DE3403250A1

DE3403250A1 - Neue hochempfindliche enzymatische testmethode

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Publication number: DE3403250A1
Application number: DE19843403250
Authority: DE
Inventors: Hideo Tagata Shizuoka Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1983-01-28
Filing date: 1984-01-27
Publication date: 1984-08-02
Anticipated expiration: 2004-01-28
Also published as: JPS59140900A; FR2540137B1; FR2540137A1; JPH0220239B2; DE3403250C2; US4693971A

Description

Hamburg, 26. Januar 2770B4

3250

Priorität: 28. 1. 1983 Japan Pat.Anm.Nr.58-13057

Anmelder;

T ο y ο J ο ζ ο K . K .

632-1, Mifuku, Ohito-cho

Tagata-gun, Shizuoka-ken

Neue hochempfindliche enzymatische Ta stire thode

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer der folgenden Substanzen: L-Glycero-3-phosphat (G3P), Dihydroxyaceton-3-phosphat (DHAP), Nicotin-adenin-dinucleotid (NAD) oder reduziertem Nicotinadenin-dinucleotid (red NAD) durch enzymatische Reaktion, und betrifft insbesondere eine solche hochempfindliche Prüfmethode für diese in einer üntersuchungsprobe enthaltenen Substanzen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Substanz in der Untersuchungsprobe zur Reaktion bringt mit der entsprechenden Komponente des nachstehenden Reaktionscyclus (I)

GPO

G3P DHAP CID

NAD GPDH red NAD

worin GPO Glycerophosphat-oxidase und GPDH Glycerophosphatdehydrogenase bedeuten und G3P, DHAP, NAD und red NAD die oben angegebene Bedeutung haben, daß man den Reaktionscyclus (I) dann ablaufen läßt und bestimmbare Veränderungen dabei meßtechnisch quantitativ ermittelt.

Es sind bisher schon enzymatische cyclisch ablaufende Bestimmungsmethoden, beispielsweise NAD-Cyclus, NADP-Cyclus oder CoA-Cyclus bekannt geworden. Bei einem b-ekannten Verfahren dieser Art läßt man Alkohol-Dehydrogenase in Anwesenheit von NAD auf Ethanol als Substrat einwirken, wobei sich reduziertes NAD bildet, das durch Einwirkung von Äpfelsäure-Dehydrogenase auf ein Substrat Oxalacetat zu NAD oxidiert wird, womit der Cyclus NAD—red NAD vervollständigt ist. (Japan. Biochem.Soc.ED. "Experimental Method in Biochemistry", Vol. 5, "Research Methods in Enzymology" S. 121-135, Tokyo Kagaku Dojin Publ., Aug. 1975, Mori, A. Ed. "Manual for Assay Methods in Neuro-transmitter", S. 165-172, Ishiyaku Publ., Nov. 1979).

Eine weitere bekannte Methode verläuft wie folgt: Anstelle von Äp feisäure -De hydroge nase in der zuvor angegebenen Reaktion wird red NAD - Oxidase verwendet, und dadurch entsteht ein Reaktionscyclus, bei dem Sauerstoff und red NAD verbraucht und H_0 und NAD gebildet werden (Institute for Phys. and Chem. Sei. Ed.: "Present and Future of Life-Science", S. 30-32, K.K. Creative Life Sei.Res.Ass., Mar., 1981).

Zwecks Reduktion von NAD zu red NAD wird Hydroxysteroid mit Hydroxysteroid-Dehydrogenase behandelt, und das red NAD wird unter Bildung von Formazan durch Wirkung einer Transferase, wie beispielsweise Diaphorase, in Anwesenheit von Tetrazoliumsalz zu NAD umgewandelt, womit der Reaktionscyclus geschlossen ist (Japan. Pat. üngeprufte Publ. No. 56-144096) . In einem weiteren bekannten Reaktionscyclus werden Glutathion und Dehydroascorbat mit Glutathiondehydroascorbat-oxido-reductase behandelt, wobei Dehydroascorbat zu Ascorbat umgewandelt wird, und dieses wird durch Einwirkung von Ascorbat-oxidase unter Verbrauch von Sauerstoff und Bildung von H₃O und Dehydroascorbat umgesetzt . (Japan. Pat. Ungeprüfte Publ. No. 56-151498) . Es ist auch schon in NAD-Cyclus bekannt, bei dem durch Verwendung von red NAD-oxidase Sauerstoff verbraucht und Wasserstoffperoxid gebildet werden. (Japan. Pat. Ungeprüfte Publ. No. 56-78599).

Es wurde nun gefunden, daß sich ein Reaktionscyclus G3P-DHAP durchführen läßt, wenn dafür GPO, bei deren Einwirkung auf ein Substrat G3P Sauerstoff verbraucht und H₃O₃ sowie DHAP gebildet werden, und weiterhin GPDH, b-ei deren Einwirkung aif ein Sub-strat DHAP red NAD verbraucht und NAD sowie G3P gebildet werden, verwendet werden. Diese Reagentien lassen sich mit geringem Aufwand beschaffen und stehen zu niedrigem Pre|ig in guter Qualität zur Verfügung, und ein weiterer Vorteil dieses Reaktionscyclus besteht darin, daß er sich trotz vorhandenem oxidativ aktivem H₃O₃ und reduktiv aktivem red NAD effektiv, mit gutem Umsatz, durchführen läßt, j Wie darüber hinaus gefunden wurde, reagiert b-ei diesem Reaktionscyclus jede der Cyclus-Komponenten G3P, DHAP, NAD, red NAD, wenn sie in einer Untersuchungsprobe enthalten ist, mit entsprechender übriger Cyclus-Komponente,

so daß man, wenn man den Reaktionscyclus zum Ablauf bringt und dabei so arbeitet, daß beispielsweise mehr als 10 Cyclen je Minute ablaufen, und dann eine dar bei dieser Reaktion eintretenden Veränderungen, die bestimmbar ist, meßtechnisch quantitativ erfaßt, die in der Untersuchungsprobe enthaltene Komponente leicht und sensitiv mit hoher Genauigkeit bestimmen kann.

Man erhält so durch das erfindungsgemäße Verfahren eine Möglichkeit, irgend eine der Substanzen G3P, DHAP, NAD oder red NAD, enthalten in einer Untersuchungsprob-e, mittels einer neuen enzymatische η hochempfindlichen Methode zu bestimmen dadurch, daß man erfindungsgemäß die in der Probe enthaltene Substanz mit einer Komponente, mit der sich der Reaktionscyclus (I) dann konstituiert, zur Reaktion bringt und so die Cyclus-Reaktion (I) zum ablaufen bringt, die, wie aus nachstehender Formel-Darstellung ersichtlich, die Bestandteile G3P, DHAP, GPO, GPDH, NAD, red NAD, O₃ und H₃O₃ aufweist.

°2	GPO	H₂O₂	/DHAP
			NAD
'/ NAD	t GPDH	red

G3P , _χ ^ ■ _Cn

Man kann dann meßtechnisch die Größe von dabei erfolgenden Veränderung3η, die erkennbar sind, bestimmen.

Beispielsweise sind für das erfindungsgemäße Verfahren Untersuchungsproben brauchbar, die irgend eine der Substanzen G3P, DHAP, NAD oder red NAD enthalten, oder auch aus denen eine solche Substanz freigesetzt oder gebildet werden kann. Insbesondere für letztgenannte Untersuchungsproben lassen sich zahlreiche enzymatische Reaktionen, bei denen die enzymatische Aktivität oder die Menge an Substrat

" 3A03250

bestimmbar sind, angeben. Beispiele dafür sind nachstehend ve rans chauli cht.

Folgende Beispiele zeigen enzymat is cha Ra aktions sy steine , aus denen je G3P freigesetzt oder gebildet werden kann.

(1) Reaktionssystem für Bestimmung von Phosphatidylglycerin in amniotischer Flüssigkeit bei der Prüfung der Resp!rationsfunktion des Fetus beim Geburtsvorgang:

Eine Phosphatidyl-glycerin (PG) enthaltende Probe, beispielsweise amniotische Flüssigkeit wird mit Phospholipase C (EC 3.1.4.3) behandelt; dabei werden Diglycerid und G3P frei, und das G3P kann bestimmt werden:

^{PG + H}2° > Diglycerid + G3P

(2) Bestimmungssystem für G3P, das frei wird aus einem enzymatischen Reaktionssystem, das ATP, Glycerin und Glycerokinase (GK) (EC 2.7.1.30) enthält. Dabei lassen sich ATP oder Glycerin bestimmen, oder es läßt sich die Glycerokinase-Aktivität ermittelt:

++
ATP + Glycerin £2 ■> ADP + G3P

(3) Wenn in dem unter (2) angegebenen Reaktionssystem Glycerin aus einer enzymatischen Reaktion von PG und Phospholipase D (EC 3.1.4.4) verwendet wird, lassen sich PG oder die Phospholipase-Aktivität bestimmen:

^{PG + H}2° D * Phosphatidat + Glycerin

Glycerin + ATP ■& > ADP + G3P

UiS.

(4) Wenn in einem wie unter (2) angegebenen Reaktionssystem Glycerin verwendet wird, das aus einer enzymatischen Reaktion von mono-, di- oder tri-Glycerid und Lipase (EC 3.1.1.3) stammt, läßt sich das Glycerid, b-eispielsweise als Triglycerid, in Serum oder Lipase, wie zum Beispiel Pankreas-Lipase im Serum bestimmen:

Glycerid + η H₃O —> η Fettsäure + Glycerin

(η = 1 in Monoglyceriden, η = 2 in Diglyceriden, η = 3 in Triglycsriden^₊

Glycerin + ATP ^§_ * ATP + G3P

la .K

(5) Wenn das in dem unter (2) zuvor angegebenen Reaktions system benötigte ATP aus einer enzymatischen Reaktion von Kreatinphosphat, ADP und Kreatinkinase (CK) (EC 2.7.3.2) stammt, läßt sich Kreatinphosphat bestimmen oder die Aktivität der Kreatinkinase (CK) ermitteln:

Kreatinphosphat + ADP ^ > Kreatin + ATP

μ
ATP + Glycerin ^ > ADP + G3P

(6) Wenn in dem unter (2) zuvor angegebenen Reaktionssystem das ATP aus einer enzymatischen Reaktion von Phosphoenolpyruvat, ADP und Pyruvat-Kinase (PK) (EC 2.7.1.40) stammt, läßt sich das Phosphoenolpyruvat bestimmen oder die Aktivität der Pyruvat-Kinase ermitteln:

M ⁺⁺ Phosohoenoloyruvat + ADP -~g > Pyruvat + ATP

μ ATP + Glycerin ^§—?> ADP + G3P

V3X\

(7) Das zuvor unter (2) angegebene Reaktionssystem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-BeStimmung einsetzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Reaktionssystem mit Acetylphosphat, ADP und Acetat-Kinase (EC 2.7.2.1) stammt Acetylphosphat + ADP ^{Aoetat + ATP}

ATP + Glycerin ^- > ADP + G3P

CaXv

(8) Das oben unter (2) angegebene Reaktionssystem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-BeStimmung benutzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Re aktions system mit 4-Phospho-L-aspartat, ADP und Aspartat-Kinase (Asp K) (EC 2.7.2.4) stammt:

Mq⁺⁺ 4-Phospho-L-aspartat + ADP —r—²^; > L-Aspartat + ATP

ATP + Glycerin §2 ^. _{ADP +}

(9) Das oben unter (2) angegebene Re ak ti ons sy stem läßt sich als Reaktionssystem für ATP-BeStimmung benutzen, wenn ATP aus einem enzymatischen Reaktionssystem mit Argininphosphat, ADP und Arginin-Kinase (Arg K) (EC 2.7.3.3) stammt:

Argininphosphat + ADP — > L-Arginin + ATP

Arg ^₊₊

ATP + Glycerin gg > ADP + G3P

Enzymatische Reaktionssysteme, aus denen DHAP freigesetzt oder gebildet wird, sind beispielsweise die folgenden:

(10) Reaktionssystem zur Ermittlung von Keto-1-phosphat oder zur Bestimmung der Aldorase-Aktivität durch Messung von DHAP, das frei wird oder gebildet wird durch die enzymatische Reaktion von Ketose-1-phosphat (K-I-P) und Aldorase (EC 4.1.2.7):

^Κ-^Χ-^Ρ > ^Aldeh*^{d + DHAP}

(11) Ein Reaktionssystem zur Bestimmung von D-Glyceroaldehyd-3-phosphat oder der Untersuchung auf Triosephosphatisomarase durch Bestimmung von DHAP, das freigesetzt oder gebildet wird durch enzymatischa Reaktion von D-Glyceroaldehyd-3-phosphat und Triphosphatisonerase (TPI) (EC 5.3.1.1) ist das folgende:

D-Glyceroaidehyd-3-phosphat —=?r=—> DHAP

Weiterhin sind nachstehend enzymatische Reaktionssysteme veranschaulicht, in denen red NAD freigesetzt oder gebildet wird.

In diesen Reaktionssystemen sollte nach Beendigung der Reaktion verbleibendes nicht umgesetztes NAD zersetzt werden; da-

AK

-s-

zu kann man unter alkalischen Bedingungen, wie b-eispielsweise bei einem pH-Vfert von mehr als 12, bei 1O°C IO Minuten lang erhitzen.

(12) Die Bestimmung von red NAD, das freigesetzt oder gebildet wurde durch enzymatische Reaktion von Ethanol und NAD unter Einwirkung von Alkoho1-Dehydrogenase (ADH) (EC 1.1.1.1) , kann man in einem Reaktionssystem zur Ermittlung von Alkohol oder Prüfung der Alkoholdehydrogenase-Aktivität einsetzen:

Ethanol + NAD j-^ > Acetaldehyd + red NAD

(13) In einem Reaktionssystem zur Bestimmung von 3-<λ-Hydroxysteroid in Gallensäuren oder zur Ermittlung von 3- (L -Hydroxysteorid-Dehydrogenase kann man dies vornehmen durch Messung des red NAD, das frei wird oder gebildet wird in dem enzymatischen Reaktionssystem, bei dem auf 3-cL -Hydroxysteroid und NAD 3- ά -Hydroxysteroid-Dehy-drogenase (HSDH) (EC 1.1.1.50) einwirkt:

3- <A-Hydroxysteroid + NAD — *■ 3-Ketosteroid + red NAD

HbDn

(14) Ein Raaktionssystem für die Ermittlung von L-Laktat oder die Bestimmung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität durch Messung von red NAD, das freigesetzt oder gebildet wird bei der enzymatischen Reaktion von L-Laktat, NAD und Laktat-Dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) ist das folgende:

L-Laktat + NAD j-j^ ■ > Pyruvat + red NAD

(15) Als Reaktionssystem für die Ermittlung von Glucose und die Prüfung der Glucose-Dehydrogenase-Aktivität durch Bestimmung von red NAD, das frei wird oder gebildet wird bei der enzymatischen Reaktion von Glucose, NAD und Glucose-Dahydrogenase (GDH) (EC 1.1.1.47), dient die folgende Reaktion:

Glucose + NAD - ■ > D-Glucono-S -lacton + red NAD

VjUn

Nachfolgend sind enzymatische Reaktionssysteme beispielsweise veranschaulicht, die NAD freisetzen oder bilden. Bei diesen Reaktionssystemen sollte nicht umgesetztes red NAD nach Beendigung der Reaktion zersetzt werden; dazu kann man bei pH-Werten von unter pH 2 bei 5O⁰C 3 Minuten lang erhitzen und dann neutralisieren, bevor die Bestimmung von NAD vorgenommen wird.

(16) Man kann in folgendem Re akt ions sy stem die Bestimmung von Prolin oder von D-Prolin-Reduktase vornehmen durch Messung von NAD, das frei oder gebildet wird bei der enzymatische η Reaktion von Prolin, red NAD und D-Prolin-Reduktase (PR) (EC 1.4.1.6):

Prolin + red NAD :r= £- 5-Aminovaleryat + NAD

(17) Im nachstehenden Reaktionssystem kann man L-Cystin bestimmen oder die Cystin-Reduktase-Aktivität ermitteln, wenn man das NAD mißt, das freigesetzt oder gebildet wird bei einer enzymatischen Reaktion von L-Cystin, red NAD und Cystin-Reduktase (CR) (EC 1.6.4.1):

L-Cystin + red NAD , —-^= > 2-L-Cystein + NAD

Die zuvor genannten enzymatischen Re akt ions sy sterne sind nur Beispiele , und die nach dem erfiridungsgemäßen Verfahren zu behandelnden Untersuchungsproben können auch aus Systemen stammen, denen ein oder mehrere weitere Reaktionssysteme beigeordnet sind, in denen eine der Substanzen freigesetzt oder gebildet wird, die für die zuvor angegebenen Reaktionssysteme benötigt werden.

Zu der Untersuchungsprobe, die eine der angegebenen Substan zen, auf die in diesen enzymatischen Reaktionssystemen geprüft werden soll, enthält, werden diejenigen Reagentisn zugegeben, die für den Ablauf der enzymatischen Reaktion notwendig sind. Ein solches Re akt ions ge mi sch kann eine

Untersuchungsprobe sein, die eine der Substanzen G3P, DHAP, NAD oder red NAD enthält. Diese enzymatischen Reaktionssysteme können gesondert oder gemeinschaftlich mit dem Reaktionscyclus (I) zubereitet und durchgeführt werden.

Die Menge an Untersuchungsprobe kann zweckmäßig in der Größenordnung von 0,05 - 10 ml liegen, und die Reaktion läuft ab, wenn man die erforderlichen Re age nt ie η, die man in eine schwach saure oder schwach alkalische Pufferlösung eingebracht hat, bei 30°C für eine Zeitspanne von generell mehr als einer Minute miteinander vermischt. Die Menge an zuzugebenden Reagentien ist nicht begrenzt; zweckmäßig ist es jedoch generell, einen Überschuß im Vergleich zu der Menge an zu untersuchender Substanz einzusetzen.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren durchzuführende Reaktionscyclus ist durch das zuvor illustrierte Schema (I) veranschaulicht.

Bei der Reaktion gemäß dieses Reaktionscyclus (I) wird ein Mol G3P unter Verbrauch von einem Mol O₂, im allgemeinen gelöster Sauerstoff, und unter Freisetzen von einem Mol H₃O₃ durch die Wirkung von GPO zu einem Mol DHAP umgewandelt, (GPO: vergleiche in der US-PS 4,275,161). Dies ist das GPO-Reaktionssystem. Es wird dann weiterhin ein Mol DHAP durch die Wirkung von GPDH (EC 1.1.1.8) in Anwesenheit von einem Mol red NAD unter Bildung von einem Mol NAD zu G3P umgewandelt. Dies ist das GPDH-Reaktionssystem. Alsdann wird das so gebildete G3P mittels des GPO-Reaktionssystems zu DHAP umgewandelt, und in dieser Weise läuft der Reaktionscyclus ab. Dieser Reaktionscyclus läuft ab in Anwesenheit von sechs Komponenten, und zwar G3P, DHAP, GPO, GPDH, red NAD und O₂; es können jedoch G3P und DHAP

- fvL -

wechselsaitig eines aus dem anderen im Verlauf des Reaktionscyclus sich bilden, und darum kann eine jede dieser Substanzen vorteilhaft benutzt werden.

Weiterhin kann bai dem Reaktionscyclus (I) H₃O₃ mit red NAD zur Bildung von NAD umgesetzt werden; bei dieser Nebanreaktion, die durch Einwirkung von NAD-Peroxidase (EC 1.11.1.1) (J.Biol. Chem., 225: 557, 1957) erfolgt, werden ein Mol H-O- und ein Mol red NAD verbraucht, und zwei Mole H₅O sowie ein Mol NAD werden gebildet, wie nachstehend als (II) veranschaulicht.

ϊ Γ,ΌΓϊ ti D^ -^

NAD Peroxidase
G3P _ "" ^ »DHAP \/· ' ς χ 3

2H₂O+NAD

In dem Rsaktionscyclus (II) wird im Reaktionscyclus (I) gebildetes H_O_ von red NAD unter Bildung von NAD verbraucht, und so werden zwei Mole red NAD in einem Cyclus des Reaktionscyclus (II) verbraucht, wodurch die Mengenänderung an red NAD s,ich verdoppelt, so daß die Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode entsprechend höher wird.

Alternativ kann man NAD mit Hilfe einer anderen Dehydrogenase

(zweite Dehydrogenase) und deren Substrat zu red NAD umwandeln und so einen NAD-Reaktionscyclus schaffen, an dem NAD, die zweite Dehydrogenase und das Substrat für diese beteiligt sind. Man kann diesen NAD-Cyclus mit dem Raaktionscyclus (I) wie nachstehend im Schema (III) veranschaulicht koppeln

H₂O₂

G3P

DHAP

NAD

CID

Substrat ftfr zweite oxidiertes

zweite Dehydro- Dehydro- Substrat

genäse

Beispielsweise lassen sich eine Komponente in der Untersuchungsprobe (dargestellt als ■» ) und eine entsprechende Komponente, die damit den Reaktionscyclus (I) auszulösen vermag, (dargestellt als ι I ) , wie nachfolgend veranschaulicht illustrieren
(a) Für G3P als Komponente in der Untersuchungsprobe:

	I GPO I	NAD	t	H₂O₂ -^ ^f	DHAP
°2			GPDH
			NAD
	red

In dem Reaktionscyclus (Ia) , bei dem G3P die Substanz in dar Probe ist, werden als Komponenten, durch die die Cyclus-Reaktion anläuft, GPO, GPDH, O₃ und red NAD verwendet. GPO katalysiert eine Reaktion, in der G3P das Substrat ist, und bei der je ein Mol G3P und O₉ verbraucht werden, während je ein Mol H₃O- und DHAP gebildet werden. Weiterhin wirkt GPDH auf ein Substrat DHAP unter Verbrauch von je einem Mol DHAP und red NAD, wobei je ein Mol G3P und NAD gebildet werden; auf diese Weise schließt sich der G3P - DHAP - Reaktionscyclus. Bei der Reaktion kann Oj in Form von in dem System gelöstem Sauerstoff zugegeben werden, und GPO, GPDH und red NAD sollten als Re age n-

tien für dia Bestimmung in tiberschußmengen beigegeben werden. Die Menge an G3P in der Untersuchungsprobe ist nicht begrenzt; natürlich wird man die Probe verdünnen, wenn die Konzentration hoch ist. Die Mengen an GPO und GPDH sind abhängig von der Menge an G3P in der Probe; sie liegen gewöhnlich höher als 0,1 Einheit pro Test, vorzugsweise bei 2-50 Einheiten für GPO und 0,5 - 40 Einheiten für GPDH. Die Menge an red NAD kann höher sein als das Produkt aus der Menge an G3P in der Probe und der Anzahl der Cyclen, und im allgemeinen verwendet man gegenüber der Menge an G3P einen .Überschuß von beispielsweise dem 50-fachen, vorzugsweise dem 100 - 1000 - fachen. Die Menge an erkennbaren Veränderungen nach Beendigung der Cyclus-Raaktion kann bestimmt werden als Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder reduziertem NAD oder gebildetem H₃O-. Wie zuvor für den Reaktionscyclus (II) gezeigt, kann man für sehr empfindliche Bestimmungsmethoden das dabei gebildete H₃O₃ bzw. verbrauchte red NAD bestimmen. In einer solchen mit dam Reaktionscyclus (I) gekoppelten Reaktion wird die NAD - Peroxidase in der Regel in einer Menga von mehr als 0,5 Einheiten je ein Test, vorzugsweise 1-20 Einheiten eingesetzt. Die Menge an erkennbarer Veränderung kann vorzugsweise bestimmt werden durch meßtechnische Erfassung des verbrauchten red NAD.

(b) Für DHAP als Komponente in der Untersuchungsprobe: Dieses Schema ist nachstehend in (Ib) veranschaulicht.

red NAD

GPDH

NAD

DHAP . ^G3P

^CIb:i

GPO

Als Komponente, mit der der Reaktionscyclus (Ib) in Gang gesetzt werden kann, können GPO, GPDH und 0_ und red NAD dienen.

Bei dieser Reaktion verläuft der Cyclus DHAP - G3P zunächst unter Verbrauch von je einem Mol DHAP und red NAD und unter Bildung von je einem Mol NAD und G3P, und dann durch Verbrauch von je einem Mol G3P und 0- und Bildung von je einem Mol H₃O₃ und DHAP. O₃ kann aus gelöstem Sauerstoff genommen werden, und so genügt es, GPO, GPDH und red NAD einfach im Überschuß beizugeben. Die Menge an GPDH und GPO ist zweckmäßig größer als 0,1 Einheit, vorzugsweise setzt man 5-40 Einheiten an GPDH und 1-50 Einheiten an GPO ein. Die Menge an red NAD, die benutzt wird, richtet sich nach dem Produkt aus Menge an DHAP in der Untersuchungsprobe und Anzahl der durchgeführten Reaktionscyclen und ist im allgemeinen eine überschußmenge, verglichen mit der Menge an DHAP, beispielsweise ein 50-fächer Überschuß, vorteilhaft ein 100 - 1000-facher Überschuß.

Die Menge an erkennbaren Veränderungen nach Beendigung der Cyclusreaktion kann man in Form von verbrauchtem Sauerstoff oder red. NAD oder gebildetem H₃O₃ bestimmen. Besonders empfindliche Bestimmungen lassen sich durchführen, wenn man, wie zuvor veranschaulicht, NAD-Peroxidase benutzt.

(c)Für redNAD als Komponente in der Untersuchungsprobe: Die Cyclusreaktion kann wie nachstehend in (Ic) veranschaulicht, durchgeführt werden.

oxidiertes Substrat

Zweite

Dehydrogenase

substrat für zweite

Dshydrogenase

G3P

[Ic]

/IS is -

Bsi der Reaktion werden als den Reaktionscyclus (Ic) bildende Komponenten DHAP, GPO, GPDH, zweite Dehydrogenase, Sub-strat für die zweite Dehydrogenase und O₂ verwendet. Es werden je ein Mol red NAD und DHAP verbraucht zur Bildung von je einem Mol NAD und G3P durch die Wirkung von GPDH auf red NAD. Dann wirkt GPO auf G3P, wobei je ein Mol G3P und 0„ unter Bildung von je einem Mol H₃O₃ und DHAP verbraucht werden. So schließt sich der DHAP - G3P - Reaktionscyclus. Gleichzeitig wird NAD, das durch die Einwirkung von GPDH auf red NAD gebildet wurde, mit einer äquimolaren Verhältnismenge an Substrat für die zweite Dahydrogenase durch die Wirkung der zweiten Dehydrogenase umgesetzt zu je einer einmolaren Verhältnismenge an red NAD und Oxidationsprodukt.

Die so entstandene red NAD wird dabei in den DHAP - G3P Reaktionscyclus geführt. O₃ kann aus in dem System gelöstem Sauerstoff genommen werden, und nur DHAP, GPO, GPDH, zweite Dehydrogenase und Substrat für diese brauchen mengenmäßig im Überschuß zugesetzt zu werden.

Die Menge an erkennbaren Veränderungen kann bestimmt werden durch Messen der Menge an verbrauchtem O₂ oder reduziertem NAD oder gebildetem H₉O₉.

(d) Für NAD als Komponente in der Untiersuchungsprobe : Die Cyclusreaktion wird nachstehend in (Id) veranschaulicht.

oxidiertes Substrat

zweite
Dehydrogenase^ Substrat für zweite Dehydrogenase

[Id]

Als Komponente, mit der die Cyclusreaktion (Id) zum Anlaufen gebracht werden kann, werden DHAP, GPO, GPDH, Q_, zweite Dehydrogenase und Substrat für die zweite Dehydrogenase verwendet. Bei der Reaktion wirkt die zweite Dehydrogenase auf NAD. Dabei werden je ein Mol NAD und Substrat für die zweite Dahydrogenase verbraucht und je ein Mol an Oxidationsprodukt und red NAD gebildet, und dann wird das red NAD dem DHAP - G3P - Reaktionscyclus zugeführt. GPDH wirkt auf das gebildete red NAD und eine äquimolare Verhältnismenge an DHAP ein, und dabei werden je ein Mol NAD und G3P gebildet. Weiterhin werden durch die Einwirkung von GPO je ein Mol an G3P und O₂ verbraucht und je ein Mol H₃O₃ und DHAP gebildet. Bei der Reaktion kann O- aus in dem Gemisch gelöstem Sauerstoff zugeführt werden, und so genügt es, wenn man für die Bestimmung als Reagentien DHAP, GPO, GPDH, die zweite Dehydrogenase und das Substrat dafür in Überschußmengen zusetzt. Die Menge an erkennbaren Veränderungen läßt sich bestimmen durch Messung des verbrauchten 0_ oder des gebildeten H₃O .

Die in den Raaktionscyclen (Ic) und (Id) verwendete zweite Dehydrogenase kann ein Enzym sein, das eine Reaktion des Substrats für diese Dehydrogenase und NAD unter Bildung eines Oxidationsprodukts dieses Substrats und red NAD katalysiert, wie dies nachstehend illustriert ist.

(18) Dehydrogenase: D-Arabitol-Dehydrogenase (A Dase) (EC 1.1.1.11) und Substrat dafür: D-Arabitol:

D-Arabitol + NAD _ _ > D-Xylose +red NAD

A Dase ^J

(19) Laktat-Dehydrogenase (LDH) (EC 1.1.1.27) und L-Laktat: L-Laktat + NAD ~=-r~ >■ Pyruvat + red NAD

(20) Malat-Dehydrogenase (de carboxy lie rend) (MDH) (EC 1.1.1.28) und L-MaIat:

L-Malat + NAD ~tuyä * Pyruvat + CO₃ + red NAD

(21) Glucose-Dehydrogenase (GDH) (EC 1.1.1.47) und Glucose: ß-D-Glucose + NAD -==r:—> D-Glucono-S -lacton + red NAD

(22) 3-1 -Hydroxysteroid-Dehydrogenasa ( Λ.-HSDH) (EC 1.1.1.50) und 3-λ-Steroid, wie Androsteron und Cholat:

3-ot -Hydroxysteroid + NAD 3-Ketosteroid + red NAD

(23) Format-Dehydrogenase (FDH) (EC 1.2.1.2) und Format: Format + NAD =zrr; >· CO₀ + red NAD

(24) Galactose-Dehydrogenase (Gal DH) (EC 1.1.1.48) und D-Galactose:

D-Galactose · ·—~—* D-Galactose- y -lacton + red NAD

(25) ß-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (ß-HSDH) (EC 1.1.1.51) und 3-ß-Hydroxysteroid:

3-ß-Hydroxysteroid + NAD 3-Ketosteroid + red NAD.

In dem Reaktionscyclus (Id) wird durch die Wirkung der zweiten Dehydrogenase in Anwesenheit des für diese geeigneten Substrats das NAD in der Probe in red NAD umgewandelt; dies ist der NAD-Re aktions cyclus. Dann läuft mit dem so gebildeten red NAD der gleiche Reaktionscyclus wie zuvor in (Ic) angegeben ab.

Die Reagentien, die in den Cyclusreaktionen (Ic) und (Id) verwendet werden, können in Überschußmengen, verglichen mit der Menge an NAD oder red NAD eingesetzt ,v/erden. Weiterhin kann der NAD-Re aktions cyclus gekoppelt werden mit einer Einwirkung von NAD-Peroxidase, wie für den Reaktionscyclus (II) veranschaulicht.

Dann wird irgend eine Substanz, die aus G3P, DHAP, NAD oder red NAD in der Probe freigesetzt oder gebildet wird, maßtechnisch ermittelt und die entsprechende Komponente oder Probe kann auf diese Weise aufgrund der vorgenannten Reaktionscyclen (Ia) , (Ib) , (Ic) oder (Id) bestimmt werden. Bei der Durchführung der Reaktion sieht man zweckmäßig mehr als IO Re aktions cycle η vor und setzt die Reagentien zweck-

- ie -

mäßig in einem molaren Überschuß gegenüber der Anzahl der Cyclen ein. Vorteilhaft ist es, wenn man Proben mit geringen Mangen an zu untersuchender Substanz oder verdünnte Proben verarbeitet. Das Reaktionsmedium kann eine Pufferlösung mit stabilem pH-Wert sein, der im allgemeinen auf schwach sauer bis schwach alkalisch eingestellt wird. Man kann beispielsweise Phosphatpuffer mit pH 6,5 bis 8,5, Tris-HCl-Puffer, Imidazol-HCl-Puffer, Dirnethylglutarat-NaOH Puffer oder PIPES-NaOΗ-Puffer benutzen. Die Reaktion läuft gewöhnlich bei 37°C über eine Zeitspanne von mehr als einer Minute.

Bei dem Reaktionscyclus (I) laufen gewöhnlich je Minute mehr als 50 Cyclen ab; gewisse Variationen ergeben sich aus der Menge an benutztem Enzym und dessen Km-Wert. Es ist vorteilhaft, die Menge an Enzym und Reagentien so aufeinander abzustimmen, daß die Reaktion mit mehr als 80 Cycle n/Mi nute ablaufen kann.

Die bei der Reaktion auftretenden erkennbaren Veränderungen werden entsprechend dem Ablauf der Reaktion gemssen. Solche erkennbaren Veränderungen sind Substanzen, die beim Ablauf einer Cyclusreaktion verbraucht oder gebildet werden im molaren Verhältnis zu der Substanz G3P oder DHAP, die in einer Menge von je ein Mol bei einer Cyclusreaktion des Reaktionscyclus (I) verbraucht oder gebildet wird. Vorzugsweise wählt man als eine solche Substanz das verbrauchte O₂ oder red NAD bzw. das gebildete H₂ ⁰?'

Die Menge an verbrauchtem 0» läßt sich zweckmäßig bestimmen, wenn man eine Sauerstoff-Elektrode benutzt und den Wert der elektro-chemischen Änderungen verfolgt.

Die Menge an verbrauchtem red NAD kann man ermitteln, wenn man die verbleibende Menge an red NAD bei Beendigung der

- is -

Reaktion abzieht von der ursprünglich vorhandenen Menge an red NAD. Die Messung der Mengen an red NAD kann nach einer beliebigen dem Fachmann bekannten Methode vorgenommen werden. Beispielsweise kann man die spezifische Absorption für red NAD und die nicht-spezifische für NAD messen. Da das Maximum dar spezifischen Absorption für NAD bei 260 nm liegt und red NAD ein solches bei 260 nm und 340 nm, mißt man für die Bestimmung von red NAD die Absorption bei 320 bis 360 nm, zweckmäßig bei 340 nm. Eine weitere Bestimmungsmethode für red NAD ist die colorimetrische Untersuchung unter Verwendung eines Elektronen-Transport-Chromogens, das einen Elektronen-Akzeptor für red NAD aufweist. Beispiele für solche Elektronen-Transport-Chromogene sind Tetrazoliumsalze, wie beispielsweise 3- (p-Iodphenyl) -2- (p-nitrophenyl) -S-phenyl^H-tetrazolium-

chlorid;

3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium-

bromid;

3 ,3 '- (4 ,4 '-Biphenylen) -bis (2 ,5-diphenyl-2H-tetrazolium-

chlorid);

3,3 '- (3 ,3 ' -Dimethoxy-4 ,4 '-biphenylen) -bis £jl- (p-nitrophenyl) -S-phanyl^H-tetrazoliumchlorid/ ( = Nitrotetrazolium: NTB);

3,3'-(3,3¹-Dimethoxy-4,4^I-biph2nyl3n)-bis /~2,5-bis (p-nitrophenyl) -2H-tetrazoliumchlorid; und

3 ,3 '- (3,3 '-Dirnethoxy-4 ,4 '-biphenylen) -bis (2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid); und

2,6-Dichlorphenolindophenol. ,

Ein vorteilhaftes Beispiel ist eine Kombination von wasserlöslichem Tetrazoliumsalz und Diaphorase oder Phenazinmethosulfat.

Ein solches Elektronen-Transport-Chromogen ist ein Elektronen-Akzeptor für red NAD, und es bildet sich ein farbiges Formazan-Pigment. Das so gebildete Pigment läßt sich bei seinem Absorptionsmaximum, wie beispielsweise bei 500 - 550 nm colorimetrisch messen.

- 2Ο -

Eine weitere Bestimmungsmethode für red NAD ist eine fluorometrisch Bestimmung. Dafür behandelt man red NAD in Anwesenheit eines Fluoreszenz-Reagens, wie beispielsweise Resazurin, mittels Diaphorasa. Für die Bestimmung von red NAD in dem Reaktionscyclus (I) wird H₀O₀ vorteilhaft zersetzt und durch Katalase entfernt. NAD-Peroxidase (EC 1.11.1.1) kann der Cyclusreaktion (I) beigegeben werden. Dadurch verdoppelt sich die Empfindlichkeit der Bestimmung, wie dies in dem zuvor illustrierten Reaktionssystem (II) veranschaulicht ist. Gebildetes H₀O₂ läßt sich durch Benutzung einer.Wasserstoffperoxid-Elektrode und Messung der elektro- chemische η Veränderungen bestimmen, oder man untersucht ein mit einem Indikator und H₀O₀ gebildetes Reaktionsprodukt, das sich erkennen läßt. Beispiele für Indikatoren sind Reagentien, die sich spektrophotometrisch messen lassen, Farbstoff Indikatoren, Fluoreszenz reagentien oder Lumineszenz reagentien.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um eine neue Bestimmungsmethode, bei der unter Benutzung des G3P - DHAP-Reaktionscyclus gearbeitet wird, wobei dieser mit mehr als 10 Cyclen je Minuten abläuft, und wobei ein Bestandteil in einer Untersuchungsprobe mit guter Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit gemssen werden kann.

Beispiel 1

Reaktionsgemisch (1,0 ml) : 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) 10 mM Glycerin
10 mM MgCl₂

Glycerokinase (Toyo Jozo Co., aus Steptomycas gewonnen): 2 Einheiten/Test

GPO (Toyo Jozo Co., aus Aerococcus gewonnen):

20 Einheiten/Test

0,25 mM red NAD

GPDH "(Hände lsprodukt: Kaninchenmuskel): 8 Einheiten/Test.

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle (1,0 ml) eingefüllt. Diese wurde in ein Spektrophotometer in die darin befindliche auf eine konstante Temperatur von 37°C eingestellte Zeil-Halte rung eingesetzt.

Es wurden Untersuchungsproben, die ATP (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 /UM) enthielten (20 ,ul) , zugegeben, und es wurde bei 37°C bebrütet. Für die zwei Minuten, die zwischen 3 und Minuten nach dem Anlaufen der Reaktion lagen, wurde die Änderung der Absorption bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 (o-o) gezeigt. Die Bestimmung ist hochempfindlich.

Es wurdo in dem zuvor angegebenen Reaktionsgemisch anstelle von Glycerin ATP in einer Menge von 5 inM eingesetzt, und es wurde eine Glycerin in Spurenmengen (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 ,uM) enthaltende Lösung in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben zugegeben, es wurde bebrütet und dann die Absorptionsänderungen meßtechnisch bestimmt. Die Ergebnisse sind eb-enfalls in Fig. 1 (·-·) veranschaulicht, und man erkennt, daß sehr gute quantitativ übereinstimmende Ergebnisse erhalten werden.

Es wurde eine Kontrollmas sung in der Weise durchgeführt, daß man Proben ( 20,ul ), die ATP (0, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 bzw. 10,0 mM) enthielten, einem Reaktionsgemisch ( 3 ml) zugab, das aus 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) , 10 mM Glycerin, 10 mM MgCl₂, Glycerokinase (2 Einheiten/Test), GPO (5 Einheiten/Test) , 1,5 mM 4-Aminoantipyrin, 1,5 mM Phenol, Peroxidase ( 5 Einheiten/Test) und 0,1% Triton X-IOO bestand, 10 Minuten lang bei 37 C bebrütete, und b-ei 500 nm die colorimetrische Messung durchführte. Das Ergebnis ist in Fig. 2 ve ranschauli cht.

Verglichen mit dem Ergebnis der nicht-cyclische η Reaktion für ATP, wie in Fig. 2 gezeigt, ergibt das erfindungsgemäße

Verfahren bei der Durchführung der Cyclusreaktion mit schätzungsweise 35 Cyclen/Min. eine um das 2000-fache empfindlichere Bestimmung, wenn man die Reaktion eine Stunde lang durchführt, im Vergleich zu der in Fig. 2 gezeigten Kontroll-Untersuchung.

Beispiel 2

Reaktionsgemisch (1,0 ml) :

50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)

GPO (20 Einheiten/Test)

0,25 mM red NAD

GPDH (8 Einheiten/Test)

Das vorstehende Re ak ti ons ge mi sch (1,0 ml) wurde in eine Quarzzelle (1,0 ml) eingegeben und bei 37 C vorbebrütet. Dazu wurden Untersuchungsproben (20 ,ul) gegeben, die G3P (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50 ,uM) enthielten, gegeben. Die Änderungen der Absorption bei 340 nm innerhalb der 2 Minuten-Zeitspanne, die zwischen 3 Minuten nach Beginn der Babrütung bis 5 Minuten danach lag, wurden gemessen, und daraus wurde die Absorptionsänderung je Minute berechnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 (o-o) veranschaulicht. Dann wurden anstelle der G3P enthaltenden Proben solche Proben eingesetzt, die DHAP (0, 10, 20, 30, 40 bzw. 50,uM) enthielten, eingesetzt, bebrütet und in der gleichen Waise wie zuvor angegeben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 (·-·) gezeigt.

Wie man sieht, lassen sich Spurenmengen von G3P oder DHAP mit dieser Be stimmungsme thode messen.

Beispiel 3

Zu der Reaktionsmischung gemäß Beispiel 2 wurde NAD-Peroxidase (3 Einheiten/ml) (von Streptococcus; Dolin u. Mitarb., J. Biol.Chem., 225: 55 7, 195 7) zugegeben und so ein Reaktionsgemisch (1,0 ml) zubereitet.

Zu diesem Raaktionsgemisch (1,0 ml) wurden Proben (20 ,ul) hinzugefügt, die G3P (0, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 ,uM) ent-

hielten, und es wurde bei 37 C bebrütet. Die Absorption innerhalb von 2 Minuten in der Zeitspanne zwischen 3 Minuten und 5 Minuten nach Beginn der Reaktion wurde bei 340 nm gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 4 veranschaulicht. Darin bedeuten die Werte o-o die Ergebnisse, die bei Mitb-enutzung von NAD-Peroxidase gewonnen wurden, und die Werte ·-· die Ergebnisse, die gewonnen wurden, wenn NAD-Peroxidase nicht zugesetzt war. Wie man aus Fig. 4 erkennen kann, können um das zweifache höher empfindliche Ergebnisse erhalten werden, wenn man NAD-Peroxidase mitbenutzt.

Beispiel 4

Reaktionsgamisch (1,0 ml):

50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) 10 mM Glycerin

10 mM MgCl₂

Glyoerokinase (2 Einheiten/Test) ,

GPO (2,0 Einheiten/Tes^)

0,25 mM red NAD _λ

GPDH (8 Einheiten/Test)

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in einen auf konstanter Temperatur von 37 C gehaltenen Reaktionsbehälter eingefüllt, und die Temperatur des Raaktionsgemisches wurde durch Vermischen mittels eines Magnetrührers gleichmäßig angepaßt.

Dazu wurden Proben gegeben, die ATP (0, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 ,uM) enthielten, und es wurde mittels einer Sauerstoff-Elektrode vom Galvani-Typ der Sauerstoff verbrauch bei der Bebrütungsreaktion gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. (o-o) /_ O₃-Verbrauch/Min. (%)_/ veranschaulicht. Dann wurde G3P anstelle von ATP eingesetzt, und es wurden Proben

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(20 ,ul) bebrütet, die G3P (O, 5, 10, 15, 20 bzw. 25 ,uM) enthielten. Die Ergabnisse sind in Fig. 5 (·-·) veranschaulicht. Man erkennt, daß sowohl ATP als auch G3P in einfacher Weise mit guter Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit bestimmt werden können.

Beispiel 5

Ein Reaktionsgemisch (1,0 ml) mit der in Beispiel 4 angegebenen Zusammensetzung wurde verwendet, und es wurde die Mange an bei der Reaktion gebildetem H₃O₃ an einer Wasserstoffperoxid-Elektrode in Form der Änderungen des elektrischen Stroms (nA) je Minute bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 veranschaulicht. Darin bedeuten die Werte 0-0 die Kurve für die quantitative Bestimmung von H₃O- bai Untersuchung von ATP (0-25 ,uM)enthaltendeη Proben (20 ,ul) und ·-· die Werte bei Benutzung von G3P (0 - 25 ,uM ) enthaltenden Proben (20 ,ul) .

Wasserstoffperoxid-Elektrode: YSI Co., Model 25 Oxidations-

Meter_r Clark 2510 Oxidase-Probe

Beispiel 6

Reaktionsgemisch zur Bestimmung von Kreatininkinase Reaktionsmischung I:

50 mM	Phosphatpuffer (pH 7,5)	(15 Einhaiten/Test)
40 mM	Kre at inp ho sp hat	red NAD
5 mM	ß-Mercaptoethanol	(8 Einheiten/Test)
3 mM	ADP
10 mM	MgCl
Glycerokinase (eine Einheit/Test) .
Reaktionsgemisch II:
GPO
0,3 mM
GPDH

Das Reaktionsgemisch I (0,2 ml) wurde in ein schmales Teströhrchen eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Es wurde Kreatinkinase (10 ,ul) (Boehringer: Kaninchenmuskelfleisch, 0,01 Einheiten/ml) hinzugegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bebrütet. Die Reaktion wurde durch 2 Minuten langes Erhitzen auf 1OO°C abgestoppt. Es wurde dann das Reaktionsgemisch II (0,8 ml) (vorbebrütet b-ei 37°C) hinzugefügt, und danach wurde mit Hilfe einer Sauerstoff-Elektrode der nach dem Beginn der Reaktion erfolgende Sauerstoff verbrauch gemessen.

Beispiel 7

Reaktionsgemisch zur Bestimmung von Phosphatidyl-

Glycerin:

Reaktionsgemisch I:

20 mM Collidinpuffer ( pH 8,0 ) Phospholipase C (20 Einheiten/Test)

10 mM CaCl₂
0,1 % Natriumdeoxycholat

Reaktionsgemisch II:

50 mM Tris-HCl-Puffer ( pH 7,5 )

GPO (15 Einheiten/Test)

Katalase (200 Einheiten/Tast)

0,25 mM red NAD

GPDH (8 Einheiten/Test) .

Amniotische Flüssigkeit (10 ,u, 1 - 1/8 Verdünnungen) (worin Phosphatidylglycerin enthalten war) wurde dem Reaktionsgemisch I (0,2 mL ) beigegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet.

Dazu wurde das Re ak ti ons ge mi sch II (0,8 ml) gegeben, und dann wurde die Absorptionsänderung je Minute bei 340 nm gemeasen. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 veranschaulicht.

Als Kontrolle wurde Reaktionsgemisch I, das keine Phospholipase C enthielt, untersucht.

Das Phosphatidylglycerin in amniotischer Flüssigkeit konnte mit guter Empfindlichkeit bestimmt werden. Der Wert für Phosphatidylglycerin in der bei diesem Versuch eingesetzten amniotischen Flüssigkeit wurde mit 6,10 mg/100 ml gemessen.

Das Reaktionsgemisch II kann, wenn darin Katalase weggelssen wird, zur Untersuchung von Phosphatidylglycerin durch Ermittlung von O₂ mittels Sauer stoff-Elektrode oder durch Bestimmung der gebildeten Menge an H_0_ mittels Wasserstoffperoxid-Elektrode eingesetzt werden.

Es wurde auch noch das folgende Reaktionsgemisch zur Bestimmung von Phosphatidylglycerin mit Hilfe einer Wasserstoffperoxid-Elektrode zubereitet 1

50 mM Phosphatpuffer ( pH 7,5 )

Phospholipase D (10 Einheiten/Test)

10 mM MgCl₂
5 mM ATP

Glycerokinase (2 Einheiten/Test)

GPO (15 Einheiten/Test)

0,25 mM red NAD

GPDH (8 Einheiten/Test) .

Beispiel 8

50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,75 mM red NAD

GPO (6 Einheiten/Test)

GPDH (5 Einheiten/Test)

Das vorstehende Reaktionsgemisch (0,5 ml) wurde in ein schmales Teströhrchen eingefüllt und bei 37 C vorbebrütet. Dazu wurde DL-G3P (Lösung (20 .ul) ( 0, 2, 4, 8, 12, 16 bzw. 20 .uM)

ο gegeben, und es wurde exakt 5 Minuten lang bei 37 C bebrütet.

Dann wurde zum Abbruch der Reaktion eine 5 mM N-Ethylmaleimid enthaltende 1%-ige Natriumlaurylsulfatlösung (2,5 ml) hinzu-

gageben. Es wurde die Absorption bei 340 nm genessen und durch Vergleich mit Kontrolle korrigiert. Fig. 9 zeigt,
daß gute quantitative linear angeordnete Bestimmungswerte erhalten wurden.

Als Kontrolle wurde anstelle von DL-G3P destilliertes
Wasser (20 ,ul) zugegeben. Bei diesem Beispiel betrug
die Anzahl der Reaktionscyclen 5400/Stunde.

In der beiliegenden Zeichnung bedeuten:

die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP und Glycerin,

die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP nach bekannter nicht-cyclischar Reaktion, die Kurve für die quantitative Bestimmung von G3P und DHAP,

die Kurve für die quantitative Bestimmung von G3P bei Benutzung von NAD-Peroxidase,
die Kurve für quantitative Bestimmung von
ATP oder G3P bei Benutzung einer Sauerstoff-Elektrode, die Kurve für die quantitative Bestimmung von ATP oder G3P bai Benutzung einer Wasserstoffperoxid-Elektrode ,

die Kurve für die quantitative Bestimmung von Kreatinkinase ,

die Kurve für die quantitative Bestimmung von Phosphatidylglycerin,

die Kurve für die quantitative Bestimmung von DL-G3P durch die Endopoint-Methode.

Claims

Pate ntansp rü ehe

l.\ Verfahren zur quantitativen Bestimmung von in einer Hintersuchungsprobe enthaltenem L-Glycero-3-phosphat (G3P) , Dihydroxyaceton-3-phosphat (DHAP) , Nicotin-adenin-dinucleotid (NAD) oder reduziertem Nicotin-adenin-dinucleotid (red NAD) durch enzymatische Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu b-estimmende Substanz in der Untersuchungsprobe zur Reaktion bringt mit einer entsprechenden Komponente des nachstehenden Reaktionscyclus (I) , der sich aus den Komponenten G3P, DHAP, Glycerophosphat-Oxidase (GPO) , Glycerophosphat-Dehydrogenase (GPDH) , NAD, red NAD, O₂ und H₃O₃ zusammensetzt,

O₉ GPO H₂O

G3P ^> DHAP

NAD GPDH red NAD

daß man den Reaktionscyclus ablaufen läßt und die Größe einer bestimmbaren Veränderung dabei meßtechnisch ermitteIt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Reaktionscyclus (I) NAD-Peroxidase zur Reaktion bringt, durch die eine ein Mol H₀O und ein Mol red NAD verbrauchende und zwei Mole H₉O sowie ein Mol NAD bildende Reaktion katalysiert wird, und daß man die Größe einer bestimmbaren Veränderung dabei meßtechnisch ermittelt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Größe einar bestimmbaren Veränderung die Menge an verbrauchtem red NAD ermittelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in dem Reaktionscyclus (I) gebildetes NAD mit
einer zweiten Dehydrogenase und einem Substrat für diese Dehydrogenase umsetzt und diese Umsatζungsreaktion zwecks Zuführung des dabei gebildeten red NAD zu dem Reaktionscyclus mit letzterem koppalt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Untersuchungsprobe einsetzt, in der G3P
durch ein Phosphatidylglycerin und Phospholipase C enthaltendes enzymatisches Reaktionssystem gebildet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Untersuchungsprobe einsetzt, in der G3P
durch ein Adenosintriphosphat (ATP) , Glycerin und Glycerokinase enthaltendes enzymatisches Reaktionssystem gebildet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Glycerin verwendet wird, das aus einem Phosphatidylglycerin und Phospholipase D enthaltendem enzymatischem
Reaktionssystem stammt.

I ι
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,

daß Glycerin verwendet wird, das aus einem Glycerin und Lipase enthaltendem enzymatischem Reaktionssystem stammt.
9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ATP verwendet wird, das aus einem Kreatinphosphat,
Adenosindiphosphat (ADP) und Kreatinkinase enthaltendem enzymatischem Reaktionssystem stammt.
10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ATP verwendet wird, das aus einem Phosphoenolpyruvat, ADP und Pyruvatkinase enthaltendem enzymatischem Reaktionssystem stammt.
-Aiii. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmt»-are η Veränderung die Menge an verbrauchtem O~ ermittelt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an gebildetem H₃O₃ ermittelt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als die Größe einer bestimmbaren Veränderung die Menge an verbrauchtem red NAD ermittelt wird.