Pufferlösung und Good′s Pufferlösungen.

11. Ein Set zur Messung von Harnstoffstickstoff, umfassend als Bestandteile:

i) α-Ketoglutarsäure (α-KG),
ii) die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin dinukleotid (NADH) oder die reduzierte Form von Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADPH),
iii) Glutamatdehydrogenase (GLDH)
iv) eine Sulfhydryl-Verbindung, und
v) Urease.

12. Set gemäß Anspruch 11, das eine Kombination aus einem ersten Reagens, das eine Pufferlösung, α-KG, entweder NADH oder NADPH und GLDH enthält, und einem zweiten Reagens, das eine Pufferlösung, Urease und eine Sulfhydryl-Verbindung enthält, darstellt.

13. Set gemäß Anspruch 12, worin das zweite Reagens α-KG enthält.