JPS60262600A

JPS60262600A - レシチンコレステロ−ルアシルトランスフエラ−ゼの活性測定法及び測定用基質

Info

Publication number: JPS60262600A
Application number: JP11657784A
Authority: JP
Inventors: Mitsuhisa Manabe; 真鍋　満久; Akemichi Maki; 牧　明道; Mitsuyoshi Hirata; 平田　三四司
Original assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd; Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Kagaku Yakuhin Co Ltd; Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1984-06-08
Filing date: 1984-06-08
Publication date: 1985-12-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はレシチンコレステロールアシルトランスフェラ
ーゼ（以下Ｌ　ＯＡ　Ｔと略す）の活性測定法及びこれ
に使用する基質に関する。ＬＯＡＴは血液中で遊離コレ
ステロール、レシチンを各々コレステロールエステルと
りゾレシチンに変える酵素であり肝臓において生合成さ
れる。

ＬＯＡＴの活性は肝細胞の障害と関係があり、急性肝炎
患者ではその活性が低下する。慢性肝炎の患者の大部分
は正常値を示し、また肝硬変などの患者の多くは低値で
あり、閉塞性黄痕では経過の悪化にともない低下する。

従って、ＬＣＡＴの活性測定は、肝機能の検査にとって
有用である。またＬ　ＯＡ、Ｔの活性測定は脂質代謝異
常。

糖尿病などの病態解明にも有用である。一般に酵素の活
性は反応速度で表わすことができ、一定量の酵素を一定
条件下で加温し、一定時間内の基質または生成物の変化
量として表わされる。

例えばＬＯＡＴの活性測定においては、最適反応温度で
ある８７℃で血清を加温し、基質である遊離コレステロ
ールの変化量（ｎ　ｍｏｌｅ）を測定し、１時間につき
血清１　ｍｌ当りの変化量ｎｍｏ１ｅ／ｍｌ／時間とし
て表現する。

酵素の反応速度は、酵素反応によって反応系の基質量が
減少するにともない低下するので。

反応系中の基質量を加温時間に対してプロットして得ら
れる基質量と時間の曲線が直線性を有する反応初期の速
度をもって示すのが一般的である。ＬＯＡＴの活性測定
においては、　被検体そのものを８７℃で加温すると９
反応開始後約１時間以内で直線性が失われるので加温時
間を短くしなければならず、そのため基質変化量がわず
かであり、光学的分析法により遊離コレステロールを測
定するような方法では正確な変化量を測定するのが困難
である。そこでストック法（Ｋ、　Ｔ、　５ｔｏｋｋｅ
ら、５ｃａｎ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ　、、　２７巻、　２１頁（１９７１））
及び共通基質法（Ｊ、　Ａ、　Ｇｌｏｍｓｅｔら、　Ｂ
ｉｏｃ旧ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ａｃ１ａ、　８９巻、２６６頁（１９６４））、〔Ｎ１
ｃｈｏｌｓ、Ａ。

■、らＢｉｏｃｈｉｎ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、
　２８１巻、１７５頁（１９７１））が利用されている
。しかしこれらの方法は脂質の抽出及び薄層クロマトグ
ラフィーによる分離が必要であるなど、操作が繁雑で。

しかもコレステロールを均一なエマルジョンとするには
、熟練を要するため基質の調製法が難しく、不安定であ
り、また放射性同位元素を使用する等好ましい方法とは
言難い。近年、界面活性剤を添加して調製したレシチン
を基質液とするＬＯＡＴの活性測定法が報告されている
が、〔特許公報、特開昭５１−１２９２９８．特公昭５
５−２２７９）　ＬＯＡＴの他方の基質であるコレステ
ロールを含まないためＬＯＡＴ活性は低値となる。

しかも基質となるレシチン及びコレステロールは水に不
溶であり、緩衝液に添加したのみでは乳濁又は沈でんし
てしまう。このような基質液を検ト体に加えて加温しても、基質の濁りが測定値を干渉する
ため、光学的に測定することは難しく。

従って臨床検査法には不適当であり、そこでレシチンと
コレステロールを含む基質液の透明化。

可溶化が必要となる。

可溶化の手段として超音波処理や界面活性剤の使用が知
られている。超音波処理は、一時的に乳濁を減少させる
だけで透明とはならず、しかも２〜３時間で沈でんが生
じ、超音波処理のみでは臨床検査には応用できない。ま
た界面活性剤による方法は、コレステロールは可溶化で
きず、従ってレシチンだけを可溶化させており。

しかもＬ　ＯＡ　Ｔの活性を阻害する。

以上のようにレシチンとコレステロールの両方を含有す
る透明なＬＯＡＴ基質を調製することは不可能であった
。

本発明者らは、ＬＯＡＴの活性測定を放射性同位元素を
用いず、光学的に感度良く、簡単に行なえる日常検査に
適した方法を確立すべく種々検討した結果、リゾレシチ
ン、ポリアニオン。

糖誘導体を用いれば、透明なレシチン−コレステロール
含有基質液が得られることを見出し。

しかもこの基質に検体を加え加温するとＬＯＡＴ〜５− の活性を高め２反応速度の直線性を延長させることがで
き、光学的に分析できることをも見出した。本発明者ら
は反応系にレシチンとコレステロール両方添加と、レシ
チンのみ添加した場合の反応速度の直線性について検討
した。その結果を第１図に示す。すなわち、一定量の検
体に緩衝液（ｐＨ７，１）に加えた種々の基質の一定量
を加え、８７℃で加温し、各時間における反応系中の遊
離コレステロール量を採取して測定した。

この結果から、レシチン無添加では約６０分以内に反応
の直線性が失われるのに対し、レシチン濃度３．０■／
ｍｌでは約９０分までその直線性が延長される。しかし
、レシチン（７５■／１１７７りに一方の基質であるコ
レステロール（１６ｍ９／ｄｌ）を添加すると活性が上
昇し、レシチンとコレステロールの添加はＬＣＡＴの活
性をより高く発現させることができた。しかも、ＬＯＡ
Ｔ反応の直線性は、４時間才で延長できた。

以上のことから、ＬＯＡＴの高い活性を得。

６一しかも反応速度の直線性を維持させておく時間を延長さ
せるには、レシチンとコレステロールの両方を必要とす
ることが分った。

さらに種々の血清で比較したところ表１の結果を得た。

いずれの血清においてもレシチン−コレステロール可溶
化基質の方が高い活性値として得られている。

表１　本基質とレシチン可溶化基質の比較含む基質を用
いて得られた血清Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性値である。

本発明に使用できるレシチンとしては９例えばジパルミ
トイルフォスファチジルコリン、ジオレオイルフォスフ
ァチジルコリン、ジミリストイルフォスファチジルコリ
ン、ジステアロイルフォスファチジルコリン、ジラウロ
イルフォスファチジルコリン等である。一方、リゾレシ
チンとしては前記レシチンのグリセロフォスホリピドか
ら脂肪酸１個がとれた。パルミトイルリゾフォスファチ
ジルコリン、オレオイルリゾフォスファチジルコリン、
ミリストイルリゾフォスファチジルコリン、ステアロイ
ルリゾフォスファチジルコリン、ラウロイルリゾフォス
ファチジルコリン等が挙げられる。また、ポリアニオン
糖誘導体としては１例えばデキストラン硫酸、ヘパリン
、コンドロイチン硫酸等が使用できる。なお、これらの
レシチン、リゾレシチン及びポリアニオン糖誘導体は種
々組み合せて使用することが可能である。

次にレシチン、リゾレシチン、ポリアニオン糖誘導体及
びコレステロールの透明な混合液（以下基質きいう）の
調製法について述べる。

リゾレシチンとレシチンを精製水に添加し乳濁液を得る
。この乳濁液を超音波処理すると透明な混合液となる。

次いでこの混合液にポリアニオン糖誘導体及びコレステ
ロールを加えるとコレステロールの結晶が分散した状態
となる。

この混合液を再び超音波処理すると透明な基質が得られ
る。

本基質のりゾレシチン濃度はａ　ｍｙ　／　ｃｔｅ　−
２００ｍ９／ｄｌ、好ましくは５　ｖｙ　／ｄ７！〜９
０　ｙｎｙ／　ｄｌであり。

レシチン濃度は１０ｍｇ／ｄｉ　〜６００ｍｇ／ｄｉ、
好ましくは６０ｍ９／ｄｌ〜２７０ｍ９／ｄｌであり、
ポリアニオン糖誘導体濃度はｏ、Ｌｍ９／ｌｉ７！〜ｌ
ｏｍｙ／ｌｔｅ、好ましく　ハ０．４■／ｄｌ〜８■／
ｄｌ及びコレステロール濃度は１　ｍｙ／ｄｌ　〜１５
０　ｍｙ／ｄ７！、好ましくはｌＯｍｙ／ｄｅ〜５０　
ｍｇ／ｄｌを各々含有するのが良い。なお、当該基質は
自体公知の方法で凍結乾燥させてもよＧ）。

本発明の基質を使用して、ＬＯＡＴ活性を測定するには
９次のようにする。例えば試験管に９− 被検体を採取し、前記の基質を加え（以下試料液という
）、攪拌後ただちに試料液の一定量を別の試験管にとり
、ＬＯＡＴ活性阻害剤（例えばコール酸など）を加えて
室温に放置する（Ａ）。

元の試料液の入った試験管は３７°Ｃ，２時間加温し９
次いで試料液を新しい試験管に一定量採取し、ＬＯＡＴ
活性阻害剤を加えて酵素反応を停止させる（Ｂ）。つづ
いて試験管（Ａ）及び（Ｂ）に遊離コレステロール測定
試薬１例えばコレステロールオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、ジエチルｍ−トルイジン及び４−アミノアンチ
ピリンを加え吸光度を測定する。同様にして既知濃度の
遊離コレステロールを含有する標準液及び水を測定する
〔（Ｃ）及び（Ｄ）〕。これらの測定値から次式に従っ
てＬ　ＯＡ　Ｔ活性値を算出する。

ｕ　：　’ｒ、ＯＡＴ活性値（ｎ　ｍｏ　Ｉ　ｅ　／ｍ
ｌ／時間）Ａａ：試験管への試料の吸光度Ａｂ“　／／　Ｂ　ｔｔ１０− ＡＣ：標準液を検体とした時の吸光度Ａｄ°水を検体とした時の吸光度Ｄ　：標準液中の遊離コレステロールの濃度Ｔ　：加温
時間ｆ　：試料液及び標準液の希釈倍数の差に基づく補正値
■：試料液の容量なお、遊離コレステロール測定試薬としては前記の酵素
法の試薬以外にも通常使用されている試薬９例えばリー
ベルマン・プルハルト試薬。

ザックヘンリー試薬等が使用可能である。また。

本発明に使用できる被検体としては血清もしくは血漿を
使用することが好ましい。

以上の様に本発明はレシチンとコレステロールの両方を
含有する基質を使用するため、従来方法と比較し、ＬＯ
ＡＴの活性を高めることができ、しかも反応の直線性を
維持しておく時間が延長できる。さらに基質液が透明で
あるため。

濁りによる影響を受けず、比色による測定法を可能にし
た等優れた方法である。

次に実施例をあげ１本発明をさらに詳しく説明するが、
これに限定されるわけではない。

実施例１゜（１）　レシチン−コレステロール基質の調製パルミト
イルリゾフォスファチジルコリン１４．８ｍ９．　シバ
ルミ１−イルフヨスファチジルコリン２５０ｍ９を精製
水９０ｍ１に加え、超音波処理（２００Ｗ、　５分間Ｘ
２　）ｌ、、澄明な溶液を得る。さらに、テキストラン
硫酸２．５ｍ９．コレステロール５０７％を加えて再び
超音波処理（２００Ｗ、　５分間×６）して透明化する
。これに精製水を加えて全量１００ｍ１とし、基質とす
る。

（２）　遊離コレステロール測定試薬の調製コレステロ
ールオキシラーゼ２００単位、パーオキシダーゼ２００
単位、フェノール２０μｌ、４−アミノアンチピリン２
００ｍ９を０１％トリトンＸ−１００を含む００５Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解して１００ｍ１とする
。

（３）ＬＯＡＴ活性測定試験管に血清０．５　ｍｌを採取し、レシチン−コレス
テロール基質０．８　ｍｌを加え（以下試料液という）
、攪拌後ただちに別の試験管（Ａ）に試料液２００μｌ
をとり、３０ｍＭデオキシコール酸溶液４０μｌを加え
室温に放置する。残った試料液を８７℃、２時間加温す
る。この試料液２（１０μｌを試験管（Ｂ）にとり、ａ
ｏｍＭデオキシコール酸溶液４０μｌを加えて酵素反応
を停止させる。

試験管（Ａ）及び（Ｂ）に各々遊離コレステロール測定
試薬８ｍｌを加え、８７°Ｇ１．０分間加温した後、５
００ｎｍにおける吸光度を測定する。

同様にして既知濃度（５００ｎ　ｍｏｌ／ｊ？　）の遊
離コレステロールを含有する標準液及び水を測定し、前
述の計算式を用いて活性値を算出した。

実施例２（］）　］レシチンーコレステロール基の調製パルミ・
トイルリゾフォスファチジルコリン７４、３　ｍ９　、
シバルミ・トイルフォスフブチジルコリン２５０ｍ９を
精製水’；）Ｏｍｌに加えて超音波処理（２００Ｗ、５
分間×２）する。この溶液にヘパリン５ｍ９．　コレス
テロール５０屑ノを加えて、再び超音波処理（２００Ｗ
、５分間×６）して透明化する。

−］８− これに精製水を加えて全量を１００ｍ１とし基質とする
。

（２）遊離コレステロール測定試薬の調製コレステロー
ルオキシダーゼＺｏｏ　単位、パーオキシダーゼ２００
単位、４−アミノアンチピリン２０θｍｇ及び濃塩酸２
０μｌにジエチル−ｍ−トルイジン２０μｌを溶解した
液の全量をＯ１％トリトンＸ−１００を含む００５Ｍフ
タル酸緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解して１００ｍ１とす
る。

（３）　Ｌ　ＣＡ　Ｔ活性測定試験管に血清０．５　ｍｌを採取し、レシチン−コレス
テロール基質０８ｍ１を加え（以下試料液という）、攪
拌後ただちに別の試験管（Ａ）に試料液１００μｌをと
り、８０ｍＭデオキシコール酸溶液４０μｌを加え、室
温に放置する。残った試料液を８７℃、２時間加温する
。

この試料液１００μｌを試験管（Ｂ）にとり、８０ｍＭ
デオキシコール酸溶液４０μｌを加えて酵素反応を停止
させる。試験管（Ａ）及び（Ｂ）に各々遊離コレステロ
ール試薬８ｍｌを加え、８７８Ｃ９１０１４− 分間加温した後、波長５４５ｎｍにおける吸光度を測定
する。同様にして、既知濃度（５００ｎ　ｍｏｌ／ｌ）
の遊離コレステロールを含有する標準液及び水を測定し
、前述の計算式を用いて活性値を算出した。

実施例８（１）　レシチン−コレステロール基質の調製ミリスト
イルリゾフォスファチジルコリン６７８ｍ？＋”ミリス
トイルフォスファチジルコリン２２］、、７■を精製水
１００ｍ１に加えて超音波処理（２００Ｗ。

５分間×２）する。この溶液にデキストラン硫酸８■、
コレステロール５０■を加えて再び超音波処理（２００
Ｗ、５分間×６）して透明化する。

一方、あらかじめ別の容器に牛血清アルブミン１５７を
精製水２００　、ｍｌ！に溶した液に前記レシチン−コ
レステロール液を攪拌しながら加えて基質とする。

（２）遊離コレステロール測定試薬の調製実施例２と同
様に調製する。

（３）ＬＣ！ＡＴ活性測定法本実施例のレシチン−コレステロール基質と遊離コレス
テロール測定試薬を使用し、実施例２と同様に行なう。

実施例４゜（１）　レシチン−コレステロール基質の調製パルミト
イルリゾフォスファチジルコリン７４．３■、ジパルミ
トイルフォスファチジルコリン２５０〜を精製水１００
　、ｍｅに加え、超音波処理（２００Ｗ。

５分間Ｘ２）Ｌ、、溶解する。さらに、デキストラン硫
酸８ｍ９．コレステロール５０７１１ｇを加えて。

再び超音波処理（２００Ｗ、５分間×６）して透明化す
る。

一方、あらかじめ別の容器に牛血清アルブミン２０１．
窒化ナトリウム０．４７を精製水８００ｍ１に溶かした
液に、前記レシチン−コレステロール液を攪拌しながら
加えて基質とする。

）（２）遊離コレステロール測定試薬の調製実施例２と同
様に行なう。

１ｂ− （３）　Ｌ　ＯＡ　Ｔ活性測定法試験管に血清０．２ｍｌを採取し、レシチン−コレステ
ロール基質０．５　ｍｌを加え（以下試料液という）、
攪拌後ただちに別の試験管（Ａ）に試料液２００μｌを
とり、３０ｍＭデオキシコール酸溶液４０μｌを加え、
室温に放置する。残った試料液を８７℃、２時間加温す
る。この試料液２００μｌを試験管（Ｂ）にとり、ｓｏ
ｍＭデオキシコール酸溶液４０μｌを加えて酵素反応を
停止させる。試験管（Ａ）及び（Ｂ）に各々遊離コレス
テロール測定試薬３ｍｌを加え、８７℃、１０分間加温
した後。

５４５ｎｍにおける吸光度を測定する。

同様にして、既知濃度の遊離コレステロールを含有する
標準液及び水を測定し、前述の計算式を用いて活性値を
算出した。

１７− １６− 各実施例１−４で行なった結果を表２に示す。

表２１８− 実施例５゜実施ｆＨのレシチン−コレステロール基質及び遊離コレ
ステロール測定試薬を使用して、血清の代りにＬＯＡＴ
活性既知の血清（Ａ）８容に高ＬＣＡＴ活性を示す既知
の血清（Ｂ）２容を添加し混和した血清（０）を用いて
、実施例３のＬＯＡ　Ｔ活性測定法と同様に操作して測
定し、添加回収率をめた。結果は表８の通りである。

表８ ※回収率のめ方（（０−０，８ＸＡ）１０．２ＸＢ）Ｘ１００　（％）

【図面の簡単な説明】

第１図は経時変化を表したものである。横軸は反応時間
、縦軸は各反応時間での遊離コレステロールの減少量を
５４５ｎｍにおける吸光度変化で表したものである。な
お、」Ｉトは血清にジパルミトイルフメスファチジルコ
リン及ヒコレステロールを添加した場合の測定点、（）
−Ｃ１→ま血清にジパルミトイルフォスファチジルコリ
ンを添加した場合の測定点、↑ｆは血清のみの場合の測
定点である。第２図は検量線である。横軸は各試料中に含まれる血清
の割合、縦軸はＬＯＡＴ活性である。反嵐時間に県の劉合

Claims

【特許請求の範囲】１）　被検体中のレシチンコレステロールアシルトラン
スフ、エラーゼの活性測定法においてポリアニオン糖誘
導体、リゾレシチン、レシチン及びコレステロールと被
検体とを溶媒中で反応させ残存するコレステロール量を
測定することを特徴とするレシチンコレステロールアシ
ルトランスフェラーゼの測定法。うポリアニオン糖誘導体、リゾレシチン、レシチン及び
コレステロールより成ることを特徴とスル被検体中のレ
シチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ測定用
基質。８）測定用基質が液状あるいは凍結乾燥されていること
を特徴とする特許請求の範囲第２項記載のレシチンコレ
ステロールアシルトランスフェラーゼ測定用基質。