DE2547557A1 - Mittel und verfahren zum unterbrechen einer enzymreaktion - Google Patents

Description

Priorität : 23. Oktober 1974, Japan , Nr. 122 243

Mittel und Verfahren zum Unterbrechen einer Enzymreaktion

Die Erfindung betrifft ein Kittel zum Unterbrechen einer Reaktion, das für die Messung der Aktivität von Seruraenzymen geeignet ist, die als Diagnosemerkmal für die Diagnose von leber-, Herz- und Muskelerkrankungen beim Menschen angev/endet werden.

Die Erfindung betrifft im einzelnen die neue Anwendung einer wäesr.ig-alkalischen Lösung von Cyclohexylaininopropansulfonsäure mit einem festgelegten Bereich der Konzentration und des pH-V»^rerts, als Unterbrechungsmittel zum Unterbrechen der enzymatischen Reaktion von Dehydrogenase oder einem Dehydrogenase-System bei der spektrophotoraetrischen Methode zur Messung der Aktivität von Serumenzym in dem vorstehend angegebenen Enzym oder Enzymsystem.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Unterbrechung der enzymatischen Reaktion von Dehydrogenase oder einem Dehydrogenase-System bei der spektrophotometrischen Kessung der Aktivität des Serumenzyms in dem angegebenen Enzym oder Enzymsystem, das dadurch gekennzeichnet ist, daß als Unterbrechungsmittel für diese enzymatische Reaktion eine wässrig-alkalische Lösung von Cyclohexylaminopropansulfonsäure sit einer Konzentration von 0,1 bis 2 m und einem pH-Wert von 10,5 bis 12,5 verwendet wird.

Zu geeigneten spektrophotometrischen Messmethoden zur Messung der

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² 2b47bb?

Aktivität von Serumenzym bei einer Dyhydrogenase oder einem Dehydrogenase-System die erfindungsgemäß angewendet v/erden können, gehören verschiedene Messmethoden, die üblicherweise auf diesem Fachgebiet zu dem angegebenen Zweck angewendet werden. Gee.ignete Beispiele dafür sind die Messung der Ultraviolettabsorption (nachstehend als "Ultraviolettmessung" bezeichnet), bei der die Aktivität von Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase (nachstehend als GOT bezeichnet), Glutaminsäure-Pyruvat-Transaminase (nachstehend als GPT bezeichnet), Aldolase (nachstehend als ALD bezeichnet), Kreatinphosphokinase (nachstehend als CPK bezeichnet), Milchsäuredehydrogenase (nachstehend als LDH bezeichnet), Alkoholdehydrogenase oder Sorbit-Dehydrogenase im menschlichen Serum durch Messung der Änderung der Absorption von Nikotinamid-adenindinucleotid (nachstehend als NAD bezeichnet) oder Nikotinamidadenin-dinucleotid-phosphat (nachstehend als FADP bezeichnet) bei 340 nm bestimmt wird, die dem Reaktionsmedium entweder für sich oder in Kombination mit einer geeigneten Dehydrogenase bzw. einem Dehydrogenase-System zugesetzt werden. Weiterhin gehören dazu die PluoreszenzEiessungsmethode (nachstehend als "Fluoreszenzmethode" bezeichnet), bei der die Serumenzymaktivität der vorstehend angegebenen Enzyme in menschlichem Serum durch Veränderung . der Intensität der Fluoreszenz von FAD oder NADP bei der Anregung mit einer Strahlung von 340 nm gemessen wird, wobei FAD oder FADP dem Reaktionsmedium entweder für sich oder in Kombination . mit einer Dehydrogenase zugefügt wird, sowie ähnliche Methoden.

Die Erfindung wix^d nachstehend ausführlicher erläutert, wobei aus Gründen der Bequemlichkeit nur auf die Methode der Ultraviolettmessung Bezug genommen wird. Es ist jedoch ersichtlich, daß das erfincLungsgemäße Unterbrechungsmittel in zufriedenstellender Weise auch auf jede andere Messmethode angewendet werden kann, wie die Fluoreszenzmessungsmethode und dergleichen.

Ein Anstieg der GOT- oder GPT-Aktivität im Serum tritt bei manchen lebererkrankungen oder bei Herzkranzinfarkten ein, so daß die Messung dieser Aktivität als geeignetes Mittel zur Diagnose dieser Erkrankungen angesehen wird.

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2 b 4 7 b b 7

Zur Messung der Serum-GOT- oder GPT-Aktivität kann die Reaktion durchgeführt werden, indes Maleatdehydrogenase im Fall von GOT und LDH im Fall von GPT zusammen mit den Enzymsubstraten, wie <?0-Ketoglutarsäure und L-Asparaginsäure für das zuerst genannte Enzym oder cc-Ketoglutarsäure und I-Alanin für das zuletzt genannte Enzym und eine reduzierte Form von NAD (nachstehend als NADH bezeichnet) in jedem Fall zu dem Reaktionssystem gegeben wird. Aus Asparaginsäure wird mit GOT Oxalessigsäure gebildet (bei Verwendung von GPT wird Brenztraubensäure aus Alanin gebildet und die bei Verwendung von GPT erhaltenen Produkte bzw. angewendeten Enzyme werden nachstehend in Klammern genannt). Diese Oxalessigsäure (Brenztraubensäure) wird mit Hilfe von Maleatdehydrogenase (Milchsäuredehydrogenase) in Apfelsäure (Milchsäure) übergeführt und gleichzeitig geht NADH durch Oxydation in NAD über, wobei eine Verminderung der durch NADH verursachten Absorption bei 340 nm stattfindet. Die Menge an Oxalessigsäure (Brenztraubensäure), die durch GOT (GPT) gebildet wird, ist stöchiometrisch gleich der Menge des oxydierten NADH und die Aktivität von GOT (GPT) kann daher durch den oxydierten Anteil an NADH bestimmt werden, der aus der Absorptionsverminderung bei 340 nm erhalten wird.

Die ALD-Aktivität im Serum wird bei Lebererkrankungen, progressiver Muskeldystrophie oder Herzkranzinfarkt erhöht. Zur Messung der ALD-Aktivität kann dem Reaktionsmedium Fructose-1,6-diphosphat als Substrat gemeinsam mit Triosephosphat-Isomerase (nachstehend als TMI bezeichnet) und Glycerin-1-phospbat-Dehydrogenase (nachstehend als GDH bezeichnet) zugesetzt werden. In diesem System werden die Verbindungen durch ALD in Dioxyacetonphosphorsäure übergeführt, die dann unter der Einwirkung von GDH und NADH in Glycerin-1-phosphat übergeführt wird. Gleichzeitig wird NADH zu NAD oxydiert. Die Hydrolyse von 1 Mol Fructose-l,6-diphosphat mit ALD führt zur Oxydation von 2 Mol NADH.

CPK wird im Serum bei einer Schädigung des Skelettmuskels oder Herzmuskels erhöht. Zur Bestimmung der CPK-Aktivität werden Kreatinphosphorsäure und Adenosin-5'-diphosphat (nachstehend als ADP bezeichnet) als Substrate verwendet und dem Reaktionsmedium werden außerdem Hexokinase (nachstehend als HK bezeichnet), Glucose, GIu-

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cose-6-phosphat-Dehydrogenase (nachstehend als G6PDH bezeichnet) und NADP zugesetzt. Durch die Einwirkung von CPK wird ADP in Adenosin-5'-triphosphat (nachstehend als ATP bezeichnet) umgewandelt,· während die Glucose in dem Reaktionsmedium unter der Einwirkung von ATP und HK in Glucose-6-phosphat tibergeführt wird. Danach wird das Glucose-6-phosphat unter der Einwirkung von G6PDH und NADP in 6-Phosphogluconsäure umgewandelt und gleichzeitig mit dieser Umwandlung wird NADP in seine reduzierte Form, die nachstehend als NADPH bezeichnet wird, übergeführt, wobei die Absorption bei 34Q nm ansteigt. Die Menge an ATP, die durch CPK gebildet wird, ist stö'chiometrisch gleich der Menge des reduzierten NADP.

Im Fall anderer Seruraenzyme, als der vorstehend aufgeführten, ist ein ähnliches Reaktionssystem anwendbar. Wenn das Serumenzym selbst eine Dehydrogenase ist, wie LDH, so wird die 'Enzymaktivität durch direkte Dehydrierung von NADH oder NADPH mit einem Substrat bestimmt, wobei die Absorptionsintensität bei 340 nm verändert wird.

Wie vorstehend angegeben wurde, besteht ein charakteristisches Merkmal der Ultraviolettmessungsmethode darin, daß die Messung unter Anwendung einer Dehydrogenasereaktion durchgeführt werden •kann, um die Reaktion des vorstehend angegebenen Serumenzyms in jedem Fall mit der Reaktion der Oxydation von NADH (oder NADPH) oder der Reaktion der Reduktion von NAD (oder NADP) zu koppeln.

Die Methode der Ultraviolettmessung erfordert keine Färbungsverfahren und kann mit Hilfe äußerst einfacher Yerfahrensschritte bei der Bestimmung durchgeführt werden, im Gegensatz zu anderen Messmethoden, bei denen nach der Färbung des Reaktionsprodukts oder des restlichen Substrats eine kolorimetrische Bestimmung durchgeführt werden muß.

Die Absorptionsintensität von NADH oder NADPH bei 340 nm ist ausserdem völlig proportional der Konzentration dieser Verbindungen und der molare Extensionskoeffizient ist ausreichend hoch. Mit Hilfe der Ultraviolettmethode lassen sich bemerkenswert hohe Präzision, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, verglichen mit an-· deren bekannten Methoden erreichen. Die Angabe eines Aktivitäts-

R Π 9 8 1 8 / 1 1 α 7

werts (Aktivitätseinheit), die in jüngerer Zeit durch die International Union of Biochemistry empfohlen worden ist, läßt sich leicht durchführen, indem die Änderung der Absorption bei 340 nm mit einem Koeffizienten multipliziert wird. Im Hinblick auf diesen erwähnten zusätzlichen Vorteil wurde schließlich angenommen, daß die Methode der Ultraviolettmessung, die bisher in der biochemischen Grundlagenforschung angewendet wurde,zur Durchführung von Routinebestimmungen der Serumenzyme in klinischen Diagnoselaboratorien anwendbar ist«

Die bisher angewendeten Methoden der Ultraviolettmessung, die manuell durchgeführt werden, finden jedoch keine verbreitete Anwendung, weil es in Ermangelung eines für die vorstehend erläuterte Enzymreaktion geeigneten Unterbrechungsmittels schwierig ist, eine große Anzahl an Serumproben zu analysieren. Außerdem sollte in Fällen, in denen täglich zahlreiche Serumproben analysiert werden, wie es in einem klinischen Diagnoselaboratorium der Fall ist, ein spezielles Photometer angewendet werden, das speziell für die Methode der Ultraviolettaessung entv/ickelt wurde, wie beispielsweise ein Reaktionsgeschwindigkeits-Analysegerät vom Typ IKB-8600 (LKB Co., Schweden), ein Rotoehem II-Fast Analyzer (Aminco Co., USA) etc. Im einzelnen wird bei manuellen Verfahren unter Verwendung eines üblichen Photometers zur Durchführung der Ultraviolettmessung ein Reaktionsgemisch und eine Serumprobe in eine Zelle gegeben und die Veränderung der Absorption bei 340 nm in Abhängigkeit von der Zeit während 10 bis 30 Minuten gemessen. Wegen dieser zeitraubenden Methode ist die Anzahl der pro Tag zu testenden Serumproben auf höchstens 10 bis 20 beschränkt und die Durchführung dieser Messungen während eines ganzen Tages ist sehr ermüdend für den Analytiker. Darüber hinaus ist das bisher verwendete spezifische Photometer eine sehr aufwendige Vorrichtung und erfordert eine hohe Kapitalinvestition, so daß sie für mittlere und kleine klinische Diagnoselaboratorien nicht geeignet ist.

Auf diesem Fachgebiet wurde bereits eine beträchtliche Anzahl von Unterbrechungsmitteln für übliche enzymatische Reaktionen vorgeschlagen, die jedoch aus nachstehenden Gründen nicht für die Ultraviolettmethode anwendbar sind. Entproteinierungsmittel, wie Tri-

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chloressigsäure, Perchlorsäure, Metaphosphorsäure, Schwefelsäure-Wolframsäure und dergleichen, vermindern die" Absorption von I¹JADH (oder NADPH) bei 340 nm und wenn andere Säuren in einer zum Unterbrechen der Reaktion ausreichenden Menge dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, so wird ebenfalls eine verminderte Absorption bei 340 η verursacht. Venn andererseits eine wässrige Lösung eines alkalischen Mittels, wie Natriumhydroxid, in einer zum Unterbrechen der Reaktion ausreichenden Menge zugesetzt wird, so unterliegt die Absorption von NAD (oder NADH) bei 340 nm unregelmäßigen Änderungen. Wenn die Enzymreaktion durch Wärmebehandlung unterbrochen wird, so wird das Reaktionsgemisch durch das Serumeinweiß trübe und durch übliche Zentrifugation bei 3000 Upm oder weniger kann die Trübung nur teilweise entfernt werden und keine zur Messung geeignete klare lösung erhalten werden.

Gemäß dem Stand der Technik wurde außerdem berichtet, daß eine wässrig alkalische lösung von p-Chlormercuribenzoat als Unterbrechungsmittel für die Dehydrogenasereaktion verwendet werden kann (E. Raabo, Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation, 17,-(1965),■265). Es wurde jedoch bestätigt, daß diese Lösung nur dann zu einer Hemmung der Dehydrogenasereaktion •führt, wenn im Reaktionsgemisch eine eng begrenzte Pufferkonzentration herrscht und daß darüber hinaus nur eine partielle Hemmung der Dehydrogenasereaktion erzielt wird, wenn ein Reaktions-. gemisch aus handelsüblichen diagnostischen Mitteln verv/endet wird. Diese bekannte Lösung eignet sich daher nicht für die praktische Anwendung.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, diese Nachfrage nach geeigneten Unterbrechungsmitteln zu befriedigen. Bei weitreichenden Untersuchungen zur Lösung dieser Aufgabe wurde festgestellt, daß zahlreiche unterschiedliche Dehydrogenasen vollständig gehemmt werden können, wenn eine geeignete Menge einer wässrig alkalischen Lösung verwendet wird, die eine spezifische Konzentration an Cyclohexylarainopropansulfonsäure (nachstehend als GAPS bezeichnet) und einen spezifischen pH-Wert aufweist und starke Pufferwirkung innerhalb eines alkalischen pH-Bereiches zeigt. Diese Lösung verursacht keine Veränderung der Absorption von NAD oder

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NADP im Gebiet von 340 um und zeigt außerdem ideale Merkmale als Unterbrechungsmittel, ohne daß sie in irgendeiner Weise die Trübung des Serums von normalen gesunden Patienten sowie auch von lipämischem Serum beeinflußt.

Es ist außerdem Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Unterbrechung der enzymatischen Reaktion einer Dehydrogenase oder eines Dehydrogenase-Systems bei der spektrophotometrischen Messmethode zur Verfugung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch die Verwendung einer wässrig alkalischen Lösung von CAPS gelöst.

Andere Gegenstände und Vorteile der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Unterbrechungsmittels wird es möglich, die Reaktion in zahlreichen Serumproben gleichzeitig durchzuführen, die Reaktion dann durch Zugabe des Unterbrechungsmittels nach einer bestimmten Dauer zu unterbrechen und anschliessend die Enzymaktivität durch Messung der Absorption bei 340 nin zu bestimmen. Mit Hilfe dieser Verfahrensweise wird es möglich, daß eine einzige Person die jeweilige Aktivität an 100 bis 200 Serumproben pro Tag bestimmen kann.

In dem Pail, in welchem die Aktivität im Verlauf der Zeit in einer Zelle gemessen wird, ist es unmöglich, das Volumen des Reaktionsgemisches auf einen bestimmten Wert zu vermindern, weil ein gewisses Fassungsvermögen der Zelle erforderlich ist. Dagegen ist es bei Anwendung eines Verfahrens unter Verwendung des erfindungsgemäßen Unterbrechungsmittels möglich, daß die Menge des umzusetzenden Reaktionsgemisches vermindert wird, indem die Menge des zuzusetzenden Unterbrechungsmittels eingestellt wird, da es ausreicht, wenn das Endvolumen nach der Zugabe des Unterbrechungsmittels den erforderlichen Grenzwert der Kapazität für die Messung überschreitet.

Im allgemeinen ist es einfach, das Volumen des Reaktionsgemisches auf einen geringen Wert, wie 1/3 bis 1/6 des Werts bei der üblichen manuellen Methode zu vermindern. Eine Blindprobe für das Serum kann ohne Zugabe des Reaktionsgemisches geprüft werden und·eine Blindprobe aus dem Reagenz wird gesondert gemessen. Der

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Blindwert für den Versuch wird, als Summe der vorstehend angegebenen beiden Blindwerte bestimmt. So wird kein Reagenz für die Korrektur durch die Blindprobe verbraucht, wodurch die erforderlichen Ersparnisse an Reagenz in klinischen Laboratorien erhielt werden.

Genauere Einzelheiten der Erfindung und des erfindungsgemäßen Verfahrens werden nachstehend ausführlicher erklärt.

Wirkung_einer_alkalischen_Puff££lösung_auf_die Dehy_drogenaseaktiyität_und_Einfluß_auf_die_Absor£tionsinten

Als Ergebnis der der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen an Phosphatpufferlösung, GIycinpufferlösung, Argininpufferlösung, Guanidinpufferlösung und CAPS-Pufferlösung wurde gefunden, daß andere Pufferlösungen, als CAPS-Pufferlösung, einige Nachteile zeigen und nicht geeignet sind, als Unterbrechungsmittel verwendet zu werden.

,Phosphatpufferlösung hat die Wirkung, daß sie die Autoxydation von NADH merklich fördert. Diese Wirkung kann durch Zugabe einer geeigneten Menge an Äthylendiamintetraessigsäure (ÄDTE) verhindert werden, wobei aber die Absorption von NAD bei 340 "nm durch Zugabe einer ÄDTE enthaltenden Phosphatpufferlösung zu dem Enzym-Reaktionsgemisch, welches eine Aminosäure, beispielsweise Glycin, enthält, stark erhöht wird und auf diese Weise eine nicht enzymatische Veränderung bei NAD verursacht wird. Eine entsprechende Änderung der Absorption kann hervorgerufen werden, wenn eine Glycinpufferlösung oder eine Argininpufferlösung einem ÄDTE enthaltenden Reaktionsgemisch zugesetzt wird. Dabei wird eine Erhöhung der Absorption von NAD bei 340 nm verursacht. Eine Guanidinpufferlösung zeigt diese Wirkung nicht, die Lösung selbst kann jedoch die Absorption von NAD bei der Konzentration und dem pH-Wert, die zur Hemmung der Wirkung eines Enzyms notwendig sind, erhöhen. Diese Wirkung einer Erhöhung der Absorption von NAD kann im Verlauf der-Zeit ständig schwanken und es ist daher schwierig, den so verur-

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sachten Einfluß zu korrigieren.

(2 ) Hemmwirkung_von_CAPS-Pufferlösung_auf_die_Deh£drogenasereaktion

Vier Enzyme, die in weitem Umfang zur Prüfung "bei der klinischen Diagnose unter den verschiedenen Serumenzymen angewendet werden, wurden im Hinblick auf die durch CAPS-Pufferlö'sung ausgeübte inhibierende Wirkung geprüft. Einige dieser Versuche sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. In diesen Versuchen wurden die Veränderungen der Absorption bei 340 nm während des gesamten Vorgangs der Reaktion automatisch aufgezeichnet und als Grad der Hemmung ausgedrückt. Dabei wird zur Durchführung der Reaktion Serum zu einem Reaktionsgemisch gegeben und danach wird die CAPS-Pufferlösung in unterschiedlichen Konzentrationen bei unterschiedlichen pH-Werten und in unterschiedlichen Mengen zugefügt.

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a b e 1 1

CAPS-Pufferlösung	Konzentration (m) 3)	pH 3)	Konzentration für die voll ständige Hemmung mit wäss riger NaOH-Lösung (Endlcon- zentration)	Serumenzym 1)	GOT	GPT	AID	CPK
Zugesetzte Menge	0,5	12,0 12,5	C 4) C	C C	C C	C C
1/2 Vol.	1	11,0 11,5	80 C	C C	C G	C C
1 VOle	2	10,5 11,0	65 C	C C	C C	C C
2 Vol.	. 0,5	11,0 11,5	85 C	C C	C G	C C
4- Vol.	1	10,5 11,0	70 C	C C	C G	C C
2	10,5	C	C	C	c ■
0,1	11,0 11,5	10 35	70 C	95 C	95 C
0,125	11,5	80	C	C	C
0,5	10,5 11,0	85 C	C C	C C	G C
0,1	11,5	C	C	C	C
0,125	11,0	C	C	C	C
>0,15n	>0,15n	>O,ln	>O,ln

1) Diagnostische Reagentien der Calbiochem USA, zur Bestimmung von GOT, GPT und CPK, und diagnostische Reagentien der Boeringer Mannheim, zur Bestimmung von AID, menschliches Standardserum (CaI-trol-Abnormal) der Calbioehem, zur Verwendung für Serum.

2) Volumenverhältnis der zugesetzten Pufferlösung zu dem Enzym-Reaktionsgemiech. Die Bezeichnung 1/2 Volumen bedeutet beispiels-

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weise, daß eine halbe Volumeneinheit Pufferlösung pro Volumeneinheit des Reaktionsgemiscb.es zugesetzt wird.

3) Molare Konzentration und pH-Wert der zugesetzten Pufferlösung.

4) C bedeutet 100 $ige, vollständige Hemmung und eine entsprechende Zahl bedeutet die prozentuale teilweise Hemmung.

a) Einfluß auf die Absorptionsintensität

Durch Zugabe einer CAPS-Pufferlösung zu einer Coenzymlösung wird gewöhnlich die Absorptionsintensität des Coenzyme bei 340 nm in gewissem Umfang erhöht, wenn auch in Abhängigkeit von der Konzentration und dem pH-Wert der Pufferlösung größere oder kleinere Unterschiede beobachtet werden. Die Erhöhung der Absorption der oxydierten Form und der reduzierten Form des Coenzyms sind jedoch pro u-Mol-Einheit ungefähr gleich und wenn demnach Arbeitskurven durch Messung der Absorption bei 340 nm bei verschiedenen Verhältnissen der oxydierten Form zu der reduzierten Form bei Konstanthalten der Gesamtmenge des Coenzyms aufgenommen werden, so wird bei der Zugabe von CAPS-PufferlöBung eine Kurve erhalten, deren Neigung gleich der Kurve ist, die ohne Zugabe des Puffers erhalten wird, und die man durch Verschieben der ohne Pufferlösung aufgenommenen Kurve in Richtung erhöhter Absorptionsintensität erhalten kann.

Bei der Ultraviolett-Messmethode wird die Enzymaktivität durch den Unterschied der Absorption bei 340 nm vor und nach der Durchführung der Reaktion bestimmt und aus diesem Grund wird die Absorptionserhöhung durch die CAPS-Pufferlösung ausgeschaltet.

b) Einfluß auf die Stabilität der Absorptionsintensität

Wie vorstehend erläutert wurde, wurde gefunden, daß die Absorption des Coenzyms bei 340 nm nach der lösung in gewissem Maß durch die erfindungsgemäße Zugabe von CAPS-Pufferlösung erhöht wird. Einige der Versuche über die Stabilität der Absorption nach der Lösung sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. In dieser Tabelle wird die Veränderung der Absorptionsintensität bei 340 nm während 3 Stun-

fi 0 9 8 1 8 > 1 1 Ö ?

den nach der lösung des Coenzyme in CAPS-Pufferlösung gezeigt,

Tabelle2

3APS1^-Puffer- Lösung	NAD	NADH	NADP	NADPH
3,5 m; pH 11,5	Ο,ΟΙΟΑ/h/cra2^ Keine größere Veränderung der O.D.	Unver ändert	Unver ändert	Unverän dert
3,33 m; pH 11,5	0,005A/h/cm Keine größere Veränderung der O.D.	ti	Il	It
3,25 m; pH 11,5	τ) Unverändert '	ti	It	It
3,25 m; pH 11,5 (enthaltend L2,5 mMol ÄDTE)	It	H	It	It
3,25 m; pH 12,0	0,005A/h/cm Keine größere Veränderung der O.D.	Il	Il	tt
3,25 m; pH 12,5	0,010A/h/cH leine größere Veränderung der O.D.	It	0,005A/h/cm Keine größere Veränderung der O.D.	It

1) Das Coenzym wird in der angegebenen Pufferlösung in einer Konzentration von 1,1 χ 10"~^m gelöst.

2) Änderung der Absorption pro Stunde bei Messung mit Hilfe einer Zelle einer optischen Weglänge von 1 cm.

3) Änderung der Absorption von ί 0,002A oder weniger während Stunden unmittelbar nach dem Auflösen werden als"unverändert"bezeichnet.

Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, sind alle Coenzyme in Pufferlösungen

einer Konzentration von 0,25 m oder weniger und einem pH-Wert von 11,5 oder weniger stabil und sind auch dann stabil, wenn ÄDTE in einer Konzentration von 12,5 mMol oder weniger vorliegt. Andererseits wird die Stabilität von NAD etwas vermindert, wenn die Konzentration 0,33 m oder mehr oder der pH-Wert 12 oder mehr beträgt. Wenn der pH-Wert 12,5 oder mehr beträgt, so wird die Stabilität von NADP ebenfalls vermindert, während die Stabilität der reduzierten Form des Coenzyme nicht beeinflußt wird.

Wenn NAD oder NADP in einer wässrigen Lösung eines stark alkalischen Kittels, z. B. Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, gelöst wird, so erhöht sich die Absorptionsintensität bei 340 nm im Verlauf der Zeit bis zu einem Maximum, das nach 10 bis 20 Minu ten erreicht wird, und fällt dann allmählich wieder ab. Diese Änderungen treten ständig während mehrerer Stunden auf und je höher die Alkalikonzentration ist, desto größer ist die beobachtete Änderung* Es ist daher äußerst schwierig, Bedingungen aufzufinden, unter denen die Enzymreaktion ohne jegliche Beeinflußung der Absorption des Coenzyme unterbrochen wird, wenn eine wässrige Lösung eines starken Alkali ohne Pufferwirkung verwendet wird.

.(4) Einf luß_auf_die_g_Trübung_<>_des_Serums

Bei der Bestimmung der Enzymaktivität wird die Absorption vor der Reaktion gewöhnlich gemessen, indem Serum zu dem Reaktionsgemisch gegeben wird und sofort CAPS-Pufferlösung zugesetzt wird, um die Reaktion zu unterbrechen. Durch Vereinfachung der vorstehend erwähnten Verfahrensweise kann folgende vorteilhafte Methode angewendet werden, da die Zugabe der CAPS-Pufferlösung die Trübung des Serums nicht beeinflußt.

Die Absorption des CAPS-Pufferlösung enthaltenden Reaktionsmediums wird vorherbestimmt und danach wird dazu die Absorption des Serums bei 340 nm addiert, v/odurch die Absorption vor der Reaktion festgelegt wird. Nach dieser Methode kann eine Einsparung an Reagenz ermöglicht werden, da kein Reagenz verbraucht wird, um für jedes Serum vor der Reaktion die Absorption zu bestimmen.

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Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollte.die Konzentration an CAPS in der wässrig alkalischen Lösung innerhalb eines Bereiches von 0,1 bis 2 molar, vorzugsweise 0,1 bis 0,5 molar und insbesondere bei 0,5 molar liegen. Der pH-Wert der wässrig alkalischen lösung von CAPS sollte innerhalb eines Bereiches von 10,5 bis 12,5» vorzugsweise 11,5 bis 12,5 und insbesondere bei 11,5 liegen. Als Alkalien, die für die Zwecke der Erfindung verwendbar sind, können beispielsweise Alkalimetallhydroxide, wie Ealiumhydroxid, Natriumhydroxid, lithiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid und dergleichen genannt werden. Es ist zu berücksichtigen, daß auch andere alkalische Substanzen als die vorstehend erwähnten eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß sie die Analyse'bedingungen, die Analysenergebnisee und dergleichen nicht störend beeinflussen.

Es ist wünschenswert, der wässrig alkalischen lösung von CAPS ausserdem einen wassermischbaren aliphatischen Alkohol zuzusetzen. Geeignete Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Alkohole sind Methanol, Äthanol, n-Propanol, Isopropanol und dergleichen. Die Menge des zuzusetzenden Alkohols ist kein wesentliches Merkmal, üblicherweise und vorzugsweise wird jedoch der Alkohol in einer Menge von 10 bis 30 fo (Y/V) eingesetzt. Im allgemeinen können Methanol oder Äthanol praktisch in einer Menge von 30 % eingesetzt werden,. n-Propanol kann in einer Menge von 10 $ und Isopropanol in einer Menge von 20 % verwendet werden.

Die Erfindung wird nachstehend durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.

Beispiel 1

Messung; der GOT-Aktivität in Serum

(a) Für eine Serumprobe wurden zwei Reagenzgläser A und B verwendet. In jedes Reagenzglas wurde 1,0 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,4 gegeben, welches die nachstehenden Bestandteile in den angegebenen Mengen enthielt.

Nachstehend sind die Enzym-Zubereitung in Einheiten (internationalen Einheiten) und die anderen Bestandteile in uMol angegeben.

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25475	57
100
7,5
36
16
0,8
0,17
0,33	Einheit
0,33	Einheit

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
ex, -Ketoglutarsäure
L-Asparaginsäure
Bernsteinsäure
Natriumhydrogencarbonat

Reduzierte Form von Nikotinamidadenindinucleotid

Ä'pfelsäure-Dehydrogenase
Milchsäure-Dehydrogenase

Die Reagenzgläser wurden in einem Wasser-Inkubator bei 30 C bebrütet und nach 5 Minuten wurden 25 jul Serum in das eine Reagenzglas A gegeben und gut eingemischt. Nach dem anschließenden Bebrüten während 60 Minuten wurden zu beiden Reagenzgläsern A und B je 1,0 ml einer 0,5 m CAPS-Pufferlösung (pH 11,5) gegeben und danach wurden 25 pl Serum in das Reagenzglas B gegeben. Beide Reagenzgläser wurden gründlich geschüttelt. 3 Stunden nach der Zugabe der CAPS-Pufferlösung wurde die Absorption der lösung in den
Reagenzgläsern A und B bei 340 nm mit Hilfe einer Zelle einer optischen Weglänge von 1 cm gemessen.

Die GOT-Aktivität wurde nach der nachstehenden Gleichung berechnet.

Die Absorption der Lösung in Reagenzglas A wird als A und die im
Reagenzglas B als B bezeichnet:

(B-A) χ 217 = Millieinheiten (internationale Einheit)/ml

Serum

(b) Nach der gleichen Verfahrensweise wie in dem vorstehend unter (a) beschriebenen Versuch, jedoch mit der Abänderung, daß anstelle der 0,5 m CAPS-Pufferlösung eine 0,2 m CAPS-30 #(V/V)-Methanolpufferlösung (pH 11,5) verwendet wurde, wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

6 0 9 8 18/1 1 Π ?

Beispiel 2 Messung; der G-PT-Aktlvität in Serum

(a) In diesem Versuch wurden zwei Reagenzgläser A und B für eine Serumprobe verwendet. In jedes Reagenzglas wurde ein 1,0 ml-Anteil einer Reaktionslösung vom pH 7_f4 der nachstehend angegebenen Zusammensetzung gegossen. Die Einheiten der angegebenen Vierte sind die gleichen, wie sie in Beispiel 1 (a) definiert wurden.

Tris~(hydroxymethyl)-aminomethan 100 £>0-Ketoglutarsäure 8,17

!-Alanin 16,5

Bernsteinsäure . 35 Natriumhydrogencarbonat 0,8

Reduzierte Form von Nikotinamid-

adenindinucleotid 0,17

Milchsäure-Dehydrogenase 0,33 Einheit

Die Reagenzgläser wurden in einem Wasser-Inkubator bei 30⁰C bebrütet und die anschließenden Verfahrensschritte wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (a) durchgeführt. Die GPT-Aktivität wurde mit Hilfe der in Beispiel 1 (a) angegebenen Gleichung berechnet.

(b) Nach der gleichen Verfahrensweise wie vorstehend unter (a), jedoch mit der Abänderung, daß anstelle der 0,5 m CAPS-Pufferlösung eine 0,2 m CAPS-20 $(V/V)-Isopropanol-Pufferlösung vom pH 11,5 verwendet wurde, wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

Beispiel 3 Messung der AIP-Aktivität in Serum

(a) Für eine Serumprobe wurden zwei Reagenzgläser, A und B, verwendete In jedes Reagenzglas wurde ein 1 ml-Anteil einer Reaktior.slösung vom pH 7,4 gegeben, welche die nachstehend angegebenen Bestandteile enthielt. Die Einheiten der angegebenen Werte waren die

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¹⁷ " 2 b 4 7 5 5 7

gleichen, wie sie in Beispiel 1 (a) definiert sind.

Collidin-Puffer 56 Monojodessigsäure 0,3

Fructose-ljö-diphosphorsäure 3

Reduzierte Form von Nikotinaiaidadenindinucleotid 0,17

Glycerin-1-phosphorsäure-Dehydroge-

nase 0,35 Einheit

Triosephosphat-Isomerase 2 Einheit

Die Reagenzgläser v/urden in einem Inkubator bei 30⁰C bebrütet und nach 5 Minuten v/urden 30 pl Serum in das Reagenzglas A gegeben und gut eingemischt. Nach dem Bebrüten während 60 Minuten wurde je 1 ml einer 0,5 m CAPS-Pufferlösung vom pH 11,5 in die Reagenzgläser A und B gegeben und danach wurden 30 ul des Serums in das Reagenzglas B gegeben. Beide Reagenzgläser wurden gründlich geschüttelt und die Absorption bei 340 nm wurde gemessen.

'Die entsprechenden Absorptionswerte werden als A und B bezeichnet und die Aktivität wird nach folgender Gleichung berechnet : (B-A) χ 90,6 = Millieinheiten/ml Serum

(b) Nach der gleichen Verfahrensweise wie unter (a), jedoch mit der Abänderung, daß anstelle der 0,5 m CAPS-Pufferlösung eine aus 0,2 ra CAPS und 10 # (V/V)n-Propanol bestehende Pufferlösung verwendet wurde, wurden die gleichen Ergebnisse erzielt.

Beispiel 4 Messung der CPK-Aktivität im Serum

Für eine Serumprobe wurden zwei Reagenzgläser verwendet und in die einzelnen Reagenzgläser wurde 1 ml einer Reaktionslösung vom pH-Wert 7,4 der nachstehend angegebenen Zusammensetzung gegossen. Die Einheiten für die angegebenen Werte sind die gleichen, wie sie in

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Beispiel 1 (a) definiert wurden.

Fatriumsalz von F,N^f-Bis-(2-ätüansulfonsäure)-piperazin 50 .

Natriumcarbonat 20

Dinatrium-creatinphosphat 20 Trilithium-adenosin-5'--diphosphat 1,5

Glucose 15

Magnesiumasparaginat 10

Adenosin^-5'-phosphorsäure 10 Glutathion 8,7

letranatrium-äthylendiainintetraacetat 1,66

Oxydierte Form von Nikotinamid-adenindinucieotid-phosphat 0,6

Hexokinase 1 Einheit

Glucose-ö-phosphorsäure-Dehydrogenase 0,33 Einheit

Die Reagenzgläser wurden in einem V/asserinkubator bei 30 C 5 Minuten bebrütet und danach wurden Je 50ul Serum in die Reagenzgläser A und B gegeben und eingemischt. Das Bebrüten wurde fortgesetzt und nach 15 Minuten und 60 Minuten wurden Je 2 ml einer 0,1 m CAPS-5mMol ÄBTE Pufferlösung (pH 11,5) in die Reagenzgläser A und B gegeben, um die Reaktion zu unterbrechen. Die Zeit nach der Zugabe der CAPS-Pufferlösung, zu der die Absorption bei 340 nm gemessen wird, wurde bei beiden Reagenzgläsern A und B auf den gleichen Wert eingestellt.

Die Absorption der Flüssigkeiten in den Reagenzgläsern A und B wird als A bzw. B bezeichnet und die Aktivität wird nach folgender Formel berechnet :

(A-B) χ 218 = Millieinheiten/ml Serum

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Claims (17)

Paten ta nsprüche

1. Verfahren zum Unterbrechen der enzymatischen Reaktion einer Dehydrogenase oder eines Dehydrogenase-Systems bei Durchführung der spektrophotometrischen Analyse zur Bestimmung der Aktivität eines Serumenzyms in dem angegebenen Enzym oder Enyzmsystern, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mittel zum Unterbrechen der enzymatischen Reaktion eine wässrig alkalische Lösung von Cyclohexylaminopropansulfonsäure einer Konzentration von 0,1 bis 2 m verwendet, die einen pH-Wert von 10,5 bis 12,5 hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Unterbrechen der enzymatischen Reaktion bei der spektrophotometrischen Analyse durchführt, bei der die Änderung der Absorption von Niktoinamid-adenin-dinucleotid oder Nikotinamid-adenin-dinucleotidphosphat bei 340 nm gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Unterbrechen der enzymatischen Reaktion bei der Fluoreszenzanalyse durchführt, bei der die Veränderung der Fluoreszenzintensität von Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder Nikotinamid-adenin-dinucleotidphosphat bei Anregung mit Licht einer V/ellenlänge von 340 nm gemessen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Unterbrechungsmittel verwendet, das in der wässrig alkalischen Lösung zusätzlich einen wassermischbaren aliphatischen Alkohol enthält.

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5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man das Unterbrechungsmittel in einer Konzentration, von 0,1 bis 0,5 m. und mit einem pH-Wert von 11,5 bis 12,5 verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet , daß man das Unterbrechungsmittel in einer Konzentration von 0,5 m und mit einem pH-Wert von 11,5 verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als wassermischbaren aliphatischen Alkohol Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den Alkohol in einer Konzentration von 10 bis 30 % einsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man Isopropanol in einer Konzentration von 20 ^ einsetzt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Unterbrechungsmittel verwendet, dessen Konzentration 0,2 m und dessen pH-Wert 11,5 beträgt, welches Isopropanol in einer Konzentration von 20 $ enthält.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge-

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kennzeichnet , daß man als Alkohol Methanol oder Äthanol in einer Konzentration von 30 % verwendet.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Alkohol n-Propanol in einer Konzentration von 10 % verwendet.

13. Mittel zum Unterbrechen der enzymatischen Reaktion einer Dehydrogenase oder eines Dehydrogenasesystems bei der spektrophotometrischen Analyse zur Bestimmung der Aktivität eines Serumenzyms in dem Enzym oder Enzymsysteni gemäß einem der Ansprüche bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es aus aktive Substanz eine wässrig alkalische Lösung von Cyclohexylaminopropansulfonsäure einer Konzentration von 0,1 bis 2 m mit einem pH-Wert von 10,5 bis 12,5 aufweist.

14. Mittel nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß die wässrig alkalische Lösung außerdem einen wassermischbaren aliphatischen Alkohol enthält.

15. Mittel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es als Alkohol Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol enthält.

16. Mittel nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es als Alkohol Isopropanol in einer Konzentration von 20 % enthält.

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17. Mittel nach einem der Ansprüche 13 "bis 16, dadurch gekennzeichnet , daß es eine Konzentration von 0,2 m, einen pH-Wert von 11,5 hat und Isopropanol in einer Konzentration von 20 io enthält.

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