JP7427522B2 - キットおよび方法 - Google Patents
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Description
本発明は、キットおよび方法に関する。
ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）の定量に吸光度や濁度の測定を用いる技術として、特許文献１～４に記載のものがある。
特許文献１（特開２００３－２８８８２号公報）には、特定の濃度の１価のカチオンおよび／または２価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させる検体中のSmall dense Ｌ
ＤＬの測定方法について記載されている。そして、同文献に記載の方法によれば、Small dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供することができるとされている。また、同文献においては、主波長６６０ｎｍにおける濁度測定により、Small dense ＬＤＬを測定したことが記載されている。
ＤＬの測定方法について記載されている。そして、同文献に記載の方法によれば、Small dense ＬＤＬのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense ＬＤＬの測定方法を提供することができるとされている。また、同文献においては、主波長６６０ｎｍにおける濁度測定により、Small dense ＬＤＬを測定したことが記載されている。
特許文献２（国際公開第２００８／５０６３６号）および特許文献３（国際公開第２００９／４８１４３号）には、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量にあたり、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定したことが記載されている。
また、特許文献４（国際公開第２００８／１０５４８６号）には、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定にあたり、６００ｎｍにおける吸光度を測定したことが記載されている。
前述の通り、特許文献１～４では、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に際し、波長６００～７００ｎｍ程度の長波長側での吸光度測定が用いられていた。
こうした技術について本発明者らが検討したところ、高水準の測定精度を安定的に得るという点で改善の余地があった。
こうした技術について本発明者らが検討したところ、高水準の測定精度を安定的に得るという点で改善の余地があった。
本発明は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い精度で安定的に定量する技術を提供するものである。
本発明者らは、波長６００～７００ｎｍ程度の領域における吸光度測定を用いるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量について、より微量の試料についても高い測定精度を得ることをめざして検討した。すると、定量に用いる試薬を保存した場合に試薬が劣化し、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量における波長域よりも短波長側にピークを有する吸収が生じて、かかる吸収の影響が高波長側にわたって観測される場合があることが新たな課題として見出された。そして、こうした吸収が生じると、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量時の吸光度に影響を及ぼすため、測定精度が低下する場合があることが明らかになった。また、短波長側の吸収ピークの出現の仕方は、たとえば測定に用いる試薬の成分や保存条件、保存日数により変化しうることがあわせて見出された。
そこで、短波長領域で生じる吸収の影響を極力排除すべくさらに検討したところ、ｓｄＬＤＬ－Ｃの分別に用いる試薬組成物について、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定波長領域外の特定の波長において、加速試験後の吸光度の比を特定の範囲とすることにより、長波長側への吸収の影響を効果的に抑制し、高精度でのｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明によれば、以下のキットおよび方法が提供される。
［１］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する第１試薬組成物と、
前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、キット。
［２］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］に記載のキット。
［３］ 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性をさらに有する、［１］または［２］に記載のキット。
［４］ 前記第１試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［３］いずれか１項に記載のキット。
［５］
第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］乃至［４］いずれか１項に記載のキット。
［６］ 前記第２試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［５］いずれか１項に記載のキット。
［７］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［１］乃至［６］いずれか１項に記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［８］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、方法。
［９］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性をさらに有する、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第１試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［８］乃至［１０］いずれか１項に記載の方法。
［１２］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［８］乃至［１１］いずれか１項に記載の方法。
［１３］ 前記第２試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む、［８］乃至［１２］いずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［８］乃至［１３］いずれか１項に記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［１］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する第１試薬組成物と、
前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、キット。
［２］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］に記載のキット。
［３］ 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性をさらに有する、［１］または［２］に記載のキット。
［４］ 前記第１試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［３］いずれか１項に記載のキット。
［５］
第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］乃至［４］いずれか１項に記載のキット。
［６］ 前記第２試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［５］いずれか１項に記載のキット。
［７］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［１］乃至［６］いずれか１項に記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［８］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、方法。
［９］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性をさらに有する、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第１試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［８］乃至［１０］いずれか１項に記載の方法。
［１２］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［８］乃至［１１］いずれか１項に記載の方法。
［１３］ 前記第２試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む、［８］乃至［１２］いずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［８］乃至［１３］いずれか１項に記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
本発明によれば、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い精度で安定的に定量する技術を提供することができる。
以下、実施の形態について説明する。本実施形態において、測定試薬等の組成物は、各成分を単独でまたは２種以上を組み合わせて含むことができる。また、本明細書において、数値範囲の「ｘ～ｙ」は「ｘ以上ｙ以下」を表し、下限値ｘおよび上限値ｙをいずれも含む。
はじめに、リポタンパク質について説明する。
リポタンパク質は、大きくVery Low Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh Density Lipoprotein（ＨＤＬ）の分画に分けられ、ＬＤＬはさらにsmall dense ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）とそれ以外の亜分画に分けられる。ｓｄＬＤＬを小粒子ＬＤＬ、small ＬＤＬ（ＳＬＤＬ）、dense ＬＤＬ、small, dense ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをlarge ＬＤＬ（Ｌ ＬＤＬ）、Light ＬＤＬと呼ぶこともある。
リポタンパク質は、大きくVery Low Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh Density Lipoprotein（ＨＤＬ）の分画に分けられ、ＬＤＬはさらにsmall dense ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）とそれ以外の亜分画に分けられる。ｓｄＬＤＬを小粒子ＬＤＬ、small ＬＤＬ（ＳＬＤＬ）、dense ＬＤＬ、small, dense ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをlarge ＬＤＬ（Ｌ ＬＤＬ）、Light ＬＤＬと呼ぶこともある。
これらのリポタンパク質の分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。
リポタンパク質の粒子サイズの直径については、報告者により異なるが、たとえばＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（または３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（または１９ｎｍ～３０ｎｍ）であり、ＨＤＬが７～１０ｎｍである。
リポタンパク質の比重については、たとえばＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１である。
リポタンパク質の粒子サイズの直径については、報告者により異なるが、たとえばＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（または３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（または１９ｎｍ～３０ｎｍ）であり、ＨＤＬが７～１０ｎｍである。
リポタンパク質の比重については、たとえばＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１である。
リポタンパク質のうち、ＬＤＬ粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS:TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定できる。また、比重は、たとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。
本実施形態において、測定しようとするｓｄＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０～約２５．５ｎｍの亜分画、または、比重１．０４０～１．０６３の亜分画を指す。
ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものがとりわけ悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０～１．０６３という値もｓｄＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９～１．０６３を中央点で分けた高比重側の値である。たとえば、ｓｄＬＤＬの比重について、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のｓｄＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものがとりわけ悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０～１．０６３という値もｓｄＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９～１．０６３を中央点で分けた高比重側の値である。たとえば、ｓｄＬＤＬの比重について、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のｓｄＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
本明細書において、ｓｄＬＤＬという場合、具体的には、ＬＤＬのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいものをいう。また、ｓｄＬＤＬは、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より高い比重範囲に属するもの、より好ましくは比重１．０４４～１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。また、ＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、ＶＬＤＬまたはＨＤＬを指し、さらにカイロミクロン、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）またはＶＨＤＬ（very high density lipoprotein）を含めることもある。
（キット）
本実施形態において、キットは、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの分別に用いられるものであり、以下の第１試薬組成物および第２試薬組成物を含む。
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する試薬組成物である。第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９以上３．０以下である。
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である。
本実施形態において、キットは、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの分別に用いられるものであり、以下の第１試薬組成物および第２試薬組成物を含む。
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する試薬組成物である。第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９以上３．０以下である。
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である。
本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定波長領域外の特定の波長において、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度の比を特定の範囲とすることにより、ｓｄＬＤＬ－Ｃの高精度での定量が可能となることを新たに見出した。具体的には、短波長側の吸収の存在の有無や程度の指標として、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０の比Ｒ１が好適であることを見出した。Ｒ１を上限値以下とすることにより、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定波長域、たとえば波長６００～７００ｎｍの領域よりも低波長側にピークを有する吸収の波長６００～７００ｎｍの領域への緩衝を効果的に抑制することができるため、高精度でのｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となる。
ここで、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定波長域自体において、緩衝の有無を判定するのは困難であったが、観測領域外の４００ｎｍｍおよび４５０ｎｍの吸光度を用いるとともに、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度比を指標とすることにより、低波長側にピークを有する吸収の存在や緩衝の影響を把握することができる。そして、Ｒ１が特定の範囲にある試薬組成物を用いることにより、測定精度を向上することができる。
ここで、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定波長域自体において、緩衝の有無を判定するのは困難であったが、観測領域外の４００ｎｍｍおよび４５０ｎｍの吸光度を用いるとともに、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度比を指標とすることにより、低波長側にピークを有する吸収の存在や緩衝の影響を把握することができる。そして、Ｒ１が特定の範囲にある試薬組成物を用いることにより、測定精度を向上することができる。
第１試薬組成物については、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度を向上する観点から、３．００以下であり、好ましくは２．８０以下、より好ましくは２．７０以下、さらに好ましくは２．６０以下、さらにより好ましくは２．５０以下である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、第２試薬組成物については、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度を向上する観点から、８．００以下であり、好ましくは７．００以下、より好ましくは６．００以下、さらに好ましくは５．００以下、さらにより好ましくは４．００以下である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
本実施形態においては、キットに含まれる第１および第２試薬組成物がいずれもＲ１について上述の条件を満たすため、ｓｄＬＤＬ－Ｃを精度良く測定することができる。
また、本実施形態のキットにおいて、第１および第２試薬組成物の少なくとも一つについては、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度をより安定的に向上する観点から、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、２．５０以下であり、好ましくは２．００以下、より好ましくは１．８０以下、さらに好ましくは１．７０以下、さらにより好ましくは１．５０以下である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、Ｒ２は、たとえば０．９以上であってもよく、また、たとえば１．０以上、または、たとえば１．２以上であってもよい。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、Ｒ２は、たとえば０．９以上であってもよく、また、たとえば１．０以上、または、たとえば１．２以上であってもよい。
また、第１試薬組成物について、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度をより安定的に向上する観点から、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２は、たとえば３．０以下であり、好ましくは２．５０以下、より好ましくは２．２０以下、さらに好ましくは２．００以下、さらにより好ましくは１．６８以下、よりいっそう好ましくは１．６０以下である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、第２試薬組成物について、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度をより安定的に向上する観点から、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２は、たとえば３．００以下であり、好ましくは２．５０以下、より好ましくは２．００以下、さらに好ましくは１．７０以下、さらにより好ましくは１．５０以下である。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃをさらに安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定精度をさらに向上する観点から、より好ましくは第１および第２試薬組成物がいずれもＲ２について上述の条件を満たす。
本実施形態において、キットは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの分別または定量に用いられ、好ましくはｓｄＬＤＬ－Ｃの分別および定量に用いられる。
また、キットは、具体的には２以上の工程を含むｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
以下、各試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
また、キットは、具体的には２以上の工程を含むｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
以下、各試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有し、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する。
第１試薬組成物は、上記１または２以上の活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去することができる。また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。
第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する１または２以上の酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素、コレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素を含む。
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有し、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する。
第１試薬組成物は、上記１または２以上の活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去することができる。また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。
第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する１または２以上の酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素、コレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素を含む。
ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポタンパク質を分解し、リポタンパク質中のコレステロールが遊離することをいう。たとえば、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がｓｄＬＤＬに全く作用しないことは要求されず、主にｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を分解し、その分解産物であるこれらリポタンパク質中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。
「反応系外に導く」とは、具体的には、ＨＤＬやＶＬＤＬ、Ｌ ＬＤＬなどに含まれるコレステロールがｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に影響を及ぼさないように、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌ ＬＤＬなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりすることをいう。
また、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、具体的には、コレステロールエステラーゼが存在し、ペルオキシダーゼコレステロールエステラーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、カタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性等の他の酵素活性についても同様である。
また、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、第１試薬組成物は、好ましくはカタラーゼ活性をさらに有する。さらに具体的には、第１試薬組成物は、好ましくはカタラーゼ活性を有する１または２以上の酵素をさらに含む組成物である。
次に、第１試薬組成物に含まれる成分をさらに具体的に説明する。
第１試薬組成物に含まれる成分として、たとえば、酵素、酵素作用を有しないタンパク質、界面活性剤、緩衝液、カップラー、電子供与体、鉄錯体が挙げられる。
第１試薬組成物に含まれる成分として、たとえば、酵素、酵素作用を有しないタンパク質、界面活性剤、緩衝液、カップラー、電子供与体、鉄錯体が挙げられる。
酵素としては、たとえばコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する酵素が挙げられる。また、上記活性以外の活性を有する酵素を含んでもよい。たとえば、第１試薬組成物は好ましくはカタラーゼ活性をさらに有し、より好ましくはカタラーゼを有する酵素を含む。
酵素の具体例として、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。
酵素の具体例として、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。
このうち、コレステロールエステラーゼとしては、たとえば細菌や菌類由来のものを用いることができる。
コレステロールオキシダーゼとしては、たとえば細菌や酵母由来のものを用いることができる。
また、スフィンゴミエリナーゼの具体例として、ＳＰＣ（旭化成社製）、Sphingomyelinase from bacillus cereus、Sphingomyelinase from staphylococcus aureus（ＳＩＧＭＡ社製）が挙げられる。
また、第１試薬組成物中の酵素活性について、たとえばスフィンゴミエリナーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２０Ｕ／ｍＬ以下である。
また、第１試薬組成物は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくはリポタンパク質分解酵素を含んでもよい。
リポタンパク質分解酵素としては、たとえばリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
リポタンパク質分解酵素としては、たとえばリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、アルブミンが挙げられる。
界面活性剤として、たとえばｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤が挙げられ、より好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用するとともにｓｄＬＤＬに作用しない界面活性剤が挙げられる。また、第１試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に分別する観点から、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含み、より好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用するとともにｓｄＬＤＬに作用しない界面活性剤を含む。
ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤として、ポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。誘導体の例としてはポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される１または２以上の非イオン界面活性剤を挙げることができる。
このうち、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの好ましい例として、ポリオキシエチレンベンジルフェニル誘導体やポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体、特殊フェノールエトキシレートが挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの具体例として、エマルゲンＡ－６０、エマルゲンＡ－５００、エマルゲンＢ－６６、エマルゲンＡ－９０（以上、花王社製）、ニューコール７０３、ニューコール７０４、ニューコール７０６、ニューコール７０７、ニューコール７０８、ニューコール７０９、ニューコール７１０、ニューコール７１１、ニューコール７１２、ニューコール７１４、ニューコール７１９、ニューコール７２３、ニューコール７２９、ニューコール７３３、ニューコール７４０、ニューコール７４７、ニューコール７８０、ニューコール６１０、ニューコール２６０４、ニューコール２６０７、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、日本乳化剤社製）、ノイゲンＥＡ－８７、ノイゲンＥＡ－１３７、ノイゲンＥＡ－１５７、ノイゲンＥＡ－１６７、ノイゲンＥＡ－１７７、ノイゲンＥＡ－１９７Ｄ、ノイゲンＥＡ－２０７Ｄ（以上、第一工業製薬社製）、ブラウノンＤＳＰ－９、ブラウノンＤＳＰ－１２．５、ブラウノンＴＳＰ－７．５、ブラウノンＴＳＰ－１６、ブラウノンＴＳＰ－５０（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
第１試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に安定的に作用させる観点から、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上である。
また、同様の観点から、第１試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下である。
また、同様の観点から、第１試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下である。
なお、第１および第２試薬組成物に含まれる界面活性剤は、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。界面活性剤のイオン性（非イオン性、陰イオン性、陽イオン性）を確認する方法としては、酸性またはアルカリ性条件での有機溶媒による抽出法、固相抽出法が挙げられる。界面活性剤の構造を決定する方法としてはＬＣ－ＭＳＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。
第１試薬組成物は、好ましくは酵素および界面活性剤を含み、より好ましくはスフィンゴミエリナーゼおよびポリオキシエチレン誘導体を含む。
緩衝液の種類は、たとえば第１試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液が挙げられる。
カップラーおよび電子供与体は、たとえばペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応する組み合わせで用いられる。
かかるカップリング反応に用いられるカップラーとして、たとえば、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが挙げられる。
また、電子供与体は、好ましくはアニリン誘導体である。アニリン誘導体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）が挙げられる。
また、鉄錯体として、たとえば第２の試薬組成物について後述するものが挙げられる。鉄錯体の濃度としては０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
かかるカップリング反応に用いられるカップラーとして、たとえば、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンが挙げられる。
また、電子供与体は、好ましくはアニリン誘導体である。アニリン誘導体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）が挙げられる。
また、鉄錯体として、たとえば第２の試薬組成物について後述するものが挙げられる。鉄錯体の濃度としては０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
第１試薬組成物は、たとえばスフィンゴミエリナーゼを含むとともに、たとえばコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、電子供与体またはカップラーのいずれか一方、ならびに、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含む構成とすることができる。
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
第２試薬組成物の成分としては、たとえば、酵素、緩衝液、界面活性剤、カップラー、鉄錯体が挙げられる。
酵素として、たとえば、ペルオキシダーゼが挙げられる。
緩衝液の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
緩衝液の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
界面活性剤として、たとえばｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、好ましくはｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む。
ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤は、ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤等のｓｄＬＤＬに選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤は、ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤等のｓｄＬＤＬに選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤としては、たとえばポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を好適に用いることができる。ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、たとえば、プルロニック１７Ｒ－４、プルロニックＬ－６４、プルロニックＰＥ３１００、プルロニックＰ－８５、プルロニックＦ－８８、プルロニックＰ－１０３、プルロニックＦ－１２７等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（ＢＡＳＦ社、ＡＤＥＫＡ社）などが挙げられる。
すべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレン誘導体をあげることができ、また、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤を使用することができる。かかる界面活性剤として、たとえば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（たとえばエマルゲン９０９（花王社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（たとえばエマルゲン７０７、エマルゲン７０９（以上、花王社製））が挙げられる。
第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．０５％以上であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上である。
また、同様の観点から、第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは８．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは５．０％（ｗ／ｖ）以下である。
また、同様の観点から、第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは８．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは５．０％（ｗ／ｖ）以下である。
カップラーとしては、たとえば第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
鉄錯体としては、たとえば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、ポルフィリン鉄錯体、ＥＤＴＡ－鉄錯体が挙げられる。
第２試薬組成物中の鉄錯体の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、また、たとえば０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
第２試薬組成物中の鉄錯体の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、また、たとえば０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
また、第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、第２試薬組成物が、以下の条件１～３のうち、第１試薬組成物が満たす１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たすことが好ましい。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、たとえば電子供与体とカップラーをペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応させ、生成した色素により特定波長の吸光度を測定する。このとき、反応促進剤として鉄錯体を使用することができるが、カップラーとペルオキシダーゼ活性、鉄錯体が同一試薬中に存在すると、試薬が徐々に自然発色し、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に影響をおよぼす場合があった。この点、第１および第２試薬組成物を上述の構成とすることにより、第１または第２試薬組成物中にカップラー、ペルオキシダーゼ活性および鉄錯体が共存しないようにすることができるため、試薬組成物の自然発色を抑制することができる。このため、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量をさらに安定的におこなうことができる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃをより安定的に定量する観点から、より好ましくは第１試薬組成物が条件１および条件３を満たすとともに、第２試薬組成物が条件２を満たす。
同様の観点から、カップラーと電子供与体とを、別々の試薬組成物中に分離して存在させることも好ましい。
また、第１または第２試薬組成物には、血清アルブミンが含まれていてもよい。
各試薬組成物のｐＨは、中性付近、たとえばｐＨ６～ｐＨ８、好ましくはｐＨ６．５～７．５であり、緩衝液を添加してｐＨを調整すればよい。
各試薬組成物のｐＨは、中性付近、たとえばｐＨ６～ｐＨ８、好ましくはｐＨ６．５～７．５であり、緩衝液を添加してｐＨを調整すればよい。
（方法）
本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。
かかる方法においては、吸光度の比Ｒ１が前述の条件を満たす第１および第２試薬組成物を用いることにより、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い精度で安定的に定量することができる。
本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。
かかる方法においては、吸光度の比Ｒ１が前述の条件を満たす第１および第２試薬組成物を用いることにより、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い精度で安定的に定量することができる。
また、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法は、たとえば試料（被検体試料）に第１試薬組成物を添加し反応させ、次いで第２試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することによりおこなえばよい。
被検体試料は、たとえば血清または血漿であり、好ましくは血清である。
第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬５０～３００μＬ、第２試薬２５～２００μＬを用いればよい。
以下、各工程をさらに具体的に説明する。
被検体試料は、たとえば血清または血漿であり、好ましくは血清である。
第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬５０～３００μＬ、第２試薬２５～２００μＬを用いればよい。
以下、各工程をさらに具体的に説明する。
（第１工程）
第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
さらに具体的には、第１工程では、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、スフィンゴミエリナーゼおよびコレステロールエステラーゼの存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
さらに具体的には、第１工程では、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、スフィンゴミエリナーゼおよびコレステロールエステラーゼの存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
たとえば第１試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するとき、第１工程における反応液のスフィンゴミエリナーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を選択的に消去する観点から、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２０Ｕ／ｍＬ以下である。
また、たとえば第１試薬組成物がｓｄＬＤＬ以外のリポタンパクに作用反応する界面活性剤を含むとき、第１工程における反応液中の界面活性剤の濃度は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を選択的に消去する観点から、好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．２５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下である。
また、たとえば第１試薬組成物がｓｄＬＤＬ以外のリポタンパクに作用反応する界面活性剤を含むとき、第１工程における反応液中の界面活性剤の濃度は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を選択的に消去する観点から、好ましくは０．１５％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．２５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下である。
第１工程において、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質から生じたコレステロールを消去し反応系外に導く工程は、好ましくは以下のいずれかの方法でおこなうことができる。
（１）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質の中コレステロールから過酸化水素を生成し、カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を水と酸素に分解させる方法
（２）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびにカップラーもしくは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（３）カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させ、かつ同時にカップラーまたは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（１）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質の中コレステロールから過酸化水素を生成し、カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を水と酸素に分解させる方法
（２）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびにカップラーもしくは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（３）カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させ、かつ同時にカップラーまたは電子供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
上記の方法において、第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有するとともに、たとえば以下の構成とする。
上記（１）の方法とする場合、第１試薬組成物はカタラーゼ活性をさらに有する。
上記（２）の方法とする場合、第１試薬組成物が少なくともカップラーおよび電子供与体の一方を含むとともに、第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性をさらに有する。
上記（３）の方法とする場合、第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性を有するとともに、第１試薬組成物がカップラーもしくは電子供与体を含む。
上記（１）の方法とする場合、第１試薬組成物はカタラーゼ活性をさらに有する。
上記（２）の方法とする場合、第１試薬組成物が少なくともカップラーおよび電子供与体の一方を含むとともに、第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性をさらに有する。
上記（３）の方法とする場合、第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性を有するとともに、第１試薬組成物がカップラーもしくは電子供与体を含む。
上記（１）または（２）の方法では、コレステロールにコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素は消去される。
反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は、好ましくは０．０１０Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．３Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．６Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２．５Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２．０Ｕ／ｍＬ以下である。
また、反応液中のコレステロールオキシダーゼの濃度は、０．１～０．７Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましい。
反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は、好ましくは０．０１０Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．３Ｕ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．６Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２．５Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２．０Ｕ／ｍＬ以下である。
また、反応液中のコレステロールオキシダーゼの濃度は、０．１～０．７Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましい。
上記（３）の方法では、カタラーゼの反応液中の濃度は、４０～２５００Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましい。
また、ペルオキシダーゼ反応液中の濃度は、０．４～２．０Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましい。
また、ペルオキシダーゼ反応液中の濃度は、０．４～２．０Ｕ／ｍＬ程度であることが好ましい。
上記（２）または（３）の方法において、電子供与体の使用濃度は、反応液中の最終濃度で好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
また、第１試薬組成物がリポプロテインリパーゼを含むとき、反応液中のリポプロテインリパーゼの濃度は好ましくは０．０１Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１Ｕ／ｍＬ以下である。
第１工程では、Ｌ ＬＤＬやＬＤＬ以外のＶＬＤＬ、ＨＤＬなどのリポタンパク質中のコレステロールを反応系外へ導くことにより、その後の工程においては、反応液中に好ましくはリポタンパク質としてはｓｄＬＤＬのみが残存することになる。このようにｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、反応系外へ導き、その後の工程でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを検出できないようにすることを、「ｓｄＬＤＬとそれ以外のリポタンパク質を差別化する」ということがある。
また、第１工程では、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールが完全に消去されていなくてもよいが、その場合は、好ましくは第２工程において、ｓｄＬＤＬ－Ｃが選択的に測定されるような界面活性剤を用いるとよい。
また、第１工程では、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールが完全に消去されていなくてもよいが、その場合は、好ましくは第２工程において、ｓｄＬＤＬ－Ｃが選択的に測定されるような界面活性剤を用いるとよい。
また、第１工程においては、イオン強度調整剤として１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩をさらに反応液に添加して用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、ｓｄＬＤＬとＬ ＬＤＬを差別化しやすくなる。
イオン強度調整剤は、具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム等の塩化物；硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム等の硫酸塩；および酢酸マグネシウム等の酢酸塩からなる群から選択して用いることができる。イオン強度調整剤の反応液中の濃度は好ましくは０～１００ｍｍｏｌ／Ｌである。
また、第１試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するとき、第１工程において、ｓｄＬＤＬとＬ ＬＤＬに対するホスフォリパーゼの触媒活性を調整するためにポリアニオンを添加することもできる。
添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。第１試薬組成物中のポリアニオンの濃度はヘパリンの場合１０～２５０Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）、デキストラン硫酸の場合０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）が好ましい。反応液中の濃度は、それぞれ５～２５０Ｕ／ｍＬ、０．０１～１．２５％（ｗ／ｖ）、０．０１～１．２５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。第１試薬組成物中のポリアニオンの濃度はヘパリンの場合１０～２５０Ｕ／ｍＬ、リンタングステン酸の場合０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）、デキストラン硫酸の場合０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）が好ましい。反応液中の濃度は、それぞれ５～２５０Ｕ／ｍＬ、０．０１～１．２５％（ｗ／ｖ）、０．０１～１．２５％（ｗ／ｖ）が好ましい。
（第２工程）
第２工程では、第１工程を経て残存したｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する。第２工程には、従来から用いられているＬＤＬの定量方法を用いることができる。たとえば、ＬＤＬ凝集剤を添加して形成されたＬＤＬ特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、ＬＤＬ特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。
酵素を用い分解生成物を定量する方法においては、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてｓｄＬＤＬ－Ｃを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
第２工程では、第１工程を経て残存したｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する。第２工程には、従来から用いられているＬＤＬの定量方法を用いることができる。たとえば、ＬＤＬ凝集剤を添加して形成されたＬＤＬ特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、ＬＤＬ特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。
酵素を用い分解生成物を定量する方法においては、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてｓｄＬＤＬ－Ｃを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
また、第２工程において、界面活性剤を含む第２試薬組成物を用いることも好ましい。第２試薬組成物が界面活性剤を含むとき、第２工程における反応液中の界面活性剤の濃度は、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
本実施形態において、各工程における、反応温度は２℃～４５℃でおこなうことが好ましく、２５℃～４０℃でおこなうことがより好ましい。
反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に供する試料の例として、血清、血漿等の血液由来試料が挙げられる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓ ｃ５０１、ｃｏｂａｓ ｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量は、たとえば５８０～７２０ｎｍの波長域、好ましくは６００～７００ｎｍの波長域の吸光度測定によりおこなう。
次に、第１および第２試薬組成物の酵素活性の測定方法を説明する。
本実施形態において、試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性、コレステロールエステラーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性は、たとえば、以下の方法にて測定できる。
本実施形態において、試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性、コレステロールエステラーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性は、たとえば、以下の方法にて測定できる。
コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として６ｍＭコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を２～４Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（０．１Ｍ リン酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．０）を加え、希釈後の溶液３ｍＬを３７℃５分加温後に基質液０．０５ｍＬを加える。その後、混合液を３７℃で反応させ波長２４０ｎｍ吸光度変化量を測定する。３７℃にて反応後、２分から７分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールオキシダーゼが含まれているといえる。
コレステロールエステラーゼ活性の測定では、基質（０．０４％リノレン酸コレステロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．６％コール酸ナトリウム溶液）、３００Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２％ ＢＳＡ、ｐＨ７．５）、反応液（０．０６％ ４－アミノアンチピリン、０．４％ フェノール、７．５ＫＵ／Ｌ ペルオキシダーゼ）を用いる。反応液１．７５ｍＬと基質液１．０ｍＬを混合後、３７℃で５分加温し、０．１ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。３７℃、２分加温後に希釈液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加え、混合液を３７℃で反応させ、波長５００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が８Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼが含まれているといえる。
スフィンゴミエリナーゼ活性の測定では、反応液（０．００８％ スフィンゴミエリン、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液、１０Ｕ／ｍＬ アルカリ性フォスファターゼ、１０Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．０２％ ４－アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＤＢ混合液）、反応停止液（１％ ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（１０ｍＭ トリス緩衝液、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いる。反応液０．０８ｍＬと希釈液で希釈した測定対象０．００３ｍＬを混合し３７℃で５分加温後に反応停止液０．１６ｍＬを加える。反応停止後に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が２Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、スフィンゴミエリナーゼが含まれているといえる。
ペルオキシダーゼ活性の測定では、反応液１（１．５ｍＭ ＨＤＡＯＳ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、および、反応液２（５ｍＭ ４－アミノアンチピリン、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％ 過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、希釈液（５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。０．３ｍＬの反応液１と希釈液で希釈した測定対象０．０８ｍＬを混合し、３７℃で５分加温する。その後０．１ｍＬの反応液２を加え、３７℃で反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、２分から５分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、ペルオキシダーゼが含まれているといえる。
カタラーゼ活性の測定では、基質（０．０６％ 過酸化水素、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。基質溶液２．９ｍＬを２５℃で予備加温後、測定対象０．１ｍＬと混合し、２４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。２５℃反応後、０分から３分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１００Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、カタラーゼが含まれているといえる。
また、第１および第２試薬組成物中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、まず、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳデータ）をデータベース検索（たとえば、Ｍａｓｃｏｔサーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試薬組成物中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいるとみなせる。
また、第１および第２試薬組成物中の酵素はたとえば以下の定量でも同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、ＨＰＬＣに接続した三連四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＭＲＭモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下の各例において、吸収スペクトルの測定には、ＨＩＴＡＣＨＩ社製のＵ－３９００を用いた。
まず、試薬組成物に用いた成分を説明する。
以下の例において、第１および第２の試薬組成物は、いずれも、ＰＩＰＥＳ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０）に表１または表２に記載の各成分を各表に記載の濃度で配合することにより調製した。
表１および表２に記載の成分を以下に示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン
４－ＡＡ：４－アミノアンチピリン
ＦｅＫ：フェロシアン化カリウム
ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ
Ｂ－Ｃａｔ：カタラーゼ
ＮａＮ3：アジ化ナトリウム
以下の例において、第１および第２の試薬組成物は、いずれも、ＰＩＰＥＳ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．０）に表１または表２に記載の各成分を各表に記載の濃度で配合することにより調製した。
表１および表２に記載の成分を以下に示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン
４－ＡＡ：４－アミノアンチピリン
ＦｅＫ：フェロシアン化カリウム
ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ
Ｂ－Ｃａｔ：カタラーゼ
ＮａＮ3：アジ化ナトリウム
（調製例１）
（実施例１－１～１－８、比較例１－１～１－４）
表１に記載の配合組成にて、各例の第１試薬組成物を調製した。
ここで、各例の第１試薬組成物は、表１に記載の成分に加えて、以下の成分を共通して含むものとした。
（実施例１－１～１－８、比較例１－１～１－４）
表１に記載の配合組成にて、各例の第１試薬組成物を調製した。
ここで、各例の第１試薬組成物は、表１に記載の成分に加えて、以下の成分を共通して含むものとした。
（第１試薬組成物の共通成分）
コレステロールエステラーゼ：０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ：２．７Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（花王社製）：０．３％（ｗ／ｖ）
コレステロールエステラーゼ：０．６Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ：０．５Ｕ／ｍＬ
スフィンゴミエリナーゼ：２．７Ｕ／ｍＬ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（花王社製）：０．３％（ｗ／ｖ）
得られた第１試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長３２０ｎｍ～４８０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。表１に各例で得られた試薬組成物の吸光度および吸光度比をあわせて示す。
また、図１（ａ）～図１（ｆ）および図２（ａ）～図２（ｆ）は、各例で得られた第１試薬組成物の調製直後ならびに３７℃にて１週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
また、図１（ａ）～図１（ｆ）および図２（ａ）～図２（ｆ）は、各例で得られた第１試薬組成物の調製直後ならびに３７℃にて１週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
（調製例２）
（実施例２－１～２－９、比較例２－１～２－４）
表２に記載の配合組成にて、各例の第２試薬組成物を調製した。
ここで、各例の第２試薬組成物は、表２に記載の成分に加えて、以下の成分を共通して含むものとした。
（実施例２－１～２－９、比較例２－１～２－４）
表２に記載の配合組成にて、各例の第２試薬組成物を調製した。
ここで、各例の第２試薬組成物は、表２に記載の成分に加えて、以下の成分を共通して含むものとした。
（第２試薬組成物の共通成分）
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（花王社製）：１．０％（ｗ／ｖ）
ポリオキシエチレンアルキルエーテル（花王社製）：１．０％（ｗ／ｖ）
得られた第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長３２０ｎｍ～４８０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。表２に各例で得られた試薬組成物の吸光度および吸光度比をあわせて示す。
また、図３（ａ）～図３（ｆ）および図４（ａ）～図４（ｇ）は、各例で得られた第２試薬組成物の調製直後ならびに３７℃にて１週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
また、図３（ａ）～図３（ｆ）および図４（ａ）～図４（ｇ）は、各例で得られた第２試薬組成物の調製直後ならびに３７℃にて１週間もしくは２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
（実施例３－１～３－４、比較例３－１～３－７）
各例における第１および第２の試薬組成物を３７℃、２週間の条件で保存し、加速試験をおこなった。
保存後の第１および第２試薬組成物を表３～表５に示した組み合わせで用い、ｓｄＬＤＬの定量を正確におこなうことができるかどうかを評価した。評価結果を表３～表５にあわせて示す。
各例における第１および第２の試薬組成物を３７℃、２週間の条件で保存し、加速試験をおこなった。
保存後の第１および第２試薬組成物を表３～表５に示した組み合わせで用い、ｓｄＬＤＬの定量を正確におこなうことができるかどうかを評価した。評価結果を表３～表５にあわせて示す。
（カタラーゼ系）
表３は、カタラーゼでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するように第１および第２試薬組成物を組み合わせた測定系の結果である。
表３は、カタラーゼでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するように第１および第２試薬組成物を組み合わせた測定系の結果である。
各測定系において、キャリブレーション吸光度を、以下の方法で測定した。ここで、キャリブレーション吸光度とは、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度が既知の標準物質を測定した場合の測定波長における吸光度である。
すなわち、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度が４１ｍｇ／ｄＬである標準物質およびｓｄＬＤＬ－Ｃが存在しないブランク物質である生理食塩水について、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度をそれぞれ以下の方法で３回測定し、主波長６００ｎｍの吸光度から副波長７００ｎｍの吸光度を差し引いた吸光度差を求めた。そして標準物質の吸光度差の平均値からブランク吸光度差の平均値を差し引いて、各例のキャリブレーション吸光度を算出した。
すなわち、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度が４１ｍｇ／ｄＬである標準物質およびｓｄＬＤＬ－Ｃが存在しないブランク物質である生理食塩水について、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度をそれぞれ以下の方法で３回測定し、主波長６００ｎｍの吸光度から副波長７００ｎｍの吸光度を差し引いた吸光度差を求めた。そして標準物質の吸光度差の平均値からブランク吸光度差の平均値を差し引いて、各例のキャリブレーション吸光度を算出した。
具体的には、表３に記載の各例について、以下の手順でｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価をおこなった。
（ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価方法）
１．上記標準物質および生理食塩水の試料３．０μＬに対し、各例の第１試薬組成物を１５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
２．上記２．で得られた試料に各例の第２試薬組成物を５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
３．上記２．で得られた試料について、第２試薬組成物が入る直前、および第２試薬組成物添加５分後に波長６００ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定し、（第２試薬組成物添加５分後の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）－（第２試薬組成物が入る直前の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）より前述のキャリブレーション吸光度を算出した。
４．一方、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定結果が４１±２．１ｍｇ／ｄＬである場合には「○」、上記範囲外である場合には「×」として各例の測定精度を評価した。
（ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価方法）
１．上記標準物質および生理食塩水の試料３．０μＬに対し、各例の第１試薬組成物を１５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
２．上記２．で得られた試料に各例の第２試薬組成物を５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
３．上記２．で得られた試料について、第２試薬組成物が入る直前、および第２試薬組成物添加５分後に波長６００ｎｍおよび７００ｎｍにおける吸光度を測定し、（第２試薬組成物添加５分後の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）－（第２試薬組成物が入る直前の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）より前述のキャリブレーション吸光度を算出した。
４．一方、ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定結果が４１±２．１ｍｇ／ｄＬである場合には「○」、上記範囲外である場合には「×」として各例の測定精度を評価した。
表３に示した各例より、カタラーゼでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去する測定系では、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定できるキャリブレーション吸光度範囲が、７３ｍＡＢＳ以上１２０ｍＡＢＳ以下となった。ここで、キャリブレーション吸光度範囲は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する際の正確度を表す指標である。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
（無色キノン系）
表４は、第１試薬組成物がペルオキシダーゼを含む構成として無色キノンを形成してｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するように第１および第２試薬組成物を組み合わせた測定系の結果である。
表４に記載の各例について、表３における前述の方法に準じてｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価をおこなった。
表４は、第１試薬組成物がペルオキシダーゼを含む構成として無色キノンを形成してｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するように第１および第２試薬組成物を組み合わせた測定系の結果である。
表４に記載の各例について、表３における前述の方法に準じてｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価をおこなった。
表４に示した各例より、無色キノンでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去する測定系では、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定できるキャリブレーション吸光度範囲が１５０ｍＡＢＳ以上１９５ｍＡＢＳ以下となった。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
（ハイブリッド消去系）
表５は、第１試薬組成物がペルオキシダーゼを含む構成として無色キノンを形成してｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するとともに、カタラーゼでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するハイブリッド消去系となるよう第１および第２試薬組成物を組み合わせた結果である。
表５に記載の各例について、表３における前述の方法に準じてｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価をおこなった。
表５は、第１試薬組成物がペルオキシダーゼを含む構成として無色キノンを形成してｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するとともに、カタラーゼでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去するハイブリッド消去系となるよう第１および第２試薬組成物を組み合わせた結果である。
表５に記載の各例について、表３における前述の方法に準じてｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価をおこなった。
表５に示した各例より、カタラーゼおよび無色キノンでｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質コレステロールを消去する測定系では、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定できるキャリブレーション吸光度範囲が１１０ｍＡＢＳ以上１６０ｍＡＢＳ以下となった。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
また、第１および第２試薬組成物のＲ１がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定することができた。
Claims (14)
- 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する１または２以上の酵素を含む第１試薬組成物と、
前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物が鉄錯体を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、キット。 - 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項１に記載のキット。
- 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性を有する１または２以上の酵素を含む、請求項１または２に記載のキット。
- 前記第１試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、請求項１乃至３いずれか１項に記載のキット。
- 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項１乃至４いずれか１項に記載のキット。
- 前記第２試薬組成物が、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）に作用する界面活性剤を含む、請求項１乃至５いずれか１項に記載のキット。
- 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、請求項１乃至６いずれか１項に記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：前記鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する１または２以上の酵素を含む - 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される１または２以上の活性を有する１または２以上の酵素を含む第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物が鉄錯体を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．００以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上８．００以下である、方法。 - 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項８に記載の方法。
- 前記第１試薬組成物が、カタラーゼ活性を有する１または２以上の酵素を含む、請求項８または９に記載の方法。
- 前記第１試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、請求項８乃至１０いずれか１項に記載の方法。
- 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項８乃至１１いずれか１項に記載の方法。
- 前記第２試薬組成物が、前記ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む、請求項８乃至１２いずれか１項に記載の方法。
- 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、請求項８乃至１３いずれか１項に記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：前記鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する１または２以上の酵素を含む
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| Yasuki Ito，Development of a homogeneous assay for measurement of small dense LDL cholesterol，Clin Chem，2010年11月04日，Vol.57 No.1，Pge.57-65 |
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