KR20010005550A

KR20010005550A - 리소포스포리피드 농도 변화와 연관된 암 감지 방법

Info

Publication number: KR20010005550A
Application number: KR1019997008613A
Authority: KR
Inventors: 고든비. 밀스; 호루브부르스제이.; 더글라스씨. 가우데트
Original assignee: 아타르진 테크놀로지스 인코퍼레이티드; 유니버시티 오브 겔프
Priority date: 1997-03-21
Filing date: 1998-03-23
Publication date: 2001-01-15
Also published as: AU743766B2; EP0985150A1; US20040137541A1; AU6580898A; JP2002510386A; EP0985150A4; US20020123084A1; IL131985A0; CN1269014A; WO1998043093A1; TR199902828T2; CA2284630A1; US20020150955A1

Abstract

본 발명은 암의 존재를 확인하기 위해, 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에 리소포스포리피드 농도를 결정하고, 리소포스포리피드 수준 변화를 감지하기 위해 암이 없는 정상개체에서 취한 샘플에 있는 농도와 비교하여, 개체에 암이 존재하는 지를 감지하는 방법이다. 이 방법을 이용하여, 개체에서 부인과 암 및 유방암의 진단 및 예후 그리고 시간에 따른 치료법의 결과를 모니터할 수 있다.

Description

리소포스포리피드 농도 변화와 연관된 암 감지 방법{METHOD FOR DETECTING CANCER ASSOCIATED WITH ALTERED CONCENTRATIONS OF LYSOPHOSPHOLIPIDS}

사람에게서 다양한 암을 초기에 감지할 수 있는 암 표식이 필요하다. 유방암 및 부임과 암은 여성에 있어서 심각한 치사율의 원인이 되고, 초기 이를 중재하는데 큰 장애가 된다. 예를 들면, 난소 암은 여성에게서 악성 종양으로 인한 4번째 많은 사인이 된다(American Cancer Society, Cancer J. Clin., 43:7-26 (1993)). 난소 암의 경우에, 초기 좀더 치료할 가능성이 있는 단계에 진단을 받은 경우에는 생존율을 더 높일 수 있으나, 환자의 70%는 진단을 받은 시기에 대부분 질병이 진행된 단계가 된다. 가장 적합하게 이용할 수 있는 혈청 표식인 CA125도 난소 암을 스크리닝할 수 있는 절대적인 표식으로 사용할 수 있는 충분한 감응성 또는 특이성을 가지지는 못한다(Einhorn et al., Obstet. Gynecol. 80:14-18 (1992)). 난소 암의 경우에, 초기 난소암 환자의 최고 50%까지도 혈청에서 CA125을 감지할 수 없는 경우가 있다(Schapira et al., Ann. Intern. Med., 118:838-843 (1993)). 자궁 또는 경부 암을 감지하는데 믿을 만한 혈청 또는 혈장 표식이 없다. 또한, 유방 암이 존재하는가를 감지하기 위한 효과적인 혈청 스크리닝 방법 또한 없다. 표식으로 CA125를 이용하여 가짜 양성 결과가 나오는 비율은 약 2%로써 각 감지되는 포기에 약 100개 가짜 양성 결과를 유도하게 된다(Jacobs et al., BMJ, 313:(7069):1355-1358 (1996); Dorum et al., E.J. Cancer 32A(10):1645-1651 (1996); Muto et al., Gynecologic Oncol. 51(1):12-20 (1993); Jacobs et al., Lancet 1(8580):268-271 (1988).

개체에 초기 암, 특히 부인과 암 및 유방암이 존재하는 지를 경제적이고, 신속하게 스크리닝하고, 개체의 예후를 정립하고, 이들 암 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하여, 이들 질병의 예후를 개선시키기 위한 좀더 신뢰성 있는 표식이 필요하다.

포스파티딜콜린(PC)은 아라키돈산 및 리놀레인산과 같은 다가포화된 지방산의 주요 소스중에 하나이다. 전자는 다양한 생물학적 활성을 가지는 에토사노이드의 전구물질이다. PC가 가수분해되면 리소포스포티딜콜린(LysoPC) 및 이의 구성 지방산이 생성되고, 이들은 시그날 변화에 관련된다(Asaoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4917-4921 (193); Yoshida et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6443-6446 (1992)). 산화된 저 밀도 리포프로테인에 높은 농도로 존재하는 LysoPC(Steinberg et al., Eng. J. Med. 320:915-924 (1989))이 아테롬발생 및 다른 염증성 질환에 중요한 역할을 한다는 신체상의 증거로 알수 있다. 예를 들면, LysoPC는 배양된 내피 세포에서 혈소판 유도된 생장 인자 A 및 B 사슬, 그리고 헤파린-결합 상피 생장 인자형 단백질(HB-EGF)을 인코드하는 유전자의 전사를 증가시키는 것으로 보고된 바 있고(Kume and Gimbrone, J. Clin. Invest. 93:907-911 (1994)), 사람 단세포에서 HB-EGF를 인코드하는 mRNA를 증가시킨다고 보고된 바 있다(Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1069-1073 (1994)). 이들 두 가지 유전자 생성물은 모두 평활근 세포 및 섬유아세포에 강력한 돌연변이 유발 물질이 된다(Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991); Ross, Nature (Lond.) 362:801-809 (1993)). LysoPC는 또한 in vitro에서 단백질 카이나제 C를 활성화시키는 것으로 보고된 바 있고(Sasaki et al., FEBS Letter 320:47-51 (1993)), 막 침투성 디아실글리세롤 또는 포로볼 에스테르에 의해 유도되는 HL-60 세포가 대식세포로 분화되는 것을 강화시킨다고 보고된 바 있다(Asaoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6447-6451 (1992)).

LysoPC는 또한, 리소포스포리라제 D의 가수분해를 통하여(Tokumura et al., Biochim. Biophys. Acta 875:31-38 (1986)), 생체 활성이 있는 리소포스포리피드 산(LPA)의 소스가 된다(Moolenaar et al., Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 119:47-65 (1992)). 난소 암 활성 인자(OCAF)는 난소 암 복수로부터 분리된 바 있고(Mills et al., Cancer Res. 48:1066 (1988); Mills et al., J. Clin. Invest. 86:851 (1990) and U.S. Patent Nos. 5,326,690 and 5,277,917), 다중 형의 LysoPA으로 구성된다고 확인된 바 있다(Xu et al., Clin. Cancer Res. 1:1223-1232 (1995)). LysoPA는 또한, 난소 암 환자의 복수에서 강력한 종양 생장 인자로 확인된 바 있다(Id.). 암 환자의 적혈구 및 혈청에서 총 리소포스파티딜콜린(LysoPC)에 촛점을 둔 기존의 연구에서는 유방 암 환자에서 LysoPC가 변화가 없다는 결론을 내렸다(Kal'nova, Vopr. Onkol. 35(7):795-801 (1989)). 전이성 유방암이 있는 환자에서는 적혈구 및 백혈구에 총 포스포리피드에 비고하여 총 리소포스포리피드의 비율이 증가된 것으로 관찰된 바 있다(Damanskii, Vopr. Onkol. 38(10):1194-202 (1992)). 이 연구에서는 특이적인 리소포스포리피드 수준을 평가하거나 지방산 조성 연구를 하지는 않았다. 또한, 이들 연구에서는 다른 형태의 암 또는 유방 암 환자에서 혈청, 혈장, 노 또는 다른 분취한된 혈액 및 적혈구의 임의 다른 체액에서 리소포스포리피드 수준을 평가하지 않았다. 따라서, 암 환자 혈장/혈청에서 특이적인 리소포스포리피드의 변화 또는 이를 예측하는 것에 대해서는 기존 연구에서 실행되지 않았던 것이다.

IV. 발명의 요약

따라서, 본 발명은 암이 없는 정상 개체에서 측정한 리소포스포리피드 수준에 비교하여, 테스트를 받는 개체에서 특정 리소포스포리피드 농도 변화와 관련된 난소, 자궁, 나팔관 및 경부 암, 유방암등의 부인과 암을 포함하는 암을 진단하고, 예후하고, 모니터하는 방법을 포함한다.

방법은 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드의 농도를 감지하는 것으로 구성된다. 이 측정은 1) 개체에서 취함 샘플에 존재하는 LysoPC 또는 LysoPA와 같은 선택된 특이적인 리소포스포리피드의 농도; 2) 포화된 또는 불포화된 지방산 또는 지방산 사슬(가령, 팔미토일-LysoPC 또는 리노레일-LysoPC)을 가지는 선택된 리소포스포리피드 서브타입의 농도 또는 글리세롤 기본구조에 부착된 특정한 긴 길이의 알코올을 가지는 서브 타입 농도; 3) 샘플에 존재하는 총 리소포스포리피드의 농도; 4) 환자에서 취한 한 가지 샘플에서 LysoPC와 같은 제 1 리소포스포리피드의 농도 및 또 다른 리소포스포리피드, LysoPA의 농도를 측정하는 것으로 이루어 진다. 한 가지 샘플에서 동시에 또는 연속적으로 상이한 리소포스포리피드를 측정함으로써 본 발명의 방법을 이용한 암을 감지하는데 있어서, 감응성 또는 특이성을 개선시키고, 가짜 음성 또는 가짜 양성 결과가 발생되는 것을 감소시킬 수 있다.

또한, 특정 리소포스포리피드를 구성하는 특이적인 지방산 복합 농도를 결정하고, 테스트 개체 및 정상 개체에서 취한 샘플과 비교한다.

본 발명은 LysoPC 및 LysoPA와 같은 리소포스포리피드가 난소 암과 같은 부인과 암 및 다른 암을 가지는 개체의 체액에서 변화된다는 발견에 일부 기초한 것이다. 본 발명의 방법에 이용할 수 있는 적절한 리소포스포리피드는 인산 또는 콜린, 이노시톨, 에탄올아민, 글리세롤 또는 세린과 같은 유도된 포스페이트가 sn-3 위치에 있는 글리세롤 기본 구조를 가지고, sn-1 또는 sn-2 위치에는 한가지 지방산 사슬을 가지고, 또 다른 sn-1 또는 sn-2 위치에는 글리세롤 기본구조에 아실 연결에 의해 하이드록실이 연결되어 있다.

또는, 긴 사슬의 알코올이 sn-1 위치에 알킬 도는 알케닐 연결에 의해 글리세롤 기본구조에 연결되거나 또는 sn-2 위치에 하이드록실과 연결된다. 이들 화합물은 다음과 같은 일반적인 화학식을 가진다.

이때, X는 임의 지방산 또는 긴 사슬의 알콜올로써 아실, 알킬 또는 알케닐 결합에 의해 부착된 18:0, 16:0, 18:1, 18:2, 20:4n-6, 22:6n-3등을 포함하나 이에 한정시키지 않고, R1는 아실 결합에 의해 포스포리피드의 글리세롤 기본구조에 연결된 팔미트산, 팔미토올레익, 스테아릭, 올레익, 리놀레익, 아라키도닉, 도카사헥사노익 지방산을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

R2는 수소, 콜린, 이노시콜, 에탄올아민, 글리세롤, 세린을 포함하나 이에 국한시키지 않는 임의 유도체 인산염이 된다.

본 발명의 방법을 이용하여 감지되는 리소포스포리피드에는 LysoPA, LysoPC, LysoPS, LysoPE, LysoPI, LysoPG등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

개체에서 암을 예후하기 위한 본 발명의 또 다른 구체예는 암이 있는 개체에서 연속적인 시간 간격을 두고 리소포스포리피드 농도를 측정하고, 이들 화합물의 농도는 암의 예후 및 치료법의 성공을 결정하기 위해 시간을 두고 비요하는 것이다. 특정 암의 경우에, 나중에 테스트 개체에서 취한 샘플에 있는 리소포스포리피드 농도가 증가되는 경우는 살아있는 종양의 수가 증가되었다는 것을 나타내고, 리소포스포리피드 농도가 감소되었다는 것은 살아있는 종양 세포의 수가 감소되었다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 적어도 한 가지 다른 리소포스포리피드 농도를 테스트 개체의 샘플에서 제 1 형의 리소포스포리피드 농도와 동시에 또는 연속하여 측정함으로써, 개체에서 암을 감지하는데 감응성 또는 특이성을 개선시킨다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, CA125와 같은 추가 암 세포 표식 농도를 결정하여, 암을 감지하는데 있어서, 감응성 및 특이성을 개선시킨다.

본 발명의 특정 구체예에서, LysoPC 또는 LysoPA의 농도를 테스트 개체에서 취한 혈장 샘플에서 측정하여, 개체에 있는 부인과 종양이 존재하는 지를 예후한다. 진단은 환자에서 취한 샘플에서 시간에 따른 리소포스포리피드 농도 변화를 결정하는 것으로 이루어 진다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 암은 테스트 개체 샘플에서 LysoPC와 같은 리소포스포리피드에 특이적인 지방산 비율을 우선 측정하고, 암을 가지고 있지 않는 정상 개체에서 취한 샘플에서 리소포스포리피드에 있는 동일한 지방산의 비율과 비교하여 이루어 진다. 정상 개체에서 리소포스포리피드에 있는 지방산 비율에 대해 테스트 개체에서 취한 샘플에 리소포스포리피드에 지방산 비율의 변화는 암 존재 여부를 나타낸다. 테스트 개체에서 취한 샘플에 있는 리소포스포리피드의 지방산 비율이 특정 값 범위에 속하는 경우에, 테스트 개체의 샘플에 리소포스포리피드에 있는 상이한 지방산의 비율을 결정하고, 정상 개체에 있는 리소포스포리피드의 동일한 지방산 비율을 비교한다. 제 2 비율 값이 변화된 경우에 암이 존재한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 유방암은 테스트 샘플에 LysoPC에서 지방산 비율을 이용하여 진단한다.

또 다른 구체예는 리소포스포리피드 농도를 측정하는 시약 및 선택적으로 항-리소포스포리피드 항체를 포함하는 진단 키트가 된다.

본 발명의 장점은 초기 단계에서 특정 리소포스포리피드가 존재하는 것과 연관된 암을 감지하고, 감지하는데 있어서, 특이성 및 감응성을 증가시키고, 개체에서 개선된 예후를 위한 초기 중재를 할 수 있는 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 유방암을 감지하는데 있어서, 양성 및 가짜 음성 결과를 줄일 수 있다.

I. 관련된 출원

본 출원은 1997년 3월 21일자 출원된 미국 특허 출원 08/822,128의 연속 출원이다.

II. 개요

본 출원은 리소포스포리피드 및 이의 구성분 지방산 농도 변화와 관련이 있는 암, 특히 부인과 및 유방 암이 개체에 있는 지를 스크리닝하는 방법에 관련된 것으로 시험 개체에서 취한 체액 샘플에 리소포스포리피드 또는 이들의 구성분인 지방산 농도를 감지하여 스크리닝한다.

도 1A-1C는 기준 개체와 암 환자 혈정에서 포스파티딜콜린(PC)(1A) 및 LysoPC(1B)의 농도 및 LysoPC/PC(1C) 비율을 그래프로 나타낸 것이다. 데이타는 7명 기준 및 17명 난소 암 환자에서 평균±SE로 나타낸 것이다. 기준과 비교하였을 때, 난소 암 환자의 혈장에서 LysoPC 농도(^**p〈0.01) 및 LysoPC/PC 비율(^**p〈0.01)에 상당한 차이가 있음이 관찰되었다.

도 2는 기준 개체 및 난소 암 환자에서 혈장 PC의 지방산 조성물(총 지방산의 mol%)을 그래프로 나타낸 것이다(16:0=팔미트산; 18:0=스테아르산; 18:1=올레인산; 18:2n-6=리노레인산; 20:4n-6=아라키돈산).

도 3은 기준 개체 및 난소 암 환자에서 혈장 LysoPC의 지방산 조성물(총 지방산의 mol%)를 그래프로 나타낸 것이다. 기준 개체와 비교하였을 때, 난소 암 환자에서 팔미트산(16:0)(^**p〈0.01) 및 스테아르산(18:0)(^***p〈0.001)에서는 농도가 상당히 더 높은 것으로 나타났고, 올레인산(18:1)(^*p〈0.05) 및 리노레인산(18:2n-6)(^***p〈0.001)에서는 농도가 더 낮은 것으로 나타났다.

도 4는 기준 개체 및 난소 암 개체에서 혈장 PC 및 LysoPC에서 16:0 몰 비율(팔미트산/18:2n-6(리놀레인산)의 몰비율을 그래프로 나타낸 것이다. 데이타는 raud 기준 및 17명의 난소 암 환자에서 평균±SE로 나타낸다. 혈장 PC와 비교하였을 때, 혈장 LysoPC(^***p〈0.001)의 경우는 상당히 차이가 있는 것으로 관찰되었다.

도 5는 난소 암 환자와 기준 개체에서 [LysoPC/PC]×[팔미토일-LysoPC(16:0/리놀레일-LysoPC(18:2n-6)]의 값을 나타내는 그래프이다. 수직선은 7명 기준 및 17명의 난소 암 환자에서 평균±SE를 나타낸 것이다. 기준과 비교하였을 때, 난소 암 환자의 혈장에서 상당히 높은 것으로 관찰되었다(^***p〈0.001).

도 6은 난소 암 환자 및 기준 개체에서 취한 혈장에서 LysoPA 농도를 나타내는 그래프이다. 수직선은 9명 기준 및 52명의 난소 암 환자에서 평균±SE를 나타낸 것이다. 기준과 비교하였을 때, 난소 암 환자의 혈장에서 LysoPA 농도가 상당히 높은 것으로 관찰되었다(^***p〈0.001).

도 7은 기준과 비교하였을 때, 활성 질환 및 정지기 질환을 가지는 환자의 혈장에서 LysoPA의 농도를 나타내는 그래프를 나타낸다. 좌측 3개 막대는 전체 LysoPA를 나타내고, 우측 3개 막대는 다중불포화된 지방산만을 가지는 LysoPA을 나타낸다. 막대는 9명 기준 및 52명의 난소 암 환자에서 평균±SE를 나타낸다. 기준과 비교하였을 때 또는 정지기 상태 질병을 가지는 환자와 비교하였을 때, 활성 질환을 가지는 환자에서는 포화된 지방산과 LysoPA 및 LysoPA 농도가 상당히 높은 것으로 나타났다.

본 발명은 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스파딕산(LysoPA), 리소포스파티딜 콜린(LysoPC), 리소포스파티딜 세린(LysoPS), 리소포스파티딜 이노시톨(LysoPI), 리소포스타티딜 에탄올아민(LysoSE), 리소포스파티딜 글리세롤(LysoPG)등을 포함하나 이에 국한시키지 않는 리소포스포리피드의 농도 변화와 연관이 있는 암을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법에는 유방암이 존재하는 지를 결정하기 위해 정상개체와 테스트 개체에서 취한 LysoPC와 같은 리소포스포리피드의 지방산 구성분을 비교하여 유방암을 스크리닝하는 것을 포함한다. 개체는 사람이 아닌 동물 또는 사람이 된다.

이들 리소포스포리피드의 농도 증가와 연관이 있는 암으로는 난소, 자궁 경우, 자궁 및 다른 암을 포함하는 부인과 종양을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 백혈병과 같은 특정 암은 이와 같은 리소포스포리피드 농도 증가와는 무관하다. 따라서, 적절하게는, 본 발명의 방법은 암이 없는 정상 개체의 체액에서 발견되는 농도와 비교하여 테스트 개체의 체액 샘플에서 리소포스포리피드의 농도가 증가된 것과 관련이 있는 것으로 알려진 암을 감지하는 것에 관계한다.

본 발명의 방법에 이용할 수 있는 적절한 리소포스포리피드는 인산 또는 콜린, 이노시톨, 에탄올아민, 글리세롤 또는 세린과 같은 유도된 포스페이트가 sn-3 위치에 있는 글리세롤 기본 구조를 가지고, sn-1 또는 sn-2 위치에는 한가지 지방산 사슬을 가지고, 또 다른 sn-1 또는 sn-2 위치에는 글리세롤 기본구조에 아실 연결에 의해 하이드록실이 연결되어 있다. 또는, 긴 사슬의 알코올이 sn-1 위치에 알킬 도는 알케닐 연결에 의해 글리세롤 기본구조에 연결되거나 또는 sn-2 위치에 하이드록실과 연결된다.

이들 화합물은 화학식 1을 가진다.

이와 같은 리소포스포리피드는 in vitro 및 in vivo에서 암 세포에 대한 생장을 촉진시키는 또는 시그날 활성을 가지는 성질을 공유한다. 예를 들면, 이와 같은 활성은 세포질 없는 칼슘의 증가와 연관되거나(Xu et al., Clin. Cancer. Res. 1:1223-1232 (1995)) 또는 다른 시그날 과정의 활성화와 연관된다(Moolenaar, Current Opinion in Cell Biol. 7:(2):203-210 (1995); Moolenaar, J. Biol. Chem. 270(22):12949-12952 (1995); Jalink et al., Biochim. Biophys. Acta 1198(2-3):186-196 (1994); and Xu et al., Biochem. J. 309:933-940 (1995)).

A. 발명의 용도

본 발명의 방법은 여러 가지 장점을 제공한다. 우선, 본 방법은 여러 명의 개체에서 초기 암 진단을 촉진시키기 위한 신속하고 경제적인 스크리닝 방법을 제공하여, 암 환자의 삶의 질을 높이고, 생존율을 개선시킬 수 있게 한다.

예후를 위한 본 발명의 방법을 이용하여, 의료 전문의들은 초기 단계의 암 환자가 치료를 요하는지 또는 치료가 필요없는 지를 결정할 수 있다. 이는 또한, 외과술, 화학요법, 방사능요법 또는 생물학적 치료법과 같은 특정 치료법으로 효과를 보지 못한 환자를 확인할 수 있다. 이와 같은 정보를 이용하여, 암 환자에서 치료법에 대한 더 나은 반응을 얻어낼 수 있는 개선된 치료법을 고안할 수 있고, 삶의 질을 높일 수 있고, 생존율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 한 가지 치료법에서 다른 치료법으로 변경해야할 환자를 확인할 수 있다. 이는 치료법에 대한 환자의 반응을 결정하기 위해 "second look" 침습적 검사를 할 필요가 없고, 특정 형태의 치료법을 계속해야할지, 종료해야할지 또는 변경해야할지를 결정할 수 있다.

암이 상당히 진행된 환자에게서는 암이 재발하기 때문에, 본 발명의 방법을 이용하여, 초기에 감지하고, 그리고 시간을 두고 지속적으로 모니터를 하여, 증상이 나타나기 전에 초기에 숨어있는 재발성 암을 감지할 수 있다. 이와 같은 목적으로 본 발명의 방법을 이용하면, 암 환자에서 치료법에 대한 반응을 개선시키고, 생존율을 증가시킨다.

또한, 본 발명의 방법은 악성 종양으로부터 양성 종양을 구별할 수 있다. 난소와 같은 기관은 초음파 또는 물리적인 검사를 이용하는 과정으로 초기에 감지할 수 있다. 그 다음, 본 발명의 방법을 이용하여 암이 존재하는지를 진단한다. 이는 외과적인 중재를 할 필요 없이, 지속적인 모니터를 하여, 초기 감지를 개선시키고, 암 환자의 생존율을 증가시킨다.

본 발명의 방법의 또 다른 용도는 알려지지 않은 일차 종양의 기원을 결정하는 것이다. 복강 또는 신체의 또 다른 부분에 있는 악성 종양의 기원 조직은 통상적인 기술로는 확인할 수 없다. 이와 같은 정보를 이용하여 종양에 대한 가장 적절한 치료법을 의료진들이 이용할 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 리소포스포리피드 또는 특정 형태의 리소포스포리피드의 농도를 측정하여 종양의 기원 조직에 대한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들면, 리소포스포리피드 농도가 상승되면, 암파종과 장 종양을 구별할 수 있는데, 이는 부인과 종양의 경우보다는 장 종양의 경우가 리소포스포리피드 농도가 더 낮기 때문이다.

본 발명의 방법을 이용하면, 암과 연관된 리소포스포리피드 농도를 측정하는 것에 추가하여, CA125, Tac, 가용성 IL2 수용체 알파, mCSF, OVX1, CEA, PSA, CA15-3, CA19.9를 포함하나 이에 국한되지 않는 또 다른 암 세포 표식을 측정하여 암을 감지하는데 있어서, 특이성 및 감응성을 개선시킨다.

감응성을 증가시키기 위해 특별하게 이용할 수 있는 측정으로는 리소포스포리피드 농도 및 다른 암 표식을 시간을 두고 측정하거나 또는 시간에 따른 리소포스포리피드의 단위 변화시간에 측정하여, 가짜 양성 결과가 나오는 것을 감소시킨다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 결정된 리소포스포리피드 농도에 대한 정보는 초음파, 생검, 복벽절제술, 생검 또는 MRI를 이용하는 것에 대체할 수 있어, 초기 암 감지를 개선시키고, 많은 집단에서 암이 존재하는 지를 스크리닝 할 수 있다.

유방 암의 경우에는 본 발명은 선-스크리닝 방법을 제공하는데, 초기 음성 결과(암이 없다는 것)는 유방조영법 또는 생검과 같은 좀더 침습적인 또는 바람직하지 못한 과정을 필요로 하는 여성의 수를 줄일 수 있다.

B. 리소포스포리피드 또는 이들의 구성 지방산의 농도를 감지하여 암을 진단

본 발명은 개체에서 암이 존재하는지를 진단하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에 리소포스포파티딜콜린(LysoPC) 및 리소포스파딕산(LysoPA) 농도 증가를 감지하는 방법을 제공한다. 체액은 혈장, 노, 타액, 복수, 뇌 척수 또는 늑막 액이 될 수 있다.

본 발명의 방법은 다음과 같이 실행한다. 상기에서 정의된 바와 같은 리소포스포리피드 농도는 지질 추출 및 분석후에 또는 상기에서 설명하는 것과 같은 항체계 검사에 의해 측정한다. 이와 같은 측정은 다음과 같이 이루어진다; 1) 개체에서 취함 샘플에 존재하는 LysoPC 또는 LysoPA와 같은 선택된 특이적인 리소포스포리피드의 농도; 2) 포화된 또는 불포화된 지방산 또는 지방산 사슬(가령, 팔미토일-LysoPC 또는 리노레일-LysoPC)을 가지는 선택된 리소포스포리피드 서브타입의 농도 또는 글리세롤 기본구조에 부착된 특정한 긴 길이의 알코올을 가지는 서브 타입 농도; 3) 샘플에 존재하는 총 리소포스포리피드의 농도; 4) 환자에서 취한 한 가지 샘플에서 LysoPC와 같은 제 1 리소포스포리피드의 농도 및 또 다른 리소포스포리피드, LysoPA의 농도를 측정하는 것으로 이루어진다. 한 가지 샘플에서 동시에 또는 연속적으로 상이한 리소포스포리피드를 측정함으로써 본 발명의 방법을 이용한 암을 감지하는데 있어서, 감응성 또는 특이성을 개선시키고, 가짜 음성 또는 가짜 양성 결과가 발생되는 것을 감소시킬 수 있다.

예를 들면, 스테아린산 또는 팔미트산과 같은 포화된 지방산 사슬의 특정 형을 가지는 LysoPC와 같은 리소포스포리피드 농도를 측정하고, 다른 형태의 지방산 사슬을 가지는 리소포스포리피드 예를 들면, 올레인산 및 리노레인산과 같은 불포화 지방산을 가지는 LysoPC과 같은 리소포스포리피드의 농도와 비교한다. 그 다음 이 값은 샘플에 있는 포스파티딜콜린(PC)과 같은 성분의 총 양을 이용하여 표준화한다. 이와 같은 측정으로 지방산 사슬 타입과는 무관하게, LysoPC 만으로 총 리소포스포리피드 농도를 측정하는 것보다는 암이 존재하는 지에 대해 좀더 많은 특이성 및 감응성을 제공한다. 또한, 리소포스포리피드 농도는 등가의 인지질 가령, LysoPC 농도는 샘플에 있는 PC 농도와 비교한다(실시예 및 도 1-5를 참고).

우선, 리소포스포리피드 또는 특정 리소포스포리피드 종의 생리학적('정상') 농도를 암이 없는 개체에서 결정한다. 연속하여, 암이 있는지를 스크리닝 받는 개체의 체액 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 측정하여, 정상 개체의 것과 비교한다. 리소포스포리피드 농도는 정상의 것에 비해 상승된 경우에는 암이 존재한다는 진단을 내린다. 또한, 상기에서 설명한 것과 같이 농도는 다른 화??물의 농도에 대해 표준화시킨 후에 비교한다.

개체의 체액 샘플에서 감지된 리소포스포리피드 농도는 상기에서 설명한 것과 같이 우선 지질을 추출하여 측정한다. 그 다음 리소포스포리피드의 양은 기체 크로마토그래피 HPLC, ELISA, NMR, 효소를 이용한 생화학적 검사 또는 다른 과정과 같은 표준 과정을 이용하여 정량화한다. 또는, 샘플에 있는 리소포스포리피드의 존재는 상기에서 설명하는 것과 같이 항체계 검사에서 항-리소포스포리피드 항체를 이용하여 정량화한다. 정상 기준에 비교하여 상당히 증가된 리소포스포리피드 농도는 암이 존재한다는 것을 나타낸다.

추가 진단 도구로써, 선택된 리소포스포리피드 종의 농도를 측정하고, 상기에서 설명하는 것과 같이 표준화시킨다. 이와 같은 종의 농도가 증가된다는 것은 암이 존재한다는 것이다. 이는 검사의 감응성 및 특이성을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 방법을 이용하여 결정된 리소포스포리피드의 농도를 이용하여 감의 존재에 대해 개체를 진단 및 스크리닝할 뿐만 아니라 암 환자의 예후를 결정할 수 있다. 또한, 치료에 대한 암의 반응은 시간을 두고 개체에서 취한 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 결정하여 모니터한다.

또한, 시간을 두고 리소포스포리피드 농도의 변화 비율을 결정하고, 이는 암이 존재하는지에 대한 좀더 감응성 있고, 특이적인 방법이 된다.

암의 진단 및 예후를 평가하는데 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, in vitro 진단 방법에는 생물학적 샘플에 있는 포스포리피드를 감지하는 것을 포함하고, 따라서 이를 이용하여 비정상적인 리소포스포리피드 농도에 대해 검사를 받을 수 있는 진단 또는 예후 기술로 이용할 수 있다. 이와 같은 검사 방법에는 기체 크로마토그래피, NMR, HPLC와 같은 공지의 기술이 포함된다. 예를 들면, Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)에서 설명하는 것과 같은 추출 과정을 이용하여, 체액에서 지질을 추출한다. TLC를 이용하여 Thomas and Holub, Biochim. Biophys. Acta, 1081:92-98 (1991)에서 설명하는 것과 같이 다양한 인지질을 분리할 수 있다. Gaudette et al., J. Biol. Chem. 268:13773-13776 (1993)에서 설명하는 것과 같이 적외선 광을 이용하여, 판에서 인지질 및 리소포스포리피드을 볼 수 있다. 지방산은 가시화된 인지질로부터 추출하여 감지하고, HPLC 또는 NMR과 복합하여, 기체 크로마토그래피와 같은 과정을 이용하여 정량화할 수 있다(Skeaff and Holub, In M. Lagarde (ed.) Biology of Eicosanoids, Vol. 152, pp. 63-76, Inserm. Paris (1987). 지방산으로 구성된 리소포스포리피드 농도는 기체 크로마토그래피에 의해 측정된 지방산으로부터 유도하고, 헵타데카노인산과 같은 내부 표준으로 계산한다. 또는, 리소포스포리피드 농도는 인지질 또는 인지질의 일부를 분리한 후에 NMR 또는 HPLC에 의해 확인할 수 있다.

추출에 의해 리소포스포리피드 농도를 직접적으로 측정하는 것에 추가하여, 테스트 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 측정하기 위해 검사에 리소포스포리피드과 반응성이 있는 단클론성 항체와 같은 항체를 이용할 수 있다. 예를 들면, 항-인지질 항체는 표준 과정을 이용하여 라벨링하고, 이는 고형상 및 액상 방사능면역검사(RIA), 형광-연결된 효소 또는 효소-연결된 면역흡착 검사(ELISA)에 이용되는데, 이때 항체는 유체 샘플에 있는 리소포스포리피드의 존재를 감지한다(Uotila et al., J. Immunol Methods 42:11 (1981)); 형광 기술(Sikora et al., (eds)., Monoclonal Antibodies, pp. 32-52, Blackwell Scientific Publications, (1984)).

리소포스포리피드를 감지하는 검사에 이용하는 리소포스포리피드에 대한 단클론성 항체는 리소포스포리피드, 이의 단편 또는 이의 기능적인 등가체로 다양한 숙주 동물에 면역주사하는 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 이와 같은 숙주 동물에는 토끼, 생쥐, 들쥐, 염소등이 포함되나 이에 한정하지는 않는다. 다양한 어쥬번트를 이용하면, 숙주 종에 딸라 면역학적 반응을 증가시킬 수 있는데, Freund's(컴플리트 및 인컴플리트), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 플루로닉 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일 에멸젼, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로페놀과 같은 표면 활성 물질 및 가능성이 있는 사람 어쥬번트 예를 들면 BCG(Bacille Calmette-Guerin), Corynebacterium parvum 등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 다클론성 항체는 면역화된 동물의 혈청에서 유도된 항체 분자의 이형집단이다.

특정 항원에 동질성 항체 집단인 단클론성 항체는 배양물에서 연속성 세포주에 의한 항체 생산 또는 상 디스플에이 라이브러리를 이용하는 임의 기술에 따라 수득될 수 있다. 여기에는 Kohler Milstein(Nature 356:495-497 (1975))의 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:2026-2030 (1983)), EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985))등이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 이와 같은 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의 이뮤노글로블린 종 또는 이의 서브클라스가 된다. MAb를 생산하는 하이브리도마는 in vitro 또는 in vivo에서 배양한다.

특이적인 리소포스포리피드를 인지하는 항체 단편을 이용하고, 공지의 기술에따라 생성시킨다. 예를 들면, 이와 같은 단편에는 항체 분자를 펩신으로 처리하여 생성되는 F(ab')₂단편, F(ab')₂단편의 이황화결합을 환원시키면 생성되는 Fab 단편등이 있으나, 이에 국한시키지는 않는다. 또는 Fab 발현 라이브러리를 작제하여(Science 246:1275-1281 (1989)), 원하는 특이성을 가지는 단클론성 Fab 단편을 신속하고, 용이하게 확인할 수 있다.

상기 검사에서 설명하는데 이용할 수 있는 리소포스포리피드에 대한 항체를 준비하는 과정, 예를 들면, 포스파티딜이노시톨 및 포스파틱산 항체를 생산하는 것에 대해 설명하고 있다(See, Keating et al., Biochem. J. 317(Pt. 3):643-646 (1996); Fukami et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:9057-9061 (1988); Fukami et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85(23):9057-9061 (1988); and Matuoka et al., Science 239(4840):640-643 (1988)).

본 발명의 또 다른 구체예에서, 테스트 개체는 유방 암과 같은 암을 감지하기 위해 선-스크리닝을 받는다. 테스트 개체의 혈청 또는 다른 체액 샘플에서 LysoPC와 같은 특이적인 리소포스포리피드의 지방산 조성물 농도를 측정한다. 리소포스포리피드에 있는 특정 지방산 비율 예를 들면, 팔미트산:리놀레인산(16:0/18:2n-6)의 비율을 정상(암이 없는) 개체에서 취한 샘플에서 수득한 동일한 지방산의 비율과 비교한다. 정상 개체로부터 수득된 비율과 비교하여 테스트 개체에서 비율의 값이 상당히 변화된 경우에 암이 존재한다는 것을 나타낸다. 암에 대해 양성으로 판된될 샘플의 비율에 대한 "차단치(cutoff)"를 결정하는 것이 바람직하다. 실시예의 특이적인 구체예에서, 데이터로부터 차단치는 적어도 3.5로 결정되었다. 또한, 테스트 샘플에서 더 낮은 비율고 정립하는 것이 좋은데, 이와 같은 낮은 값과 상위 값사이의 범위는 "추가 테스트를 요함" 결과가 된다. 만일 이 범위에 특정 리소포스포리피드 가령, LysoPC의 지방산 비율이 속하는 경우에, 동일한 리소포스포리피드에서 상이한 지방산의 비율 값을 측정하는 제 2 테스트를 실시하여, 원래 테스트 샘플에 있는 동일한 리소포스포리피드에 이들 지방산의 비율과 비교한다. 테스트 샘플에 있는 제 2 비율의 값이 제 2 차단치보다 큰 경우에 개체는 암을 가지고 있는 것이고, 추가로 유방조영법을 실시한다. 실시예의 특정 구체예에서, 차단치 1.00는 유방암이 존재한다는 것을 나타낸다. 이와 같이 LysoPC와 같은 리소포스포리피드에서 지방산 비율의 2 단계 분석으로 감응성을 증가시키고, 가짜 음성 및 양성 결과가 나올 확율을 줄인다. 특히, 이 방법은 암이 존재한다는 것을 결정하기 위해 유방조영법과 같은 과정을 실시하는 횟수를 줄임으로써 비용을 절감하고, 편리하게 결정할 수 있다.

C. 암을 가지고 있는 개체의 모니터 방법

본 발명은 시간에 따른 환자에서 암을 추적하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 암 환자의 체액 샘플에서 LysoPC와 같은 리소포스포리피드 농도를 결정하는 것이다. 후에, 리소포스포리피드 농도를 측정하여, 환자의 초기 단계에서 측정된 농도와 비교한다. 시간에 따라 리소포스포리피드 농도가 증가된 경우에는 생존한 종양 세포의 수가 증가되었다는 것을 말하고, 따라서 환자에서 암이 증가되었다는 것이다. 역으로, 리소포스포리피드 농도가 감소된 경우에는 암이 감소되었다는 것을 말한다.

또한, LysoPA와 같은 한가지 이상의 리소포스포리피드를 테스트 샘플에서 취한다. 이와 같이 측정함으로써, 의료진은 특정 치료법 또는 과정을 변경, 중지 또는 시작해야할 지를 조절하여, 환자의 예후 및 생존율을 개선시킨다.

D. 진단 키트

개체의 체액 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 측정하기 위해 여기에서 설명하는 방법은 미리 포장된 진단 키트를 이용하여 실행할 수 있다. 이와 같은 키트에는 다양한 지질 샘플에서 액체를 추출하는 시약과 같은 리소포스포리피드 농도를 측정하는 시약을 포함한다. 시약에는 완충제와 같은 보조제, EDTA와 같은 샘플의 운반 또는 저장동안에 리소포스포리피드의 가수분해 또는 연속적인 생산을 저해하는 물질이 포함된다. 또는, 진단 키트에는 암 환자를 진단하는 임상 세트에 통상적으로 이용될 수 있는 항-리소포스포리피드 항체 또는 항체 복합물과 같은 라벨된 항체 시약이 포함된다. 키트에는 본 발명의 방법을 실행하고 또는 처리를 위해 진단 실험실에 샘플을 이동하는 방법 및 본 발명의 방법을 실행하는데 적절한 기구등이 포함된다.

다음의 실시예는 본 발명의 방법을 설명하고, 이를 이용하는데 있어서, 당업자를 지원하는 것을 설명한다. 실시예는 본 발명의 방법을 제한하는 의미는 아니다.

실시예 1. 난소 암 환자의 혈장에 LysoPC 및 이의 구성 지방산을 감지

A. 개체

Toronto General Hospital에 입원한 36 내지 74세의 상피 난소 암으로 진단을 받은 17명의 개체가 실시예에 포함된다. 이들 개체중 7명은 활성 질환으로 진단을 받았고, 9명은 분석시에 시스플라티늄계 화학요법을 받고 있었다. M.D. Anderson Cancer Center (Houston, Texas)에서 화학요법 과정에 있는 활성 백혈병을 가지는 6명의 개체도 비교를 목적으로 포함시킨다. 기준 개체는 46 내지 63세(평균 52세)의 7명의 건강한 여성이 된다.

B. 혈장 샘플

EDTA를 포함하는 진공용기(Becton Dickinson and Company, Rutherford, New Jersey)에 혈액 7㎖을 뽑고, 혈장을 분리한다(1,600 x g, 15 min). 혈장은 -20℃에 저장하고, 7일이내에 분석한다.

C. 지질 추출 및 인지질 분석

혈장 지질은 Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917 (1959)에서 설명하는 방법에 따라 약간 변형하여 실시한다. 각 0.5㎖ 혈장 샘플에, 3.75㎖ 클로로포름/메탄올(1:2 v/v)을 첨가하고, 내용물은 1분간 혼합한다. 대부분 혈장 단백질을 펠렛으로 원심분리한 후에, 클로로포름/메탄올 추출물은 새 튜브로 옮기고, 1.25㎖ 클로로포름으로 완전하게 혼합한다. 1.75㎖ H₂O을 첨가하고, 내용물은 간단하게 혼합하고, 원심분리하여 상을 분리한다. 저층 클로로포름 층을 분리한 후에, 2.5㎖ 클로로포름 및 63㎕ concHCl을 나머지 수용성 상에 첨가한다. 클로로포름 층은 원심분리한 후(2차 추출) 수집한다. 제 1 및 제 2(산성화된) 클로로포름 추출물은 질소하에 농축시키고, 실리카 겔 플레이트에 스팟한다(Silica Gel 60) (EM Science, Gibbstown, New Jersey). 인지질은 이차원 TLC[1차원: 클로로포름/메탄올/14.8N 수산화암모니움:65:35:5.5 (v/v/v) ; 2차원; 클로로포름/메탄올/88% 포름산/물;55:28:5:1(v/v/v/v)]을 이용하여 분리한다(Thomas and Holub, Biochim. Biophys. Acta. 1081:92-98 (1991)). TLC 플레이트는 두 단계 크로마토그래피사이에 30분간 질소하에서 40℃상에서 건조시킨다. 인지질은 물에 0.1% 8-아니리노-1-나프탈렌-설폰산(ANS)(Sigma, St. Louis, Missouri)을 플레이트에 분무하고, 적외선 광으로 볼 수 있다(Gaudette et al., J. Biol. Chem., 268:13773-13776 (1993)). PC 및 LysoPC에 상응하는 점을 플레이트에서 ??어내고, 2㎖ 아세틸 클로라이드/메탄올5:50(v/v)을 이용하여 실리카 겔 존재하에 트랜스메틸화시킨다. 양을 알고 있는 헵타데카노인산(17:0)을 내부 표준으로 삼는다. 트랜스메틸화 반응후에, 지방산 메틸 에스테르는 페트롤리움 에테르로 추출하여, 모델 5890 A 기체 크로마토그래피로 정량화하는데(Hewlett Packard, Wilmington, Delaware), 상기에서 설명하는 것을 참고로 한다(Skeaff and Holub, In M. Lagarde, (ed), Biology of Eicosanoids, Vol. 152, pp. 63-76, Inserm, Paris (1987)). 존재하는 PC 및 LysoPC의 농도는 기체 크로마토그래피(GC)에 의해 측정된 지방산의 양으로 알 수 있고, 이는 헵타데카노인 산으로 계산한다.

데이터는 Student' test로 분석하고, p〈0.05일 때 유의성이 차이가 있다.

D. 결과

1. 혈장 PC 및 LysoPC 농도

정상 기준 개체(1.26 ±0.17 μmol/㎖)와 비교하였을 때 난소 암 개체(1.08 ±0.07 μmol/㎖, mean ±SE)에서 혈장 PC 농도가 평균 14% 낮으나, 이 차이는 유의성이 있지는 않다(p〈0.2)(도 1A) 대조적으로 난소 암 개체에서 혈장 LysoPC 농도는 기준의 것보다 상당히 높았다(평균 43%; p〈0.01)(도 1B). 이에 상응하는 값은 기준 및 난소 암 개체에서 각각 125.6 ±7.1 nmol/㎖(mean ±SE) 및 179.7 ±10.0nmol/㎖이다. LysoPC에 대한 PC의 몰 비율은 기준 개체(0.11 ±0.02)(도 1C)의 것과 비교하여 볼 때 난소 암 환자에서 상당히 높다(0.17 ±0.01, 평균 ±SE).

이 과정에서 수득된 총 혈장 PC 및 LysoPC중에, 각각 98% 및 88%는 기준 및 난소 암 환자모두에서 처음 클로로포름(중성 추출물)에 추출되었다. 총 혈장 PC에 소량만이 있고, 대부분의 양(21.6 vs 14.4 nmol/㎖; p〈0.05)은 기준 개체보다는 난소 암 개체의 혈장 산성화된 추출물에서 관찰되었다.

2. 혈장 PC 및 LysoPC의 지방산 조성물

기준 및 난소 암 환자에서 혈장 PC의 지방산 조성에는 큰 차이가 없었다(도 2). 대조적으로, 난소암 환자의 혈장 LysoPC에는 기준과 비교하였을 때 상당히 더 높은 팔미토일- 및 스테아릴-LysoPC 종을 포함하고, 상당히 낮은 농도의 올레일- 및 특히 리노레오일-LysoPC 종을 포함한다(도 3). 난소 암 환자에서 혈장 팔미토일에 대한 리노레오일-LysoPC의 몰 비율(5.3 ±0.3, mean ±SE)은 기준의 것(3.0 ±0.4)보다 상당히 높다(도 4).

3. 난소 암 지시물질로써 혈장 팔미토일-LysoPC에 대한 리노올레일-LysoPC 몰 비율의 농도 차이 비교

정상 개체와 비교하였을 때, 난소 암 개체에서 혈장 LysoPC 농도(도 1B) 및 LysoPC(도 1C)와 팔미토일-LysoPC/리노올레일-LysoPC(도 4)의 몰 비율이 상당히 높은 것으로 나타났는데, 각 p〈0.01, p〈0.01, p〈0.001; 일부 개체에서 수득된 데이터는 기준의 것을 덮었다. 따라서, [LysoPC/PC 몰 비율] ×[팔미토일-LysoPC/리노올레일-LysoPC 몰 비율]을 계산한다. 기준사이에 값(0.324 ±0.054, mean ±SE)은 난소 암 개체의 것(0.928 ±0.092, mean ±SE)과 비교한다. 도 5에서 볼 수 있는 것과 같이, 난소 암 개체간에 평균 치는 기준의 것보다는 상당히 높다(p〈0.001). 또한, 17명 개체중 15명은 기준의 평균±1SD(0.0450)보다 더 높은 값을 가지고, 17명중 13명은 기준의 평균±2SD(0.596)보다 훨씬 큰 값을 가진다.

실시예 2. 난소 암 환자의 혈장에서 LysoPA 및 이의 구성 지방산의 감지

A. 개체 및 혈장 샘플

혈액은 Gynecological Oncology Clinic of the Toronto Hospital의 52명의 난소 암 환자에서 수집하여, EDTA를 포함하는 각 튜브에 수집하여, 리소포스포리피드 또는 인지질의 대사 또는 생산을 감소시킨다. 정상 혈장은 9명의 건강한 지원자로부터 수득하여, 기준으로 삼는다. 상기에서 설명하는 것과 같이 샘플을 원심분리하여, 혈소판 및 다른 혈액 성분을 제거하고, 혈장은 -20℃에서 냉동시킨다. 혈장은 하기에서 설명하는 것과 같이 LysoPA 및 다른 리소포스포리피드에 대해 검사를 받는다. 단백질은 임상 검사에 기초하여 활성 또는 정지 질병이 존재하는지에 대해 검사를 받는다.

B. LysoPA 정제

LysoPA는 상기 LysoPC의 경우와 같이 정제하는데, 단 산성화된 클로로포름 추출물 또는 제 2 산성화된 클로로포름 추출물을 평가하는 것이 다른 점이다.

C. LysoPA 지방산 분석

TLC에 의해 분리된 LysoPA는 2㎖ 염화아세틸/메탄올 5:50(v/v)을 이용하여 2.5시간동안 실리카 겔 존재하에서 트랜스메틸화시킨다. 헵타데카노인산(17:0)을 내부 표준으로 이용한다. 트랜스메틸화 후에, LysoPA에 포함된 지방산에서 유도된 지방산 메틸 에스테르는 페트롤리움 에테르로 추출하고, Skeaff and Holub (Skeaff and Holub, In: M. Lagarde (ed.) Biology of Eicosanoids and Related Substances in Blood and Vascular Cells, 152:63-76, Paris, Inserm (1987)에서 설명하는 것과 같이, 모델 5890A 기체 크로마토그래피(Hewlett Packard, Wilmington, Delaware)상에서 기체 크로마토그래피에 의해 정량화한다. 여기에 포함된 모든 LysoPA 농도는 GC에 의해 평가한 지방산 함량에서 유도된 것이고, 헵타데카노인 산으로 계산한다.

D. 결과

이 실시예에서는 정상 개체와 비교하였을 때 총 LysoPA의 농도는 난소 암 환자에서 상당히 상승된 것을 알 수 있다(도 6을 참고). 또한, 도 6에서 볼 수 있는 환자의 혈장 샘플에 활성 또는 휴지 질환의 존재에 대해 평가하였을 때, 총 LysoPA 및 LysoPA와 폴리불포화된 지방산의 양은 정상 개체의 혈장에 있는 이들 등가 화합물보다 상당히 높은 것으로 나타났다. 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이 일부 휴지기 질병을 가지는 환자에서 폴리불포화된 지방산 사슬을 가진 LysoPA의 농도가 즈악된 것으로 나타났다. 난소 암은 자주 재발하기 때문에, 이 결과는 임상적인 분석에 의해 감지되지 않는 종양이 존재하는 환자를 반영하는 것이다.

E. 토론

LysoPC 및 LysoPA와 같은 리소포스포리피드(LPAs)는 사람 혈장의 정상적인 구성분이다. 혈장에서 LysoPC의 대부분이 알부민에 결합되어 있다(Skipski et al., Biochem. J. 104(2):340-52 (1967)). 건강한 개체에서 혈장에 LysoPC의 절대적인 농도는 연구마다 다양하다(Skipski et al., supra; Philips and Dodge, J. Lipid Res. 8:676-681 (1967); Gillet and Besterman, Atherosclerosis 22:111-124 (1975); Kriat et al., J. Lipid Res. 34:1009-1019 (1993)). 이와 같은 다양성은 연구 집단간에 총 혈장 지질 함량에서 차이가 있다는 것을 반영하는 것으로 그 이유는 총 혈장 인지질에 대한 비율로 나타내는 경우에, LysoPC는 약 6.5% 구성되는 것으로 나타났다. 건강한 개체에서 혈장 LysoPC(PC는 총 혈장 인지질의 68%가 됨; Skipski et al., supra: Gillett and Besterman, supra)의 예상되는 값은 총 인지질의 7.5 ±1.0%(mean ±S.E.)이고, 일반적으로 이는 기존 문헌 값에 일치한다. 현재 연구에서 좀더 높은 값은 제 2 산성화된 추출 단계의 이용을 반영하는 것으로 총 LysoPC의 약 12%가 회수된다. 대조적으로, LysoPC는 난소 암 환자 혈장에서 총 인지질의 11.8 ±0.8%가 된다. 그리고, LysoPA는 난소 암 환자의 혈장에 총 인지질의 0.05%로 존재한다. LysoPC의 경우, 기준에 비교하여 난소암 환자의 혈장에서, 팔미토일 및 스테아로일-LysoPC 종은 증가되고, 올레일 및 리노레오일-LysoPC 종은 감소되고, 아라키도노일-LysoPC는 변화가 없다.

이들 세 가지 실시예의 결과로부터, 정상 개체와 비교하였을 때, 난소 암 환자에서 수득된 혈장에서 LysoPA 특히 폴리불포화 지방산을 가지는 LysoPA가 상승된 것을 분명하게 알 수 있다. LysoPA 특히, 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA는 복수, 방사능 증거 또는 물리적인 검사에 의해 확인된 활성 질환을 가지는 개체에서 상당히 높다. 이와 같은 증가는 LysoPA 농도는 난소 암 환자의 상당 부분에서 상승되었다는 것을 분명하게 알 수 있다. 이와 같은 증가는 환자가 현재 활성 질환을 가지는 집단과 현재 비활성인 질병을 가지는 집단과 분명하게 구별된다(도 7). 2년 이내에 비활성 또는 정지 상태 질병을 가진 환자의 상당 비율(약 50%)에서 재발된다. 이는 도 7에서 볼 수 있는 것과 같이 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA 농도가 증가된 것으로 알 수 있다. 따라서, LysoPA 특히, 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA 농도를 측정하명, 치료법에 대한 반응 및 재발의 조기 감지가 가능하다. 치료중인 또는 휴지기 질환을 가지는 환자에서 CA125의 농도를 측정하면, 진단전에 환자의 연구에 삽외시켜, LysoPA 농도 특히, 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA의 농도를 측정함으로써 난소 암의 존재에 대해 개체를 조기에 스크리닝하는 본 발명의 방법에 이용하는데 충분한 특이성 및 감응성을 제공한다.

LysoPA 농도 특히, 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA의 농도를 측정하여, 단독으로 또는 LysoPC, 다른 리소포스포리피드, CA125, mCSF, TAC, 가용성 IL2 수용체 알파 및 다른 공지의 표식을 포함하나 이에 국한되지 않는 다중 표식과 복합한 연구에서 이용하여, 난소 암을 초기에 감지할 수 있는 특이성 및 감응성을 제공한다.

상기 결과에서, 리소포스포리피드 수준을 측정함으로써 치료가 가능한 초기 단계의 암 환자를 확인할 수 있다. 리소포스포리피드 수준은 또한, 특정 형태의 치료법에 반응을 보이는 환자를 정의하거나 또는 예후 표식으로 제공할 수 있다. 도한, 이와 같은 결정은 개별 환자에 적합한 치료법을 맞추는데 도움이 되고, 이미 치료를 받은 환자의 질병 재발을 확인할 수 있다.

특정 이론에 구애를 받지는 않지만, 특정 암에서 LysoPC 및 LysoPA 생산이 증가된다는 것은 이들 지질의 혈장 및 혈청 농도가 상승되는 원인이 된다. 난소 암 환자의 혈장에서 LysoPC 및 LysoPA의 상응에 대한 원인 및 그 기작에 대해서는 알려진 바가 없지만, 출원인은 난소 암 세포가 리소포스포리피드 증가의 원인이 된다고 보고 있다. 증가된 포스포리파제 A₁(PLA₁) 또는 PLA₂또는 PLD 활성은 현 실시예에서 관찰되는 LysoPC 및 LysoPA 혈장 농도와 필적한다. PLA₂는 PC의 sn-2 위치의 지방산을 절단하여, 추로 포화된 지방산을 포함하는 LysoPC를 만들기 때문에, 포화된 LysoPC(팔미토일 및 스테아로일)가 증가되게 된다. PLA₁은 sn-1 위치에서 지방산을 절단하기 때문에, 주로 불포화된 지방산(리네오일, 아라키돈닉, DHA)을 가지는 LysoPA가 된다. 이는 포스포리파제의 역할을 말하는 것으로, 증가된 LysoPC에는 주로 포화된 지방산을 포함하고, 이는 포스포리파제 A₂(PLA₂)의 역할이 되고, 증가된 LysoPA에는 불포화된 지방산을 포함하여, 이는 포스포리파제 PLA₁의 역할을 말하는 것이다. PLD는 LysoPC, LysoPS, LysoPI, LysoPE, LysoPG를 LysoPA로 전환시키는데 중요한 역할을 한다. PLD의 기능적인 활성은 혈장 또는 혈청에 있는 LysoPC 수준을 변경시킬 수 있다. PLD 활성 감소로 인하여 난소 암 환자에서 LysoPC 수준이 증가된다.

LysoPC 및 LysoPA는 여러 계통에서 온 세포를 활성화시키는 것으로 보고 있다. 상기 실시예는 LysoPC 및 LysoPA 농도가 난소 암 환자의 혈장에서 기준의 것과 비교하였을 때 상당히 상승되었다는 것을 설명하고 있다. 이와 같은 현상은 모든 암에서 공통적인 현상은 아닌데, 예를 들면, 6명의 백혈병 환자중 5명에서는 정상 기준과 비교하였을 때 상당히 낮은(정상의 절반 수준) 혈장 LysoPC를 가지기 때문이다. 난소 암 환자의 혈장에서는 팔미토일- 및 스테아로일-LysoPC 종은 상당히 높은 반면에, 올레일 특히, 리노레오일-LysoPC는 정상과 비교하였을 때 상당히 낮았다. LysoPC/PC 및 팔미토일-LysoPC/리오올레일-LysoPC의 몰 비율은 기준 개체와 비교하였을 때 난소 암 환자에서 상당히 상승되었다. 또한, 혈장의 계산치[LysoPC/PC]x[팔미토일-LysoPC/리노올레일-LysoPC]도 기준과 비교하였을 때 난소 암 환자에서 상당히 높았다. 마지막으로, 폴리불포화된 지방산을 가지는 LysoPA 및 LysoPA의 농도는 난소 암 환자의 혈장에서 상당히 높았다. 이와 같은 값은 난소 암 환자의 초기 진단, 예후 및 모니터 치료의 지시물질로 작용할 수 있다.

실시예 3. 정립된 질병을 가지는 유방암 환자의 혈청에서 LysoPC의 변경된 지방산 조성물

A. 개체

MD Cancer Center(Houston, Texas)에서 질병이 잘 정립된 23명의 유방 암 환자(혈액 샘플링 전에 진단 일이 평균 6.9년)가 분석을 위한 혈액 샘플을 제공하였다. University of Guelph(Guelph, Ontario, Canada)에서 영양 및 운동 연구용으로 모집한 24명의 지원자를 정상 개체로 이용하였다. 유방 암 환자의 편균 연령은 59세(30-77)이고, 기준 개체의 연령은 36세(27-55)이다.

B. 혈청 샘플

혈액(7㎖)은 항-응고제를 포함하지 않은 진공관에 뽑은 다음 응혈이 일어나도록 20분간 실온에 방치한다. 혈청은 원심분리(1600 x g, 15 min)에 의해 분리하고, 분석하기 전에 -20℃에서 저장한다.

C. 지질 추출 및 인지질 분석

상기 실시예에서 설명하는 것과 같이 지질 추출 및 인지질 분석을 실행하는데, 단, 인지질은 Holub and Skeaff, Methods Enzymol. 141:234-244 (1987)에서 설명하는 방법에 따라 용매계 클로로포름/메탄올/빙초산/물 50:37.5:3.5:5:2 v/v/v/v을 이용하여 1차원 크로마토그래피에 의해 분리한다.

PC 및 LysoPC에 상응하는 밴드를 플레이트에서 긁어내고, 메탄올에서 2㎖ 농축 황산을 이용하여 3시간동안 실리카 겔에서 트랜스메틸화시킨다.

D. 결과

기준 및 유방 암 집단에서 LysoPC/PC의 비율은 매우 유사하다(각 0.093±0.004 및 0.106±0.005). 집단 간에 LysoPC의 지방산 조성물은 상이하다. 특히, 16:0 내지 18:2n-6의 비율(팔미트산에 대한 리놀레인 지방산)은 기준(2.32 ±0.13) 및 유방 암 군(5.48 ±0.30)간에 상당한 차이(p 〈 0.01)가 있다. 비율에 대한 "차단 점"으로 3.50 값을 할당하고, 테스트 개체의 샘플이 16:0/18:2n-6의 경우에 적어도 3.50의 값을 가지는 경우에, 유방 암으로 간주한다. 테스트 개체의 샘플이 비율 값이 3.5 이하의 경우에, 유방 암이 아닌 것으로 간주할 수 있다. 이와 같은 실시예에서, 개체의 2/23 또는 8.7%는 가짜 음성(예를 들면, 유방암이나 차단 치를 초과하지는 않고, 유방암을 가지지 않은 범주에 넣는다)으로 간주한다. 가짜 양성으로 확인된 것은 없다.

이와 같은 결과는 이 실시예에서 16:0/18:2n-6 비율이 3.00 내지 3.50인 범위로 정의한다. 이 범위에 속하는 테스트 샘플은 테스트 샘플에 있는 LysoPC의 상이한 지방산 복합물의 비율을 결정하고, 기준 개체에서 수득한 값과 비교하는 제 2 테스트로부터 이익을 얻는다. 이 실시예에서, 한 환자에서 지방산 18:1/18:2n-6(올레인 산/리놀레인)의 비율을 결정하고,이 범위에 속하는 16:0/18:2n-6 지방산에 대한 값을 만드는 4명의 기준 개체에서 이 비율을 결정한다. 제 2 비율에 대한 차단치는 1.0으로 한다(예를 들면, 1.0에서 비율은 암이 있다는 것을 나타낸다). 이와 같은 테스트를 이용하여, 가짜 음성의 수는 1 또는 4.3%로 감소되고, 가짜 양성 기율은 0으로 유지된다.

이와 같은 결과에서, LysoPC와 같은 혈청 리소포스포리피드의 지방산 조성물을 분석하고, 이 개체에서 수득한 값과 기준 개체에서 수득한 값을 비교함으로써 정립된 질병을 가지는 개체에서 유방 암이 있는 지를 감지할 수 있다. 제 2 테스트(가령, 다른 구성 지방산 복합물로부터 수득한 제 2 비율)를 추가하면, 이 방법의 전반적인 감지력을 증가시킨다.

실시예 4. 유방 암으로 새로 진단을 받은 여성의 혈청에서 LysoPC의 변경된 지방산 조성물

A. 개체

유방암으로 최근에 진단을 받은 15명의 여성에게서 외과술을 받기 전에 혈액 샘플을 취하고, 혈청은 Centre de Sante Publique du Quebec(Beauport Quebec)으로 보낸다. 15명의 암이 없는 나이군이 일치하는 여성 기준 개체도 상기 센터에 혈청 샘플을 보냈다. 개체의 평균 연령은 54세이다(범위 32-73).

혈청 샘플 및 지질 추출, 인지질 분석은 실시예 8에서 설명하는 것과 같이 실시하였다.

B. 결과

암 개체 및 정상 개체간에 상대적인 LysoPC의 양이 차이가 나지는 않았지만, 혈청 LysoPC의 지방산 조성물은 상이하였다. 16:0/18:2n-6의 비율은 기준 군의 것(2.94 ±0.32)과 비교하였을 때, 암 개체(4.62 ±0.35)에서 상당히 높은 것으로 나타났다(p〈0.05). LysoPC에서 16:0/18:2n-6에 대한 차단치를 3.50를 이용하는 경우에(가령, 적어도 3.5 값은 유방 암이 있다는 것을 나타낸다), 15명의 유방 암 개체중 4명은 이 테스트에서 유방 암이 없다고 잘 못 결정되었다(가짜 음성 비율=26.7%). 15명 중 2명은 유방 암이 있는 것으로 잘 못 결정되었다(가짜 양성 비율=13.3%). LysoPC에서 18:1/18:2n-6의 값을 결정하기 위해 3.00 내지 3.50 범위에 속하는 16:0/18:2n-6의 값을 가지는 샘플에 대한 제 2 테스트를 이용하고, 적어도 1.00의 차단치를 이용하면, 가짜 음성 비율은 0으로 감소되고(16:0/18:2n-6 LysoPC이 3.00 내지 3.50을 가지는 네명의 개체는 1.00이상의 18:1/18:2n-6 LysoPC 비율을 가진다). 가짜 양성의 수는 3/15 또는 20%로 증가된다.

이 결과에서 본 발명의 방법은 최근에 질병이 있는 것으로 진단을 받은(대부분의 경우가 전이되기 전) 환자에서 암이 존재하는 지를 감지할 수 있다. 이는 좀더 침습성 있는 과정을 거치기 전에 유방 암이 존재할 가능성이 있는 여성 집단을 스크리닝할 수 있도록 한다.

유방 암을 감지하는 경우에, 유방 암 개체 및 정상 개체에서 이용할 수 있는 데이터를 이용하여, 차단 점을 정립하고, 암을 가지는 추가 개체를 결정하기 위해 추가로 테스트를 받아야 하는 샘플에서 지방산의 비율을 정립한다. LysoPC와 같은 리소포스포리피드에서 특이적인 지방산 복합물에 대한 차단점은 정상 개체 및 새로 유방암으로 진단을 받은 개체로부터 수득된 추가 데이터에서 정립할 수 있다. 이와 같은 차단점을 선택하여 가짜 음성 결과를 최소로 하고(10% 미만), 수용할 수 없는 수준(30% 이상)의 가짜 양성 결과를 없앤다. 즉, 차단 점은 차단 점 이하에 속하는 암 환자의 수 및 암이 없는 것으로 확인되는 수를 최소로 하고, 암을 가지지 않지만, 차단 점 이상에 속하는 개체의 수 또한 최소로 한다. 테스트 개체에서 LysoPC에서 2 가지 지방산에 비율과 정상 개체에서 LysoPC에 있는 이들 지방산의 비율을 비교하여, 제 2 복합 지방산의 값에 대해 제 1 복합 지방산의 값을 비교할 수 있다. 또한, 실시예에서 비교를 복적으로 비율을 만들기 위해 이용되는 LysoPC에서 특이적인 지방산 복합에 추가하여, 다른 지방산 복합물을 비율에 이용할 수 있다. 가령, 16:0/18:2n-6 및 18:1/18:2n-6. 추가 지방산 복합물을 선택하여 정상 개체에 있는 동일한 지방산의 양과 비교하여 유방 암 샘플에 있는 변경된 양으로 존재하는 지방산을 결정할 수 있다.

여기에는 다양한 문헌이 참고 문헌으로 첨부된다.

당업자는 본 발명이 본 발명의 특징을 벗어나지 않고 여기에서 설명하고 있는 것 이외에 다른 형태로도 구체화될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 여기에서 설명하는 특정 구체예는 설명을 위한 것이고, 이에 제한시키는 것은 아니다. 본 발명의 범위는 청구 범위가 되고, 상기 설명하는 실시예에 국한되는 것은 아니다.

Claims

테스트 개체에서 리소포스포리피드 농도가 변경된 것과 관련이 있는 암이 존재하는 지를 감지하는 방법에 있어서, 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드의 농도를 결정하고, 암이 없는 정상 개체에서 취한 샘플에 있는 리소포스포리피드의 농도와 비교하고, 이때 정상 개체의 샘플에 있는 리소포스포리피드 농도와 비교하였을 때, 테스트 개체의 샘플에 있는 리소포스포리피드 농도가 변경된 것은 암이 존재한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 감지 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플에서 적어도 한 가지 타입의 리소포스포리피드 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플에서 리소포스포리피드의 서브 타입의 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 테스트 개체의 샘플에서, 팔미토일-X, 스테아로일-X, 올레일-X, 리노레오일-X, 아라키도닐-X, 도카사헥사노일-X 자방산의 농도를 측정하고, 기준 농도와 이 농도를 비교하는 단계가 추가로 포함되고, 이때, X는 LysoPC, LysoPA, LysoPS, LysoPI, LysoPE, LysoPG 리소포스포리피드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 샘플에서 팔미토일-X와 리노올레일-X의 몰 비율을 결정하고, 기준 비율과 이 비율을 비교하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 테스트 개체의 샘플에서 [X/PC]x[팔미토일-X/리노올레일-X]의 값을 결정하고, 기준 값과 이 값을 비교하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 테스트 개체의 샘플에서 추가 암 세포 표식의 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 추가 암 세포 표식은 CA125, Tac, 가용성 IL2 수용체 알파, mCSF, OVX1, CEA, PSA, CA1503, CA19.9에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 암은 난소암, 나팔관 암, 자궁 암, 복막내 암 전이 및 경부 암에서 선택되는 부인과 암이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리소포스포리피드의 농도를 결정하는 단계는 리소포스포리피드와 결합하는 항-리소포스포리피드와 샘플을 접촉시키고, 결합된 항체를 감지하는 것으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플에서 리소포스포리피드의 지방산 조성물 및 리소포스포리피드의 지방산 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리소포스포리피드는 sn-3 위치에 인산염 또는 유도된 인산염을 가지는 글리세롤 기본구조를 가지고, 아실 결합에 의해 연결된 sn-1 또는 sn-2 위치에 있는 한 개 지방산 사슬을 가지고, 또 다른 sn-1 또는 sn-2 위치에 있는 하이드록실 기를 가지는 sn-1 또는 sn-2 리소포스포리피드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리소포스포리피드는 sn-3 위치에 인산염 또는 유도된 인산염을 가지는 글리세롤 기본구조를 가지고, 알킬 또는 알케닐 결합에 의해 연결된 sn-1 위치에 있는 한 개 지방산 사슬을 가지고, sn-2 위치에 있는 하이드록실 기를 가지는 sn-1 리소포스포리피드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 또는 13 항에 있어서, 리소포스포리피드는 다음의 화학식을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.

이때, X는 단일 지방산 사슬 또는 긴 알코올 사슬이고, R1은 단일 지방산 사슬이고, R2는 유도화된 인산염이 된다.
제 14 항에 있어서, X는 18:0, 16:0, 18:1, 18:2, 20:4n-6, 22:6n-3에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, R1은 팔미트 지방산, 팔미토올레인 지방산, 스테아린 지방산, 올레인 지방산, 리놀레인 지방산, 아라키도닉 지방산, 도카사헥사논 지방산에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서, R2는 수소, 콜린, 이노시톨, 에탄올아민, 글리세롤, 세린에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리소포스포리피드는 LysoPC, LysoPA, LysoPS, LysoPE, LysoPI, LysoPG 리소포스포리피드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 포화된 또는 불포화된 지방산 또는 지방산 사슬 길이를 가지는 리소포스포리피드의 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 특정 긴 사슬 알코올을 가지는 리소포스포리피드의 농도를 추가로 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 샘플은 혈장, 혈청, 뇨, 타액, 복수, 뇌 척수액, 늑막 액에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 암은 암을 가지지 않는 정상 개체의 샘플과 비교하였을 때 테스트 개체에서 리소포스포리피드의 농도가 증가된 것과 관련이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
테스트 샘플에서 취한 체액 샘플에 암이 존재하는 지를 감지하는 방법에 있어서,

(a) 테스트 개체의 체액 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 측정하고;

(b) 테스트 개체의 샘플에서 리소포스포리피드의 지방산 농도를 결정하고; 그리고

(c) 기준에서 수득한 값과 a 및 b 단계에서 수득한 값을 비교하여, 기준에서 수득한 값보다 a 및 b에서 수득한 값이 변화된 경우에 암이 있다는 것을 암시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 농도는 다른 리소포스포리피드, 인지질, 알부민, 및 크레아티닌에서 선택된 화합물의 농도에 대해 표준화시킨 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 리소포스포리피드는 LysoPC, LysoPA, LysoPS, LysoPE, LysoPI, LysoPG에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 암은 부인과 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 23 항에 있어서, 암은 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 리소포스포리피드의 농도는 시간을 두고 연속적으로 측정하여 시간에 따른 리소포스포리피드 농도 변화를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
시간에 따른 테스트 개체에서 암이 존재하는 지를 감지하는 방법에 있어서,

a) 처음에 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 측정하고;

b) 나중에 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드의 농도를 결정하고; 그리고

c) 암이 존재하는 지를 감지하기 위해 처음에 테스트 개체에서 취한 샘플에서의 리소포스포리피드 농도에 대해 시간이 지난 후에, 테스트 개체에서 취한 샘플에서 리소포스포리피드의 농도의 증감이 있는 지를 확인하기 위해, a와 b 농도를 비교하여,

나중에 샘플에서 리소포스포리피드 농도가 증가된 경우에는 살아있는 종양세포의 수가 증가되었음을 나타내고, 감소된 경우에는 살아있는 종양 세포의 수가 감소되었다는 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 암은 난소암, 나팔관 암, 자궁 암, 복막내 암 전이 및 경부 암에서 선택되는 부인과 암이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 종양은 유방 암인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 항-리소포스포리피드 항체와 샘플을 접촉시켜 리소포스포리피드 농도를 결정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 샘플에서 리소포스포리피드의 지방산 조성물 및 지방산 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 특정 긴 사슬 알코올을 가지는 리소포스포리피드 농도를 결정하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 리소포스포리피드는 sn-3 위치에 인산염 또는 유도된 인산염을 가지는 글리세롤 기본구조를 가지고, 아실 결합에 의해 연결된 sn-1 또는 sn-2 위치에 있는 한 개 지방산 사슬을 가지고, 또 다른 sn-1 또는 sn-2 위치에 있는 하이드록실 기를 가지는 sn-1 또는 sn-2 리소포스포리피드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 리소포스포리피드는 sn-3 위치에 인산염 또는 유도된 인산염을 가지는 글리세롤 기본구조를 가지고, 알킬 또는 알케닐 결합에 의해 연결된 sn-1 위치에 있는 한 개 지방산 사슬을 가지고, sn-2 위치에 있는 하이드록실 기를 가지는 sn-1 리소포스포리피드인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29 항에 있어서, 리소포스포리피드는 LysoPC, LysoPA, and LysoPS, LysoPE, LysoPI, LysoPG에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
테스트 개체에서 부인과 암을 감지하는 방법에 있어서, 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드 농도를 결정하고, 암이 없는 개체의 샘플에서 리소포스포리피드 농도와 비교하여, 정상 개체에서 리소포스포리피드 농도와 비교하였을 경우에, 테스트 개체의 샘플에 있는 리소포스포리피드 농도가 증가된 경우는 부인과 암이 존재한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
테스트 개체에서 암을 감지하는 방법에 있어서, 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에서 리소포스포리피드의 지방산 농도 비율 값을 결정하고, 암이 없는 정상 개체에서 취한 샘플에서 리소포스포리피드에 동일한 지방산의 농도 비율 값과 비교하여, 정상 개체에서 취한 샘플에서 비율 값과 비교하였을 경우에 테스트 개체에서 비율의 값이 변화된 경우에 암이 존재한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 변화는 증가되었다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 암은 유방 암이고, 리소포스포리피드는 LysoPC인 것을 특징으로 하는 방법.
제 40 항에 있어서, 테스트 개체의 샘플에서 LysoPC의 지방산 농도 비율 값은 적어도 3.4인 것을 특징으로 하는 방법.
제 41 항에 있어서, LysoPC에서 지방산은 팔미트 및 리노레익 지방산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 41 항에 있어서, 테스트 개체의 샘플에서 LysoPC에서 지방산 농도의 비율 값은 3이상 3.4미만이고, 체액 샘플에서 LysoPC의 다른 지방산의 비율 값을 결정하여, 상이한 지방산의 경우에 비율이 적어도 1인 경우에는 암이 존재한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
제 44 항에 있어서, 지방산은 올레인 및 리놀레인산인 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 암은 난소암, 나팔관 암, 자궁 암, 복막내 암 전이 및 경부 암에서 선택되는 부인과 암이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 39 항에 있어서, 리소포스포리피드는 LysoPC, LysoPA, and LysoPS, LysoPE, LysoPI, LysoPG에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 38 항에 있어서, 연속적인 시간 간격을 두고, 리소포스포리피드의 농도을 측정하여, 테스트 개체에서 리소포스포리피드의 농도가 시간에 따라 변화되는 비율을 정립하는 것을 특징으로 하는 방법.
암이 없는 개체에 비교하여 개체에서 리소포스포리피드의 농도 변화와 연관이 있는 암을 감지하기 위해, 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에 리소포스포리피드 농도를 감지하는 진단 키트에 있어서, 키트에는 테스트 개체에서 취한 체액 샘플에 리소포스포리피드 농도를 측정하는 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 49 항에 있어서, 시약은 항-리소포스포리피드 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 49 항에 있어서, 저장 또는 운반 동안에 샘플에 리소포스포리피드의 생산 또는 가수분해를 저해하는 시약이 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.