JPS63233800A - レシチンコレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、検体中のレシチンコレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（以下ＬＣＡＴと略すことがある）の活
性測定法および該酵素活性測定用組成物に関する。

「従来の技術及びその問題点」 ＬＣＡＴは血液中でレシチンおよび遊離コレスレロール
を基質として作用しリゾレシチンおよびコレスレロール
エステルを生成せしめる酵素であり肝臓において生合成
されている。ＬＣＡＴの活性は肝細胞の障害と関係があ
り、例えば、急性肝炎、肝硬変、閉塞性黄痕、肝癌など
でＬＣＡＴ活性は低下し、アルコール性肝障害、脂肪肝
などで上昇が認められる。従ってＬＣＡＴの活性測定は
、肝機能の検査にとって有用であり、またＬＣＡＴの活
性測定は脂質代謝異常、１尿病などの病態解明にも有用
である。

従来、本酵素の活性測定は、基質として消費される遊離
コレスレロールの変化量を測定し求められている０、具
体的には、血清（あるいは血５ｉ）を最適反応温度であ
る３７℃にて一定時間（例えば２時間）加温し、加温前
後の遊離コレスレロールの変化量（ｎ　５ｔｏｌｅ　）
を求め、１時間（ｈ）につき血清１ｍｌ当たりの変化量
ｎ　ｍｏｌｅ　／（ｍｌ　−ｈ）として表現する。

酵素の反応速度は、反応液中の基質が充分量あり、その
反応曲線が時間に対し直線性を有する反応初期の速度を
もって示すのが一般的である。しかしながら、ＬＣＡＴ
の場合、高比重リポ蛋白を反応の場とし、しかも高比重
リポ蛋白中のアポ蛋白Ａ−Ｉが本酵素の活性化因子とな
っていること、またレシチンおよびコレスレロールが本
来、水に溶けないことなどから活性測定は極めて困難で
ある。活性測定法としては、大別して、少量の血清（あ
るいは血漿）に過剰量のＬＣＡＴ活性を有しない基質を
加える共通基質法と、血清（あるいは血５１）を直接加
温し内因性のリポ蛋白を基質とする自己基質法とがある
。自己基質法の場合、血清（あるいは血５りそのものを
３７℃で加温すると反応開始後１時間以内に直線性が失
われるが、本質的に通常ＬＣＡＴ活性そのものが非常に
低いため、加温時間を長くしなければ分光光学的分析法
により遊離コレスレロールの変化量を測定することは困
難であった。

その為、界面活性剤を添加して調製したレシチンを被検
体に加えるＬＣＡＴの活性測定法〔特開昭５１−１２９
２９３号〕が報告されているが、ＬＣＡＴの他方の基質
である遊離コレスレロールを添加しないためＬＣＡＴ活
性は低値となり、またレシチン可溶化のための界面活性
剤は、ＬＣＡＴ活性を阻害し、従って臨床検査法上は不
適当である。また、ＬＣＡＴの基質であるレシチンおよ
び遊離コレスレロールを含む被検体液の透明化、可溶化
のため超音波による処理〔臨床化学、第４巻。

第３・４合併号、３０６〜３１１頁、　　（１９７６年
）〕が報告されているが、超音波処理では、一時的に乳
濁を減少させるだけで透明とはならず、しかも２〜３時
間で沈澱が生じるため、超音波処理のみでは、臨床検査
市場においては応用できなかった。またポリアニオン糖
誘導体を用いてコレスレロール、レシチンを透明化しＬ
ＣＡＴの活性測定する方法〔特開昭６０−２６２６００
号〕あるいはコレスレロール、レシチンからなるリポソ
ームを加え、ＬＣＡＴの活性測定をする方法（リポソー
ム法と略すことがある）〔第２６回臨床化学会、１９８
６年１１月２２日発表（開会プログラム、要旨集第１０
０〜１０１頁、１９８６年）〕等により、ＬＣＡＴ反応
の直線性を保持したり、活性を上昇させることにより被
検体のインキユベートの時間を短縮することが報告され
ているが、しかしながらやはり反応時間（インキユベー
トの時間）は、リポソーム法で４０分以上、それ以外の
方法では、１時間からそれ以上の反応時間を要し、酵素
活性測定法として適当ではなく、また臨床検査の場にお
いて迅速にＬＣＡＴ活性を測定するという面からも満足
されうるちのではなく、現在量も短時間で測定可能なリ
ポソーム法において均質で安定なリポソームを調製する
ことは非常に困難であり、実際一般的臨床診断の場に、
一定組成のリポソームを供給することは困難である。

また最近、外因性レシチンおよびコレスレロールエステ
ラーゼを使用しリゾレシチンの増加速度からＬＣＡＴ活
性を測定する〔特開昭６１−２９３３９６号〕報告があ
るが、リゾレシチン増加量を検出するのに反応時間を約
１時間以上要し、前述の如くにこのように多くの時間を
必要とするのは、比色定量法の感度限界に寄るところが
大きく迅速測定の観点から、この方法も問題がある。

「問題点を解決するための手段」 本発明者らは、ＬＣＡＴの活性測定を感度良く、しかも
迅速に簡単に行なえる日常検査に適した方法を確立すべ
く種々検討した結果、レシチンコレステロールアシルト
ランスフェラーゼが反応を触媒するレシチンおよび遊離
コレスレロールを基質として作用せしめ、リゾレシチン
およびコレスレロールエステルを生成する酵素反応系を
用いて、生成するリゾレシチンにリゾホスホリパーゼ（
ＥＣ，３，１，１，５；以下旦ヱ旦と略すことがある）
、グリセロホスホコリンジェステラーゼ（ＥＣ，３，１
，４，２；以下ＣＰＣＰと略すことがある）を作用せし
め、同時または逐次に生成するグリセロール−３−リン
酸（以下Ｇ３Ｐと略すことがある）の量を酵素的サイク
リング法を利用し高感度に測定することによりＬＣＡＴ
活性測定ができることを見出し、また、旦ヱＰ、ＣＰＣ
Ｐ。

グリセロホスフェートオキシダーゼ（以下ＧＰＯと略す
ことがある）および還元型ニコチン・アデニン・ジヌク
レオチド（以下還元型ＮＡＤと略すことがある）を含有
する組成物を用いることによって、ＬＣＡＴ活性を迅速
に正確にしかも簡単に行えることを見出し本発明を完成
した。

即ち本発明は、被検体中のＬＣＡＴの活性測定法におい
て、該酵素が反応を触媒するレシチンおよび遊離コレス
レロールを基質として作用せしめ、リゾレシチンおよび
コレスレロールエステラーゼ成する反応系を用いて、生
成するリゾレシチンにリゾホスホリパーゼ、グリセロホ
スホコリンホスホジェステラーゼを作用せしめ、同時ま
たは逐次に生成するグリセロール−３−リン酸の量を酵
素的サイクリング法を利用し高感度に測定することを特
徴とするＬＣＡＴの活性測定法であり、また、旦ヱＰ、
ＣＰＣＰ、ＧＰＯおよび還元型ＮＡＤを含有するＬＣＡ
Ｔの活性測定用組成物を提供するものである。

より具体的に本発明を説明すると、式（１）で表される
酵素反応系を利用し、生成するリゾレシチンの生成量ま
たは生成速度を測定することにより、ＬＣＡＴ活性を測
定することにおいて、従来ＣＡＴ レシチン　＋　遊離コレステロールー−−−→リゾレシ
チン　＋　コレステロール（ｉ）からの技術によっては
、リゾレシチンの生成量または生成速度が非常に微量ま
たは微速度であるために、非常に測定時間を要し、また
簡便な測定が困難であったが、本発明は、式（ｉ）で表
される酵素反応系に、式（ｉｉ）で表される酵素反応と
式（ｉｉｉ　）で表される酵素的サイクリング系を組合
わせることにより、臨床診断の場においても前便に、し
かも迅速にＬＣＡＴ活性測定を可能ならしめたものであ
る。

渠ヱ且 ＣＰＣＰ →クリセロ本スネリルコリン ＧａＰ　　　＋　　コリン 本発明において、式（ｉ）で表される反応系を形成せし
めるのに必要な基質は、レシチンおよび遊離コレステロ
ールであるが、通常被検体として挙げられる血清もしく
は血漿中には、レシチンおよび遊離コレステロールを内
因しているので本発明の実施においてレシチンおよび／
または遊離コレスレロールを添加することは、必須では
ない。

ＬＣＡＴ反応等に伴うレシチンの不足を補うために外因
性のレシチンを添加することもでき、外因性のレシチン
として、ジパルミトイルフオスファチジルコリン、ジオ
レオイルフオスファチジルコリン５　ジミリストイルフ
オスファチジルコリン。

ジステアロイルフオスファチジルコリン、ジラウロイル
フォスファチジルコリン、天然レシチンまたは超音波処
理した各種レシチン等が挙げられる。

また、ＬＣＡＴ活性を阻害しない基質、例えばレシチン
、コレスレロールよりなるリポソームを添加してもよい
。さらにまた、ＬＣＡＴ反応系中にコレスレロール加水
分解酵素を存在せしめることは、ＬＣＡＴ反応で消去さ
れる遊離コレステロールを補充でき、内因性の遊離コレ
ステロールの初期濃度を上げることができ、または内因
性若しくはＬＣＡＴ反応によって生じるコレステロール
エステルにコレステロール加水分解酵素を作用せしめこ
とによりＬＣＡＴ酵素反応を促進することができ、ひい
ては、測定感度を上げることができるので、好適な例と
して挙げることができる。上記記載のコレスレロール加
水分解酵素とは、コレステロールエステルに作用し、遊
離コレステロールを生成せしめる加水分解酵素の総称と
して用いたもので、このような酵素作用を示す酵素、つ
まりコレスレロールエステラーゼ（以下ＣＨＥと略すこ
とがある）と一般的に呼ばれている酵素の他に、上記酵
素作用を有するリパーゼ、エステラーゼと呼ばれている
酵素を含むもので、ＣＨＥとしては、哺乳動物の膵、肝
、脳、副腎、畢丸、卵巣等の動物組織由来、または、シ
ュウトモナス　フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ　　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　　）。

シゾフィラム　コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍｃ
ｏｍｕｎｅ）　　、　　クロモバクテリウム□ビスコサ
ム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｓ　　　ｖｉｓｃｏ
ｓｕｍ）　　等の微生物由来のＣＨＥが挙げられ、リパ
ーゼとしては、動物の膵、肝、脂肪組織由来、植物種子
由来、または、シュウトモナス　フルオレッセンス、ゲ
オイカム　カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ　ｃａｎ
ｄｉｄｕｓ）等の微生物由来のリパーゼが挙げられる。

用いる場合通常、１キツトに対して１０以上、好ましく
は１〜７０Ｕ用いればよい。

上述の如く式（ｉ）で表されるＬＣＡＴ酵素反応によっ
て生成するリゾレシチンを式〔１１〕で表されるが如く
の二段階の酵素反応でＧａＰおよびコリンに導かれる０
本酵素反応で用いられるリゾホスホリパーゼ（ＬＹＰ）
の量は、通常０．３〜１０Ｕ／キツトであり、好ましく
は０．５〜３Ｕ／キフトであり、グリセロホスホコリン
ホスホジェステラーゼ（ＣＰＣＰ）の量は、通常０．３
〜１０Ｕ／キツトであり、好ましくは０．５〜３Ｕ／キ
ツトである。

なお、ＬＣＡＴ活性高感度測定のために、式〔ｉｉ　）
で表される酵素反応の一段目の酵素反応によって、生成
する遊離脂肪酸をアシル−ＣｏＡシンセターゼとアシル
−ＣｏＡヒドロラーゼを用いて酵素サイクリング測定す
る方法〔ジャーナル　オプ　バイオケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ　）　）　９４４８７〜４９２頁、１９
８３年〕も、発明者は検討したが、被検体中の脂肪酸の
組成が個体差等により、一定では無く　（個体差等によ
り、分子量の違う脂肪酸の分布が一定していない）、個
々の被検体中の全脂肪酸に対する酵素の相対活性が一定
では無いため、必ずしも臨床診断の場において用いるに
は満足のいくものではなかった。

次に式〔１１〕に示されるが如くの酵素反応を経由して
生成するグリセロ−３−リン酸（ＧａＰ）の量の測定に
おいて、先に発明者が、見出した式（ｉｉｉ　）で表さ
れる酵素サイクリング法を用いた測定法〔特開昭５９−
１４０９００号〕を適用すると、多種の酵素反応系が関
与する複雑な酵素反応にも関わらず、ＬＣＡＴ活性を感
度よく迅速にまた、実際の臨床診断の場においても適用
可能であるほど簡便に測定可能であることを見出したも
のである。

式（ｉｉｉ　）で表される酵素サイクリング反応を形成
する初期成分としては、Ｇ　Ｐ　Ｏ，Ｇ　Ｐ　Ｄ　Ｈ，
Ｏｚおよび還元型ＮＡＤである。この酵素サイクリング
反応（ｉｉｉ　）において、旦を旦は被検体中のＧａＰ
を基質として、１分子のＧａＰとＯｔとを消費して１分
子のＨ，Ｏ□とＤＨＡＰを生成し、更にこのＤ　ｆＴ　
Ａ　Ｐを基質としてＧＰＤＨは、１分子のＤＨＡ　Ｐと
還元型ＮＡＤを消費して１分子の０３ＰとＮＡＤを生成
してなるものでＧ　３　Ｐ　−Ｄ　ＨＡ　Ｐのサイクル
反応を形成する。よって、零醇素サイクリング反応を形
成する成分としてＧＰＯ，ＣＰＤＨ，Ｏｆおよび還元型
ＮＡＤが必要であるが、実際には、０．は、反応系にお
ける溶存酸素を利用すれば充分であり、ＧＰＯ，ＧＰＤ
Ｈ，および還元型ＮＡＤを測定のための試薬として過剰
量用いればよい。用いられるＧＰＯやＧＰＤＨの使用量
としては特に限定されるものでなく、被検体中のＧａＰ
および予測されるＬＣＡＴ活性から生成が考えられる０
３Ｐの量の和に基づいて適宜決定すればよく、０３Ｐの
量と相対的に加減して用いればよく、通常被検体１キッ
ト当りＣＰ旦は、５〜２０Ｕ好ましくは８〜１５Ｕであ
り、ＣＰ　Ｄ　Ｈは、０．３〜１．８Ｕ好ましくは０．
５〜１．５Ｕであり、またこれ以上の量の各酵素を用い
てもよい、さらに還元型ＮＡＤの使用量としては被検体
中のＧａＰおよび予測されるＬＣＡＴ活性から生成が考
えられるＧａＰの量の和と反応時間によるサイクリング
数の積取上の量を用いればよく、通常Ｇ３Ｐの盪に比べ
大過剰の量が用いられ、例えば５０倍量以上、好ましく
は１００〜１００００倍量用いればよく、またこの量以
上用いることを何ら限定するものではない。

さらにこの酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）における
）（、Ｏｆと還元型ＮＡＤを反応せしめてＮＡＤを生成
する、より高感度な測定法となしてもよい。

即ち酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）において、１分
子のＨ２Ｏ□と１分子の還元型ＮＡＤを消費し、２分子
の水（Ｈ２Ｏ）と１分子のＮＡＤを生成する反応を触媒
する酵素であるＮＡＤ”ペルオキシダーゼ（ＥＣ，１，
１１，’　１．　１　、以下ＮＡＤＰＯと略すことがあ
る）〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリ
ー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌｌ、）　　　２２工、５
５７　　（１９５７）３を組合せ用いてなるもので、下
記反応（ｉｖ　）にて表される。

この酵素サイクリング反応（ｉｖ）においては、酵素サ
イクリング反応（ｉｉｉ　）にて生成したＨ　ｚ　Ｏｚ
が、更に還元型ＮＡＤと共に消費されてＮＡＤを生成す
るために、酵素サイクリング反応（ｉｖ　）の１サイク
ルにて２分子の還元型ＮＡＤの消費となるもので、酵素
サイクリング反応（ｉｉｉ　）に比べて２倍の還元型Ｎ
ＡＤの変化量となり、より筋感度にＬＣＡＴ活性を測定
できるものとなる。

また上記の各種酵素反応および酵素サイクリング反応に
おける媒体としては、用いる各酵素の活性の安定なｐＨ
域のものであればよく、本ＬＣＡＴ活性測定を行うに当
たって、通常ｐｌ（７，０〜８．５好ましくはｐＨ７，
３〜８．２であり、媒体緩衝液としては、上記ｐＨ域内
に調整されたリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、イミ
ダゾール−塩酸緩衝液、ジメルグルクール酸−水酸化ナ
トリウム緩衝液、ピペスー水酸化ナトリウム緩衝液。

ＨＥＰＥＳｉ衝液等が用いられる。またＬＹＰおよびＧ
ＰＣＰの活性化剤であるカルシウム塩類。

マグネシウム塩類等の金属塩類を媒体中に添加しても良
い０例えば、カルシウム塩類である塩化カルシウムを添
加する場合には、添加濃度として１〜１０ｍＭ、好まし
くは２〜６ｍＭである。更に、インキエベート時の温度
は通常３７℃付近で行えば良い。

反応時間は、同時に酵素反応（ｉ）、　　（ｉｉ）およ
び酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若しくは（ｉｖ　
）を形成せしめる場合にあっては、５分以上反応せしめ
ればよく、測定の迅速性から見て、好ましくは５〜１０
分である。また逐次に酵素反応〔ｉ〕。

（ｉｉ　）および酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）、
若しくは（ｉｖ）を形成せしめる場合にあっては、酵素
反応（ｉ）の反応時間を１０分以上にせしめ、酵素反応
（ｉｉ）および酵素サイクリング反応〔ｉ■〕若しくは
〔１ｖ〕各々の反応時間は２分以上であればよい、さら
にまた、酵素反応〔１〕を形成せしめ、その後に、酵素
反応〔１１〕および酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）
若しくは（ｉｖ　）を同時に形成せしめる場合にあって
は、酵素反応〔１〕の反応時間を１０分以上にせしめ、
酵素反応（ｉｉ　）および酵素サイクリング反応（ｉｉ
ｉ　）若しくは（ｉｖ）反応時間は２分以上であればよ
い。

このようにして反応せしめた後、ついで反応によって生
ずる検出できる変化の量または変化速度を測定するので
あるが、この検出できる変化としては、酵素サイクリン
グ反応（ｉｉｉ　）若しくは（ｉｖ〕のＧａＰまたはＤ
ＨＡＰの１モル比の生成または消費の１回サイクル反応
において、１モル比若しくは２モル比の成分を消費する
か、または生成する成分が挙げられ、これらの成分とし
ては、消費されるＯｔ、消費される還元型ＮＡＤ、生成
されるＨ８０８の各成分が挙げられる。まず消費される
Ｏ：の量の定量に当たっては、通常酸素電極を用いる電
気化学的変化の量として定量すればよい。

また還元型ＮＡＤの消費量の定量に当たっては、予め用
いた量の還元型ＮＡＤから反応後に残存する還元型ＮＡ
Ｄの量の差を求めることによってなされる。この反応後
に残存する還元型ＮＡＤの量または予め用いた量の還元
型ＮＡＤの量の定量は、公知の種々の還元型ＮＡＤの定
量法が用いられる。

この還元型ＮＡＤの定量法としては、例えば共存するＮ
ＡＤに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤの特異的吸
収波長である吸収波長域の波長に基づいて吸光度測定す
ればよい、還元型ＮＡＤの定量のための特異的吸収波長
である吸収波長域としては、３２０〜３６０ｎｍ近辺で
あり、好ましくは還元型ＮＡＤの特異的極大吸収を有す
る３４０ｎｍ近辺である。この波長により、残存する還
元型ＮＡＤを吸光度値として定量することができる。

さらに他の還元型ＮＡＤの定量法としては、還元型ＮＡ
Ｄの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の
発色による方法が挙げられる。この水素原子伝達系色原
体としては各種テトラゾリウム塩や２．６−シクロロフ
エノールインドフエノールなどが挙げられ、好ましくは
水溶性テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはフェナジ
ンメトサルフェートを組み合わせて電子伝達を良好に甘
しめたものを用いればよい、この水素原子伝達系色原体
は、還元型ＮＡＤの水素原子を受けて呈色するホルマザ
ン色素を形成するもので、このホルマザン色素をその吸
収波長域、例えば５００〜５５Ｑｎｍにおける極大吸収
波長域に基づいて吸光度測定すればよい。さらに他の還
元型ＮＡＤの定量法としては、還元型ＮＡＤにレザズリ
ンなどの螢光用試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめ
て反応によって螢光する成分の量を定量してもよい。

特に酵素サイクリング反応（ｉｖ　）を形成せしめる場
合には、還元型ＮＡＤの変化量が酵素サイクリング反応
（ｉｉｉ　）の場合よりも２倍の高感度となり還元型Ｎ
ＡＤの定量に基づ＜ＬＣＡＴ活性測定は、好適な例とし
て挙げることができる。

また生成する成分であるＨ、Ｏｔの定量に当たっては、
過酸化水素電極を用いる電気化学的変化の量として定量
するか、またはＨ！０３と反応して検出できる生成物に
変化する指示薬組成物を用いて定量してもよい、この指
示薬組成物としては、通常色調の変化を可視にて生ずる
呈色薬組成物、光照射により螢光を発する螢光薬組成物
や発色する発光薬組成物である分光光学的手段によりそ
の変化の量を定量し得る組成物が用いられる。

また、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若しくは〔ｉ
ｖ〕の反応によって生ずる検出できる変化速度としては
、反応によって消費されるＯ２減少速度、消費される還
元型ＮＡＤ減少速度または生成されるＨ　！　Ｏを増加
速度が挙げられ、変化速度を測定するれば、酵素サイク
リング反応が定常状態になると、基質量に比例するので
、従って、ＬＣＡＴ反応前および反応後の還元型ＮＡＤ
減少速度を３４０ｎ園にて分光学的に測定、あるいは０
．の減少速度を酸素電極にて測定、あるいはＨ２Ｏ２の
増加速度を過酸化水素電極にて測定し、ＬＣＡＴ反応前
および反応後の速度の変化量を計測することにより、被
検体中のＬＣＡＴ活性が求められ、このようなシステム
を考えることにより自動分析器への適用が可能である。

本発明の各種酵素系を利用して、ＬＣＡＴ活性を測定す
るには、例えば次のように行えばよい。

血清または血漿等の被検体液を、２本の試験管に分注す
る。１本の試験管に所定量のＬＣＡＴ阻害削〔例えば、
コール酸、１％濃度以上のトリトンＸ−１００（商品名
；シグマ社製）など〕を加えり後、適宜所定量のコレス
レロールエステル加水分解酵素を加え氷冷する（Ａ）、
他方の試験管にも適宜所定量のコレスレロールエステル
加水分解酵素を加え、３７℃、一定時間（通常１０分以
上、好ましい範囲は１０〜２０分）加温した後、ＬＣＡ
Ｔ阻害剤を加え、ＬＣＡＴ活性に基づく酵素反応を停止
させる（Ｂ）、つづいて（Ａ）および（Ｂ）両試験管よ
り試験液を、一定量づつ取り、それぞれの試験液に、還
元型ＮＡＤ、旦ヱヱ、旦旦ｐ旦、旦旦且およびＧＰＤＨ
を含むＬＣＡＴ活性測定用試薬を加え還元型ＮＡＤの減
少速度を３７’Ｃ，３４０ｎｍにて分光光学的に測定、
あるいは過酸化水素の増加速度を過酸化水素電極にて測
定する。同様にして既知濃度の０３Ｐ溶液（標準液）一
定量をＬＣＡＴ活性測定試薬に加え、還元型ＮＡＤの減
少速度あるいは過酸化水素の増加速度を測定する（Ｒｃ
）−これらの測定値から次式に従ってＬＣＡＴ活性値を
算出する。

Ｒｃ　　　　　　　　　　　　　Ｔ Ｕ；ＬＣＡＴ活性値（ｎ　　ｍｏ　］　ｅ／ａ１．　　
ｈ）Ｒ＾；試験管Ａの試験液の還元型ＮＡＤの減少速度
（または過酸化水素の増加速度） Ｒｌ　ｉ試験管Ｂの試験液の還元型ＮＡＤの減少速度（
または過酸化水素の増加速度） Ｒ６；標準液の還元型ＮＡＤの減少速度（または過酸化
水素の増加速度） Ｓ；標準液の濃度（ｎ　　ｍｏ　ｌ　ｅ／ｍ１）Ｔ；試
験管ＢにおけるＬＣＡＴ活性阻害剤を添加する前の加温
時間　（ｈ） ｆ；試験液および標準液の希釈倍数の差に基づく補正値 本発明ＬＣＡＴ活性測定に要する被検体の量は通常２〜
３０μｌあればよく、好ましくは４〜１６μｌである。

測定感度は、本来被検体中の内因性リゾレシチン量（具
体的な例示としてＲＡ／ＲｃｘＳｘｆ）とＬＣＡＴ活性
Ｎ活性体的な例示とし、゛て、（Ｒｍ　　Ｒａ）　／　
ＲｃＸ　Ｓ　Ｘ　ｆ　）との兼ね合いで決められるべき
であるが、リゾレシチン量については、臨床的に正常範
囲が決められていないので、ここでは、被検体約５μｌ
を用いる時、被検体の加温時間（Ｔ）を１５分間とする
と、充分な感度が得られたが、ＧＰＯ，ＧＰＤＨ量を調
節することで、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若し
くは（ｉｖ）のサイクリング速度を調整することにより
更に検出感度を挙げることができる。なお、前記の具体
的測定方法の例示にしたがってＬＣＡＴ活性測定を行っ
た場合には、被検体中にレシチンおよび水に作用し、リ
ゾレシチンおよび遊離脂肪酸を生成せしめる酵素である
活性型フォスフォリバーゼＡｔＣＥＣ，３，１，１，４
；以下ＰＬＰＡ２と略すことがある〕の存在の可能性が
あることから、誤差の原因となることが考えられる。し
かしながら、十数検体に測定したところでは、通常のＬ
ＣＡＴ活性測定においては、はとんど影響を与えていな
かった。

ただ、前記の試験管（Ａ）の試験液の取り扱いにおいて
、所定量のＬＣＡＴ阻害剤を加え、適宜所定量のコレス
レロール加水分解酵素を加えた後、３７℃で一定時間加
温し、氷冷することで、被検体中に存在可能性のあるＰ
ＬＰＡｆｆｉの活性量に関与せずにＬＣＡＴ活性量を求
められることから、適宜この方法に置ぎ換えてＬＣＡＴ
活性測定を行えばよく、また、酵素反応（ｉ）、　　（
ｉｉ）、　　（ｔｉｉ〕を同時に形成せしめＬＣＡＴ活
性測定をする場合には、他の酵素の活性は阻害せずＰＬ
ＰＡｚのみの酵素阻害をしめす物質を加えればよい。

このように本発明は、新規なＬＣＡＴ活性測定法であり
、また、この新規なＬＣＡＴ活性測定に必須な、リゾホ
スホリパーゼ、グリセロホスホコリンホスホジェステラ
ーゼ、グリセロホスフェートオキシダーゼ、グリセロホ
スフェートデヒドロゲナーゼおよび還元型ＮＡＤを含有
するＬＣＡＴ活性測定用組成物を提供することで、臨床
診断の場において、筒便にしかも、ＬＣＡＴ活性測定を
迅速に行わしめるものである。

また、本発明組成物には、前記の活性測定法において記
載した種々の溶媒等を付加してもよく、上記のＬＹヱ、
ＣＰＣＰ、ＧＰＯおよびＣＰ　Ｄ　Ｈ等の酵素および還
元型ＮＡＤ等の基質は、使用に当たって適当な一定量の
溶媒に溶解または懸濁すればＬＣＡＴ活性測定が可能な
ように、予め清涼された上、自体公知の方法で凍結乾燥
した後、一つまたはそれ以上に分配して提供することも
できる。

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何ら限定されるものではない。

「実施例」 実施例　１ ｉｌｌ　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホスホ
リパーゼ（（ＬＹＰ）、東洋醸造社製；ビブリオ属由来
）１０単位（Ｕ）、グリセロホスホコリンホスホジェス
テラーゼ（（ＣＰＣＰ）；東洋醸造社製；微生物由来　
東洋醸造カタログＮａ　　Ｔ−３３）１０単位、グリセ
ロホスフェ−トオキシグーゼ（（ＧＰＯ）、東洋醸造社
製；アエロコツカス属由来〕　１６０単位、グリセロホ
スフェートデヒドロゲナーゼ（（ＧＰＤｆ（）；べ−リ
ンガ−・マンハイム社製；ウサギ骨格筋由来〕　６８単
位を５ｍＭ塩化カルシウム、０．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ
　（ＮＡＤＨ）を含む４０＋ｗＭＨＥＰＥＳ緩衝？＆＜
ｐＨ８，０）に溶解して２０ｍ１とする。

（２１Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 ４検体の血清について、２本の試験管に血清０．１ｍｉ
づつ分注し、そのうち１本にコレステロールエステラー
ゼ（（ＣＨＥ）、東洋醸造社製；シュウトモナス属由来
）１．４を位またはリパーゼ（（ＬＰ）ｉ東洋醸造社製
；クロモバクテリウム属由来〕５単位を添加し２本の試
験管共氷冷する。それぞれにつき５μｌを取りだし、Ｌ
ＣＡＴ活性測活性測定用試薬１添Ａし、３７℃に加温後
５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定する
。また、２本の試験管を３７℃にて、１５分間加温し、
それぞれに１０％トリトンＸ−１００５μｌを加えＬＣ
ＡＴ反応を停止させる。

その後、それぞれにつき５μｌを取りだし、ＬＣＡＴ活
性測活性測定用試薬１添ｌし、３７℃に加温後５〜６分
間における３　４０　ｎｍの吸光度変化を測定する。さ
らに２００μＭのグリセロール−３−リン酸５μＩにつ
いても同様に測定を行い前述の計算式を用いてＬＣＡＴ
活性測定値を算出す゛る。いずれの血清についても、コ
レステロールエステル加水分解酵素を添加したものの方
が、無添加のものより２〜３．５倍高い活性値として得
られ、その結果を第１表に示す。本発明においてコレス
テロールエステル加水分解酵素を添加することは、好適
な例として挙げることができるが、゛無添加の場合にお
いても測定値として充分なものであった。

第１表 実施例　２ ｆｉｌ　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホスホ
リパーゼ〔同上）１０単位、グリセロホスホコリンホス
ホジェステラーゼ〔同上〕１０１０単グリセロホスフエ
ートオキシグーゼ〔同上１１６０単位、グリセロホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ〔同上〕　６８単位を５ｍＭ塩
化カルシウム、０．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ　（ＮＡＤＨ
）を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解して２０ｍｌとする。

＋２１　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 １検体の血清について、３本の試験管に血清０、Ｌｍｌ
づつ分注し、コレステロールエステラーゼ〔同上〕をそ
れぞれ１ｍ１当り１．　４単位。

１４単位、７０４位を添加し、試験管を３７℃にて、適
時加温し、それぞれにｌθ％トリトンＸ−１００５μｌ
を加えＬＣＡＴ反応を停止させる。

その後、それぞれにつき５μｌを取りだし、ＬＣＡＴ活
性測定用試薬１ｍｆｆ１に添加し、３７℃に加温後５〜
６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。さ
らに２００μＭのグリセロール−３−リン酸５μｌにつ
いても同様に測定を行い＋Ｉｆ述の計算式を用いて時間
経過に基づ＜ＬＣＡＴ活性量を算出する。結果は第１図
〔コレステロールエステラーゼ添加型別のＬＣＡＴ活性
量の経時変化を表したもので、横軸は、血清の加温時間
、縦軸は、ＬＣＡＴ活性量を示す、尚、−〇−はコレス
テロールエステラーゼ１．４Ｕ／ｍ＋、−Δ−は１４　
Ｕ／ｍｌ、−口−は７０　［Ｊ／ｍｌ、添加した場合の
測定点で、−・−は血清のみの場合の測定点である〕に
示すが、反応時間が長くなればなるほど１、コレステロ
ール加水分解酵素に依存してＬＣＡＴ活性測定値は低下
していく。これは、Ｌ　ＣＡＴの反応の場である高比重
リボ蛋白を分解するためであるが、本発明のＬＣＡＴ活
性測定における好ましい測定時間である２０分以内では
、はとんど影響を受けていない。よって、実施例１の結
果と合わせて考えると、本発明ＬＣＡＴ活性測定法の如
く短時間で高感度にＬＣＡＴ活性を測定できる系で顕著
にコレステロール加水分解酵素の添加効果の現れること
がわかる。

実施例　３ ＋１１　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホスホ
リパーゼ〔同上〕５５単、グリセロホスホコリンホスホ
ジェステラーゼ〔同上〕　５単位、グリセロホスフェー
トオキシダーゼ（同上〕　１５０単位、グリ七ロホスフ
エートデヒドロゲナーゼ〔同よ〕　３４単位を５ａ＋Ｍ
塩化カルシウム。

０．２５＋＊Ｍ還元型ＮＡＤ　（ＮＡＤＨ）、０．１％
トリＩ・ンＸ−１００を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳｌｌ街
液（ｐＨ８，０）に溶解してｌ　Ｑｍｊ！とする。

（２）　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 ４検体の血清について、２本の試験管に血清０．１ｍｌ
づつ分注し、そのうちの１本に１０％トリトンｘ−ｔｏ
ｏ　　ｓμ２を加え、さらにコレステロールエステラー
ゼ〔同上〕０．２単位を加え氷冷する。残りの試験管に
コレステロールエステラーゼ〔同上〕０．２単位を添加
し、試験管を３７℃にて、１５分間加温し、その後、ｌ
Ｏ％トリトンＸ−１００５μｌを加えＬＣＡＴ反応を停
止させる。その後、それぞれにつき５μｉを取りだし、
ＬＣＡＴ活性測定用試薬１ｍりに添加し、３７℃に加温
後５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定す
る。さらに２００Ｉ！Ｍのグリセロール−３−リン酸５
μｌについても同様に測定を行い前述の計算式を用いて
ＬＣＡＴ活性測定値を算出する。結果は第２表に示す。

第２表 また、血清２を４１５．３１５．２１５．１１５と適時
希釈してサンプル試料を作成し、前記の如くにしてＬＣ
ＡＴ活性値を、測定し、検量線を、作成したところ、第
２図〔横軸は、各試料中に含まれる血清の割合、縦軸は
、ＬＣＡＴ活性値を示す〕に示すが如くきわめて良い直
線性を示した。

実施例　４ Ｔｌ）　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整試薬１　リ
ゾホスホリパーゼ〔同上〕５単位、グリセロホスホコリ
ンホスホジェステラーゼ〔同上〕５単位、グリセロホス
フエートデヒドロケナーゼ〔同上〕８．５単位を５ｓ＋
Ｍ塩化カルシウム、０．２５ａＭ還元型ＮＡＤ　（ＮＡ
ＤＨ）、０．１％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭＨ
ＥＰＥＳｆｆｌ衝液（ｐＨ８，０）に溶解して５ｍｉと
する。

試薬２　グリセロホスフェートオキシダーゼ〔同上〕　
１６０単位を５０ｍＭＨＥＰＥＳｌｌ衝液（ｐＨ８，０
）に溶解して１ｍｊｌとする。

試薬３１６５％ドデシル硫酸ナトリウム（２１Ｌ　ＣＡ
　Ｔ活性測定 ２検体の血清について、２本の試験管に血清０．０５ｍ
Ｊづつ分注し、そのうちの１本に１０％トリトンＸ−１
００５μｌを加え、さらにコレステロールエステラーゼ
〔同上〕０．５単位を加え氷冷する。残りの試験管にコ
レステロールエステラーゼ〔同上〕０．５単位を添加し
、試験管を３７℃にて、１５分間加温し、その後、１０
％トリトンｘ−ｉｏｏ　　ｓμｌを加えＬＣＡＴ反応を
停止させる。あらかじめ加温した試薬１　０゜５　ｍ　
ｊ中にそれぞれの試験管から５μｌを取りだし加え、３
７℃にて５分間加温した後、試薬２をｏ、Ｑ５ｍＪを加
える。さらに３７℃にて５分間加温し試薬３０．５ｍｊ
を加え酵素的サイクリング反応を停止させる。この液よ
りそれぞれ０゜Ｑｌｍｊｔを採取し、過酸化水素電極に
て、試′薬２を加えてから５分間に増加した過酸化水素
の量を測定する。また、２００μＭのグリセロール−３
−リン酸５μｉについても同様に測定を行い前述の計算
式を用いてＬＣＡＴ活性測定値を算出する。

結果は第３表に示す。

第３表 参考例　１ （１）リゾレシチン測定用試薬の調整 リゾホスホリパーゼ（同上）１０単位、グリセロホスホ
コリンホスホジェステラーゼ〔同上〕ＩＯ単位単位ザグ
リセロホスフェートオキシダーゼ上〕　１６０単位、グ
リセロホスフェートデヒドロゲナーゼ〔同上〕６８単位
を５ｍＭ塩化カルシウム、０．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ　
（ＮＡＤＨ）を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解して２０ｍＡとする。

（２）リゾレシチン量の測定 ３検体の血清について、試験管に血清０．１ｍＡづつ分
注し、それぞれに１０％トリトンＸ−１００５μｉを加
えＬＣＡＴ反応を停止させた後、コレステロールエステ
ラーゼ（同上）　　１．　４単位を加え試験管を３７℃
にて、加温し、それぞれにつき経時的に、５μｌを取り
だし、リゾレシチン測定用試薬１ｍｌに添加し、３７℃
に加温後５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を
測定し、リゾレシチンの量を定量する。その結果を第４
表に示す。

第４表 上記の参考例に示すが如く、活性型フォスフォリパーゼ
Ａ２由来のリゾレシチンの増加は認められない。

「発明の効果」 本発明によって、レシチンコレステロールアシルトラン
スフェラーゼ活性を感度よく、しかも迅速に、また実際
の臨床診断の場においても適用可能なほど簡便に測定な
らしめるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はコレステロールエステラーゼ添加量刑のＬＣＡ
Ｔ活性量の経時変化を示し、第２図は検量線を示す。 第１図 血り傭　の　カロシＩＬ日８Ｐｆｉ 第　２　図゛ な１に枡ヤ１を１休ろ江シ１り別５ 手続補正書 １、事件の表示 昭和６２年特許願第６７００３号 ２、発明の名称 レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの活
性測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１自　　発 ５、補正の対象 明細書の全文 ６、補正の内容 （１）訂正明細書　　　　　　　　　　　　　−通１、
発明の名称 レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの活
性測定法 ２、特許請求の範囲 （１）　被４０体中のレシチンコレステロールアシルト
ランスフェラーゼの活性測定法において、該酵素が反応
を触媒するレシチンおよびｉＨＩ！コレステロールを基
質として作用せしめ、リゾレシチンおよびコレステロー
ルエステルを生成する酵素反応系を用いて、生成するリ
ゾレシチンにリゾホスホリパーゼ、グリセロホスホコリ
ンホスホジェステラーゼを作用せしめ、同時または逐次
に生成するグリセロール−３−リン酸の量を酵素的サイ
クリング法を利用し高感度に測定することを特徴とする
レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼの活
性測定法。 ＋２＋生成するグリセロール−３−リン酸（０３Ｐ）量
を酵素的サイクリング法を利用し高感度に測定すること
において、０３Ｐ、　　ジヒドロキシアセトン−３−ホ
スフェート（ＤＨＡＰ）、ニコチンアミド・アデニン・
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）。 １元型ＮＡＤ、酸素（Ｏｘ）　、過酸化水素（ＨｔＣｈ
）、グリセロホスフェートオキシダーゼ（旦旦旦）およ
びグリセロホスフエートデヒドロゲナーセ（ＣＰ　Ｄ　
Ｈ）の成分および酵素の関与する下記サイクリング反応
（１） を形成せしめるため、被検体中に、旦ヱ旦、用皿、還元
型ＮＡＤおよびｏ２を存在せしめ、次いで反応によって
生ずる検出できる変化の量または速度を定量してなる特
許請求の範囲第１項記載の活性測定法。 （３）サイクリング反応（１）において、１分子の１１
！０□と１分子の還元型ＮＡＤを消費して２分子の水分
子と１分子のＮＡＤを生成する反応を触媒するＮＡＤ”
ペルオキシダーゼを作用せしめ、次いで反応によって生
ずる検出できる変化の漬または速度を定量してなる特許
請求の範囲第２項記載の活性測定法。 （４）検出できる変化の量または速度が、Ｏｔ消費量ま
たは０□減減少度である特許請求の範囲第２項記載の活
性測定法。 （５）検出できる変化の量または速度が、Ｈ２Ｏ２生成
量またはＨｔ　Ｏを増加速度である特許請求の範囲第２
項記載の活性測定法。 （６）検出できる変化の量または速度が、還元型ＮＡＤ
消費量または還元型ＮＡＤ減少速度である特許請求の範
囲第２項および３項記載の活性測定法。 （７）レシチンコレステロールアシルトランスフェラー
ゼが反応を触媒するレシチンおよび遊離コレステロール
を基質として、リゾレシチンおよびコレステロールエス
テルを生成する酵素反応系において、コレステロールエ
ステル加水分解酵素を共存せしめることを特徴とする特
許請求の範囲第１項記載の活性測定法。 （ｉｌｌリゾホスホリパーゼ、グリセロホスホコリンホ
スホジェステラーゼ、グリセロホスフエートオキシダー
ゼ、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼおよび還元
型ＮＡＤを含有するレシチンコレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼの活性ｎ　走用組成物。 ３、発明の詳細な説明 「産業上の利用分野」 本発明は、検体中のレシチンコレステロールアシルトラ
ンスフェラーゼ（以下ＬＣＡＴと略すことがある）の活
性測定法および該酵素活性測定用組成物に関する。 「従来の技術及びその問題点」 ＬＣＡＴは血液中でレシチンおよび遊離コレステロール
を基質として作用しリゾレシチンおよびコレステロール
エステルを生成せしめる酵素であり肝臓において生合成
されている。ＬＣＡＴの活性は肝細胞の障害と関係があ
り、例えば、急性肝炎、肝硬変、閉塞性黄度、肝癌など
でＬＣＡＴ活性は低下し、アルコール性肝障害、脂肪肝
などで上昇が認められる。従ってＬＣＡＴの活性測定は
、肝機能の検査にとって有用であり、またＬＣＡＴの活
性測定は脂質代謝異常、Ｆ尿病などの病態解明にも有用
である。　　　゛ 従来、本酵素の活性測定は、基質として消費される遊離
コレステロールの変化量を測定し求められている。具体
的には、血清（あるいは血漿）を最適反応温度である３
７℃にて一定時間（例えば２時間）加温し、加温前後の
遊離コレステロールの変化ｉ１　（ｎ　ｍｏｌｅ　）を
求め、１時間（ｈ）につき血清１１当たりの変化ｌ　ｎ
　１ｌｏｌｅ　／ｒｍｌ−ｈ）として表現する。 酵素の反応速度は、反応液中の基質が充分量あり、その
反応曲線が時間に対し直線性を有する反応初期の速度を
もって示すのが一般的である。しかしながら、ＬＣＡＴ
の場合、高比重リボ蛋白を反応の場とし、しかも高比重
リボ蛋白中のアポ蛋白Ａ−１が本酵素の活性化因子とな
っていること、またレシチンおよびコレステロールが本
来、水に溶けないことなどから活性測定は極めて困難で
ある。活性測定法としては、大別して、少量の血清（あ
るいは血漿）に過剰量のＬＣＡＴ活性を有しない基質を
加える共通基質法と、血清（あるいは血漿）を直接加温
し内因性のリボ蛋白を基質とする自己基質法とがある。 自己基質法の場合、血清（あるいは血漿）そのものを３
７℃で加温すると反応開始後１時間以内に直線性が失わ
れるが、本質的に通常ＬＣＡＴ活性そのものが非常に低
いため、加温時間を長くしなければ分光光学的分析法に
より遊離コレステロールの変化量を測定することは困難
であった。 その為、界面活性剤を添加して調製したレシチンを被検
体に加えるＬＣＡＴの活性測定法〔特開昭５１−１２９
２９３号〕が報告されているが、ＬＣＡＴの他方の基質
である遊離コレステロールを添加しないためＬＣＡＴ活
性は低値となり、またレシチン可溶化のための界面活性
剤は、ＬＣＡＴ活性を阻害し、従って臨床検査法上は不
適当である。また、ＬＣＡＴの基質であるレシチンおよ
び遊離コレステロールを含む被検体液の透明化、可溶化
のため超音波による処理〔臨床化学、第４巻。 第３・４合併号、３０６〜３１１頁、　　（１９７６年
）〕が報告されているが、超音波処理では、一時的に乳
濁を減少させるだけで透明とはならず、しかも２〜３時
間で沈澱が生じるため、超音波処理のみでは、臨床検査
市場においては応用できなかった。またポリアニオン糖
誘導体を用いてコレステロール、レシチンを透明化しＬ
ＣＡＴの活性測定する方法〔特開昭６０−２６２６００
号〕あるいはコレステロール、レシチンからなるリポソ
ームを加え、ＬＣＡＴの活性測定をする方法（リポソー
ム法と略すことがある）　〔第２６回臨床化学会、１９
８６年１１月２２日発表（開会プログラム、要旨集第１
００〜１０１頁、１９８６年）〕等により、ＬＣＡＴ反
応の直線性を保持したり、活性を上昇させることにより
被検体のインキュベートの時間を短縮することが報告さ
れているが、しかしながらやはり反応時間（インキュベ
ートの時間）は、リポソーム法で４０分以上、それ以外
の方法では、１時間からそれ以上の反応時間を要し、酵
素活性測定法として適当ではなく、また臨床検査の場に
おいて迅速にＬＣＡＴ活性を測定するという面からも満
足されうるちのではなく、現在量も短時間で測定可能な
リポソーム法において均質で安定なリポソームを調製す
ることは非常に困難であり、実際一般的臨床診断の場に
、一定組成のリポソームを供給することは困難である。 また最近、外因性レシチンおよびコレステロールエステ
ラーゼを使用しリゾレシチンの増加速度からＬＣへ人活
性を測定する〔特開昭６１−２９３３９６号〕報告があ
るが、リゾレシチン増加量を検出するのに反応時間を約
１時間以上要し、前述の如くにこのように多くの時間を
必要とするのは、比色定量法の感度限界に寄るところが
大きく迅速測定の観点から、この方法も問題がある。 「問題点を解決するための手段」 本発明者らは、ＬＣＡＴの活性測定を感度良く、しかも
迅速に簡単に行なえる日常検査に適した方法を確立すべ
く種々検討した結果、レシチンコレステロールアシルト
ランスフェラーゼが反応を触媒するレシチンおよび遊離
コレステロールを基質として作用せしめ、リゾレシチン
およびコレステロールエステルを生成する酵素反応系を
用いて、生成するリゾレシチンにリゾホスホリパーゼ（
ＥＣ，３，１，１，５；以下旦ヱ旦と略すことがある）
、グリセロホスホコリンホスホジェステラーゼ（ＥＣ，
３，１，４，２；以下ＧＰＣＰと略すことがある）を作
用せしめ、同時または逐次に生成するグリセロール−３
−リン酸（以下Ｇ３Ｐと略すことがある）の量を酵素的
サイクリング法を利用し高感度に測定することによりＬ
ＣＡＴ活性測定ができることを見出し、また、旦ヱＰ、
ＧＰ−且、グリセロホスフェートオキシダーゼ（以下Ｃ
Ｐ旦と略すことがある）および還元型ニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド（以下還元型ＮＡＤと略すこ
とがある）を含有する組成物を用いることによって、Ｌ
ＣＡＴ活性を迅速に正確にしかも簡単に行えることを見
出し本発明を完成した。 即ち本発明は、被検体中のＬＣＡＴの活性測定法におい
て、該酵素が反応を触媒するレシチンおよび遊離コレス
テロールを基質として作用せしめ、リゾレシチンおよび
コレステロールエステルを生成する反応系を用いて、生
成するリゾレシチンにリゾホスホリパーゼ、グリセロホ
スホコリンホスホジェステラーゼを作用せしめ、同時ま
たは逐次に生成するグリセロール−３−リン酸の量を酵
素的サイクリング法を利用し高感度に測定することを特
徴とするＬＣＡＴの活性測定法であり、また、上ヱヱ、
ＧＰＣＰ、ＧＰＯ，ＧＰＤＨおよび還元型ＮＡＤを含有
するＬＣＡＴの活性測定用組成物を提供するものである
。 より具体的に本発明を説明すると、式（１）で表される
酵素反応系を利用し、生成するリゾレシチンの生成量ま
たは生成速度を測定することにより、ＬＣＡＴ活性を測
定することにおいて、従来　ＣＡＴ レシチン　＋　遊離コレステロール リゾレシチン　士　コレステロールエステル〔１〕から
の技術によっては、リゾレシチンの生成量または生成速
度が非常に微量または微速度であるために、非常に測定
時間を要し、また簡便な測定が困難であったが、本発明
は、弐い〕で表される酵素反応系に、式（ｉｉ）で表さ
れる酵素反応と式（ｉｉｉ　）で表される酵素的サイク
リング系を組合ねせることにより、臨床診断の場におい
ても簡便に、しかも迅速にＬＣＡＴ活性測定を可能なら
しめたものである。 ＹＰ ＰＣＰ →グリセロネス本リルコリン　　−−−−−−−→Ｇ３
Ｐ　　　＋　　コリン 本発明において、式（ｉ）で表される反応系を形成せし
めるのに必要な基質は、レシチンおよび遊離コレステロ
ールであるが、通常被検体として挙げられる血清もしく
は血漿中には、レシチンおよび遊離コレステロールを内
因しているので本発明の実施においてレシチンおよび／
または１Ｌｆｉｌｌコレスチロールを添加することは、
必須ではない。 ＬＣＡＴ反応等に伴うレシチンの不足を補うために外因
性のレシチンを添加することもでき、外因性のレシチン
として、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、ジオ
レオイルフォスファチジルコリン、ジミリストイルフォ
スファチジルコリン。 ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジラウロイル
フォスファチジルコリン、天然レシチンまたは超音波処
理した各種レシチン等が挙げられる。 また、ＬＣＡＴ活性を阻害しない基質、例えばレシチン
、コレステロールよりなるリポソームを添加してもよい
。さらにまた、ＬＣＡＴ反応系中にコレステロールエス
テル加水分解酵素を存在せしめることは、ＬＣＡＴ反応
で消去される遊離コレステロールを補充でき、内因性の
遊離コレステロールの初期温度を上げることができ、ま
たは内因性若しくはＬＣＡＴ反応によって生じるコレス
テロールエステルにコレステロールエステル加水分解酵
素を作用せしめことによりＬＣＡＴ酵素反応を促進する
ことができ、ひいては、測定感度を上げることかできる
ので、好適な例として挙げることができる。上記記載の
コレステロール加水分解酵素とは、コレステロールエス
テルに作用し、遊離コレステロールを生成せしめる加水
分解酵素の総称として用いたもので、このような酵素作
用を示す酵素、つまりコレステロールエステラーゼ（以
下ＣＨＥと略すことがある）と一般的に呼ばれている酵
素の他に、上記酵素作用を有するりバーゼ、エステラー
ゼと呼ばれている酵素を含むもので、ＣＨＥとしては、
哺乳動物の膵、肝、脳、副腎、翠丸、卵巣等の動物組織
由来、または、シュウトモナス　フルオレッセンス（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆＩｕｏｒｅ３ｃｅｎｓ　　）、
　　シゾフィラム　コムネ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕ
ｍ　　ｃｏｍｕｎｅ）　　、　　クロモバクテリウム　
ビスコサム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍνｉｓｃ
ｏｓｕｍ）　　等の微生物由来のＣＨＥが挙げられ、リ
パーゼとしては、動物の膵、肝、脂肪組織由来、！！［
物種子由来、または、シュウトモナス　フルオレッセン
ス、ゲオイカム　カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｕｍ　
ｃａｎｄｉｄｕｓ）等の微性物由来のリパーゼが挙げら
れる。用いる場合通常、■キットに対してＩＵ以上、好
ましくは１〜７０Ｕ用いればよい。 上述の如く式（ｉ）で表されるＬＣＡＴ酵素反応によっ
て生成するリゾレシチンを式（ｉｉ）で表されるが如く
の二段階の酵素反応でＧａＰおよびコリンに導かれる。 本酵素反応で用いられるリゾホスホリパーゼ（旦ヱ旦）
の量は、通常０．３〜ｌｏｇ／キットであり、好ましく
は０．５〜３Ｕ／キツトであり、グリセロホスホコリン
ホスホジェステラーゼ（Ｇ　Ｐ　ＣＰ）の量は、通常０
．３〜１０Ｕ／キフトであり、好ましくは０．５〜３Ｕ
／キツトである。 なお、ＬＣＡＴ活性高感度測定のために、式〔ｉｉ〕で
表される酵素反応の一段目の酵素反応によって、生成す
る遊離脂肪酸をアシル−ＣｏＡシンセターゼとアシル−
ＣｏＡヒドロラーゼを用いて酵素サイクリング測定する
方法〔ジャーナル　オプ　バイオケミストリー（Ｊ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ　）　）　　９４゜４８７〜４９２頁、１
９８３年〕も、発明者は検討したが、被検体中の脂肪酸
の組成が個体差等により、一定では無く　（個体差等に
より、分子量の違う脂肪酸の分布が一定していない）、
個々の被検体中の全脂肪酸に対する酵素の相対活性が一
定では無いため、必ずしも臨床診断の場において用いる
には満足のいくものではなかった。 次に式（ｉｉ）に示されるが如くの酵素反応を経由して
生成するグリセロ−３−リンＭ（ＧａＰ）の量の測定に
おいて、先に発明者が、見出した式（ｉｉｉ　）で表さ
れる酵素サイクリング法を用いた測定法〔特開昭５９−
１４０９００号〕を適用すると、多種の酵素反応系が関
与する複雑な酵素反応にも関わらず、ＬＣＡＴ活性を感
度よく迅速にまた、実際の臨床診断の場においても適用
可能であるほど簡便に測定可能であることを見出したも
のである。 式（ｉｉｉ　）で表される酵素サイクリング反応を形成
する初期成分としては、ＧＰＯ，ＧＰＤＨ，Ｏｌおよび
還元型ＮＡＤである。この酵素サイクリング反応（ｉｉ
ｉ　）において、ＧＰＯは被検体中のＧ３Ｐを基質とし
て、１分子の０３Ｐと０．とを消費して１分子のＨ８０
，とＤ）（ＡＰを生成し、更にこのＤＨＡＰを基質とし
てＧＰＤＨは、１分子のＤＨＡＰと還元型ＮＡＤを消費
して１分子のＧａＰとＮＡＤを生成してなるもので０３
Ｐ−ＤＨＡＰのサイクル反応を形成する。よって、本酵
素サイクリング反応を形成する成分としてＧＰＯ，ＧＰ
旦且、０□および還元型ＮＡＤが必要であるが、実際に
は、０．は、反応系における溶存酸素を利用すれば充分
であり、ＧＰＯ，ＣＰＤＨ，および還元型ＮＡＤを測定
のための試薬として過剰量用いればよい、用いられるＧ
ＰＯやＣＰ　Ｄ　Ｈの使用量としては特に限定されるも
のでなく、被検体中の内在性リゾレシチン由来のＧａＰ
および予測されるＬＣＡＴ活性から生成が考えられるＧ
ａＰの量の和に基づいて適宜決定すればよく、ＧａＰの
量と相対的に加減して用いればよ（、通常被検体１キッ
ト当りＧＰＯは、５〜２０Ｕ好ましくは８〜１５Ｕであ
り、ＧＰＤ）Ｉは、０．３〜１．８Ｕ好ましくは０．５
〜１．５Ｕであり、またこれ以上の量の各酵素を用いて
もよい、さらに還元型ＮＡＤの使用量としては通常ＧＰ
ＤＨの還元型ＮＡＤに対するＫｍ値に比べ大過剰の量が
用いられ、例えば５０倍量以上、好ましくは１００〜１
００００倍量用いればよく、またこの量販上用いること
を何ら限定するものではない。 さらにこの酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）における
Ｈ　ｔ　Ｏｔと還元型ＮＡＤを反応せしめてＮＡＤを生
成する、より高感度な測定法となしてもよい。 即ち酵素サイクリング反応（１ｉｉ）において、１分子
のＩ（８０□と１分子の還元型ＮＡＤを消費し、２分子
の水（ＨｚＯ）と１分子のＮＡＤを生成する反応を触媒
する酵素であるＮＡＤ”ペルオキシダーゼ（ＥＣ，１，
１１，１，１；以下ＮＡＤＰＯと略すことがある）〔ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　　　２２−１．５５７　　　
（１９５７））を組合せ用いてなるこの酵素反応（ｉｖ
　）においては、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）に
て生成したＨｔＣｈが、更に還元型ＮＡＤと共に消費さ
れてＮＡＤを生成するために、酵素サイクリング反応（
ｉｖ　）の１サイクルにて２分子の還元型ＮＡＤの消費
となるもので、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）に比
べて２倍の還元型ＮＡＤの変化量となり、より高感度に
ＬＣＡＴ活性を測定できるものとなる。 また上記の各種酵素反応および酵素サイクリング反応に
おける媒体としては、用いる各酵素の活性の安定なｐＨ
域のものであればよく、本ＬＣＡＴ活性測定を行うに当
たって、通常ｐＨ７，０〜８．５好ましくはｐＨ７，３
〜８．２であり、媒体緩衝液としては、上記ｐＨ域内に
調整されたリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液５イミダ
ゾール−塩酸緩衝液、ジメルグルクール酸−水酸化ナト
リウム緩衝液、ピペスー水酸化ナトリウム緩衝液。 ＨＥＰＥＳ緩衝液等が用いられる。また旦ヱ旦およびＧ
ＰＣＰの活性化剤であるカルシウム塩類。 マグネシウム塩類等の金属塩類を媒体中に添加しても良
い０例えば、カルシウム塩類である塩化カルシウムを添
加する場合には、添加濃度として１〜ｌｏｍＭ、好まし
くは２〜６ｍＭである。更に、インキュベート時の温度
は通常３７℃付近で行えば良い。 反応時間は、同時に酵素反応（ｉ）、　　（ｉｉ）およ
び酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若しくは（ｉｖ）
を形成せしめる場合にあっては、５分以上反応せしめれ
ばよく、測定の迅速性から見て、好ましくは５〜ｌＯ分
である。また逐次に酵素反応〔ｉ〕。 （ｉｉ　）および酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若
しくは（ｉｖ　）を形成せしめる場合にあっては、酵素
反応（ｉ）の反応時間を１０分以上にせしめ、酵素反応
（ｉｉ）および酵素サイクリング反応（ｉｉｉ　）若し
くは（ｉｖ　）各々の反応時間は２分以上であればよい
、さらにまた、酵素反応（ｉ）を形成せしめ、その後に
、酵素反応（ｉｉ　）および酵素サイタリング反応（ｉ
ｉｉ　）若しくは（ｉｖ　）を同時に形成せしめる場合
にあっては、酵素反応（ｉ）の反応時間を１０分以上に
せしめ、酵素反応（ｉｉ　）および酵素サイクリング反
応（ｉｉｉ　）若しくは（ｉｖ）反応時間は２分以上で
あればよい。 このようにして反応せしめた後、ついで反応によって生
ずる検出できる変化の量または変化速度を測定するので
あるが、この検出できる変化としては、酵素サイクリン
グ反応（ｉｉｉ　）若しくは（ｉｖ〕のＧａＰまたはＤ
ＨＡＰの１モル比の生成または消費の１回サイクル反応
において、１モル比若しくは２モル比の成分を消費する
か、または生成する成分が挙げられ、これらの成分とし
ては、消費される０１消費される還元型ＮＡＤ、生成さ
れるＨｏｏｔの各成分が挙げられる。まず消費されるＯ
ｌの量の定量に当たっては、通常酸素電極を用いる電気
化学的変化の量として定量すればよい。 また還元型ＮＡＤの消費量の定量に当たっては、予め用
いた量の還元型ＮＡＤから反応後に残存する還元型ＮＡ
Ｄの量の差を求めることによってなされる。この反応後
に残存する還元型ＮＡＤの量または予め用いた量の還元
型ＮＡＤの量の定量は、公知の種々の還元型ＮＡＤの定
量法が用いられる。 この還元型ＮＡＤの定量法としては、例えば共存するＮ
ＡＤに特異的吸収波長でなく、還元型ＮＡＤの特異的吸
収波長である吸収波長域の波長に基づいて吸光度測定す
ればよい、還元型ＮＡＤの定量のための特異的吸収波長
である吸収波長域としては、３２０〜３６０ｎｍ近辺で
あり、好ましくは還元型ＮＡＤの特異的極大吸収を有す
る３４ｏｎｍ近辺である。この波長により、残存する還
元型ＮＡＤを吸光度値として定量することができる。 さらに他の還元型ＮＡＤの定量法としては、還元型ＮＡ
Ｄの水素原子の受容能を有する水素原子伝達系色原体の
発色による方法が挙げられる。この水素原子伝達系色原
体としては各種テトラゾリウム塩や２，６−シクロロフ
エノールインドフエノールなどが挙げられ、好ましくは
水溶性テトラゾリウム塩とジアホラーゼまたはフェナジ
ンメトサルフェートを組み合わせて電子伝達を良好に甘
しめたものを用いればよい、この水素原子伝達系色原体
は、還元型ＮＡＤの水素原子を受けて呈色するホルマザ
ン色素を形成するもので、このホルマザン色素をその吸
収波長域、例えば５００〜５５０ｎｍにおける極大吸収
波長域に基づいて吸光度測定すればよい、さらに他の還
元型ＮＡＤの定量法としては、還元型ＮＡＤにレザズリ
ンなどの螢光用試薬の共存下ジアホラーゼを作用せしめ
て反応によって螢光する成分の量を定量してもよい。 特に酵素サイクリング反応（ｉｖ　）を形成せしめる場
合には、還元型ＮＡＤの変化量が酵素サイクリング反応
（ｉｉｉ　）の場合よりも２倍の高感度となり還元型Ｎ
ＡＤの定量に基づ（ＬＣＡＴ活性測定は、好適な例とし
て挙げることができる。 また生成する成分であるＨオｏ２の定量に当たっては、
過酸化水素電極を用いる電気化学的変化の量として定量
するか、またはＨｔ　Ｏｇと反応して検出できる生成物
に変化する指示薬組成物を用いて定量してもよい。この
指示薬組成物としては、通常色調の変化を可視にて生ず
る呈色薬組成物、光照射により螢光を発する螢光薬組成
物や発色する発光薬組成物である分光光学的手段により
その変化の量を定量し得る組成物が用いられる。 また、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ）若しくは〔ｉｖ
）の反応によって生ずる検出できる変化速度としては、
反応によって消費される０ｔｆＩｊｉ少速度、消費され
る還元型ＮＡＤ減少速度または生成されるＨ２Ｏ２増加
速度が挙げられ、変化速度を測定するれば、酵素サイク
リング反応が定常状態になると、基質量に比例するので
、従って、ＬＣＡＴ反応前および反応後の還元型ＮＡＤ
減少速度を３４ｏｎ−にて分光学的に測定、あるいはｏ
２の減少速度を酸素電極にて測定、あるいはＨオｏ２の
増加速度を過酸化水素電極にて測定し、ＬＣＡＴ反応前
および反応後の速度の変化量を計測することにより、被
検体中のＬＣＡＴ活性が求められ、このようなシステム
を考えることにより自動分析器への適用が可能である。 本発明の各種酵素系を利用して、ＬＣＡＴ活性を測定す
るには、例えば次のように行えばよい。 血清または血脩等の被検体液を、２本の試験管に分注す
る。１本の試験管に所定量のＬＣＡＴ阻害剤〔例えば、
コール酸、１％濃度以上のトリトンＸ−１００（商品名
；シグマ社！！りなど〕を加えた後、適宜所定量のコレ
ステロールエステル加水分解酵素を加え氷冷する（Ａ）
、他方の試験管にも適宜所定量のコレステロールエステ
ル加水分解酵素を加え、３７℃、一定時間（通常１０分
以上、好ましい範囲は１０〜２０分）加温した後、ＬＣ
ＡＴ阻害剤を加え、ＬＣＡＴ活性に基づく酵素反応を停
止させる（Ｂ）。つづいて（Ａ）および（Ｂ）両試験管
より試験液を、一定量づつ取り、それぞれの試験液に、
還元型ＮＡＤ、旦ヱ旦、旦旦旦旦、ＧＰＯおよびＧ　Ｐ
　Ｄ　ＩＩを含むＬＣＡＴ活性測定用試薬を加え還元型
ＮＡＤの減少速度を３７’Ｃ，３４０ｎｍにて分光光学
的に測定、あるいは過酸化水素の増加速度を過酸化水素
電極にて測定する。同様にして既知濃度のＧ３Ｐ溶液（
標準液）一定量をＬＣＡＴ活性測定試薬に加え、還元型
ＮＡＤの減少速度あるいは過酸化水素の増加速度を測定
する（Ｒｃ）−これらの測定値から次式に従ってＬＣＡ
Ｔ活性値を算出する。 し　　　　　　　Ｔ Ｕ　、ＬＣＡＴ活性値（ｎ　　ｎｏ　ｌ　ｅ／ｍ１．　
ｈ）Ｒ４；試験管への試験液の還元型ＮＡＤの減少速度
（または過酸化水素の増加速度） Ｒ１；試験管Ｂの試験液の還元型ＮＡＤの減少速度（ま
たは過酸化水素の増加速度） Ｒｃ；標準液の還元型ＮＡＤの減少速度（または過酸化
水素の増加速度） Ｓ；標準液の濃度（ｎ　　ｍｏｌｅ／ｍ１）Ｔ；試験管
ＢにおけるＬＣＡＴ活性阻害剤を添加する前の加温時間
　（ｈ） ｆ；試験液および標準液の希釈倍数の差に基づく補正値 本発明ＬＣＡＴ活性測定に要する被検体の量は通常２〜
３０μ！あればよく、好ましくは４〜１６μ！である。 測定感度は、本来被検体中の内因性リゾレシチン量（具
体的な例示としてＲＡ／Ｒ（×５ｘｒ）とＬＣＡＴ活性
！活性体的な例示として、（Ｒｓ−Ｒａ）　／　ＲｃＸ
　Ｓ　Ｘ　ｆ　）との兼ね合いで決められるべきである
が、リゾレシチン世については・、臨床的に正常範囲が
決められていないので、ここでは、被検体約５μｌを用
いる時、被検体の加温時間（Ｔ）を１５分間とすると、
充分な感度がｉ）られたが、ｃｐｏ、ＧＰＤＨｌをＪＪ
ｌｆＩＩｉすることで、酵素サイクリング反応（ｉｉｉ
　）若しくは（１ｖ〕のサイクリング速度を調整するこ
とにより更に検出感度を挙げることができる。なお、前
記の具体的測定方法の例示にしたがってＬＣＡＴ活性測
定を行った場合には、被検体中にレシチンおよび水に作
用し、リゾレシチンおよび遊離脂肪酸を生成せしめる酵
素である活性型フォスフォリパーゼＡｚ［ＩＥＣ，３，
１，１，４ｉ以下ＰＬＰＡよと略すことがある〕の存在
の可能性があることから、誤差の原因となることが考え
られる。しかしながら、十数検体に測定したところでは
、通常のＬＣＡＴ活性測定においては、はとんど影響を
与えていなかった。 ただ、前記の試験管（Ａ）の試験液の取り扱いにおいて
、所定量のＬＣＡＴ阻害剤を加え、適宜所定量のコレス
テロールエステル加水分解酵素を加えた後、３７℃で一
定時間加温し、氷冷することで、被検体中に存在可能性
のあるＰＬＰＡｆｆｉの活性量に関与せずにＬＣＡＴ活
性量を求められることから、適宜この方法に置き換えて
ＬＣＡＴ活性測定を行えばよく、また、酵素反応（ｉ）
、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）を同時に形成せしめＬＣＡＴ活
性測定をする場合には、他の酵素の活性は阻害せずＰＬ
ＰＡ、のみの酵素阻害をしめす物質を加えればよい。 このように本発明は、新規なＬＣＡＴ活性測定法であり
、また、この新規なＬＣＡＴ活性測定に必須な、リゾホ
スホリパーゼ、グリセロホスホコリンホスホジェステラ
ーゼ、グリセロホスフェートオキシダーゼ、グリセロホ
スフェートデヒドロゲナーゼおよび還元型ＮＡＤを含有
するＬＣＡＴ活性測定用組成物を提供することで、ａ床
診断の場において、簡便にしかも、ＬＣＡＴ活性測定を
迅速に行わしめるものである。 また、本発明組成物には、前記の活性測定法において記
載した種々の溶媒等を付加してもよく、上記の旦ヱ旦、
ＧＰＣＰ、旦凡旦およびＣＰＤＨ等の酵素および還元型
ＮＡＤ等の基質は、使用に当たって適当な一定量の溶媒
に溶解または懸濁し、自体公知の方法で凍結乾燥した後
、一つまたはそれ以上に分配して提供することもできる
。 次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何ら限定されるものではない。 「実施例」 実施例　１ ｆｉｌ　Ｌ　、ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホス
ホリパーゼ（（ＬＹＰ）、東洋醸造社製；ビブリオ属由
来）１０単位、グリセロホスホコリンホスホジェステラ
ーゼ（（ＣＰＣＰ）。 東洋醸造社製；微生物由来　東洋醸造カタログ述Ｔ−３
３）１０単位、グリセロホスフェートオキシダーゼ（（
ＧＰＯ）ｉ東洋醸造社製；アエロコツカス属由来〕　１
６０４１位、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ（
（ＣＰＤｌｌ）；ベーリンガー・マンハイム社製；ウサ
ギ骨格筋由来〕６８単位を５μｌＭ塩化カルシウム、０
．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ　（ＮＡＤＨ）を含む４０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）に熔解して２０ｍｊ！
とする。 ＋２１　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 ４検体の血清について、２本の試験管に血清０．１ｍＩ
づつ分注し、そのうち１本にコレステロールエステラー
ゼ（（ＣＨＥ）；東洋醸造社製；シュウトモナス属由来
〕　１．４単位またはリパーゼ（（ＬＰ）、東洋醸造社
製；クロモバクテリウム属由来〕　５単位を添加し２本
の試験管共氷冷する。それぞれにつき５μｌを取りだし
、ＬＣＡＴ活性測活性測定用試薬１添Ａし、３７℃に加
温後５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定
する。また、２本の試験管を３７℃にて、１５分間加温
し、それぞれに１０％トリトンＸ−ｔｏ０５μｌを加え
ＬＣＡＴ反応を停止させる。 その後、それぞれにつき５μｌを取りだし、ＬＣＡＴ活
性測活性測定用試薬１定ｊ＋し、３７℃に加温後５〜６
分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。さら
に２００μＭのグリセロール−３−リン酸５μｌについ
ても同様に測定を行い前述の計算式を用いてＬＣＡＴ活
性測定値を算出する。いずれの血清についても、コレス
テロールエステル加水分解酵素を添加したものの方が、
無添加のものより２〜３．５倍高い活性値として得られ
、その結果を第１表に示す。本発明においてコレステロ
ールエステル加水分解酵素を添加することは、好適な例
として挙げることができるが、無添加の場合においても
測定値として充分なもので第１表 実施例　２ （１１Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホスホリ
パーゼ〔同上〕　１０単位、グリセロホスホコリンホス
ホジェステラーゼ〔同上〕１０１０単グリセロホスフェ
ートオキシダーゼ〔同上〕１６０単位、グリセロホスフ
ェートデヒドロゲナーゼ〔同上〕　６８単位を５ｍＭ塩
化カルシウム、０．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ（ＮＡＤＨ）
を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳｆｉ衝液（ｐＨ８，０溶解溶
解して２０ｍ１とする。 （２１Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 １検体の血清について、３本の試験管に血ｌ＃Ｑ、１ｍ
＃づつ分注し、コレステロールエステラーゼ〔同上〕を
それぞｆＬ　ｌ　ｍ　１当り１．４単位。 １４単位、７０単位を添加し、試験管を３７℃にて、適
時加温し、それぞれに１０％トリトンＸ−１００５μｌ
を加えＬＣＡＴ反応を停止させる。 その後、それぞれにつき５μｌを取りだし、ＬＣＡＴ活
性測活性測定用試薬１定ｊ！し、３７℃に加温後５〜６
分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定する。さら
に２００μＭのグリセロール−３−リン酸５μ２につい
ても同様に測定を行い前述の計算式を用いて時間経過に
基づ＜ＬＣＡＴ活性量を算出する。結果は第１図〔コレ
ステロールエステラーゼ添加量刑のＬＣＡＴ活性量の経
時変化を表したもので、横軸は、血清の加温時間、縦軸
は、ＬＣＡＴ活性量を示す、尚、−〇−は・ゴレステロ
ールエステラーゼ１．４Ｕ／蒙ｌ、−Δ−は１４０／ｓ
ｌ、　−ローは７０Ｕ／ｍｌ、添加した場合の測定点で
、−・−は血清のみの場合の測定点である〕に示すが、
反応時間が長くなればなるほど１、コレステロールエス
テル加水分解酵素であるコレステロールエステラーゼに
依存してＬＣＡＴ活性測定値は低下していく、これは、
ＬＣＡＴの反応の場である高比重リボ蛋白を分解するた
めであるが、本発明のＬＣＡＴ活性測定における好まし
い測定時間である２０分以内では、はとんど影響を受け
ていない、よって、実施例１の結果と合わせて考えると
、本発明ＬＣＡＴ活性測定法の如く短時間で高感度にＬ
ＣＡＴ活性を測定できる系で顕著にコレステロール加水
分解酵素の添加効果の現れることがわかる。 実施例　３ （１１Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整リゾホスホリ
パーゼ（同上〕５５単、グリセロホスホコリンホスホジ
ェステラーゼ〔同上〕５５単、グリセロホスフェートオ
キシダーゼ（同上）１５０単位、グリセロホスフェート
デヒドロゲナーゼ〔同上〕　３４単位を５１ＩＩＭ塩化
カルシウム。 ０．２５ｍＭ還元型ＮＡＤ　（ＮＡＤＨ）、０．１％ト
リトンＸ−１００を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解して１０ｍｊｌとする。 （２１Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定 ４検体の血清について、２本の試験管に血清Ｑ、１ｍｊ
Ｉづつ分注し、そのうちの１本に１０％トリトンＸ−１
００５μｌを加え、さらにコレステロールエステラーゼ
〔同上〕０．２単位を加え氷冷する。残りの試験管にコ
レステロールエステラーゼ〔同上〕０．２単位を添加し
、試験管を３７℃にて、１５分間加温し、その後、１０
％トリトンＸ−１００５μｌを加えＬＣＡＴ反応を停止
させる。その後、それぞれにつき５μ！を取りだし、Ｌ
ＣＡＴ活性測活性測定用試薬１定ｊ！し、３７℃に加温
後５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化を測定す
る。さらに２００μＭのグリセロール−３−リン酸５μ
ｌについても同様に測定を行い前述の計算式を用いてＬ
ＣＡＴ活性測定値を算出する。結果は第２表に示す。 以下余白 第２表 また、血清２を４１５．３１５．２１５．１１５と適時
希釈してサンプル試料を作成し、前記の如（にしてＬＣ
ＡＴ活性値を、測定し、検量線を、作成したところ、第
２図〔横軸は、各試料中に含まれる血清の割合、縦軸は
、ＬＣＡＴ活性値を示す〕に示すが如くきわめて良い直
線性を示した。 実施例　４ （１）　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定用試薬の調整試薬ｌ　リ
ゾホスホリパーゼ〔同上〕５５単、グリセロホスホコリ
ンホスホジェステラーゼ〔同上〕　５単位、グリセロホ
スフェートデヒドロゲナーゼ〔同上〕　８．５単位を５
ｍＭ塩化カルシウム、０、２５ｍＭ還元型ＮＡＤ　（Ｎ
ＡＤＩ−ｒ）、０．１％トリドアＸ−１００を含む５０
ｍＭＨＥ　Ｐ　Ｅ　ｓｙｉ衝液溶解Ｈ８，０）に熔解し
て５ｍｆとする。 試薬２　グリセロホスフェートオキシダーゼ〔同上〕　
１６０単位を５０ｍＭＨ［ＺＰＥＳ緩衝液（ｐ［１８，
０）に溶解して１　ｍ　ｌとする。 試薬３１．５％ドデシル硫酸ナトリウム＋２１　Ｌ　Ｃ
Ａ　Ｔ活性測定 ２検体の血清について、２本の試験管に血清０．０５ｍ
ｊｔづつ分注し、そのうちの１本に１０％トリトンＸ−
１００５μｌを加え、さらにコレステロールエステラー
ゼ〔同上〕　０．５単位を加え水冷する。残りの試験管
にコレステロールエステラーゼ〔同上〕　０．５単位を
添加し、試験管を３７℃にて、１５分間加温し、その後
、１０％トリトンｘ−ｉｏｏ　　ｓμｌを加えＬＣＡＴ
反応を停止させる。あらかじめ加温した試薬１０゜５ｍ
！中にそれぞれの試験管から５μｌを取りだし加え、３
７℃にて５分間加温した後、試薬２を０、Ｑ５ｍｊ＋を
加える。さらに３７℃にて５分間加温し試薬３０．５ｍ
ｌを加え酵素的サイクリング反応を停止させる。この液
よりそれぞれ０゜Ｑ１ｍｊ！を採取し、過酸化水素電極
にて、試薬２を加えてから５分間に増加した過酸化水素
の量を測定する。また、２００μＭのグリセロール−３
−リン酸５μｌについても同様に測定を行い前述の計算
式を用いてＬＣＡＴ活性測定値を算出する。 結果は第３表に示す。 第　　３　　表 参考例　１ ｉｌｌリゾレシチン測定用試薬の調整 リゾホスホリパーゼ〔同上）１０単位、グリセロホスホ
コリンホスホジェステラーゼ〔同上〕１０１０単グリセ
ロホスフェートオキシダーゼ〔同上〕　１６０単位、グ
リセロホスフェートデヒドロゲナーゼ〔同上〕　６８単
位を５＋＊Ｍ塩化カルシウム、０．２５ｍＭ還元型ＮＡ
Ｄ　（ＮＡＤＨ）を含む４０ｍＭＨＥＰＥＳｌｌ衝液（
ｐＨ８，０溶解溶解して’ｌ　Ｑｒｒ＋１とする。 （２）リゾレシチン量の測定 ３検体の血清について、試験管に血清０，１ｍｆｆ１づ
つ分注し、それぞれに１０％トリトンＸ−１００５μｉ
を加えＬＣＡＴ反応を停止させた後、コレステロールエ
ステラーゼ〔同上〕１．４単位を加え試験管を３７℃に
て、加温し、それぞれにつき経時的に、５μｌををりだ
し、リゾレシチン測定用試薬１ｍｆｆ１に添加し、３７
℃に加温後５〜６分間における３４０ｎｍの吸光度変化
を測定し、リゾレシチンの量を定量する。その結果を第
　　４　　表 上記の参考例に示すが如く、活性型フォスフォリパーゼ
Ａ２由来のリゾレシチンの増加は認められない。 「発明の効果」 本発明に東って、レシチンコレステロールアシルトラン
スフェラーゼ活性を感度よく、しかも迅速に、また実際
の臨床診断の場においても適用可能なほど簡便に測定な
らしめるものである。 ４、図面の簡単な説明 第１図はコレステロールエステラーゼ添加量刑のＬＣＡ
Ｔ活性量の経時変化を示し、第２図は検量線を示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）被検体中のレシチンコレステロールアシルトラン
   スフェラーゼの活性測定法において、該酵素が反応を触
   媒するレシチンおよび遊離コレスレロールを基質として
   作用せしめ、リゾレシチンおよびコレステロールエステ
   ルを生成する酵素反応系を用いて、生成するリゾレシチ
   ンにリゾホスホリパーゼ、グリセロホスホコリンホスホ
   ジエステラーゼを作用せしめ、同時または逐次に生成す
   るグリセロール−３−リン酸の量を酵素的サイクリング
   法を利用し高感度に測定することを特徴とするレシチン
   コレステロールアシルトランスフェラーゼの活性測定法
   。
2. （２）生成するグリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）量
   を酵素的サイクリング法を利用し高感度に測定すること
   において、Ｇ３Ｐ、ジヒドロキシアセトン−３−ホスフ
   ェート（ＤＨＡＰ）、ニコチン・アデニン・ジヌクレオ
   チド（ＮＡＤ）、還元型ＮＡＤ、酸素（Ｏ＿２）、過酸
   化水素（Ｈ＿２Ｏ＿２）、グリセロホスフェートオキシ
   ダーゼ（￥ＧＰＯ￥）およびグリセロホスフェートデヒ
   ドロゲナーセ（￥ＧＰ￥￥ＤＨ￥）の成分および酵素の
   関与する下記サイクリング反応〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 を形成せしめるため、被検体中に、￥ＧＰＯ￥、￥ＧＰ
   ￥￥ＤＨ￥、還元型ＮＡＤおよびＯ＿２を存在せしめ、
   次いで反応によって生ずる検出できる変化の量または速
   度を定量してなる特許請求の範囲第１項記載の活性測定
   法。
3. （３）サイクリング反応〔 I 〕において、１分子のＨ
   ＿２Ｏ＿２と１分子の還元型ＮＡＤを消費して２分子の
   水分子と１分子のＮＡＤを生成する反応を触媒するＮＡ
   Ｄ＾＋ペルオキシダーゼを作用せしめ、次いで反応によ
   って生ずる検出できる変化の量または速度を定量してな
   る特許請求の範囲第２項記載の活性測定法。
4. （４）検出できる変化の量または速度が、Ｏ＿２消費量
   またはＯ＿２減少速度である特許請求の範囲第２項記載
   の活性測定法。
5. （５）検出できる変化の量または速度が、Ｈ＿２Ｏ＿２
   生成量またはＨ＿２Ｏ＿２増加速度である特許請求の範
   囲第２項記載の活性測定法。
6. （６）検出できる変化の量または速度が、還元型ＮＡＤ
   消費量または還元型ＮＡＤ減少速度である特許請求の範
   囲第２項および３項記載の活性測定法。
7. （７）レシチンコレステロールアシルトランスフェラー
   ゼが反応を触媒するレシチンおよび遊離コレスレロール
   を基質として、リゾレシチンおよびコレスレロールエス
   テルを生成する酵素反応系において、コレスレロールエ
   ステル加水分解酵素を共存せしめることを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の活性測定法。
8. （８）リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホコリンホス
   ホジエステラーゼ、グリセロホスフェートオキシダーゼ
   、グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼおよび還元型
   ＮＡＤを含有するレシチンコレステロールアシルトラン
   スフェラーゼの活性測定用組成物。