JP4328754B2 - 安定化された試薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、安定化された試薬組成物に関する。

生化学試薬では、酵素反応を利用して、目的の成分から直接もしくは２次的に生成した過酸化水素と水素供与体、水素受容体から酸化縮合反応により形成された色素を比色定量することで、目的の成分を測定する試薬が多く開発されている。こうした生化学試薬は、試薬中に含まれている成分や試薬中の溶存酸素によって水素供与体が変質し、非特異的な反応を起こしブランク値が高くなる傾向が強くなる。とりわけ、被検試料中に含まれることがあるビリルビン等の還元性物質により測定誤差が生じることを防止する目的で、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化合物が試薬組成物中に配合されている場合、保存中に水素供与体が変質し、非特異的反応な酸化縮合による発色を起こしやすくなり、ブランク値が上昇する。ブランク値が高いと、測定値中に占めるブランク値の割合が大きくなるので、測定の正確さや感度が低下し、好ましくない。これを避けるため、試薬を２試薬系にして、水素供与体と水素受容体を分ける方法やフェロシアン化物と水素供与体を分ける方法が知られている。

しかしながら、最近は試薬の誤調製の防止や操作の簡便性といった市場ニーズから、あらかじめ試薬成分が混合された、使用時の調製が不要な液状試薬が多くなってきている。水素供与体と、フェロシアン化合物とを含む液状試薬では、上記の通り保存中に水素供与体が変質し、非特異的反応な酸化縮合による発色を起こしやすくなり、ブランク値が上昇するという問題が生じる。この問題は、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物に含めておき、使用時に混合することによっても防止することができない。すなわち、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物に含めておき、使用時に混合する場合であっても、水素供与体とフェロシアン化合物とが共存する試薬組成物を用いると、保存中の水素供与体の変質に起因して、混合後に非特異的な水素供与体と水素受容体とのカップリング反応が起き、ブランク値が上昇するという問題がある。

従って、本発明の目的は、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物の安定性を改善し、ブランク値の上昇を防止することができる、安定化された試薬組成物を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、水素供与体と、フェロシアン化合物とを少なくとも含む試薬組成物に、グリシン型両性界面活性剤を配合することにより、水素供与体の変質を防止することができ、測定時の水素供与体と水素受容体との間の非特異的な結合反応を有意に防止することができ、ひいてはブランク値の上昇を抑制することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、前記水素供与体、フェロシアン化合物、及びグリシン型両性界面活性剤が少なくとも同一の試薬に含まれていることを特徴とする試薬組成物を提供する。

本発明により、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物の安定性を改善し、ブランク値の上昇を防止することができる、安定化された試薬組成物が初めて提供された。本発明によれば、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物を保存した場合の、フェロシアン化合物による水素供与体の変質が有意に抑制され、それによってブランク値の上昇が抑制されるので、より正確で高感度な測定が可能になる。

本発明の方法に用いられる両性界面活性剤は、グリシン型両性界面活性剤であり、アルキルグリシン及び長鎖アルキルジアミノエチルグリシンが好ましい。ここで、アルキルグリシンにおけるアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよく、アルキル基の炭素数は、特に限定されないが、１〜３０程度が好ましく、特に１〜２０程度が好ましい。また、長鎖アルキルジアミノエチルグリシンにおけるアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよく、アルキル基の炭素数は、特に限定されないが、１〜３０程度が好ましく、特に１〜２０程度が好ましい。これらのグリシン型両性界面活性剤は市販されている（例えば、日本油脂社製のニッサンアノン＃３００（商品名）やニッサンアノンＬＧ（商品名））ので、市販品を用いることができる。

試薬組成物中のグリシン型両性界面活性剤の配合量は、組成物の種類に応じて適宜選択できるが、通常、試薬組成物全体の重量を基準として0.01〜1%程度が好ましい。

上記したグリシン型両性界面活性剤を配合する試薬組成物は、従来より周知の試薬組成物であってよい。被検試料中に含まれる測定すべき化合物に酸化酵素を作用させ、それによって生じる過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を比色定量する１試薬系又は２試薬系の試薬組成物自体は周知であり、ビリルビン等の還元性物質に起因する測定誤差を回避するためにフェロシアン化合物をさらに配合した試薬組成物も周知である。本発明の安定化された試薬組成物は、水素供与体と、フェロシアン化合物とを同時に含むいずれの試薬組成物からも調製可能である。

過酸化水素を生じさせる酸化酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコエンザイムＡオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらの酵素の作用を受けて過酸化水素を生じる測定又は消去すべき物質としては次のものを挙げることができる。すなわち、コレステロールオキシダーゼやペルオキシダーゼによる作用を受ける物質としてコレステロール、ウリカーゼによる作用を受ける物質として尿酸、アシルコエンザイムＡオキシダーゼによる作用を受ける物質として脂肪酸、グルコースオキシダーゼによる作用を受ける物質としてグルコース、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼによる作用を受ける物質としてグリセロ−３−リン酸を挙げることができる。上記した酸化酵素は、水素供与体とフェロシアン化合物を同時に含む本発明の試薬組成物中に含まれていてもよいし、別の試薬組成物中に含まれているものであってもよい。

発色系試薬の水素供与体としては、アニリン誘導体やフェノール誘導体が広く用いられており、特に、下記一般式(I)で表されるアニリン誘導体が広く用いられている。

（ただし、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は互いに独立に任意の有機基、Ｒ^４は水素又は任意の有機基）

Ｎ−スルホプロピルアニリン誘導体又はＮ−ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体が水溶性のため使いやすく、波長や感度の点からも好ましく、広く用いられている。特に好ましい水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(DAOS)及びＮ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン(HDAOS)を挙げることができる。試薬組成物中の水素供与体の濃度は特に限定されないが、通常、0.1 mM〜10 mM 程度である。

水素受容体は、過酸化水素及び上記した水素供与体と反応（カップリング反応）して結合して色素を形成するいずれの化合物であってもよく、4-アミノアンチピリンやメチルベンズチアゾロンヒドラゾン等が広く用いられている。特に4-アミノアンチピリンが好ましい。試薬組成物中の水素受容体の濃度は特に限定されないが、通常、0.5 〜 20 mM程度である。

一方、上記比較例１の第２試薬に、グリシン型両性界面活性剤（日本油脂製ニッサンアノン＃３００（商品名））を0.1%添加した第２試薬（実施例１）及びグリシン型両性界面活性剤（日本油脂製ニッサンアノンＬＧ（商品名））を0.1%添加した第２試薬（実施例２）を調製した。

試薬組成物には、通常、緩衝剤が含まれている。緩衝剤としては、公知の試薬組成物に用いられているいずれのものであってもよく、例えば、ｐＨを５〜８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液を挙げることができ、グッドの緩衝液としてはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ及びＰＯＰＳＯを挙げることができる。緩衝剤の濃度は特に限定されないが、通常、１０〜５００ｍＭ程度が好ましい。

本発明の試薬組成物の形態は、特に限定されないが、試薬成分同士が反応しやすい液状試薬組成物の場合に本発明の安定化された試薬組成物は特に威力を発揮する。液状試薬組成物の場合には、通常、溶媒が含まれるが、溶媒としては水が好ましい。

過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物は、１試薬系でも２試薬系でもよいが、保存中の水素供与体と水素受容体との反応を防止するために、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物中に含有する２試薬系が好ましい。水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物中に含有する２試薬系の場合、グリシン型両性界面活性剤は、水素供与体とフェロシアン化合物とを同時に含む方の試薬組成物に配合される。

本発明の安定化された試薬組成物は、従来の試薬組成物と全く同様に使用することができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

比較例１、実施例１、２
下記組成を有する第１試薬及び第２試薬を調製した（比較例１）。
第１試薬 ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ7.0 100 mmol/L
ペルオキシダーゼ 3.0単位/mL
４−アミノアンチピリン 1.3 mmol/L
第２試薬 ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ7.0 100 mmol/L
ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル 0.1％
フェロシアン化カリウム 0.1 mmol/L
HDAOS 2 mmol/L
コレステロールオキシダーゼ 1.4 U/mL

一方、上記比較例１の第２試薬に、グリシン系両性界面活性剤（日本油脂製ニッサンアノン＃３００（商品名））を0.1%添加した第２試薬（実施例１）及びグリシン系両性界面活性剤（日本油脂製ニッサンアノンＬＧ（商品名））を0.1%添加した第２試薬（実施例２）を調製した。

生理食塩水４μＬに、あらかじめ３７℃で加温した第１試薬３００μＬを混和し、３７℃で５分間加温した後に、第２試薬１００μＬを加え、３７℃で５分反応させ、６００ｎｍにおける吸光度を測定した。第２試薬を調製直後のものと、調製後３７℃、２日間保存したもので測定を行い、６００ｎｍにおける吸光度の変化を求めた。結果を表１に示す。

表１に示す結果から明らかなように、本発明により、第２試薬が安定化され、第１試薬と第２試薬の混和後の吸光度（ブランク値）の上昇が著しく抑制されることがわかる。

Claims (11)

1. 過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、前記水素供与体、フェロシアン化合物、及びグリシン型両性界面活性剤が少なくとも同一の試薬に含まれていることを特徴とする試薬組成物。
2. 前記グリシン型両性界面活性剤の配合量が試薬組成物全体中の重量を基準として0.01〜1％である請求項１記載の試薬組成物。
3. 前記グリシン型両性界面活性剤が、アルキルグリシン又は長鎖アルキルジアミノエチルグリシンである請求項１又は２記載の試薬組成物。
4. 前記水素供与体は、アニリン誘導体である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の試薬組成物。
5. 前記水素受容体は、4-アミノアンチピリン又はメチルベンゾチアゾロンヒドラゾンである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の試薬組成物。
6. 前記フェロシアン化合物が、フェロシアン化アルカリ金属である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の試薬組成物。
7. 前記水素供与体と、前記フェロシアン化合物と、前記グリシン型両性界面活性剤とを同時に含み、前記水素受容体は、別の試薬組成物中に含まれる、２試薬系の試薬組成物である請求項１ないし６の記載のいずれか１項記載の試薬組成物。
8. 前記水素供与体、水素受容体、フェロシアン化合物、及びグリシン型両性界面活性剤を含む、１試薬系の試薬組成物である請求項１ないし６のいずれか１項記載の試薬組成物。
9. 前記水素供与体濃度が0.1〜10mMである請求項８記載の試薬組成物。
10. 前記水素受容体濃度が0.5〜20mMである請求項８又は９記載の試薬組成物。
11. 前記フェロシアン化合物の濃度が0.05〜1mMである請求項８ないし１０のいずれか１項記載の試薬組成物。