JPH08293A - カルシウムイオン測定方法および組成物 - Google Patents
カルシウムイオン測定方法および組成物Info
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- JPH08293A JPH08293A JP13584294A JP13584294A JPH08293A JP H08293 A JPH08293 A JP H08293A JP 13584294 A JP13584294 A JP 13584294A JP 13584294 A JP13584294 A JP 13584294A JP H08293 A JPH08293 A JP H08293A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 被検体を、ホスファチジルグリセロールに作
用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロール
の存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量
に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定して
なるカルシウムイオン測定方法、およびそのカルシウム
イオン測定用組成物である。 【効果】 被検体中のカルシウムイオンの量に応じて変
化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法におい
て、基質としてホスファチジルグリセロールを用いるこ
とにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンやリポ
蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウムイ
オンの測定ができ、かつ測定用組成物を提供できた。
用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロール
の存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量
に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定して
なるカルシウムイオン測定方法、およびそのカルシウム
イオン測定用組成物である。 【効果】 被検体中のカルシウムイオンの量に応じて変
化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法におい
て、基質としてホスファチジルグリセロールを用いるこ
とにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンやリポ
蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウムイ
オンの測定ができ、かつ測定用組成物を提供できた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は被検体中に含まれるカル
シウムイオンの定量法に関する。さらに詳しくは、被検
体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリ
パーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用
せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化す
るホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とす
るカルシウムイオン測定方法およびホスファチジルグリ
セロール、ホスホリパーゼＡ2、リゾホスホリパーゼ、
グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬
を含有するカルシウムイオン測定用組成物に関する。
シウムイオンの定量法に関する。さらに詳しくは、被検
体を、ホスファチジルグリセロールに作用するホスホリ
パーゼ及びホスファチジルグリセロールの存在下に作用
せしめ、被検体中のカルシウムイオン量に応じて変化す
るホスホリパーゼの酵素活性を測定することを特徴とす
るカルシウムイオン測定方法およびホスファチジルグリ
セロール、ホスホリパーゼＡ2、リゾホスホリパーゼ、
グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、グリ
セロール−３−リン酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬
を含有するカルシウムイオン測定用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体成分中のカルシウムイオンの定量法
として、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ
−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏ
ｎｅ；ｏ−ＣＰＣ）法が日常広く用いられている。この
方法はｏ−ＣＰＣがアルカリ性下でカルシウムイオンと
反応して赤紫色の色素を生成するという原理による発色
法であるが、マグネシウムイオンの影響を受けるなど特
異性に欠けること、タンパク質や温度の影響を受けるな
どの欠点がある。
として、ｏ−クレゾールフタレインコンプレクソン（ｏ
−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｏ
ｎｅ；ｏ−ＣＰＣ）法が日常広く用いられている。この
方法はｏ−ＣＰＣがアルカリ性下でカルシウムイオンと
反応して赤紫色の色素を生成するという原理による発色
法であるが、マグネシウムイオンの影響を受けるなど特
異性に欠けること、タンパク質や温度の影響を受けるな
どの欠点がある。
【０００３】そのため、近年、より特異性の高い酵素法
が種々報告されている。これらは、いずれも酵素のカル
シウムイオンによる活性化や阻害作用を利用したもの
で、 （１）ホスホリパーゼＤを用いるものとして例えば特開
昭６２−１９５２９７号公報；レシチン、ホスホリパー
ゼＤ及びコリンオキシダーゼからなる組成物、特開平４
−１８７０９８号公報；コリン系リン脂質、ホスホリパ
ーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属
塩からなる組成物、特開平４−２３９９９号公報；非天
然型ホスフォリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ及び
コリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからな
る組成物。
が種々報告されている。これらは、いずれも酵素のカル
シウムイオンによる活性化や阻害作用を利用したもの
で、 （１）ホスホリパーゼＤを用いるものとして例えば特開
昭６２−１９５２９７号公報；レシチン、ホスホリパー
ゼＤ及びコリンオキシダーゼからなる組成物、特開平４
−１８７０９８号公報；コリン系リン脂質、ホスホリパ
ーゼＤ、コリンオキシダーゼ、界面活性剤及び２価金属
塩からなる組成物、特開平４−２３９９９号公報；非天
然型ホスフォリルコリン誘導体、ホスホリパーゼＤ及び
コリンオキシダーゼ又はコリンデヒドロゲナーゼからな
る組成物。
【０００４】（２）ホスホリパーゼＡ2 を用いるものと
して例えば特開平１−２３１８９６号公報；ホスフォリ
ルコリンチオエステルを基質に用いてホスホリパーゼＡ
2 酵素活性を測定する方法、特開平５−１６８４９８号
公報；基質としてコリンリン脂質またはエタノールアミ
ンリン脂質を用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定
する方法。
して例えば特開平１−２３１８９６号公報；ホスフォリ
ルコリンチオエステルを基質に用いてホスホリパーゼＡ
2 酵素活性を測定する方法、特開平５−１６８４９８号
公報；基質としてコリンリン脂質またはエタノールアミ
ンリン脂質を用いてホスホリパーゼＡ2 酵素活性を測定
する方法。
【０００５】（３）カルモジュリンを用いるものとして
例えば特開昭６２−３６１９９号公報）。 （４）ピルビン酸キナーゼを用いるものとして例えば特
開平２−１４２４９８号公報。 （５）アミラーゼを用いるものとして例えば臨床化学、
１９（補冊）、６９、１９９０年。 （６）トランスアミナーゼを用いるものとして例えば特
開平５−２１９９９２号公報などがある。
例えば特開昭６２−３６１９９号公報）。 （４）ピルビン酸キナーゼを用いるものとして例えば特
開平２−１４２４９８号公報。 （５）アミラーゼを用いるものとして例えば臨床化学、
１９（補冊）、６９、１９９０年。 （６）トランスアミナーゼを用いるものとして例えば特
開平５−２１９９９２号公報などがある。
【０００６】これらの方法において、（３）はカルモジ
ュリンの入手が困難である点、２段階の活性化を利用す
るため反応時間が長いという問題がある。（４）はカル
シウムイオンの阻害作用を利用したものであるため測定
精度に問題点があった。また、（５）は内在性のアミラ
ーゼの影響を受けやすいという点や亜鉛、銅イオン等の
影響を受ける。更に（６）は生成物のひとつであるヒド
ロキサム酸について特異性の高い定量法がないこと、ま
たもう一方の生成物であるアンモニアを定量する場合の
内在性アンモニアによる干渉等の問題がある。
ュリンの入手が困難である点、２段階の活性化を利用す
るため反応時間が長いという問題がある。（４）はカル
シウムイオンの阻害作用を利用したものであるため測定
精度に問題点があった。また、（５）は内在性のアミラ
ーゼの影響を受けやすいという点や亜鉛、銅イオン等の
影響を受ける。更に（６）は生成物のひとつであるヒド
ロキサム酸について特異性の高い定量法がないこと、ま
たもう一方の生成物であるアンモニアを定量する場合の
内在性アンモニアによる干渉等の問題がある。
【０００７】また上記（１）及び（２）はホスホリパー
ゼを用いる方法であるが、これらの測定法で基質として
用いられているレシチン等のコリン系リン脂質やエタノ
ールアミンリン脂質の場合には、これらの基質はいずれ
も水に不溶な界面活性能を有する物質である。従って、
水に溶解性の高い他の界面活性剤等と組合せて可溶化さ
れた混合ミセルとして用いられるが、ホスファチジルグ
リセロールに比べ溶解性が低いため、基質濃度に限界が
あった。
ゼを用いる方法であるが、これらの測定法で基質として
用いられているレシチン等のコリン系リン脂質やエタノ
ールアミンリン脂質の場合には、これらの基質はいずれ
も水に不溶な界面活性能を有する物質である。従って、
水に溶解性の高い他の界面活性剤等と組合せて可溶化さ
れた混合ミセルとして用いられるが、ホスファチジルグ
リセロールに比べ溶解性が低いため、基質濃度に限界が
あった。
【０００８】また、レシチンは細胞膜を構成するリン脂
質として最も含量が多く、通常血液中にもリポ蛋白の成
分として存在するものである。リポ蛋白は、リン脂質や
コレステロール等の水に不溶な成分と蛋白質との複合体
であり、可溶化された状態で血中に存在する。このリン
脂質の約７０％がレシチンであり、この影響により正確
な測定が妨げられるという欠点を有する。
質として最も含量が多く、通常血液中にもリポ蛋白の成
分として存在するものである。リポ蛋白は、リン脂質や
コレステロール等の水に不溶な成分と蛋白質との複合体
であり、可溶化された状態で血中に存在する。このリン
脂質の約７０％がレシチンであり、この影響により正確
な測定が妨げられるという欠点を有する。
【０００９】更に、リポ蛋白中に存在するコレステロー
ルは、レシチンと複合体を形成することが知られてお
り、医薬、化粧品、食品分野等でレシチン−コレステロ
ール複合体として様々に利用されていることからわかる
ようにレシチンに対する親和性が強く、特に検体が血液
の場合には、大きな影響を与える。コレステロールはそ
のエステル型も合わせ、通常、低密度リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）では約４５％、また高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）にも
約３０％含まれており、しかもこの含量には大きな個体
差が認められるので個々の検体により影響の度合が異な
り正確な測定をなし得ない。
ルは、レシチンと複合体を形成することが知られてお
り、医薬、化粧品、食品分野等でレシチン−コレステロ
ール複合体として様々に利用されていることからわかる
ようにレシチンに対する親和性が強く、特に検体が血液
の場合には、大きな影響を与える。コレステロールはそ
のエステル型も合わせ、通常、低密度リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）では約４５％、また高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）にも
約３０％含まれており、しかもこの含量には大きな個体
差が認められるので個々の検体により影響の度合が異な
り正確な測定をなし得ない。
【００１０】これらの種々の問題点を改良するために、
上記した非天然型ホスフォリルコリン誘導体を基質と
し、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリ
ンデヒドロゲナーゼからなる組成物及び測定法が報告さ
れている（特開平４−２３９９９号公報）。この方法は
従来のレシチン基質の代わりに水に対する溶解性を改善
するため非天然型とした合成ホスホリルコリン誘導体を
基質に用い、ホスホリパーゼＤを作用させる方法である
が、水に対する溶解性を改善した基質であることから天
然に存在しないものであり、従って合成が必要である点
で実用性に欠け、さらに内在性基質の影響を受けるもの
であった。
上記した非天然型ホスフォリルコリン誘導体を基質と
し、ホスホリパーゼＤ及びコリンオキシダーゼ又はコリ
ンデヒドロゲナーゼからなる組成物及び測定法が報告さ
れている（特開平４−２３９９９号公報）。この方法は
従来のレシチン基質の代わりに水に対する溶解性を改善
するため非天然型とした合成ホスホリルコリン誘導体を
基質に用い、ホスホリパーゼＤを作用させる方法である
が、水に対する溶解性を改善した基質であることから天
然に存在しないものであり、従って合成が必要である点
で実用性に欠け、さらに内在性基質の影響を受けるもの
であった。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホスホリパ
ーゼのカルシウムイオンによる活性化反応に基づくカル
シウムイオン測定法に関するものである。更に詳しく
は、溶解性に優れた基質を用いることにより、精度の高
い測定法を、また被検体に内在する成分の影響を受けな
い正確な測定法を提供するものである。
ーゼのカルシウムイオンによる活性化反応に基づくカル
シウムイオン測定法に関するものである。更に詳しく
は、溶解性に優れた基質を用いることにより、精度の高
い測定法を、また被検体に内在する成分の影響を受けな
い正確な測定法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】これまでにホスホリパー
ゼＡ2 またはホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオ
ン測定法は種々報告されているが前述のように種々の問
題があった。そこで本発明者らはこのような点に鑑み、
調製が簡単でより実用的なカルシウムイオン測定試薬を
提供することを目的に鋭意検討した結果、ホスホリパー
ゼの基質としてレシチンに比べ溶解性の高いホスファチ
ジルグリセロールを基質に用い、ホスファチジルグリセ
ロールに作用するホスホリパーゼを用いることにより、
被検体に内在する成分の影響を受けることなくより正確
にカルシウムイオンが定量できることを見い出した。
ゼＡ2 またはホスホリパーゼＤを用いたカルシウムイオ
ン測定法は種々報告されているが前述のように種々の問
題があった。そこで本発明者らはこのような点に鑑み、
調製が簡単でより実用的なカルシウムイオン測定試薬を
提供することを目的に鋭意検討した結果、ホスホリパー
ゼの基質としてレシチンに比べ溶解性の高いホスファチ
ジルグリセロールを基質に用い、ホスファチジルグリセ
ロールに作用するホスホリパーゼを用いることにより、
被検体に内在する成分の影響を受けることなくより正確
にカルシウムイオンが定量できることを見い出した。
【００１３】この知見におけるひとつの特徴は、基質濃
度を従来に比べ高く設定する事ができるため過剰量の基
質という酵素反応にとって理想的な条件設定が可能にな
ったということである。このような条件下ではその測定
値は、多少の基質の変動による影響を受けないため、よ
り精度の高い測定が可能となる。また他の特徴は、ホス
ファチジルグリセロールが血清や尿等の生体成分にほと
んど存在しない物質であるため、レシチンを用いたとき
のような内在性基質の影響を受けない点が挙げられる。
さらに本発明者らは意外にもホスファチジルグリセロー
ルを基質に用いた場合、内在性リポ蛋白の影響を殆ど受
けないということを見出し本発明を完成するに至った。
度を従来に比べ高く設定する事ができるため過剰量の基
質という酵素反応にとって理想的な条件設定が可能にな
ったということである。このような条件下ではその測定
値は、多少の基質の変動による影響を受けないため、よ
り精度の高い測定が可能となる。また他の特徴は、ホス
ファチジルグリセロールが血清や尿等の生体成分にほと
んど存在しない物質であるため、レシチンを用いたとき
のような内在性基質の影響を受けない点が挙げられる。
さらに本発明者らは意外にもホスファチジルグリセロー
ルを基質に用いた場合、内在性リポ蛋白の影響を殆ど受
けないということを見出し本発明を完成するに至った。
【００１４】本発明は、上記の知見に基づいて完成され
たもので、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作
用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロール
の存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量
に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する
ことを特徴とするカルシウムイオン測定方法、およびホ
スファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾ
ホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエ
ステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、
過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組
成物である。
たもので、被検体を、ホスファチジルグリセロールに作
用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロール
の存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオン量
に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する
ことを特徴とするカルシウムイオン測定方法、およびホ
スファチジルグリセロール、ホスホリパーゼＡ2 、リゾ
ホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホジエ
ステラーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、
過酸化水素指示薬を含有するカルシウムイオン測定用組
成物である。
【００１５】本発明の被検体としては、一般的にはその
測定対象の性質上、生体成分である場合が多い。生体成
分の例としては生体体液、食品などが挙げられ、例えば
血清、血漿、涙液、唾液や尿、牛乳、骨髄、乳製品など
が挙げられる。これら被検体は、一般に１μｌ〜５００
μｌ、好ましくは３μｌ〜１００μｌの適宜な量を用い
ればよい。
測定対象の性質上、生体成分である場合が多い。生体成
分の例としては生体体液、食品などが挙げられ、例えば
血清、血漿、涙液、唾液や尿、牛乳、骨髄、乳製品など
が挙げられる。これら被検体は、一般に１μｌ〜５００
μｌ、好ましくは３μｌ〜１００μｌの適宜な量を用い
ればよい。
【００１６】本発明に用いる基質であるホスファチジル
グリセロールは、簡便には市販の試薬を用いればよく、
それらは一般的には１位は飽和、２位は飽和または不飽
和であり脂肪酸残基の炭素数がＣ8 〜Ｃ24であるが、使
用するホスホリパーゼが作用し得る、即ち基質となり得
るものであることが必要である。
グリセロールは、簡便には市販の試薬を用いればよく、
それらは一般的には１位は飽和、２位は飽和または不飽
和であり脂肪酸残基の炭素数がＣ8 〜Ｃ24であるが、使
用するホスホリパーゼが作用し得る、即ち基質となり得
るものであることが必要である。
【００１７】好ましくはホスファチジルグリセロールの
１位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和脂肪酸残基、２位が炭素
数Ｃ12〜Ｃ20の飽和または不飽和脂肪酸残基で示される
もので、特に好適には例えばジミリストイルホスファチ
ジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリ
セロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロー
ル、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジル
グリセロール等の単独または混合物が挙げられ、また例
えば、卵黄レシチンよりその塩基交換反応により作られ
たものや、ジミリストイルホスファチジルグリセロー
ル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジス
テアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオ
イル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の
合成ホスファチジルグリセロールが挙げられる。
１位が炭素数Ｃ12〜Ｃ20の飽和脂肪酸残基、２位が炭素
数Ｃ12〜Ｃ20の飽和または不飽和脂肪酸残基で示される
もので、特に好適には例えばジミリストイルホスファチ
ジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリ
セロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロー
ル、１−リノレオイル−２−オレオイルホスファチジル
グリセロール等の単独または混合物が挙げられ、また例
えば、卵黄レシチンよりその塩基交換反応により作られ
たものや、ジミリストイルホスファチジルグリセロー
ル、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジス
テアロイルホスファチジルグリセロール、１−リノレオ
イル−２−オレオイルホスファチジルグリセロール等の
合成ホスファチジルグリセロールが挙げられる。
【００１８】また、ホスファチジルグリセロールに作用
するホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ2 （Ｅ
Ｃ３．１．１．４）またはホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．
１．４．４）が挙げられ、ホスホリパーゼＡ2 を用いる
場合にはホスホリパーゼＡ2の酵素活性を測定し、また
ホスホリパーゼＤを用いる場合にはホスホリパーゼＤの
酵素活性を測定して、目的とするカルシウムイオンの測
定を行うものである。
するホスホリパーゼとしては、ホスホリパーゼＡ2 （Ｅ
Ｃ３．１．１．４）またはホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．
１．４．４）が挙げられ、ホスホリパーゼＡ2 を用いる
場合にはホスホリパーゼＡ2の酵素活性を測定し、また
ホスホリパーゼＤを用いる場合にはホスホリパーゼＤの
酵素活性を測定して、目的とするカルシウムイオンの測
定を行うものである。
【００１９】このうちホスホリパーゼＡ2 は基質である
ホスファチジルグリセロールを含むジアシルグリセロリ
ン脂質の２位の脂肪酸エステル結合の加水分解を触媒す
る酵素であり、ヘビ毒、ハチ毒、ブタすい臓（臨床酵素
ハンドブック、第６０７頁、講談社、１９８２年）やス
トレプトマイセス属などに存在が知られている。
ホスファチジルグリセロールを含むジアシルグリセロリ
ン脂質の２位の脂肪酸エステル結合の加水分解を触媒す
る酵素であり、ヘビ毒、ハチ毒、ブタすい臓（臨床酵素
ハンドブック、第６０７頁、講談社、１９８２年）やス
トレプトマイセス属などに存在が知られている。
【００２０】例えばストレプトマイセス属由来のホスホ
リパーゼＡ2 （旭化成工業（株）製、カタロクナンバ
ー：Ｔ−３１）を用いた場合、ホスファチジルグリセロ
ールを基質に用いることにより、レシチンを基質に用い
た場合に比べ、本発明の効果に加え、その反応性が格段
にすぐれており、より少量の酵素でカルシウムイオンの
定量が可能であること、また、定量域においてもレシチ
ン基質の場合よりも広いことが示された。また、ブタす
い臓、ハチ毒由来の酵素についても、レシチンを用いた
ときに比べ、必要な酵素量が格段に少なくてすむことが
確認された。
リパーゼＡ2 （旭化成工業（株）製、カタロクナンバ
ー：Ｔ−３１）を用いた場合、ホスファチジルグリセロ
ールを基質に用いることにより、レシチンを基質に用い
た場合に比べ、本発明の効果に加え、その反応性が格段
にすぐれており、より少量の酵素でカルシウムイオンの
定量が可能であること、また、定量域においてもレシチ
ン基質の場合よりも広いことが示された。また、ブタす
い臓、ハチ毒由来の酵素についても、レシチンを用いた
ときに比べ、必要な酵素量が格段に少なくてすむことが
確認された。
【００２１】本発明においては、ホスホリパーゼの酵素
活性が測定されるが、ホスホリパーゼＡ2 の酵素活性の
測定につき例示的に説明すると、ホスホリパーゼＡ2 を
酵素に用いる場合の反応生成物のひとつであるリゾホス
ファチジルグリセロールをリゾホスホリパーゼ（ＥＣ
３．１．１．５）（ＬＹＰＬ）及びグリセロホスホリル
コリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．２）
（ＧＰＣＰ）の作用によりグリセロール−３−リン酸を
生成せしめ、このグリセロール−３−リン酸を公知の定
量手段、好適にはグリセロール−３−リン酸オキシダー
ゼ（ＥＣ１．１．３．２１、例えば旭化成工業（株）
製、カタロクナンバー：Ｔ−１５、Ｔ−４０）（ＧＰ
Ｏ）の作用により、酸素を消費し、ジヒドロキシアセト
ンリン酸および過酸化水素を形成せしめばよい。
活性が測定されるが、ホスホリパーゼＡ2 の酵素活性の
測定につき例示的に説明すると、ホスホリパーゼＡ2 を
酵素に用いる場合の反応生成物のひとつであるリゾホス
ファチジルグリセロールをリゾホスホリパーゼ（ＥＣ
３．１．１．５）（ＬＹＰＬ）及びグリセロホスホリル
コリンホスホジエステラーゼ（ＥＣ ３．１．４．２）
（ＧＰＣＰ）の作用によりグリセロール−３−リン酸を
生成せしめ、このグリセロール−３−リン酸を公知の定
量手段、好適にはグリセロール−３−リン酸オキシダー
ゼ（ＥＣ１．１．３．２１、例えば旭化成工業（株）
製、カタロクナンバー：Ｔ−１５、Ｔ−４０）（ＧＰ
Ｏ）の作用により、酸素を消費し、ジヒドロキシアセト
ンリン酸および過酸化水素を形成せしめばよい。
【００２２】この反応形式を以下に示す。 ホスファチジルグリセロール＋Ｈ2 Ｏ→リゾホスファチジルグリセロール＋脂 （ホスホリパーゼＡ2 ） 肪酸 リゾホスファチジルグリセロール＋Ｈ2 Ｏ→グリセロホスホリルグリセロール （ＬＹＰＬ） ＋脂肪酸 グリセロホスホリルグリセロール＋Ｈ2 Ｏ→グリセロール−３−リン酸＋グリ （ＧＰＣＰ） セロール グリセロール−３−リン酸＋Ｏ2 →ジヒドロキシアセトンリン酸＋Ｈ2 Ｏ2 （ＧＰＯ）
【００２３】次いで、この反応において、例えば消費さ
れた酸素を酸素電極で定量するか、形成された過酸化水
素を過酸化水素電極や過酸化水素指示薬、例えばカプラ
ーとして４−アミノアンチピリン、また水素供与体とし
てフェノ−ル、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナト
リウム、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−アニシジン等の色原体及びペルオキシダーゼ（ＥＣ
１．１１．１．７）、蛍光基質や発光基質、例えばフェ
ニルチオヒダントイン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキ
シフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール、イソルミノ
ール、ルシゲニン等の発光基質を、必要に応じて水素供
与体、ペルオキシダーゼの存在下に作用せしめて過酸化
水素を定量すればよく、例えば過酸化水素指示薬を用い
た場合には反応によって形成された色素を分光光度計を
用いて適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることによ
り容易に定量でき、また蛍光基質や発光基質を用いた場
合には蛍光光度計または発光検出器により定量すればよ
い。
れた酸素を酸素電極で定量するか、形成された過酸化水
素を過酸化水素電極や過酸化水素指示薬、例えばカプラ
ーとして４−アミノアンチピリン、また水素供与体とし
てフェノ−ル、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンナト
リウム、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ
−アニシジン等の色原体及びペルオキシダーゼ（ＥＣ
１．１１．１．７）、蛍光基質や発光基質、例えばフェ
ニルチオヒダントイン、ホモバニリン酸、４−ヒドロキ
シフェニル酢酸等の蛍光基質、ルミノール、イソルミノ
ール、ルシゲニン等の発光基質を、必要に応じて水素供
与体、ペルオキシダーゼの存在下に作用せしめて過酸化
水素を定量すればよく、例えば過酸化水素指示薬を用い
た場合には反応によって形成された色素を分光光度計を
用いて適宜その吸収波長域にて吸光度を求めることによ
り容易に定量でき、また蛍光基質や発光基質を用いた場
合には蛍光光度計または発光検出器により定量すればよ
い。
【００２４】前記した反応で用いられるリゾホスホリパ
ーゼについては実質的にホスファチジルグリセロールに
作用しないものであれば特に限定はされず、動物、植
物、微生物等の起源より取得することができる。微生物
由来の酵素としては、ビブリオ属由来の酵素（旭化成工
業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３２）が適してい
る。またグリセロホスホリルコリンホスホジエステラー
ゼも同様に特に限定はされず例えばグリオクラディウム
属の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ
−３３）等が利用できる。これらの酵素については適
宜、基質特異性を確認したのち使用すればよい。
ーゼについては実質的にホスファチジルグリセロールに
作用しないものであれば特に限定はされず、動物、植
物、微生物等の起源より取得することができる。微生物
由来の酵素としては、ビブリオ属由来の酵素（旭化成工
業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−３２）が適してい
る。またグリセロホスホリルコリンホスホジエステラー
ゼも同様に特に限定はされず例えばグリオクラディウム
属の酵素（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ
−３３）等が利用できる。これらの酵素については適
宜、基質特異性を確認したのち使用すればよい。
【００２５】また、本発明において用いられるホスホリ
パーゼＤについては、その由来を含め特に限定はされる
ものではない。ホスホリパーゼＤはレシチンのコリン−
リン酸エステル結合を加水分解する触媒作用を有し、さ
らにホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルグリセロール等のグリセロリン
脂質にも作用する酵素であるが、その起源としては例え
ば、キャベツ、ニンジン、ラット脳などの動植物由来
（酵素ハンドブック、第４５１頁、朝倉書店、１９８３
年）、ストレプトマイセス・クロモファスカスなどの微
生物由来のものが挙げられる。
パーゼＤについては、その由来を含め特に限定はされる
ものではない。ホスホリパーゼＤはレシチンのコリン−
リン酸エステル結合を加水分解する触媒作用を有し、さ
らにホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルグリセロール等のグリセロリン
脂質にも作用する酵素であるが、その起源としては例え
ば、キャベツ、ニンジン、ラット脳などの動植物由来
（酵素ハンドブック、第４５１頁、朝倉書店、１９８３
年）、ストレプトマイセス・クロモファスカスなどの微
生物由来のものが挙げられる。
【００２６】例えば、ストレプトマイセス クロモファ
スカス（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−
０７）を用いた場合、酵素の使用量はレシチン基質のと
きに比べ多く必要とするが、内在性成分の影響に関して
の効果は、ホスホリパーゼＡ 2 の場合と同等以上であっ
た。
スカス（旭化成工業（株）製、カタログナンバー：Ｔ−
０７）を用いた場合、酵素の使用量はレシチン基質のと
きに比べ多く必要とするが、内在性成分の影響に関して
の効果は、ホスホリパーゼＡ 2 の場合と同等以上であっ
た。
【００２７】本発明においてホスホリパーゼとしてホス
ホリパーゼＤを使用する場合、ホスホリパーゼＤの酵素
活性が測定される。この場合、被検体中のカルシウムイ
オンとホスファチジルグリセロールの存在下にてホスホ
リパーゼＤの酵素活性が発現して生成される反応生成物
はホスファチジン酸およびグリセロールである。従っ
て、このホスホリパーゼＤの酵素活性の測定に当たって
は、反応生成物であるホスファチジン酸またはグリセロ
ールを公知の方法により測定すればよい。
ホリパーゼＤを使用する場合、ホスホリパーゼＤの酵素
活性が測定される。この場合、被検体中のカルシウムイ
オンとホスファチジルグリセロールの存在下にてホスホ
リパーゼＤの酵素活性が発現して生成される反応生成物
はホスファチジン酸およびグリセロールである。従っ
て、このホスホリパーゼＤの酵素活性の測定に当たって
は、反応生成物であるホスファチジン酸またはグリセロ
ールを公知の方法により測定すればよい。
【００２８】例えばグリセロールを定量する場合は、Ａ
ＴＰの存在下グリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．
３０、例えば旭化成工業（株）製、カタログナンバー：
Ｔ−０９）を用いればグリセロール−３−リン酸に転換
されるので、このグリセロール−３−リン酸を前述の方
法により簡単に定量することができる。
ＴＰの存在下グリセロールキナーゼ（ＥＣ２．７．１．
３０、例えば旭化成工業（株）製、カタログナンバー：
Ｔ−０９）を用いればグリセロール−３−リン酸に転換
されるので、このグリセロール−３−リン酸を前述の方
法により簡単に定量することができる。
【００２９】本発明のカルシウムイオン測定法におい
て、基質に用いるホスファチジルグリセロール濃度は
０．２〜２０ｍＭ、特に０．８〜４ｍＭが好ましい。ま
たホスホリパーゼの使用量は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ
が適切であるが、ホスホリパ−ゼＡ2 を用いる場合は
０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ、特に０．１〜２．５ｕ／ｍ
ｌが好ましく、ホスホリパーゼＤを用いる場合は０．０
３〜８ｕ／ｍｌ、特に０．０８〜２ｕ／ｍｌが好まし
い。
て、基質に用いるホスファチジルグリセロール濃度は
０．２〜２０ｍＭ、特に０．８〜４ｍＭが好ましい。ま
たホスホリパーゼの使用量は０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ
が適切であるが、ホスホリパ−ゼＡ2 を用いる場合は
０．０２５〜１０ｕ／ｍｌ、特に０．１〜２．５ｕ／ｍ
ｌが好ましく、ホスホリパーゼＤを用いる場合は０．０
３〜８ｕ／ｍｌ、特に０．０８〜２ｕ／ｍｌが好まし
い。
【００３０】ＬＹＰＬは１．０〜２０ｕ ／ｍｌ、特に
２〜１０ｕ／ｍｌが好ましく、ＧＰＣＰは０．０２〜５
ｕ／ｍｌ、特に０．１〜１ｕ／ｍｌが好ましく、グリセ
ロール−３−リン酸オキシダーゼは１０〜２００ｕ／ｍ
ｌ、特に２０〜１００ｕ／ｍｌが好ましい。また過酸化
水素指示薬についてペルオキシダーゼは２〜５０ｕ／ｍ
ｌ、特に４〜２５ｕ／ｍｌが好ましく、色原体は０．２
〜３０ｍＭを用いればよい。
２〜１０ｕ／ｍｌが好ましく、ＧＰＣＰは０．０２〜５
ｕ／ｍｌ、特に０．１〜１ｕ／ｍｌが好ましく、グリセ
ロール−３−リン酸オキシダーゼは１０〜２００ｕ／ｍ
ｌ、特に２０〜１００ｕ／ｍｌが好ましい。また過酸化
水素指示薬についてペルオキシダーゼは２〜５０ｕ／ｍ
ｌ、特に４〜２５ｕ／ｍｌが好ましく、色原体は０．２
〜３０ｍＭを用いればよい。
【００３１】さらに反応媒体として、例えばトリス緩衝
液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳやＨＥＰＥＳ等のグッド
の緩衝液などを例えばｐＨ６．５〜８．５に適宜調整し
て使用すればよい。さらに可溶化助剤として、例えば非
イオン界面活性剤、例えばアルキル アリル ポリエー
テル アルコール（オクチル フェノキシ ポリエトキ
シエタノール、商品名；トリトン Ｘ−１００）を０．
０５〜５％添加してもよい。
液、リン酸緩衝液、ＰＩＰＥＳやＨＥＰＥＳ等のグッド
の緩衝液などを例えばｐＨ６．５〜８．５に適宜調整し
て使用すればよい。さらに可溶化助剤として、例えば非
イオン界面活性剤、例えばアルキル アリル ポリエー
テル アルコール（オクチル フェノキシ ポリエトキ
シエタノール、商品名；トリトン Ｘ−１００）を０．
０５〜５％添加してもよい。
【００３２】このようにして調製された上記した諸成分
組成からなる反応試薬について、例えば１テスト当り反
応試薬０．５〜１ｍｌを用い、これに被検体を添加し、
３７℃で加温し、例えば２分間以上で１０分間以内、好
ましくは５分間以内のホスホリパーゼによる反応を行
い、その後簡便には例えば反応で形成された色素を適宜
その吸収波長域にて吸光度を求めることにより定量すれ
ばよい。これらホスホリパーゼ反応によりホスファチジ
ルグリセロールから生成した物質の定量は、ホスホリパ
ーゼ反応と同時に行ってもよく、または逐次的に行うこ
ともできる。好適にはこの反応の一定時間内の色素の生
成速度として定量すればよい。
組成からなる反応試薬について、例えば１テスト当り反
応試薬０．５〜１ｍｌを用い、これに被検体を添加し、
３７℃で加温し、例えば２分間以上で１０分間以内、好
ましくは５分間以内のホスホリパーゼによる反応を行
い、その後簡便には例えば反応で形成された色素を適宜
その吸収波長域にて吸光度を求めることにより定量すれ
ばよい。これらホスホリパーゼ反応によりホスファチジ
ルグリセロールから生成した物質の定量は、ホスホリパ
ーゼ反応と同時に行ってもよく、または逐次的に行うこ
ともできる。好適にはこの反応の一定時間内の色素の生
成速度として定量すればよい。
【００３３】本発明の測定用組成物の調製に当たって
は、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に
分けた場合には、それら各成分を適宜組み合わせること
もできる。吸光度の測定は分光光度計のみならず、臨床
検査室でもよく用いられている自動分析機を用いて連続
測定にも適応できる。
は、反応試薬は一つまたは二つ以上に分け、二つ以上に
分けた場合には、それら各成分を適宜組み合わせること
もできる。吸光度の測定は分光光度計のみならず、臨床
検査室でもよく用いられている自動分析機を用いて連続
測定にも適応できる。
【００３４】
【実施例】次いで、本発明を実施例にて説明するが、本
発明は何らこれらによって限定されるものではない。 実施例１ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス由来）による
カルシウムイオンの定量）
発明は何らこれらによって限定されるものではない。 実施例１ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイセス由来）による
カルシウムイオンの定量）
【００３５】＜試薬１＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．２％トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００） ５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエ
ステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
ル（日本精化（株）製） ０．２％トリトン Ｘ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００） ５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジエ
ステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
【００３６】＜試薬２＞ ３００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） １０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマ
イセス属由来、旭化成工業（株）製、カタログナンバ
ー：Ｔ−３１） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
イセス属由来、旭化成工業（株）製、カタログナンバ
ー：Ｔ−３１） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００３７】〔操作〕上記試薬１を１．５ｍｌずつ分注
し、０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０ｍＭ
の塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌを添加し、３７℃
にて５分間予備加温した。その後、試薬２を０．５ｍｌ
加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡し
た。試薬２添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、
その差を求めた。被検液の代わりに、水を用いたものを
試薬ブランクとして同様の操作を行い、各々の計算値よ
り差し引き、その結果を図１に示した。図１から明らか
なように、吸光度変化量は塩化カルシウム濃度に対し、
良好な直線性を示した。
し、０、０．４、０．８、１．２、１．６、２．０ｍＭ
の塩化カルシウム水溶液０．０５ｍｌを添加し、３７℃
にて５分間予備加温した。その後、試薬２を０．５ｍｌ
加え、３７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡し
た。試薬２添加後の３分目、４分目の吸光度を測定し、
その差を求めた。被検液の代わりに、水を用いたものを
試薬ブランクとして同様の操作を行い、各々の計算値よ
り差し引き、その結果を図１に示した。図１から明らか
なように、吸光度変化量は塩化カルシウム濃度に対し、
良好な直線性を示した。
【００３８】実施例２ 実施例１使用の酵素に対して、ホスファチジルグリセロ
ールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レ
シチン）を用いた場合の添加回収率の比較
ールを基質に用いた場合と、ホスファチジルコリン（レ
シチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００３９】＜試薬１Ａ＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．３％ トリトン Ｘ−１００ ３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
ル（日本精化（株）製） ０．３％ トリトン Ｘ−１００ ３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
【００４０】＜試薬２Ａ＞ ２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） １０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ０．４８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマ
イセス属由来、旭化成工業（株）製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
イセス属由来、旭化成工業（株）製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４１】＜試薬１Ｂ＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．３３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン
（日本精化（株）製） ０．２７％ トリトン Ｘ−１００ ３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
（日本精化（株）製） ０．２７％ トリトン Ｘ−１００ ３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．１３ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ２ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業（株）
製）
【００４２】＜試薬２Ｂ＞ ２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．８） １０ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２．４ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ストレプトマイ
セス属由来、旭化成工業（株）製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
セス属由来、旭化成工業（株）製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ
【００４３】〔操作〕精度管理用凍結乾燥プール血清
（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対し
て、０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々
の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌず
つ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試
薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの
吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、４分
目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検試料の代わ
りに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を
行い、各々の計算値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシ
ウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換
算し、その添加回収率を求めた。
（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対し
て、０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液１容を混合し、添加回収用の試料とした。各々
の試料５０μｌに対して、上記試薬１Ａを１．５ｍｌず
つ分注し、３７℃にて５分間予備加温した。その後、試
薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３７℃において５４６ｎｍの
吸光度変化を追跡した。試薬２Ａ添加後の３分目、４分
目の吸光度を測定し、その差を求めた。被検試料の代わ
りに、水を用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を
行い、各々の計算値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシ
ウム水溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換
算し、その添加回収率を求めた。
【００４４】ホスファチジルグリセロールの代わりにレ
シチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同
様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は
表１に示した。
シチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同
様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は
表１に示した。
【００４５】
【表１】
【００４６】表１から明らかなように、ホスファチジル
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９６％
〜１０３％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、
７６％〜８１％と添加回収率が悪かった。
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９６％
〜１０３％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、
７６％〜８１％と添加回収率が悪かった。
【００４７】実施例３ 血清のカルシウムイオン測定へ及ぼす影響 反応液は上記の実施例２と同じものを使用した。 〔操作〕脂質検査用管理血清（商品名：リピッドコンセ
ーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて
５段階希釈した。この０〜１００％のリピッドコンセー
ラ９容に対し、（１）生理食塩水１容を混合したもの、
（２）５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合したも
の、を調製し試料とした。操作は、前記実施例２のとお
り、ホスファチジルグリセロールを用いたとき（表
２）、レシチンを用いたとき（表３）両方につき実施
し、結果を同様に濃度換算した。
ーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生理食塩水にて
５段階希釈した。この０〜１００％のリピッドコンセー
ラ９容に対し、（１）生理食塩水１容を混合したもの、
（２）５０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合したも
の、を調製し試料とした。操作は、前記実施例２のとお
り、ホスファチジルグリセロールを用いたとき（表
２）、レシチンを用いたとき（表３）両方につき実施
し、結果を同様に濃度換算した。
【００４８】夫々のリピッドコンセーラ濃度について、
塩化カルシウム添加試料の値から塩化カルシウム無添加
の値を差し引いた。この値から、リピッドコンセーラ０
の時を１００％として、５ｍＭ塩化カルシウムの回収率
を計算し、各々の表２、表３に示した。レシチンを基質
に用いた場合は、リピッドコンセーラ量の増加に従い、
回収率が顕著に低下するのに対して、ホスファチジルグ
リセロールを用いた場合は殆ど影響を受けていないこと
が示された。
塩化カルシウム添加試料の値から塩化カルシウム無添加
の値を差し引いた。この値から、リピッドコンセーラ０
の時を１００％として、５ｍＭ塩化カルシウムの回収率
を計算し、各々の表２、表３に示した。レシチンを基質
に用いた場合は、リピッドコンセーラ量の増加に従い、
回収率が顕著に低下するのに対して、ホスファチジルグ
リセロールを用いた場合は殆ど影響を受けていないこと
が示された。
【００４９】
【表２】
【００５０】
【表３】
【００５１】実施例４ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来）を用いた場合の添加
回収率の比較 ＜試薬１Ａ＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．２４％ トリトン Ｘ−１００ ３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業
（株）製）
回収率の比較 ＜試薬１Ａ＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．２４％ トリトン Ｘ−１００ ３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業
（株）製）
【００５２】＜試薬２Ａ＞ ２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．２％ ４−アミノアンチピリン ０．６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノ
ボ・ノルディスク社製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．２Ｍ ＮａＣｌ
ボ・ノルディスク社製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５３】＜試薬１Ｂ＞ ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０） １．６７ｍＭ ＴＯＯＳ（（株）同仁化学研究所製） １．２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日
本精化（株）製） ０．２４％ トリトン Ｘ−１００ ３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業
（株）製）
本精化（株）製） ０．２４％ トリトン Ｘ−１００ ３．３３ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ２７ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．２６ｕ／ｍｌ グリセロホスホリルコリンホスホジ
エステラーゼ（旭化成工業（株）製） ５．２４ｕ／ｍｌ リゾホスホリパーゼ（旭化成工業
（株）製）
【００５４】＜試薬２Ｂ＞ ２５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．２％ ４−アミノアンチピリン ２８ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＡ2 （ブタ膵由来、ノボ
・ノルディスク社製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．２Ｍ ＮａＣｌ
・ノルディスク社製） １８ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ０．２Ｍ ＮａＣｌ
【００５５】〔操作〕精度管理用凍結乾燥プール血清
（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対し
て、０、１０、２０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合
し、添加回収用の試料とした。おのおのの試料２５μｌ
に対して上記試薬１Ａを０．７５ｍｌずつ分注し、３７
℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．２
５ｍｌ加え、３７℃において５分間加熱した。反応停止
液として０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを加え、５４６ｎｍ
の吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いた
ものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定
値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準
液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回
収率を求めた。
（商品名：コンセーラ（日水製薬（株））９容に対し
て、０、１０、２０ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合
し、添加回収用の試料とした。おのおのの試料２５μｌ
に対して上記試薬１Ａを０．７５ｍｌずつ分注し、３７
℃にて５分間予備加温した。その後、試薬２Ａを０．２
５ｍｌ加え、３７℃において５分間加熱した。反応停止
液として０．５％ＳＤＳ溶液２ｍｌを加え、５４６ｎｍ
の吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を用いた
ものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の測定
値より差し引いた。２ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準
液として用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回
収率を求めた。
【００５６】ホスファチジルグリセロールの代わりにレ
シチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同
様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は
表４に示した。
シチンを用いた試薬１Ｂと試薬２Ｂの組み合わせで 同
様の操作を行い、添加回収率を求めた。これらの結果は
表４に示した。
【００５７】
【表４】
【００５８】表４から明らかなように、ホスファチジル
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９７％
〜１０７％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、
５９％〜６２％と添加回収率が悪かった。
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９７％
〜１０７％と良好であるのに対し、レシチンの場合は、
５９％〜６２％と添加回収率が悪かった。
【００５９】実施例５ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイセス・クロモファス
カス由来）によるカルシウムイオンの定量 ＜反応液＞ ４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２ｍＭ ＡＴＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．３％ トリトン Ｘ−１００ ９ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ３８ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業
（株）製） ０．０３％ ４−アミノアンチピリン ０．０２％ フェノール ０．３２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイ
セス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
カス由来）によるカルシウムイオンの定量 ＜反応液＞ ４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２ｍＭ ＡＴＰ ２ｍＭ ＭｇＣｌ2 １．５ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロー
ル（日本精化（株）製） ０．３％ トリトン Ｘ−１００ ９ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ３８ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業
（株）製） ０．０３％ ４−アミノアンチピリン ０．０２％ フェノール ０．３２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイ
セス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６０】〔操作〕上記反応液を１ｍｌずつ分注し３
７℃にて予備加温する．０、０．０５、０．１、０．
２、０．２５、０．５ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．
０５ｍｌをそれぞれ添加し３７℃にて正確に５分間反応
させた。０．５％ＳＤＳ（１０ｍＭＥＤＴＡを含む）を
２ｍｌ加え反応を停止し、５００ｎｍの吸光度を測定し
た。、その結果を図２に示した。図２から明らかなよう
に、吸光度変化量は、塩化カルシウム濃度に対し、良好
な直線性を示した。
７℃にて予備加温する．０、０．０５、０．１、０．
２、０．２５、０．５ｍＭの塩化カルシウム水溶液０．
０５ｍｌをそれぞれ添加し３７℃にて正確に５分間反応
させた。０．５％ＳＤＳ（１０ｍＭＥＤＴＡを含む）を
２ｍｌ加え反応を停止し、５００ｎｍの吸光度を測定し
た。、その結果を図２に示した。図２から明らかなよう
に、吸光度変化量は、塩化カルシウム濃度に対し、良好
な直線性を示した。
【００６１】実施例６ 実施例５使用のホスホリパーゼＤに対して、ホスファチ
ジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジ
ルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
ジルグリセロールを基質に用いた場合と、ホスファチジ
ルコリン（レシチン）を用いた場合の添加回収率の比較
【００６２】＜試薬１Ａ＞ ４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ２．７ｍＭ ＡＴＰ ２．７ｍＭ ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
（日本精化（株）製） ０．４％ トリトン Ｘ−１００ １２ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ５０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業
（株）製） ０．０２７％ フェノール
（日本精化（株）製） ０．４％ トリトン Ｘ−１００ １２ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ５０ｕ／ｍｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ
（旭化成工業（株）製） ０．３ｕ／ｍｌ グリセロールキナーゼ（旭化成工業
（株）製） ０．０２７％ フェノール
【００６３】＜試薬２Ａ＞ ４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５） ０．１２％ ４−アミノアンチピリン ０．２６ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマイ
セス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
セス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６４】＜試薬１Ｂ＞ ４０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ３ｍＭ ジパルミトイルホスファチジルコリン（日本精
化（株）製） ０．６％ トリトン Ｘ−１００ ０．０５２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマ
イセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
化（株）製） ０．６％ トリトン Ｘ−１００ ０．０５２ｕ／ｍｌ ホスホリパーゼＤ（ストレプトマ
イセス・クロモファスカス由来、旭化成工業（株）製）
【００６５】＜試薬２Ｂ＞ １００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．０３％ ４−アミノアンチピリン ０．０２％ フェノール ４．５ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ ６ｍＭ ＥＤＴＡ ５ｕ／ｍｌ コリンオキシダーゼ（旭化成工業（株）
製）
製）
【００６６】〔操作〕脂質検査用管理血清（商品名：リ
ピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生
理食塩水にて３倍に希釈したもの９容に対して、０、
２、４、６ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加
回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上
記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間
予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３
７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬
２Ａ添加後の３分目、５分目の吸光度を測定し、その差
を求めた。
ピッドコンセーラ「ニッスイ」、日水製薬（株））を生
理食塩水にて３倍に希釈したもの９容に対して、０、
２、４、６ｍＭ塩化カルシウム溶液１容を混合し、添加
回収用の試料とした。各々の試料５０μｌに対して、上
記試薬１Ａを１．５ｍｌずつ分注し、３７℃にて５分間
予備加温した。その後、試薬２Ａを０．５ｍｌ加え、３
７℃において５４６ｎｍの吸光度変化を追跡した。試薬
２Ａ添加後の３分目、５分目の吸光度を測定し、その差
を求めた。
【００６７】被検試料の代わりに、水を用いたものを試
薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差
し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液と
して用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率
を求めた。次に、ホスファチジルグリセロールの代わり
にレシチンを用い、比較検討した。まず、試薬１Ｂ０．
５ｍｌを３７℃にて予備加温したものに上記試料１０μ
ｌを加え、３７℃にて１０分間反応させた。
薬ブランクとし同様の操作を行い、各々の計算値より差
し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水溶液を標準液と
して用い、これら測定値を濃度換算し、その添加回収率
を求めた。次に、ホスファチジルグリセロールの代わり
にレシチンを用い、比較検討した。まず、試薬１Ｂ０．
５ｍｌを３７℃にて予備加温したものに上記試料１０μ
ｌを加え、３７℃にて１０分間反応させた。
【００６８】次いで、試薬２Ｂを１ｍｌ加え、ホスホリ
パーゼＤ反応を止めるとともに、更に３７℃、１５分間
加温した。０．５％ＳＤＳ１．５ｍｌを加えたのち５０
０ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を
用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々
の測定値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水
溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、
その添加回収率を求めた。これらの結果は表５に示し
た。
パーゼＤ反応を止めるとともに、更に３７℃、１５分間
加温した。０．５％ＳＤＳ１．５ｍｌを加えたのち５０
０ｎｍの吸光度を測定した。被検試料の代わりに、水を
用いたものを試薬ブランクとし同様の操作を行い、各々
の測定値より差し引いた。０．５ｍＭ塩化カルシウム水
溶液を標準液として用い、これら測定値を濃度換算し、
その添加回収率を求めた。これらの結果は表５に示し
た。
【００６９】
【表５】
【００７０】表５から明らかなように、ホスファチジル
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９８％
〜１０８％と良好なのに対し、レシチンの場合は、９．
７％〜１２．５％と添加回収率が極端に悪かった。
グリセロールを基質に用いた場合の添加回収率が９８％
〜１０８％と良好なのに対し、レシチンの場合は、９．
７％〜１２．５％と添加回収率が極端に悪かった。
【００７１】
【発明の効果】被検体中のカルシウムイオンの量に応じ
て変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法に
おいて、基質としてホスファチジルグリセロールを用い
ることにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンや
リポ蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウ
ムイオンの測定ができ、かつ良好に測定するための組成
物を提供できる。
て変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定する方法に
おいて、基質としてホスファチジルグリセロールを用い
ることにより、被検体中の内在性成分、特にレシチンや
リポ蛋白の悪影響を受けず、簡便で精度の高いカルシウ
ムイオンの測定ができ、かつ良好に測定するための組成
物を提供できる。
【図１】ホスホリパーゼＡ2 を用いた場合の塩化カルシ
ウム濃度に対する検量線を表す図である。
ウム濃度に対する検量線を表す図である。
【図２】ホスホリパーゼＤを用いた場合の塩化カルシウ
ム濃度に対する検量線を表す図である。
ム濃度に対する検量線を表す図である。
Claims (6)
- 【請求項１】 被検体を、ホスファチジルグリセロール
に作用するホスホリパーゼ及びホスファチジルグリセロ
ールの存在下に作用せしめ、被検体中のカルシウムイオ
ン量に応じて変化するホスホリパーゼの酵素活性を測定
することを特徴とするカルシウムイオン測定方法。 - 【請求項２】 ホスファチジルグリセロールに作用する
ホスホリパーゼがホスホリパーゼＡ2 であり、ホスホリ
パーゼの酵素活性がホスホリパーゼＡ2 の酵素活性であ
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ホスホリパーゼＡ2 の酵素活性の測定が
ホスホリパーゼＡ2の作用により、カルシウムイオン濃
度に応じて生成するリゾホスファチジルグリセロールを
リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリルコリンホスホ
ジエステラーゼの作用によりグリセロール−３−リン酸
に変換せしめ、このグリセロール−３−リン酸の定量で
ある請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 ホスファチジルグリセロールに作用する
ホスホリパーゼがホスホリパーゼＤであり、ホスホリパ
ーゼの酵素活性がホスホリパーゼＤの酵素活性である請
求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 ホスホリパーゼＤの酵素活性が、ホスホ
リパーゼＤの作用により、カルシウムイオン濃度に応じ
て生成するグリセロールをＡＴＰの存在下グリセロール
キナーゼの作用によりグリセロール−３−リン酸に変換
せしめ、このグリセロール−３−リン酸の定量である請
求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 ホスファチジルグリセロール、ホスホリ
パーゼＡ2 、リゾホスホリパーゼ、グリセロホスホリル
コリンホスホジエステラーゼ、グリセロール−３−リン
酸オキシダーゼ、過酸化水素指示薬を含有するカルシウ
ムイオン測定用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13584294A JP3693302B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | カルシウムイオン測定方法および組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13584294A JP3693302B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | カルシウムイオン測定方法および組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08293A true JPH08293A (ja) | 1996-01-09 |
| JP3693302B2 JP3693302B2 (ja) | 2005-09-07 |
Family
ID=15161043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13584294A Expired - Lifetime JP3693302B2 (ja) | 1994-06-17 | 1994-06-17 | カルシウムイオン測定方法および組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3693302B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
| WO2017221795A1 (ja) * | 2016-06-22 | 2017-12-28 | 旭化成ファーマ株式会社 | Ｌｐ－ＰＬＡ２活性の測定 |
-
1994
- 1994-06-17 JP JP13584294A patent/JP3693302B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100354630C (zh) * | 2002-10-31 | 2007-12-12 | 世诺临床诊断制品株式会社 | 样品中钙的测定试剂和测定方法 |
| WO2017221795A1 (ja) * | 2016-06-22 | 2017-12-28 | 旭化成ファーマ株式会社 | Ｌｐ－ＰＬＡ２活性の測定 |
| JPWO2017221795A1 (ja) * | 2016-06-22 | 2019-01-17 | 旭化成ファーマ株式会社 | Ｌｐ−ＰＬＡ２活性の測定 |
| US10900063B2 (en) | 2016-06-22 | 2021-01-26 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Measurement of Lp-PLA2 activity |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3693302B2 (ja) | 2005-09-07 |
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