JPS60262600A - レシチンコレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの活性測定法及び測定用基質 - Google Patents

レシチンコレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの活性測定法及び測定用基質

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JPS60262600A
JPS60262600A JP11657784A JP11657784A JPS60262600A JP S60262600 A JPS60262600 A JP S60262600A JP 11657784 A JP11657784 A JP 11657784A JP 11657784 A JP11657784 A JP 11657784A JP S60262600 A JPS60262600 A JP S60262600A
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JP
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cholesterol
lecithin
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measuring
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JP11657784A
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Mitsuhisa Manabe
真鍋 満久
Akemichi Maki
牧 明道
Mitsuyoshi Hirata
平田 三四司
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Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd
Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はレシチンコレステロールアシルトランスフェラ
ーゼ(以下L OA Tと略す)の活性測定法及びこれ
に使用する基質に関する。LOATは血液中で遊離コレ
ステロール、レシチンを各々コレステロールエステルと
りゾレシチンに変える酵素であり肝臓において生合成さ
れる。
LOATの活性は肝細胞の障害と関係があり、急性肝炎
患者ではその活性が低下する。慢性肝炎の患者の大部分
は正常値を示し、また肝硬変などの患者の多くは低値で
あり、閉塞性黄痕では経過の悪化にともない低下する。
従って、LCATの活性測定は、肝機能の検査にとって
有用である。またL OA、Tの活性測定は脂質代謝異
常。
糖尿病などの病態解明にも有用である。一般に酵素の活
性は反応速度で表わすことができ、一定量の酵素を一定
条件下で加温し、一定時間内の基質または生成物の変化
量として表わされる。
例えばLOATの活性測定においては、最適反応温度で
ある87℃で血清を加温し、基質である遊離コレステロ
ールの変化量(n mole)を測定し、1時間につき
血清1 ml当りの変化量nmo1e/ml/時間とし
て表現する。
酵素の反応速度は、酵素反応によって反応系の基質量が
減少するにともない低下するので。
反応系中の基質量を加温時間に対してプロットして得ら
れる基質量と時間の曲線が直線性を有する反応初期の速
度をもって示すのが一般的である。LOATの活性測定
においては、 被検体そのものを87℃で加温すると9
反応開始後約1時間以内で直線性が失われるので加温時
間を短くしなければならず、そのため基質変化量がわず
かであり、光学的分析法により遊離コレステロールを測
定するような方法では正確な変化量を測定するのが困難
である。そこでストック法(K、 T、 5tokke
ら、5can、J、Cl1n、Lab。
Invest 、、 27巻、 21頁(1971))
及び共通基質法(J、 A、 Glomsetら、 B
ioc旧m、 Biophys。
Ac1a、 89巻、266頁(1964))、〔N1
chols、A。
■、らBiochin、 Biophys、Acta、
 281巻、175頁(1971))が利用されている
。しかしこれらの方法は脂質の抽出及び薄層クロマトグ
ラフィーによる分離が必要であるなど、操作が繁雑で。
しかもコレステロールを均一なエマルジョンとするには
、熟練を要するため基質の調製法が難しく、不安定であ
り、また放射性同位元素を使用する等好ましい方法とは
言難い。近年、界面活性剤を添加して調製したレシチン
を基質液とするLOATの活性測定法が報告されている
が、〔特許公報、特開昭51−129298.特公昭5
5−2279) LOATの他方の基質であるコレステ
ロールを含まないためLOAT活性は低値となる。
しかも基質となるレシチン及びコレステロールは水に不
溶であり、緩衝液に添加したのみでは乳濁又は沈でんし
てしまう。このような基質液を検ト 体に加えて加温しても、基質の濁りが測定値を干渉する
ため、光学的に測定することは難しく。
従って臨床検査法には不適当であり、そこでレシチンと
コレステロールを含む基質液の透明化。
可溶化が必要となる。
可溶化の手段として超音波処理や界面活性剤の使用が知
られている。超音波処理は、一時的に乳濁を減少させる
だけで透明とはならず、しかも2〜3時間で沈でんが生
じ、超音波処理のみでは臨床検査には応用できない。ま
た界面活性剤による方法は、コレステロールは可溶化で
きず、従ってレシチンだけを可溶化させており。
しかもL OA Tの活性を阻害する。
以上のようにレシチンとコレステロールの両方を含有す
る透明なLOAT基質を調製することは不可能であった
本発明者らは、LOATの活性測定を放射性同位元素を
用いず、光学的に感度良く、簡単に行なえる日常検査に
適した方法を確立すべく種々検討した結果、リゾレシチ
ン、ポリアニオン。
糖誘導体を用いれば、透明なレシチン−コレステロール
含有基質液が得られることを見出し。
しかもこの基質に検体を加え加温するとLOAT〜5− の活性を高め2反応速度の直線性を延長させることがで
き、光学的に分析できることをも見出した。本発明者ら
は反応系にレシチンとコレステロール両方添加と、レシ
チンのみ添加した場合の反応速度の直線性について検討
した。その結果を第1図に示す。すなわち、一定量の検
体に緩衝液(pH7,1)に加えた種々の基質の一定量
を加え、87℃で加温し、各時間における反応系中の遊
離コレステロール量を採取して測定した。
この結果から、レシチン無添加では約60分以内に反応
の直線性が失われるのに対し、レシチン濃度3.0■/
mlでは約90分までその直線性が延長される。しかし
、レシチン(75■/1177りに一方の基質であるコ
レステロール(16m9/dl)を添加すると活性が上
昇し、レシチンとコレステロールの添加はLCATの活
性をより高く発現させることができた。しかも、LOA
T反応の直線性は、4時間才で延長できた。
以上のことから、LOATの高い活性を得。
6一 しかも反応速度の直線性を維持させておく時間を延長さ
せるには、レシチンとコレステロールの両方を必要とす
ることが分った。
さらに種々の血清で比較したところ表1の結果を得た。
いずれの血清においてもレシチン−コレステロール可溶
化基質の方が高い活性値として得られている。
表1 本基質とレシチン可溶化基質の比較含む基質を用
いて得られた血清L CA T活性値である。
本発明に使用できるレシチンとしては9例えばジパルミ
トイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスフ
ァチジルコリン、ジミリストイルフォスファチジルコリ
ン、ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジラウロ
イルフォスファチジルコリン等である。一方、リゾレシ
チンとしては前記レシチンのグリセロフォスホリピドか
ら脂肪酸1個がとれた。パルミトイルリゾフォスファチ
ジルコリン、オレオイルリゾフォスファチジルコリン、
ミリストイルリゾフォスファチジルコリン、ステアロイ
ルリゾフォスファチジルコリン、ラウロイルリゾフォス
ファチジルコリン等が挙げられる。また、ポリアニオン
糖誘導体としては1例えばデキストラン硫酸、ヘパリン
、コンドロイチン硫酸等が使用できる。なお、これらの
レシチン、リゾレシチン及びポリアニオン糖誘導体は種
々組み合せて使用することが可能である。
次にレシチン、リゾレシチン、ポリアニオン糖誘導体及
びコレステロールの透明な混合液(以下基質きいう)の
調製法について述べる。
リゾレシチンとレシチンを精製水に添加し乳濁液を得る
。この乳濁液を超音波処理すると透明な混合液となる。
次いでこの混合液にポリアニオン糖誘導体及びコレステ
ロールを加えるとコレステロールの結晶が分散した状態
となる。
この混合液を再び超音波処理すると透明な基質が得られ
る。
本基質のりゾレシチン濃度はa my / cte −
200m9/dl、好ましくは5 vy /d7!〜9
0 yny/ dlであり。
レシチン濃度は10mg/di 〜600mg/di、
好ましくは60m9/dl〜270m9/dlであり、
ポリアニオン糖誘導体濃度はo、Lm9/li7!〜l
omy/lte、好ましく ハ0.4■/dl〜8■/
dl及びコレステロール濃度は1 my/dl 〜15
0 my/d7!、好ましくはlOmy/de〜50 
mg/dlを各々含有するのが良い。なお、当該基質は
自体公知の方法で凍結乾燥させてもよG)。
本発明の基質を使用して、LOAT活性を測定するには
9次のようにする。例えば試験管に9− 被検体を採取し、前記の基質を加え(以下試料液という
)、攪拌後ただちに試料液の一定量を別の試験管にとり
、LOAT活性阻害剤(例えばコール酸など)を加えて
室温に放置する(A)。
元の試料液の入った試験管は37°C,2時間加温し9
次いで試料液を新しい試験管に一定量採取し、LOAT
活性阻害剤を加えて酵素反応を停止させる(B)。つづ
いて試験管(A)及び(B)に遊離コレステロール測定
試薬1例えばコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、ジエチルm−トルイジン及び4−アミノアンチ
ピリンを加え吸光度を測定する。同様にして既知濃度の
遊離コレステロールを含有する標準液及び水を測定する
〔(C)及び(D)〕。これらの測定値から次式に従っ
てL OA T活性値を算出する。
u : ’r、OAT活性値(n mo I e /m
l/時間)Aa:試験管への試料の吸光度 Ab“ // B tt 10− AC:標準液を検体とした時の吸光度 Ad°水を検体とした時の吸光度 D :標準液中の遊離コレステロールの濃度T :加温
時間 f :試料液及び標準液の希釈倍数の差に基づく補正値
■:試料液の容量 なお、遊離コレステロール測定試薬としては前記の酵素
法の試薬以外にも通常使用されている試薬9例えばリー
ベルマン・プルハルト試薬。
ザックヘンリー試薬等が使用可能である。また。
本発明に使用できる被検体としては血清もしくは血漿を
使用することが好ましい。
以上の様に本発明はレシチンとコレステロールの両方を
含有する基質を使用するため、従来方法と比較し、LO
ATの活性を高めることができ、しかも反応の直線性を
維持しておく時間が延長できる。さらに基質液が透明で
あるため。
濁りによる影響を受けず、比色による測定法を可能にし
た等優れた方法である。
次に実施例をあげ1本発明をさらに詳しく説明するが、
これに限定されるわけではない。
実施例1゜ (1) レシチン−コレステロール基質の調製パルミト
イルリゾフォスファチジルコリン14.8m9. シバ
ルミ1−イルフヨスファチジルコリン250m9を精製
水90m1に加え、超音波処理(200W、 5分間X
2 )l、、澄明な溶液を得る。さらに、テキストラン
硫酸2.5m9.コレステロール507%を加えて再び
超音波処理(200W、 5分間×6)して透明化する
。これに精製水を加えて全量100m1とし、基質とす
る。
(2) 遊離コレステロール測定試薬の調製コレステロ
ールオキシラーゼ200単位、パーオキシダーゼ200
単位、フェノール20μl、4−アミノアンチピリン2
00m9を01%トリトンX−100を含む005Mリ
ン酸緩衝液(pH6,0)に溶解して100m1とする
(3)LOAT活性測定 試験管に血清0.5 mlを採取し、レシチン−コレス
テロール基質0.8 mlを加え(以下試料液という)
、攪拌後ただちに別の試験管(A)に試料液200μl
をとり、30mMデオキシコール酸溶液40μlを加え
室温に放置する。残った試料液を87℃、2時間加温す
る。この試料液2(10μlを試験管(B)にとり、a
omMデオキシコール酸溶液40μlを加えて酵素反応
を停止させる。
試験管(A)及び(B)に各々遊離コレステロール測定
試薬8mlを加え、87°G1.0分間加温した後、5
00nmにおける吸光度を測定する。
同様にして既知濃度(500n mol/j? )の遊
離コレステロールを含有する標準液及び水を測定し、前
述の計算式を用いて活性値を算出した。
実施例2 (]) ]レシチンーコレステロール基の調製パルミ・
トイルリゾフォスファチジルコリン74、3 m9 、
シバルミ・トイルフォスフブチジルコリン250m9を
精製水’;)Omlに加えて超音波処理(200W、5
分間×2)する。この溶液にヘパリン5m9. コレス
テロール50屑ノを加えて、再び超音波処理(200W
、5分間×6)して透明化する。
−]8− これに精製水を加えて全量を100m1とし基質とする
(2)遊離コレステロール測定試薬の調製コレステロー
ルオキシダーゼZoo 単位、パーオキシダーゼ200
単位、4−アミノアンチピリン20θmg及び濃塩酸2
0μlにジエチル−m−トルイジン20μlを溶解した
液の全量をO1%トリトンX−100を含む005Mフ
タル酸緩衝液(pH6,0)に溶解して100m1とす
る。
(3) L CA T活性測定 試験管に血清0.5 mlを採取し、レシチン−コレス
テロール基質08m1を加え(以下試料液という)、攪
拌後ただちに別の試験管(A)に試料液100μlをと
り、80mMデオキシコール酸溶液40μlを加え、室
温に放置する。残った試料液を87℃、2時間加温する
この試料液100μlを試験管(B)にとり、80mM
デオキシコール酸溶液40μlを加えて酵素反応を停止
させる。試験管(A)及び(B)に各々遊離コレステロ
ール試薬8mlを加え、878C91014− 分間加温した後、波長545nmにおける吸光度を測定
する。同様にして、既知濃度(500n mol/l)
の遊離コレステロールを含有する標準液及び水を測定し
、前述の計算式を用いて活性値を算出した。
実施例8 (1) レシチン−コレステロール基質の調製ミリスト
イルリゾフォスファチジルコリン678m?+”ミリス
トイルフォスファチジルコリン22]、、7■を精製水
100m1に加えて超音波処理(200W。
5分間×2)する。この溶液にデキストラン硫酸8■、
コレステロール50■を加えて再び超音波処理(200
W、5分間×6)して透明化する。
一方、あらかじめ別の容器に牛血清アルブミン157を
精製水200 、ml!に溶した液に前記レシチン−コ
レステロール液を攪拌しながら加えて基質とする。
(2)遊離コレステロール測定試薬の調製実施例2と同
様に調製する。
(3)LC!AT活性測定法 本実施例のレシチン−コレステロール基質と遊離コレス
テロール測定試薬を使用し、実施例2と同様に行なう。
実施例4゜ (1) レシチン−コレステロール基質の調製パルミト
イルリゾフォスファチジルコリン74.3■、ジパルミ
トイルフォスファチジルコリン250〜を精製水100
 、meに加え、超音波処理(200W。
5分間X2)L、、溶解する。さらに、デキストラン硫
酸8m9.コレステロール50711gを加えて。
再び超音波処理(200W、5分間×6)して透明化す
る。
一方、あらかじめ別の容器に牛血清アルブミン201.
窒化ナトリウム0.47を精製水800m1に溶かした
液に、前記レシチン−コレステロール液を攪拌しながら
加えて基質とする。
) (2)遊離コレステロール測定試薬の調製実施例2と同
様に行なう。
1b− (3) L OA T活性測定法 試験管に血清0.2mlを採取し、レシチン−コレステ
ロール基質0.5 mlを加え(以下試料液という)、
攪拌後ただちに別の試験管(A)に試料液200μlを
とり、30mMデオキシコール酸溶液40μlを加え、
室温に放置する。残った試料液を87℃、2時間加温す
る。この試料液200μlを試験管(B)にとり、so
mMデオキシコール酸溶液40μlを加えて酵素反応を
停止させる。試験管(A)及び(B)に各々遊離コレス
テロール測定試薬3mlを加え、87℃、10分間加温
した後。
545nmにおける吸光度を測定する。
同様にして、既知濃度の遊離コレステロールを含有する
標準液及び水を測定し、前述の計算式を用いて活性値を
算出した。
17− 16− 各実施例1−4で行なった結果を表2に示す。
表2 18− 実施例5゜ 実施fHのレシチン−コレステロール基質及び遊離コレ
ステロール測定試薬を使用して、血清の代りにLOAT
活性既知の血清(A)8容に高LCAT活性を示す既知
の血清(B)2容を添加し混和した血清(0)を用いて
、実施例3のLOA T活性測定法と同様に操作して測
定し、添加回収率をめた。結果は表8の通りである。
表8 ※回収率のめ方 ((0−0,8XA)10.2XB)X100 (%)
【図面の簡単な説明】
第1図は経時変化を表したものである。横軸は反応時間
、縦軸は各反応時間での遊離コレステロールの減少量を
545nmにおける吸光度変化で表したものである。な
お、」Iトは血清にジパルミトイルフメスファチジルコ
リン及ヒコレステロールを添加した場合の測定点、()
−C1→ま血清にジパルミトイルフォスファチジルコリ
ンを添加した場合の測定点、↑fは血清のみの場合の測
定点である。 第2図は検量線である。横軸は各試料中に含まれる血清
の割合、縦軸はLOAT活性である。 反嵐時間 に県の劉合

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1) 被検体中のレシチンコレステロールアシルトラン
    スフ、エラーゼの活性測定法においてポリアニオン糖誘
    導体、リゾレシチン、レシチン及びコレステロールと被
    検体とを溶媒中で反応させ残存するコレステロール量を
    測定することを特徴とするレシチンコレステロールアシ
    ルトランスフェラーゼの測定法。 うポリアニオン糖誘導体、リゾレシチン、レシチン及び
    コレステロールより成ることを特徴とスル被検体中のレ
    シチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ測定用
    基質。 8)測定用基質が液状あるいは凍結乾燥されていること
    を特徴とする特許請求の範囲第2項記載のレシチンコレ
    ステロールアシルトランスフェラーゼ測定用基質。
JP11657784A 1984-06-08 1984-06-08 レシチンコレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの活性測定法及び測定用基質 Pending JPS60262600A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5122454A (en) * 1987-03-20 1992-06-16 Toyo Yozo Company, Ltd. Assay method for lecithin-cholesterol acyltransferase
WO2012092365A1 (en) * 2010-12-31 2012-07-05 Alphacore Pharma Llc Detection of lcat activity

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