JPH11103888A - 生体成分測定用試薬および測定方法 - Google Patents
生体成分測定用試薬および測定方法Info
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- JPH11103888A JPH11103888A JP26860397A JP26860397A JPH11103888A JP H11103888 A JPH11103888 A JP H11103888A JP 26860397 A JP26860397 A JP 26860397A JP 26860397 A JP26860397 A JP 26860397A JP H11103888 A JPH11103888 A JP H11103888A
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Abstract
元物質、特にビリルビンによる影響を回避する。 【解決手段】HLB13以上のポリオキシエチレンアル
キルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分に
直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成する
酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色剤を
含有することを特徴とする生体試料中の特定成分を酸化
酵素を用いて測定する試薬および該試薬を使用する生体
成分測定法。
Description
唾液、髄液等の生体試料中の特定成分、例えば尿酸、コ
レステロール、クレアチニン、クレアチンなどをそれぞ
れの酸化酵素を用いて測定する試薬および測定方法にお
いて、試料中の還元物質、特にビリルビンによる影響を
回避することを特徴とする。
ロールをコレステロールオキシダーゼを用いて測定する
方法において、試料中の還元物質、例えばアスコルビン
酸、ビリルビンなどがコレステロールの測定に影響を及
ぼすことはしばしば経験されることである。すなわち、
コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸
化水素をペルオキシーゼの存在下、4−アミノアンチピ
リンとアニリン誘導体をカップリングさせ、発色させる
ことによって、コレステロールを定量する。この際に、
試料中の還元物質により過酸化水素が還元され、4−ア
ミノアンチピリンとアニリン誘導体のカップリングが減
少することになり、特定成分に比例した発色強度が得ら
れない。
アスコルビン酸オキシダーゼを添加して、アスコルビン
酸を除去する方法(特公昭56-39198号公報)、あるいは
鉄、コバルト、セレン、銅、水銀、ニッケル等の有機錯
体などにより、アスコルビン酸を酸化させる方法(特公
平1-41223 号公報、特公昭63-67139号公報、特公昭63-3
9871号公報)が報告されている。さらにヨウ素酸塩など
の過酸化物によるアスコルビン酸の除去も報告されてい
る(特公平2-4861号公報)。アスコルビン酸オキシダー
ゼの添加は、効率的にアスコルビン酸を除去することが
可能になるとともに、他の成分等の悪影響を及ぼすこと
がほとんどないため広く利用されている。
避するためには、ビリルビンオキシダーゼを添加する方
法(特公昭55-25840号公報)、2価の銅イオン化合物と
界面活性剤および/またはシアン化合物を添加する方法
(特開昭59-159798 号公報)、陽イオン界面活性剤を添
加する方法(特開平8-78号公報)、両性界面活性剤を添
加する方法(特開平7-155196号公報)が報告されてい
る。しかしながら、ビリルビンオキシダーゼは過酸化水
素非存在下で色原体のカップリング反応を促進する作用
を有しているため、実用されるに至っていない。
/またはシアン化合物を添加する方法は、ビルルビンの
除去には効果が認められるが、酸化酵素を用いて生じる
過酸化水素を比色定量する場合、ビリルビンオキシダー
ゼを使用する場合と同様の問題が生じる。さらに、シア
ン化合物は猛毒であり、使用上、好ましくない。陽イオ
ン界面活性剤または両性界面活性剤を添加する方法は、
酵素を用いて生体成分を比色定量する場合、酵素の保存
安定性を低下させる。このように、試料中の還元物質の
影響を回避する方法として、アスコルビン酸に関しては
効果的、汎用的な方法がある一方、ビリルビンに関して
は、そのような方法が確立されていない状況である。
特定成分を測定するに当たり、還元物質、特にビリルビ
ンによる影響を回避することを目的とする。
鑑み、鋭意検討した結果、フェロシアン化イオンと非イ
オン界面活性剤の1種であるポリオキシエチレンアルキ
ルエーテルを共存させることによって、還元物質による
影響を軽減する効果を見出し、さらに詳細に検討を行っ
た結果、HLB13以上のポリオキシエチレンアルキル
エーテルに、特にその効果が顕著であることを見出し、
本発明を完成するにいたった。
オキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオ
ンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過
酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび
過酸化水素発色剤を含有することを特徴とする生体試料
中の特定成分を酸化酵素を用いて測定する試薬である。
化酵素を用いて測定する方法において、試料にHLB1
3以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロ
シアン化イオンおよび生体成分に直接的にまたは間接的
に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシ
ダーゼおよび過酸化水素発色試薬を含有する試薬を反応
させ、生成した過酸化水素から発生した発色強度を測定
することを特徴とする生体成分の測定方法である。
血清、尿、血漿、唾液、髄液等が挙げられる。また、こ
れらの生体試料中の特定成分としては、尿酸、コレステ
ロール、中性脂肪、無機リン、グルコース、クレアチニ
ン、クレアチン、遊離脂肪酸、リン脂質などが例示され
る。
いて測定する試薬とは、それぞれの特定成分に直接的
に、または間接的に作用して過酸化水素を生成する酸化
酵素を使用する。
としては、尿酸とウリカーゼ、グルコースとグルコース
オキシダーゼ、コレステロールとコレステロールオキシ
ダーゼ、中性脂肪とグリセロール−3−リン酸オキシダ
ーゼ、無機リンとキサンチンオキシダーゼ、クレアチ
ン、クレアチニンとザルコシンオキシダーゼ、遊離脂肪
酸とアシルCoAオキシダーゼ、リン脂質とコリンオキ
シダーゼなどが挙げられる。
リオキシエチレンアルキルエーテルとは、アルキル基が
炭素原子数12〜22のアルキル基であり、オキシエチ
レン基の繰り返し単位数が4〜50,000の化合物で
ある。このような化合物としては、例えば、ポリオキシ
エチレンドデシルエーテル(HLB13.1) 、ポリオキシエチ
レンセチルエーテル(HLB14.2) 、ポリオキシエチレンオ
クチルエーテル(HLB13.1) 、ポリオキシエチレンステア
リルエーテル(HLB13.9) 、ポリオキシエチレンオレイル
エーテル(HLB16.2) 、ポリオキシエチレンラウリルエー
テル(HLB15.3)、オクタエチレングリコールモノ-n- ド
デシルエーテル(HLB13.1) などが例示される。HLBが
13よりも低いと、生体試料中の濁り成分の影響を受け
るために、正確な測定が困難となる。
アン化カリウム、フェロシアン化ナトリウムなどが例示
される。
キシエチレンアルキルエーテルの濃度は特に限定される
ものではないが、好適には0.05〜2.0重量%で用
いられる。また、フェロシアン化イオンの濃度は、0.
1〜300μMである。これらの濃度より少ないと、ビ
リルビンの影響を回避することが困難である。また、こ
れらの濃度より多いと、試薬ブランクの上昇を引き起こ
し、正確な測定が困難である。
ゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素発色試薬、HLB1
3以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フェロ
シアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの試薬
は一液でも、または二液であってもよい。また、液状試
薬であっても、固形試薬であってもよい。
ルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、過酸化水素
発色試薬、HLB13以上のポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有
する。これらの試薬は一液でも、または二液であっても
よい。また、液状試薬であっても、固形試薬であっても
よい。
チニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロ
ラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、
過酸化水素発色試薬、HLB13以上のポリオキシエチ
レンアルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび緩
衝剤を含有する。これらの試薬は一液でも、または二液
であってもよい。また、液状試薬であっても、固形試薬
であってもよい。
酸化酵素、ペルオシダーゼ、過酸化水素発色試薬、HL
B13以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル、フ
ェロシアン化イオンおよび緩衝剤を含有する。これらの
試薬は、必要によりアスコルビン酸オキシダーゼ、カタ
ラーゼ、アジ化ナトリウムを含んでいてもよい。
および過酸化水素発色試薬は何ら制限されるものではな
い。過酸化水素発色試薬としては、例えば4−アミノア
ンチピリンまたは3−メチル−2−ベンゾチアゾリンヒ
ドラゾン(MBTH)とフェノールまたその誘導体また
はアニリンまたはその誘導体を組み合わせて使用する。
フェノール誘導体としては、2−クロロフェノール、4
−クロロフェノール、1,2−ジクロロフェノール等が
挙げられる。アニリン誘導体としては、N,N−ジメチ
ルアニリン、N,N−ジエチルアニリン、N,N−ジエ
チル−m−トルイジン、N,N−ジメチル−m−アニシ
ジン、N−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’
−アセチルエチレンジアミン、N−エチル−N−(β−
ヒドロキシエチル)−m−トルイジン、N−エチル−N
−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−m−トル
イジン、N−エチル−N−スルホプロピル−m−トルイ
ジン、N−エチル−N−スルホプロピル−3,5−ジメ
トキシアニリン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−
3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン、
N−エチル−N−スルホプロピル−m−アニシジン、N
−エチル−N−(3−メチルフェニル)−N’−サクシ
ニルエチレンジアミン、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシ−N−スルホプロピル)−m−アニシジン等が挙げ
られる。また、10−X−メチルカルバモイル−3,7
−ジメチルアミノ−10H−フェノチアジン、ビス〔8
−ビス(4−クロロフェニル)メチル−4−ジメチルア
ミノフェニル〕アミン、1,4−ビス(ジメチルアミ
ノ)ジフェニル−(2,7−ジヒドロキシ−4−ナフチ
ル)メタン等のロイコ色素を使用してもよい。
来する混濁の除去(特公平2-24520号公報)、脂質加水
分解酵素の反応促進剤(特公昭60-12040号公報)、試薬
保存中の自然発色防止(特開平7-51095 号公報)、ヘム
タンパクの安定化(特表平8-502411号公報)などの報告
がなされている。一方、フェロシアン化イオンはビリル
ビンの影響を回避するために使用されている。しかし、
HLB13以上のポリオキシエチレンアルキルエーテル
をフェロシアン化イオンと共存させることによって、ビ
リルビンなどの還元物質の影響を回避した例は知られて
いない。
キルエーテルおよびフェロシアン化イオンのいずれか一
方を添加しただけでは、ビリルビン影響を回避する効果
が不十分であるか、または、本発明と同レベルの効果が
得られる濃度では、試薬の粘性が高くなる。あるいは試
薬ブランクの上昇を引き起こすなどの測定の正確性にお
いて悪影響を及ぼす。
より測定する法において、銅イオン、陽イオン界面活性
剤または両性イオン界面活性剤を添加すると、しばしば
酸化酵素タンパクへ影響を及ぼし、その結果、酸化酵素
の保存安定性を低下させることが知られている。しか
し、ポリオキシエチレンアルキルエーテルをフェロシア
ン化イオンと共存させる場合、酸化酵素の保存安定性を
低下させない。
テルに代えて、他の非イオン界面活性剤、例えばポリオ
キシエチレンアルキルフェニルエーテル群に属する界面
活性剤あるいはエステル結合を有する界面活性剤を使用
しても、同様の効果を得ることはできない。
て説明する。実施例1 血清中尿酸の測定 試薬組成1(本発明) (第一試薬) 100mM PIPES緩衝液(pH7.0) 20U/ml ペルオキシダーゼ 3mM N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピ ル)−m−トルイジン(TOOS) 0.3% ポリオキシエチレンオレイルエーテル(HLB 16.2) (第二試薬) 100mM PIPES緩衝液(pH7.0) 2U/ml ウリカーゼ 2mM 4−アミノアンチピリン 0.3% ポリオキシエチレンオレイルエーテル(HLB 16.2) 0.1mM フェロシアン化カリウム
間加温後、第二試薬130μlを添加し、さらに5分間
加温後、546nmの吸光度を、精製水を対照に測定し
た。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた
検量線を用いて、測定値を算出した。その結果を表2に
示す。
イオン界面活性剤を使用した試薬組成2に比べて、試料
中のビリルビンの影響を低減していることが確認され
た。
で5分間加温し、第二試薬130μlを添加し、混和
し、5分間加温後、546nmの吸光度を、精製水を対
照に測定した。得られた吸光度から、予め標準液を用い
て得られた検量線を用いて、測定値を算出した。その結
果を表3に示す。
イオン界面活性剤を使用する試薬組成2に比べて、ビリ
ルビンの影響を低減していることが確認された。
温後、第二試薬を90μl添加し、さらに5分間加温
後、546nmの吸光度を、精製水を対照に測定した。
得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量
線を用いて測定値を算出した。その結果を表4に示す。
イオン界面活性剤を使用する試薬組成2に比べて、ビリ
ルビンの影響を低減していることが確認された。
のビリルビン40mg/dlに代えて、イントラリポス
10%を用いた以外は実施例1と同様にして試料の調製
を実施した。 測定方法 試料8μlに第一試薬260μlを添加、37℃で5分
間加温後、第二試薬130μlを添加し、さらに5分間
加温後、546nmの吸光度を、精製水を対照に測定し
た。得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた
検量線を用いて、測定値を算出した。実施例1と同様に
試料を調製した結果を表5に示し、ビリルビンをイント
ラリポスに代えた結果を表6に示す。
の非イオン界面活性剤を使用する試薬組成2に比べて、
ビリルビンの影響を低減し、さらに乳びの影響を受けな
いことが確認された。
加温後、第二試薬を90μl添加し、さらに5分間加温
後、546nmの吸光度を、精製水を対照に測定した。
得られた吸光度から、予め標準液を用いて得られた検量
線を用いて測定値を算出した。その結果を表7に示す。
0.1mMである試薬組成1の方が、0.05μMであ
る試薬組成2に比べて、ビリルビンの影響が軽減されて
いることが確認された。
加温後、第二試薬90μlを添加し、さらに5分間加温
後、546nmの吸光度を、精製水を対照に測定した。
また37℃にて一週間保存した試薬についても同様の検
討を行った。その結果を表8に示す。
0.1mMである試薬組成1の方が、1mMである試薬
組成2に比べて、試薬ブランクの上昇が少ないことが確
認された。
エチレンアルキルエーテルおよびフェロシアン化イオン
を使用することにより、生体試料中の還元物質、特にビ
リルビンの影響を回避して特定成分を正確に測定するこ
とができる。また、これらの添加物は試薬中に添加され
る酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色試
薬を安定に保ち、長期保存が可能である液状試薬として
も正確な測定が可能である。
Claims (6)
- 【請求項1】 HLB13以上のポリオキシエチレンア
ルキルエーテル、フェロシアン化イオンおよび生体成分
に直接的にまたは間接的に作用して過酸化水素を生成す
る酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび過酸化水素発色剤
を含有することを特徴とする生体試料中の特定成分を酸
化酵素を用いて測定する試薬。 - 【請求項2】 HLB13以上のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルが、HLB13以上のポリオキシエチレ
ンオクチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエ
ーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオ
キシエチレンラウリルエーテルまたはポリオキシエチレ
ンセチルエーテルまたはオクタエチレングコールモノ-n
- ドデシルエーテルであり、フェロシアン化イオンがフ
ェロシアン化カリウムまたはフェロシアン化ナトリウム
である請求項1記載の試薬。 - 【請求項3】 HLB13以上のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルが、ポリオキシエチレンオレイルエーテ
ル(HLB 16.2)またはオクタエチレングリコールモノ−n
−ドデシルエーテル(HLB 13.1)である請求項1記載の試
薬。 - 【請求項4】 HLB13以上のポリオキシエチレンア
ルキルエーテルの濃度が、0.05〜2.0重量%、で
あり、フェロシアン化イオンの濃度が、0.1〜300
μMである請求項1記載の試薬。 - 【請求項5】 生体成分に直接的にまたは間接的に作用
して過酸化水素を生成する酸化酵素がウリカーゼ、コレ
ステロールオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、グリセロール−3−リン酸オキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダー
ゼまたはアシルCoAオキシダーゼである請求項1記載
の試薬。 - 【請求項6】 生体試料中の特定成分を酸化酵素を用い
て測定する方法において、試料にHLB13以上のポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、フェロシアン化イオ
ンおよび生体成分に直接的にまたは間接的に作用して過
酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼおよび
過酸化水素発色試薬を含有する試薬を反応させ、生成し
た過酸化水素から発生した発色強度を測定することを特
徴とする生体成分の測定方法。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26860397A JP3601648B2 (ja) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | 生体成分測定用試薬および測定方法 |
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Publication Number | Publication Date |
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JP3601648B2 JP3601648B2 (ja) | 2004-12-15 |
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ID=17460837
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP26860397A Expired - Lifetime JP3601648B2 (ja) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | 生体成分測定用試薬および測定方法 |
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- 1997-10-01 JP JP26860397A patent/JP3601648B2/ja not_active Expired - Lifetime
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