JP3797603B2 - 試薬組成物の安定化方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、試薬組成物の安定化方法及び安定化された試薬組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】
生化学試薬では、酵素反応を利用して、目的の成分から直接もしくは2次的に生成した過酸化水素と水素供与体、水素受容体から酸化縮合反応により形成された色素を比色定量することで、目的の成分を測定する試薬が多く開発されている。こうした生化学試薬は、試薬中に含まれている成分や試薬中の溶存酸素によって水素供与体が変質し、非特異的な反応を起こしブランク値が高くなる傾向が強くなる。とりわけ、被検試料中に含まれることがあるビリルビン等の還元性物質により測定誤差が生じることを防止する目的で、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化合物が試薬組成物中に配合されている場合、保存中に水素供与体が変質し、非特異的反応な酸化縮合による発色を起こしやすくなり、ブランク値が上昇する。ブランク値が高いと、測定値中に占めるブランク値の割合が大きくなるので、測定の正確さや感度が低下し、好ましくない。これを避けるため、試薬を2試薬系にして、水素供与体と水素受容体を分ける方法やフェロシアン化物と水素供与体を分ける方法が知られている。
【0003】
しかしながら、最近は試薬の誤調製の防止や操作の簡便性といった市場ニーズから、あらかじめ試薬成分が混合された、使用時の調製が不要な液状試薬が多くなってきている。水素供与体と、フェロシアン化合物とを含む液状試薬では、上記の通り保存中に水素供与体が変質し、非特異的反応な酸化縮合による発色を起こしやすくなり、ブランク値が上昇するという問題が生じる。この問題は、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物に含めておき、使用時に混合することによっても防止することができない。すなわち、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物に含めておき、使用時に混合する場合であっても、水素供与体とフェロシアン化合物とが共存する試薬組成物を用いると、保存中の水素供与体の変質に起因して、混合後に非特異的な水素供与体と水素受容体とのカップリング反応が起き、ブランク値が上昇するという問題がある。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物の安定性を改善し、ブランク値の上昇を防止することができる、試薬組成物の安定化方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、水素供与体と、フェロシアン化合物とを少なくとも含む試薬組成物に、グリシン型両性界面活性剤を配合することにより、水素供与体の変質を防止することができ、測定時の水素供与体と水素受容体との間の非特異的な結合反応を有意に防止することができ、ひいてはブランク値の上昇を抑制することができることを見出し、本発明を完成した。
【0006】
すなわち、本発明は、過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、少なくとも前記水素供与体と、フェロシアン化合物とを同時に含む試薬組成物に、グリシン型両性界面活性剤を配合することから成る、試薬組成物の安定化方法を提供する。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明の方法に用いられる両性界面活性剤は、グリシン型両性界面活性剤であり、アルキルグリシン及び長鎖アルキルジアミノエチルグリシンが好ましい。ここで、アルキルグリシンにおけるアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよく、アルキル基の炭素数は、特に限定されないが、1〜30程度が好ましく、特に1〜20程度が好ましい。また、長鎖アルキルジアミノエチルグリシンにおけるアルキル基は、直鎖状でも分枝状でもよく、アルキル基の炭素数は、特に限定されないが、1〜30程度が好ましく、特に1〜20程度が好ましい。これらのグリシン型両性界面活性剤は市販されている(例えば、日本油脂社製のニッサンアノン#300(商品名)やニッサンアノンLG(商品名))ので、市販品を用いることができる。
【0008】
試薬組成物中のグリシン型両性界面活性剤の配合量は、組成物の種類に応じて適宜選択できるが、通常、試薬組成物全体の重量を基準として0.01〜1%程度が好ましい。
【0009】
上記したグリシン型両性界面活性剤を配合する試薬組成物は、従来より周知の試薬組成物であってよい。被検試料中に含まれる測定すべき化合物に酸化酵素を作用させ、それによって生じる過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を比色定量する1試薬系又は2試薬系の試薬組成物自体は周知であり、ビリルビン等の還元性物質に起因する測定誤差を回避するためにフェロシアン化合物をさらに配合した試薬組成物も周知である。本発明の方法は、水素供与体と、フェロシアン化合物とを同時に含むいずれの試薬組成物にも適用可能である。
【0010】
過酸化水素を生じさせる酸化酵素としては、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、アシルコエンザイムAオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼ等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらの酵素の作用を受けて過酸化水素を生じる測定又は消去すべき物質としては次のものを挙げることができる。すなわち、コレステロールオキシダーゼやペルオキシダーゼによる作用を受ける物質としてコレステロール、ウリカーゼによる作用を受ける物質として尿酸、アシルコエンザイムAオキシダーゼによる作用を受ける物質として脂肪酸、グルコースオキシダーゼによる作用を受ける物質としてグルコース、グリセロ−3−リン酸オキシダーゼによる作用を受ける物質としてグリセロ−3−リン酸を挙げることができる。上記した酸化酵素は、水素供与体とフェロシアン化合物を同時に含む本発明の試薬組成物中に含まれていてもよいし、別の試薬組成物中に含まれているものであってもよい。
【0011】
発色系試薬の水素供与体としては、アニリン誘導体やフェノール誘導体が広く用いられており、特に、下記一般式(I)で表されるアニリン誘導体が広く用いられている。
【0012】
【化1】
(ただし、R1、R2及びR3は互いに独立に任意の有機基、R4は水素又は任意の有機基)
【0013】
N−スルホプロピルアニリン誘導体又はN−ヒドロキシスルホプロピルアニリン誘導体が水溶性のため使いやすく、波長や感度の点からも好ましく、広く用いられている。特に好ましい水素供与体として、N−エチル−N−(2−ヒドロキシスルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(DAOS)及びN−(2−ヒドロキシスルホプロピル)−3,5−ジメトキシアニリン(HDAOS)を挙げることができる。試薬組成物中の水素供与体の濃度は特に限定されないが、通常、0.1 mM〜10 mM 程度である。
【0014】
水素受容体は、過酸化水素及び上記した水素供与体と反応(カップリング反応)して結合して色素を形成するいずれの化合物であってもよく、4-アミノアンチピリンやメチルベンズチアゾロンヒドラゾン等が広く用いられている。特に4-アミノアンチピリンが好ましい。試薬組成物中の水素受容体の濃度は特に限定されないが、通常、0.5 〜 20 mM程度である。
【0015】
フェロシアン化合物は、フェロシアンイオンを含有するいずれの化合物であってもよく、通常、フェロシアン化カリウムのような、フェロシアン化アルカリ金属が用いられている。試薬組成物中のフェロシアン化合物の濃度は特に限定されないが、通常、0.05〜1 mM程度である。
【0016】
試薬組成物には、通常、緩衝剤が含まれている。緩衝剤としては、公知の試薬組成物に用いられているいずれのものであってもよく、例えば、pHを5〜8に維持することができるリン酸、グリシン、トリス及びグッドの緩衝液を挙げることができ、グッドの緩衝液としてはMES、Bis−Tris、PIPES、MOPSO、BES、MOPS、HEPES及びPOPSOを挙げることができる。緩衝剤の濃度は特に限定されないが、通常、10〜500mM程度が好ましい。
【0017】
本発明の試薬組成物の形態は、特に限定されないが、試薬成分同士が反応しやすい液状試薬組成物の場合に本発明の方法は特に威力を発揮する。液状試薬組成物の場合には、通常、溶媒が含まれるが、溶媒としては水が好ましい。
【0018】
過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物は、1試薬系でも2試薬系でもよいが、保存中の水素供与体と水素受容体との反応を防止するために、水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物中に含有する2試薬系が好ましい。水素供与体と水素受容体とを別々の試薬組成物中に含有する2試薬系の場合、グリシン型両性界面活性剤は、水素供与体とフェロシアン化合物とを同時に含む方の試薬組成物に配合される。
【0019】
本発明の方法により安定化された試薬組成物は、従来の試薬組成物と全く同様に使用することができる。
【0020】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0021】
比較例1、実施例1、2
下記組成を有する第1試薬及び第2試薬を調製した(比較例1)。
【0022】
一方、上記比較例1の第2試薬に、グリシン型両性界面活性剤(日本油脂製ニッサンアノン#300(商品名))を0.1%添加した第2試薬(実施例1)及びグリシン型両性界面活性剤(日本油脂製ニッサンアノンLG(商品名))を0.1%添加した第2試薬(実施例2)を調製した。
【0023】
生理食塩水4μLに、あらかじめ37℃で加温した第1試薬300μLを混和し、37℃で5分間加温した後に、第2試薬100μLを加え、37℃で5分反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。第2試薬を調製直後のものと、調製後37℃、2日間保存したもので測定を行い、600nmにおける吸光度の変化を求めた。結果を表1に示す。
【0024】
【表1】
表1
【0025】
表1に示す結果から明らかなように、本発明の方法により、第2試薬が安定化され、第1試薬と第2試薬の混和後の吸光度(ブランク値)の上昇が著しく抑制されることがわかる。
【0026】
【発明の効果】
本発明により、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物の安定性を改善し、ブランク値の上昇を防止することができる、試薬組成物の安定化方法が初めて提供された。本発明の方法によれば、水素供与体と、フェロシアン化合物とが共存する試薬組成物を保存した場合の、フェロシアン化合物による水素供与体の変質が有意に抑制され、それによってブランク値の上昇が抑制されるので、より正確で高感度な測定が可能になる。
Claims (6)
- 過酸化水素と、水素供与体と、水素受容体との反応により色素を形成し、形成された色素を定量するための試薬組成物であって、少なくとも前記水素供与体と、フェロシアン化合物とを同時に含む試薬組成物に、グリシン型両性界面活性剤を配合することから成る、試薬組成物の安定化方法。
- 前記グリシン型両性界面活性剤が、アルキルグリシン又は長鎖アルキルジアミノエチルグリシンである請求項1記載の方法。
- 前記水素供与体は、アニリン誘導体である請求項1又は2記載の方法。
- 前記水素受容体は、4-アミノアンチピリン又はメチルベンゾチアゾロンヒドラゾンである請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フェロシアン化合物が、フェロシアン化アルカリ金属である請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試薬組成物は、前記水素供与体と、前記フェロシアン化合物と、前記グリシン型両性界面活性剤とを同時に含み、前記水素受容体は、別の試薬組成物中に含まれる請求項1ないし5のいずれか1項記載の方法。
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