WO2023199890A1 - 試薬組成物およびキット - Google Patents

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WO2023199890A1
WO2023199890A1 PCT/JP2023/014549 JP2023014549W WO2023199890A1 WO 2023199890 A1 WO2023199890 A1 WO 2023199890A1 JP 2023014549 W JP2023014549 W JP 2023014549W WO 2023199890 A1 WO2023199890 A1 WO 2023199890A1
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WO
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reagent composition
sdldl
sample
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cholesterol
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PCT/JP2023/014549
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康樹 伊藤
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デンカ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to reagent compositions and kits.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2000-325097.
  • the same document describes a first step in which HDL cholesterol is selectively enzymatically reacted by adding an enzyme and a first surfactant to a sample containing lipoproteins, and then a second step in which HDL cholesterol is selectively enzymatically reacted by adding an enzyme and a first surfactant.
  • the second step of selectively enzymatically reacting cholesterol and in the first or second step, HDL cholesterol and/or LDL cholesterol is measured by measuring the compound consumed or produced by the reaction with the enzyme.
  • This method does not require a lipoprotein flocculant that increases the turbidity of the reaction solution, there are no restrictions on the enzymes used, and the method does not require the use of a lipoprotein coagulant that increases the turbidity of the reaction solution.
  • LDL cholesterol can be easily and inexpensively quantified without the need to add another enzyme in the step of adding another enzyme, and if necessary, it can form lipoprotein aggregates that interfere with optical measurement of HDL cholesterol. Since it is possible to provide a measurement method and a measurement reagent that can accurately and inexpensively measure without causing damage, it is said to be particularly useful in the field of clinical testing for arteriosclerosis and the like.
  • the present invention provides a technique for measuring sdLDL-C with excellent accuracy and specificity after sample dilution.
  • the present inventors investigated to improve the reaction specificity of sdLDL-C quantification (specifically, the correlation with the standard method) and the accuracy after sample dilution.
  • the sdLDL-C has good correlation with the standard ultracentrifugation method and has excellent accuracy after sample dilution.
  • the following reagent compositions and kits are provided.
  • a step of causing the first reagent composition to act on the sample After the step of causing the first reagent composition to act on the sample, cholesterol in the remaining lipoproteins is quantified by acting on a second reagent composition for quantifying small dense LDL cholesterol (sdLDL-C).
  • sdLDL-C small dense LDL cholesterol
  • a first reagent composition comprising the reagent composition according to any one of [1] to [9]; a second reagent composition for quantifying the sdLDL-C; A kit used for quantifying the sdLDL-C in the sample, comprising: [11] The kit according to [10], wherein the second reagent composition has peroxidase activity.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of evaluating the accuracy of the measured value of sdLDL-C after sample dilution.
  • FIG. 3 is a diagram showing evaluation results of reaction specificity (correlation with standard method) of measured values of sdLDL-C.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the reaction specificity of the measured value of sdLDL-C (correlation coefficient in correlation with the reference method) and the contact angle.
  • FIG. 3 is a diagram showing evaluation results of dilution linearity of measured values of sdLDL-C.
  • FIG. 3 is a diagram showing evaluation results of dilution linearity of measured values of sdLDL-C.
  • a composition such as a measurement reagent can contain each component alone or in combination of two or more.
  • the numerical range "x to y" represents “x to y" and includes both the lower limit value x and the upper limit value y.
  • Lipoproteins are broadly divided into Very Low Density Lipoprotein (VLDL), Low Density Lipoprotein (LDL), and High Density Lipoprotein (HDL), and LDL is further divided into small dense LDL (sdLDL) and other subfractions. Can be divided. sdLDL is sometimes called small particle LDL, small LDL (SLDL), dense LDL, and small, dense LDL, and other LDLs are sometimes called large LDL (L LDL) and light LDL.
  • VLDL Very Low Density Lipoprotein
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • HDL High Density Lipoprotein
  • sdLDL small dense LDL
  • SLDL small LDL
  • LDL small LDL
  • LDL large LDL
  • LDL large LDL
  • lipoprotein fractions and subfractions can be distinguished by particle size or specific gravity.
  • the particle size diameter of lipoproteins varies depending on the reporter, but for example, VLDL is 30 nm to 80 nm (or 30 nm to 75 nm), LDL is 22 nm to 28 nm (or 19 nm to 30 nm), and HDL is 7 to 80 nm (or 30 nm to 75 nm). It is 10 nm.
  • VLDL is 1.006 or less
  • LDL is 1.019 to 1.063
  • HDL is 1.063 to 1.21.
  • the LDL particle diameter can be determined by, for example, gradient gel electrophoresis (GGE) (JAMA, 260, p.1917-21, 1988), NMR (HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition, edited by Nader Rifai et al., p.609- 623, AACC PRESS: The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No. 3, p.15-16).
  • GGE gradient gel electrophoresis
  • NMR HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition, edited by Nader Rifai et al., p.609- 623, AACC PRESS: The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No. 3, p.15-16).
  • the specific gravity can be determined, for example, based on analysis by ultracentrifugation (Atherosclerosis, 106, p.241-253
  • the sdLDL to be measured is generally a sub-fraction of the LDL fraction with a diameter of about 22.0 to about 25.5 nm or a sub-fraction with a specific gravity of 1.040 to 1.063. Point to the picture.
  • LDL is divided into sub-fractions based on size is that LDL with smaller particle diameters is more likely to cause arteriosclerosis and is more malignant than other LDLs, so smaller LDLs are measured separately. Because it was necessary.
  • the diameter distribution and specific gravity distribution within LDL are continuous, and it is not possible to clearly distinguish which specific gravity is particularly high in malignancy.
  • the above-mentioned specific gravity value of 1.040 to 1.063 is not established as a characteristic of sdLDL, but the central point is the LDL specific gravity range of 1.019 to 1.063, which is a widely used and established value. This is the value on the higher specific gravity side.
  • the specific gravity of sdLDL is fractionated between 1.044 and 1.060 (Atherosclerosis:106 241-253 1994).
  • the specific gravity range of sdLDL differs slightly depending on the reporter, but in all cases, the presence of sdLDL when fractionated within that range is associated with clinical malignancy.
  • the present inventor conducted studies to improve the accuracy when quantifying sdLDL-C in a sample.
  • the remaining lipoproteins are determined by applying the first reagent composition to the sample (first step) and then applying the second reagent composition for quantifying sdLDL cholesterol (sdLDL-C).
  • the first reagent composition is highly selective in its action on LDL other than sdLDL.
  • the first reagent composition acts selectively on LDL other than sdLDL, and if the selectivity is too low, that is, the first reagent composition It has been found that if the reagent is likely to act on the target sdLDL, there is a concern that the accuracy of quantifying sdLDL-C in the sample in the second step will be reduced. Therefore, the present inventor conducted further studies to make the selectivity of the action of the first reagent composition more preferable, and found that the first reagent composition has a specific enzymatic activity and the contact angle falls within a specific range.
  • the first reagent composition contains a specific component and has a contact angle within a specific range, so it can be suitably used for quantifying sdLDL-C and improves the accuracy of sdLDL-C measurement. It can be made excellent.
  • the first reagent composition is used in combination with a second reagent composition described below to quantify sdLDL-C.
  • a second reagent composition described below to quantify sdLDL-C.
  • the reagent composition is used for quantifying small dense LDL cholesterol (sdLDL-C) after the step of causing the first reagent composition to act on the sample and the step of causing the first reagent composition to act on the sample.
  • sdLDL-C small dense LDL cholesterol
  • PET base material PET (amorphous polyester) resin plate, transparent, 2 mm thick
  • Pretreatment Wipe the surface of an unused PET base material with a 70% ethanol aqueous solution. Measurements are taken within 5 minutes after wiping.
  • Measurement method and conditions droplet method, ⁇ /2 method, temperature: 15 to 25°C, syringe: Teflon coated 18G, dropping method, dropped amount: 2 ⁇ L, measured 1 second after dropping.
  • Calculation of contact angle Measure 5 times and calculate the average value of the 5 times.
  • dust on the PET base material is wiped off before measurement. Static electricity affects the contact angle, so wipe it off to avoid friction as much as possible, and then take measurements within 5 minutes.
  • the contact angle is specifically a static contact angle measured by, for example, DMo-901, 701, 601, 501, DMC-MC3, etc. manufactured by Kyowa Kaimen Kagaku Co., Ltd.
  • the present inventors set the contact angle between the first reagent composition and the PET substrate within a specific range to improve reaction specificity (correlation with the standard method) and We have newly discovered that it is possible to quantify sdLDL-C with excellent accuracy after diluting the sample.
  • the reason for this is not necessarily clear, but it is thought to be as follows.
  • the first reagent composition eliminates cholesterol in lipoproteins other than sdLDL in the first step, but the contact angle may be related to the accuracy after sample dilution. There is.
  • the contact angle between the reagent composition and the PET substrate is 63.0° or more from the viewpoint of improving the reaction specificity (correlation with the standard method) of sdLDL-C measurement and the accuracy after diluting the sample. , preferably 63.8° or more.
  • the contact angle between the reagent composition and the PET substrate is 67.0° or less, preferably 66.5°.
  • the angle is preferably 66.0° or less, more preferably 66.0° or less.
  • the contact angle with the PET base material for example, by appropriately selecting the type, combination, amount, etc. of each component contained in the first reagent composition.
  • adjusting the type and amount of surfactant, the type and amount of enzyme or protein, etc. are listed as factors for adjusting the contact angle with the PET base material within a desired numerical range.
  • the first reagent composition is liquid.
  • the viscosity of the first reagent composition at 5°C may be, for example, 2.5 mPa ⁇ s or less, preferably 2.2 mPa ⁇ s. - s or less, more preferably 2.0 mPa ⁇ s or less.
  • the viscosity of the first reagent composition at 5° C. may be, for example, 1.6 mPa ⁇ s or more, or may be, for example, 1.8 mPa ⁇ s or more.
  • the viscosity of the first reagent composition at each temperature is measured by method 2 below.
  • method 2 sets the measurement temperature to 5°C
  • method 2-2 sets the measurement temperature to 37°C.
  • Equipment EMS viscometer (Electro Magnetically Spinning Viscometer)
  • Measurement method and conditions Measurement method: Electromagnetic spinning method, Motor rotation speed: 1000 rpm, Holding time: 600 seconds
  • Sequence loop 1 time
  • sample 500 ⁇ L
  • Calculation of viscosity Measurement is carried out 5 times, and the average value of the 5 times is calculated.
  • the viscosity is measured using, for example, EMS-1000 manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • the present inventors also discovered that among the reagents for measuring sdLDL-C, by setting the viscosity of the first reagent composition within a specific range, it is possible to quantify sdLDL-C with even greater accuracy. I found it. The reason for this is not necessarily clear, but it is thought to be as follows. In quantifying sdLDL-C, for example, a reagent probe sucks in a certain amount of the first reagent composition and discharges it into the reaction cell.
  • the first reagent composition contains a nonionic surfactant and has a specific enzyme activity
  • lipoproteins other than sdLDL in the sample are can be erased by acting on
  • cholesterol in lipoproteins other than sdLDL, especially cholesterol in lbLDL can be stably guided out of the reaction system.
  • the surfactant acts (reacts) means that the surfactant decomposes lipoproteins and the cholesterol in the lipoproteins is released.
  • a surfactant that acts (reacts) on lipoproteins other than sdLDL the surfactant is not required to not act on sdLDL at all, but only needs to act primarily on lipoproteins other than sdLDL.
  • a surfactant that acts (reacts) on LDL other than sdLDL it is sufficient that the surfactant primarily acts on LDL other than sdLDL.
  • “Elimination” means decomposing a substance in an analyte sample so that the decomposed product cannot be detected in the next step.
  • "erasing cholesterol in lipoproteins other than sdLDL” means decomposing lipoproteins other than sdLDL in a subject sample, and cholesterol in these lipoproteins, which is a degradation product, is not detected in the subsequent process. It means to do something like that.
  • "eliminating cholesterol in LDL other than sdLDL” refers to preventing cholesterol in LDL other than sdLDL in the subject sample from being detected in the subsequent steps.
  • to lead out of the reaction system means to remove cholesterol contained in HDL, VLDL, L LDL, etc. so that it does not affect the quantitative determination of sdLDL-C. This refers to eliminating cholesterol, aggregating it, or inhibiting it from reacting in later steps.
  • the components contained in the first reagent composition will be explained in more detail.
  • the first reagent composition includes at least a nonionic surfactant.
  • this surfactant is a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL, and more preferably a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL and does not act on sdLDL.
  • the nonionic surfactant is preferably a polyoxyethylene derivative, more preferably a polyoxyethylene polycyclic phenyl ether derivative, More preferably, it is one or two selected from the group consisting of polyoxyethylene benzyl phenyl ether derivatives and polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivatives, and more preferably polyoxyethylene monostyrenated phenyl ether (POE monostyrenated phenyl ether). ether). From the same viewpoint, it is also preferable that the nonionic surfactant includes a polyoxyethylene benzyl phenyl ether derivative and a polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative.
  • the POE monostyrenated phenyl ether may be composed of a plurality of compounds having different degrees of polymerization of the POE moiety.
  • the average degree of polymerization of oxyethylene is, for example, 1 or more, preferably 5 or more, more preferably 10 or more, and, for example, 100 or less, from the viewpoint of improving accuracy in quantifying sdLDL-C. , preferably 80 or less, more preferably 50 or less, still more preferably 40 or less, and may be, for example, 30 or less.
  • the average degree of polymerization is determined from the intensity of the oxyethylene signal of the POE monostyrenated phenyl ether measured by NMR.
  • the signal intensity of the methylene protons (4 pieces) of the POE moiety is 3.5 ppm based on the intensity of the protons (9 pieces) of the TMS group at 0.08 ppm. It can be calculated by the ratio of
  • the degree of polymerization of oxyethylene, a component constituting the POE monostyrenated phenyl ether is determined by structural analysis using liquid chromatography mass spectrometry.
  • each component will be separated.
  • LC liquid chromatography
  • QTOF mass spectrometer quadrupole time-of-flight mass spectrometer
  • a mass spectrum consisting of peaks spaced at 44 amu intervals can be obtained.
  • the degree of polymerization of oxyethylene in each component can be calculated by subtracting the mass number (MW 198) of monostyrenated phenol from the molecular weight estimated from the m/z of each peak and dividing by 44.
  • the composition of each component can be determined.
  • the degree of polymerization of oxyethylene can be analyzed.
  • the content of POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition is preferably 0.01% (w/v) based on the entire first reagent composition from the viewpoint of improving accuracy in quantifying sdLDL-C. ) or more, more preferably 0.03% (w/v) or more, still more preferably 0.05% (w/v) or more, even more preferably 0.1% (w/v) or more.
  • the content of POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition is preferably 0.6% (w/v) or less based on the entire first reagent composition, and more preferably Preferably it is 0.4% (w/v) or less, more preferably 0.35% (w/v) or less, even more preferably 0.3% (w/v) or less.
  • POE monostyrenated phenyl ether is available as an industrial raw material or a research reagent, and for example, a commercially available product can be used.
  • POE monostyrenated phenyl ether may be produced and used. Specifically, it can be produced by the following method and conditions. That is, POE monostyrenated phenyl ether is obtained by adding a predetermined amount of ethylene oxide to monostyrenated phenol in the presence of a basic catalyst.
  • the basic catalyst include sodium hydroxide, potassium hydroxide, and alkali metal alcoholates.
  • the addition reaction temperature is preferably 120 to 200°C.
  • styrenated phenol is obtained by alkylating phenol and styrene at a temperature of 70°C to 200°C under an acid catalyst.
  • the acid catalyst inorganic acids such as sulfuric acid and phosphoric acid, organic acids such as p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid, Lewis acids such as boron trifluoride diethyl ether complex, etc. can be used.
  • inorganic acids such as sulfuric acid and phosphoric acid
  • organic acids such as p-toluenesulfonic acid and methanesulfonic acid
  • Lewis acids such as boron trifluoride diethyl ether complex, etc.
  • Monostyrenated phenol is produced by, for example, adding styrene dropwise to phenol under a phosphoric acid catalyst to perform an alkyl reaction, and then adding a sulfuric acid or magnesium sulfate catalyst to remove unreacted phenol and styrene. It can be synthesized by completing the reaction.
  • the amount of phosphoric acid catalyst used is preferably 0.001 to 0.01 equivalent relative to phenol.
  • the amount of the sulfuric acid or magnesium sulfate catalyst used is preferably 2% by mass to 10% by mass based on the mass of the phosphoric acid catalyst.
  • the equivalent ratio of phenol to styrene is preferably 0.9 to 1.3 as the equivalent ratio of styrene to phenol.
  • POE monostyrenated phenyl ether can then be obtained by subjecting the obtained monostyrenated phenol and ethylene oxide to an addition reaction under heating and pressure using potassium hydroxide as a catalyst in a pressure-resistant container such as an autoclave.
  • the heating and pressurizing conditions are, for example, a pressure of about 1.5 kg/cm 3 and a temperature of about 130°C.
  • the number of repeating oxyethylene units, that is, the degree of polymerization of oxyethylene can be adjusted.
  • a mixture of monostyrenated phenol, distyrenated phenol with two styrenes bonded, and tristyrenated phenol with three styrenes bonded is obtained as the styrenated phenol, and monostyrenated phenol is extracted from the mixture. It can also be used after separation and purification.
  • the POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition can be confirmed, for example, by a method of analysis using a combination of IR, NMR, LC-MS, and the like.
  • methods for determining the structure of the POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition include analysis methods using LC/MS/MS and NMR.
  • the concentration of POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition can be calculated, for example, by HPLC or LC/MS measurement.
  • the concentration of POE monostyrenated phenyl ether in the first reagent composition can also be obtained by NMR measurement.
  • the concentration of the nonionic surfactant in the first reagent composition is determined from the viewpoint of stably acting the nonionic surfactant on lipoproteins other than sdLDL to further improve dilution linearity and accuracy after diluting the sample. It is preferably 0.01% (w/v) or more, more preferably 0.025 (w/v) or more, and even more preferably 0.03% (w/v) or more with respect to the total composition of the composition.
  • % (w/v) or less more preferably 0.875% (w/v) or less, even more preferably 0.75% (w/v) or less, even more preferably 0.6% (w/v) Hereinafter, it is even more preferably 0.3 (w/v) or less.
  • the nonionic surfactant in the first reagent composition can be identified, for example, by a method of analysis using a combination of IR, NMR, LC-MS, etc.
  • methods for determining the structure of the nonionic surfactant in the first reagent composition include analysis methods using LC-MSMS and NMR.
  • the first reagent composition has cholesterol esterase (CHE) activity, cholesterol oxidase (COO) activity, and sphingomyelinase (SMase) activity.
  • CHE cholesterol esterase
  • COO cholesterol oxidase
  • SMase sphingomyelinase
  • the first reagent composition can stably act on lipoproteins other than sdLDL and lead the cholesterol out of the reaction system.
  • the first reagent composition specifically includes an enzyme having cholesterol esterase activity, an enzyme having cholesterol oxidase activity, and an enzyme having sphingomyelinase activity.
  • the first reagent composition more specifically includes cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and sphingomyelinase.
  • cholesterol esterase cholesterol oxidase, peroxidase, and catalase, for example, those derived from bacteria or fungi, or those derived from plants can be used.
  • cholesterol esterase activity specifically means that cholesterol esterase is present and a reaction catalyzed by cholesterol esterase can occur. The same applies to other enzyme activities such as cholesterol oxidase activity.
  • the cholesterol esterase activity of the first reagent composition is preferably 50 U/L or more, more preferably 100 U/L or more, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. , also preferably 3000 U/L or less, more preferably 2500 U/L or less, still more preferably 2000 U/L or less, even more preferably 1000 U/L or less, and for example 1800 U/L or less, or, for example It may be 1500 U/L or less.
  • the cholesterol oxidase activity of the first reagent composition is preferably 100 U/L or more, more preferably 150 U/L or more, and preferably 800 U/L or less, more preferably 750 U/L. /L or less, even more preferably 700U/L or less, even more preferably 650U/L or less, still more preferably 600U/L or less.
  • the first reagent composition Since the first reagent composition has sphingomyelinase activity, in the step of liberating cholesterol in lipoproteins other than sdLDL and leading them out of the reaction system (first step described below), the first reagent composition contains cholesterol in lipoproteins other than sdLDL, especially L. The reactivity to LDL can be increased.
  • the sphingomyelinase activity of the first reagent composition is preferably 100 U/L or more, more preferably 200 U/L or more, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. It is also preferably 3000 U/L or less, more preferably 2800 U/L or less.
  • the first reagent composition preferably contains at least one activity selected from the group consisting of peroxidase (POD) activity and catalase activity, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. It also has.
  • the first reagent composition more preferably further includes at least one enzyme selected from the group consisting of an enzyme having peroxidase activity and an enzyme having catalase activity, and more preferably further includes at least one of peroxidase and catalase. , more preferably further comprises catalase.
  • the peroxidase activity of the first reagent composition is preferably 200 U/L or more, more preferably 300 U/L or more, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system, Moreover, it is preferably 3000 U/L or less, more preferably 2500 U/L or less, and also preferably, for example, 2000 U/L or less. Further, the peroxidase activity of the first reagent composition may be, for example, 5000 U/L or less, or, for example, 4000 U/L or less.
  • the catalase activity of the first reagent composition is intended to stably remove hydrogen peroxide generated when the first reagent composition is applied to a sample, and to more stably remove cholesterol in lipoproteins other than sdLDL in the sample. From the viewpoint of guiding it out of the reaction system, it is preferably 100 KU/L or more, more preferably 200 KU/L or more, and preferably 2000 KU/L or less, and more preferably 1500 KU/L or less.
  • the cholesterol oxidase activity, cholesterol esterase activity, sphingomyelinase activity, peroxidase activity, and calatase activity of the first reagent composition can be measured, for example, by the following methods.
  • a 6mM cholesterol solution (dissolved in isopropanol) is used as the substrate solution.
  • a diluent 0.1M phosphate buffer, Triton Add.
  • the mixed solution is reacted at 37° C. and the amount of change in absorbance at a wavelength of 240 nm is measured.
  • the amount of change in absorbance from 2 minutes to 7 minutes is measured, and cholesterol oxidase activity is calculated. For example, if the amount of change in absorbance is 3 U/L or more, it can be said that the measurement target has cholesterol oxidase activity, and more specifically, it can be said that cholesterol oxidase is contained.
  • substrate 0.04% cholesterol linolenate, 1% Triton 5mM EDTA ⁇ 2Na, 2mM MgCl 2 , 0.2% bovine serum albumin (BSA), pH 7.5
  • reaction solution 0.06% 4-aminoantipyrine, 0.4% phenol, 7.5KU/L peroxidase ( POD)
  • POD peroxidase
  • the measurement target After heating at 37°C for 2 minutes, 0.1 mL of the measurement target diluted with a diluent is added, the mixture is allowed to react at 37°C, and the amount of change in absorbance at a wavelength of 500 nm is measured. After the reaction at 37°C, the amount of change in absorbance from 0 minutes to 3.5 minutes is measured, and cholesterol esterase activity is calculated. For example, if the amount of change in absorbance is 8 U/L or more, it can be said that the measurement target has cholesterol esterase activity, and more specifically, it can be said that cholesterol esterase is contained.
  • the sphingomyelinase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, reaction solution (0.008% sphingomyelin, 0.05% Triton Mixture solution), reaction stop solution (1% sodium dodecyl sulfate solution), and diluent solution (10 mM Tris buffer, 0.1% TritonX100, pH 8.0) are used. 0.08 mL of the reaction solution and 0.003 mL of the measurement target diluted with the diluent are mixed, heated at 37° C. for 5 minutes, and then 0.16 mL of the reaction stop solution is added.
  • reaction solution 0.008% sphingomyelin, 0.05% Triton Mixture solution
  • reaction stop solution 1% sodium dodecyl sulfate solution
  • diluent solution 10 mM Tris buffer, 0.1% TritonX100, pH 8.0
  • the amount of change in absorbance at the main wavelength of 546 nm and the sub wavelength of 700 nm is measured, and the sphingomyelinase activity is calculated. For example, if the amount of change in absorbance is 2 U/L or more, it can be said that the measurement target has sphingomyelinase activity, and more specifically, it can be said that sphingomyelinase is contained.
  • the amount of change in absorbance from 2 minutes to 5 minutes is measured and the peroxidase activity is calculated. For example, if the amount of change in absorbance is 10 U/L or more, it can be said that the measurement target has peroxidase activity, and more specifically, it can be said that peroxidase is contained.
  • the catalase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, a substrate (0.06% hydrogen peroxide, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) is used in catalase activity measurement. After prewarming 2.0 mL of the substrate solution at 25° C., it is mixed with 0.1 mL of the measurement target, and the amount of change in absorbance at 240 nm is measured. For example, after a reaction at 25°C, the amount of change in absorbance from 0 minutes to 3 minutes is measured to calculate catalase activity. For example, if the amount of change in absorbance is 50 U/L or more, it can be said that the measurement target has catalase activity, and more specifically, it can be said that catalase is contained.
  • the first reagent composition may further have other enzyme activities, specifically one or more enzyme activities selected from the group consisting of ascorbate oxidase activity and lipoprotein lipase (LPL) activity. You may further have. Further, the first reagent composition may contain, for example, an enzyme having one or more enzyme activities selected from the group consisting of an enzyme having ascorbic acid oxidase activity and an enzyme having lipoprotein lipase activity. contains one or more enzymes selected from the group consisting of ascorbate oxidase and lipoprotein lipase.
  • the ascorbic acid oxidase activity of the first reagent composition is preferably 0.1 U/mL or more, more preferably 0.1 U/mL or more, from the viewpoint of avoiding the influence of ascorbic acid coexisting in the sample on measurement accuracy. It is 2 U/mL or more, preferably 15 U/mL or less, and more preferably 10 U/mL or less.
  • the ascorbic acid oxidase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, in the ascorbic acid oxidase activity measurement, a substrate (10 mM ascorbic acid solution-0.13 mM EDTA diluted 20 times with 90 mM KH 2 PO 4 -5 mM NaHPO 4 ) is used. 1 mL of the substrate is prewarmed at 30° C., and after 5 minutes, 0.1 mL of the measurement target diluted with 90 mM NaHPO 4 solution containing 0.05% BSA is added and mixed to start the reaction.
  • a substrate (10 mM ascorbic acid solution-0.13 mM EDTA diluted 20 times with 90 mM KH 2 PO 4 -5 mM NaHPO 4 ) is used. 1 mL of the substrate is prewarmed at 30° C., and after 5 minutes, 0.1 mL of the measurement target diluted with 90 mM NaHPO 4 solution containing 0.05% B
  • reaction stop solution 0.2N HCl
  • absorbance at 245 nm is measured to calculate ascorbic acid oxidase activity. For example, if the activity amount is 10 U/L or more, it can be said that the measurement target has ascorbic acid oxidase activity, and more specifically, it can be said that "ascorbic acid oxidase" is included.
  • the lipoprotein lipase activity of the first reagent composition is preferably 2 U/mL or more, more preferably 50 U/mL or more, and preferably 300 U/mL, from the viewpoint of preferably adjusting the action on various lipoproteins. or less, more preferably 200 U/mL or less.
  • the lipoprotein lipase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, in the measurement of lipoprotein lipase activity, an olive oil emulsion solution (5 g of olive oil, 2 mL of ethanol, 5 mL of 5.0% Triton Add 15 mL of liquid pH 7.0 and stir at room temperature for 1 to 2 hours). Add a diluted solution (20mM phosphate buffer, 2mM MgCl 2 , 0.5mM EDTA-2Na, pH 7.5) to the substrate solution pre-warmed at 37°C for 5 minutes to a concentration of 0.9 to 1.6U/mL.
  • reaction stop solution 0.2M trichloroacetic acid
  • Coloring reagents 200 mL of 50 mM MES-NaOH buffer, 4 mL of 5 % Triton ⁇ Add 3.0 mL of 6H 2 O 40.7 mg, glycerol kinase 200 U, La glycerophosphate oxidase 500 U, peroxidase 300 U), react the mixture at 37°C for 15 minutes, measure the absorbance at a wavelength of 545 nm, and calculate the lipoprotein lipase activity. do. For example, if the amount of change in absorbance is 3 U/L or more, it can be said that the measurement target has lipoprotein lipase activity, and more specifically, it can be said that lipoprotein lipase is contained.
  • Lipoprotein lipase is not limited as long as it is an enzyme capable of degrading lipoproteins, and for example, lipoprotein lipase derived from animals or microorganisms can be used.
  • the enzymes in the first reagent composition and the second reagent composition described below can also be identified by the following method. That is, first, a fragment peptide obtained by decomposing a sample containing the target enzyme with trypsin is detected using a hybrid mass spectrometer. The mass of the peptide obtained by a mass spectrometer and the spectrum of fragment ions (MS/MS data) obtained by colliding with argon gas in the mass spectrometer are searched in a database (for example, Mascot search) to determine the protein content. can be identified. If the sequence of the fragment peptide derived from the amino acid sequence in the reagent composition matches the amino acid sequence registered in the database as a unique sequence, it can be considered that the target enzyme is contained.
  • a database for example, Mascot search
  • the enzymes in the first reagent composition and the second reagent composition described below can be identified, for example, by the following quantitative method. That is, among the fragment peptides obtained by decomposing the target enzyme with trypsin, a peptide that is specific to the target enzyme and gives a strong signal in mass spectrometry is selected as a peptide to be quantified. Regarding the peptide to be quantified, an unlabeled peptide and a peptide labeled with a stable isotope as an internal standard are produced by chemical synthesis.
  • a sample containing the target enzyme was completely digested with trypsin, a known amount of stable isotope-labeled peptide was added, and the sample was digested in MRM mode ( Measure in multiple reaction monitoring mode).
  • MRM mode Measure in multiple reaction monitoring mode.
  • a mixture of the unlabeled peptide to be quantified and a known amount of stable isotope-labeled peptide is measured in the same way, and a calibration curve of the internal standard concentration ratio and peak area ratio is created to determine the absolute amount of the peptide to be quantified in the sample.
  • the target enzyme can be quantified by calculating .
  • the first reagent composition may contain components other than those described above.
  • Other components include, for example, buffers, salts, proteins without enzymatic activity, preservatives such as sodium azide, hydrogen donors, and couplers.
  • the type of buffer solution can be selected as appropriate, for example.
  • Specific examples of buffers include MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer, phosphate buffer, Tris buffer, PIPES (piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)) buffer, HEPES ( Examples include 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer.
  • the concentration of the buffer is preferably 1 mM or more, more preferably 5 mM or more, and even more preferably 10 mM or more, from the viewpoint of retaining the enzyme activity in the composition and improving the storage stability of the reagent. Further, it is preferably 300mM or less, preferably 200mM or less, more preferably 150mM or less, and even more preferably 100mM or less.
  • the salt is blended as a pH adjuster or an ionic strength adjuster.
  • Specific examples of salts include basic substances such as sodium salts such as sodium hydroxide and sodium sulfate; potassium salts such as potassium hydroxide; magnesium salts such as magnesium chloride and magnesium sulfate; and ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium chloride. It will be done.
  • the first reagent composition contains at least one of a monovalent cation and a divalent cation, or a salt thereof, separation of sdLDL and L LDL becomes easier.
  • the salt concentration in the first reagent composition is preferably 2 mmol/L or more based on the total composition of the first reagent composition, from the viewpoint of stably acting as a pH adjuster or an ionic strength adjuster. It is more preferably 5 mmol/L or more, more preferably 50 mmol/L or less, and more preferably 30 mmol/L or less.
  • the first reagent composition preferably contains at least one of a hydrogen donor and a coupler, more preferably one of a hydrogen donor and a coupler.
  • the hydrogen donor or the coupler is used in the first step to guide cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. More specifically, either a hydrogen donor or a coupler is used to cause cholesterol esterase or cholesterol oxidase to act on cholesterol in lipoproteins other than sdLDL, and convert the generated hydrogen peroxide into colorless quinone in the presence of peroxidase. is used.
  • hydrogen donors include N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)- 3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOPS), N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-(3-sulfopropyl)aniline (HALPS), N-(3-sulfopropyl)-3-methoxy-5-aniline (HMMPS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3- Examples include aniline derivatives such as sulfopropyl)-4-fluoro-3,5-dimethoxyaniline (FDAOS) and N-ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'-succinyl
  • a coupler used in the coupling reaction is included in the first reagent composition.
  • couplers that can be used include, but are not limited to, 4-aminoantipyrine (4AA), aminoantipyrine derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone, and sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone.
  • the concentration of the coupler in the first reagent composition is preferably 0.2 mM or more, more preferably 0.2 mM or more, from the viewpoint of stably acting on sdLDL with respect to the entire reaction solution composition after addition of the first reagent composition. It is 0.3mM or more, preferably 5.0mM or less, and more preferably 3.3mM or less.
  • the kit is used for quantifying sdLDL-C in a sample, and includes the above-described first reagent composition and a second reagent composition for quantifying sdLDL-C. Further, the kit is specifically used in a method for quantifying sdLDL-C that includes two or more steps. At this time, the first and second reagent compositions are used in different steps, and preferably the first and second reagent compositions are used in this order.
  • the structure of the second reagent composition will be explained in more detail.
  • the second reagent composition is a reagent composition for quantifying sdLDL-C.
  • the components of the second reagent composition vary depending on the composition of the first reagent composition, but any composition that can quantify sdLDL-C may be used, and known substances can be used.
  • the second reagent composition examples include enzymes, buffers, salts, surfactants, proteins that do not have enzymatic activity, preservatives, and either one of a hydrogen donor and a coupler.
  • the first reagent composition contains one of the hydrogen donor and the coupler and does not contain the other
  • the second reagent composition contains one of the hydrogen donor and the coupler but does not contain the other. including.
  • the second reagent composition has, for example, peroxidase activity.
  • the peroxidase activity of the second reagent composition is preferably 500 U/L or more, more preferably 1000 U/L or more, and preferably 10000 U/L. L or less.
  • the peroxidase activity is carried over to the second step, so the concentration in the second reagent can be reduced or it can be omitted.
  • the pH of the second reagent composition is preferably 6.0 or higher, more preferably 6.5 or higher, from the viewpoint of retaining the enzyme activity in the composition and improving the storage stability of the reagent. , preferably 8.0 or less, more preferably 7.5 or less.
  • the second reagent composition preferably contains a surfactant that acts on sdLDL.
  • the surfactant that acts on sdLDL may be a surfactant that selectively acts on sdLDL, such as a surfactant that acts only on sdLDL, a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL, or a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL, or all surfactants that act on lipoproteins other than sdLDL. It may also be a surfactant that acts on lipoproteins.
  • Examples of the surfactant in the second reagent composition include polyoxyethylene derivatives, and surfactants used in commercially available reagents for measuring total cholesterol and the like can be used.
  • Examples of such surfactants include polyoxyethylene alkyl phenyl ethers such as polyoxyethylene octylphenyl ether (for example, Emulgen 909 (manufactured by Kao Corporation), Triton X-100), polyoxyethylene alkyl ethers (for example, Emulgen 707, Emulgen 709 (manufactured by Kao Corporation).
  • the coupler is preferably 4-aminoantipyrine (4-AA), an aminoantipyrine derivative, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone, sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone.
  • the concentration of the coupler in the second reagent composition is preferably 0.5 mM or more, more preferably It is 1.0mM or more, preferably 15mM or less, and more preferably 10mM or less.
  • the hydrogen donor is preferably included in the second reagent composition.
  • Specific examples of the hydrogen donor include those described above for the first reagent composition.
  • the concentration of the hydrogen donor in the reagent is preferably 3 mM or more, more preferably 4. It is 5mM or more, preferably 15mM or less, and more preferably 12mM or less.
  • proteins and preservatives that do not have enzymatic activity include those mentioned above for the first reagent composition.
  • the method in this embodiment is a method for quantifying sdLDL-C in a sample using the first and second reagent compositions described above.
  • the quantitative method in this embodiment includes the following first step and second step.
  • (1st step) A step of allowing the above-mentioned first reagent composition to act on the sample (2nd step) After the 1st step, by allowing the above-mentioned second reagent composition to act, cholesterol in the remaining lipoproteins is removed.
  • Step of quantifying the compositions of the first and second reagent compositions are as described above.
  • by using the first reagent composition of the present embodiment it is possible to perform measurements with excellent accuracy and specificity after diluting the specimen. It also becomes possible to stably quantify sdLDL-C as a reagent with a high correlation.
  • the method for quantifying sdLDL-C may be carried out by, for example, adding the first reagent composition to a sample (analyte sample) and reacting it, then adding the second reagent composition and reacting it, and measuring the absorbance.
  • the subject sample is, for example, a blood-derived sample such as serum or plasma, and preferably serum.
  • the first and second steps are typically performed in an automated analyzer.
  • the amount of the sample and the amount of each reagent composition can be appropriately determined by taking into account, for example, the concentration of the reagent in each reagent composition, but are determined within the range applicable to the automatic analyzer. For example, 1 to 10 ⁇ L of the analyte sample, 50 to 300 ⁇ L of the first reagent, and 25 to 200 ⁇ L of the second reagent may be used.
  • Each step will be explained in more detail below.
  • the first reagent composition is applied to the sample.
  • lipoproteins other than sdLDL are eliminated, and cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is released and guided out of the reaction system.
  • a surfactant that preferably acts on lipoproteins other than sdLDL is allowed to act on the sample in the presence of sphingomyelinase and cholesterol esterase. Cholesterol generated by release from lipoproteins is then reacted with an enzyme that reacts with cholesterol, such as cholesterol oxidase, and guided out of the reaction system.
  • the first step for example, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is eliminated and led out of the reaction system, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is aggregated, and cholesterol is inhibited so that it does not react in a later step.
  • Known techniques can be used.
  • the step of erasing cholesterol generated from lipoproteins other than sdLDL and guiding it out of the reaction system includes, for example, sphingomyelinase in the first reagent composition, It may include forming a colorless quinone in the presence of hydrogen peroxide generated by cholesterol esterase activity and cholesterol oxidase activity, and an electron donor.
  • At least one of monovalent cations and divalent cations or salts thereof may be further added to the reaction solution as an ionic strength adjusting agent.
  • an ionic strength regulator By adding an ionic strength regulator, it becomes easier to differentiate between sdLDL and LLDL.
  • sdLDL-C remaining after the first step is quantified.
  • a conventional method for quantifying LDL can be used. For example, a method of quantifying the content of LDL-specific aggregates formed by adding an LDL aggregating agent by turbidimetry, a method of using an antigen-antibody reaction using an LDL-specific antibody, and a method of quantifying degradation products using an enzyme. There are ways to do this.
  • the quantitative method is selected depending on, for example, the components and composition contained in the second reagent composition.
  • the enzyme can be used to quantify the decomposition product.
  • a second reagent composition containing one or more enzymes for measuring cholesterol selected from the group consisting of cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, and peroxidase is added to the reaction solution after the first step.
  • sdLDL-C is released and degraded, and the reaction product is quantified.
  • the reaction temperature in each step is preferably 2°C to 45°C, more preferably 25°C to 40°C.
  • the reaction time for each step is preferably 1 to 10 minutes, more preferably 3 to 7 minutes.
  • Examples of automatic analyzers used for quantifying sdLDL-C include TBA-120FR, TBA-200FR (manufactured by Toshiba Corporation), JCA-BM1250, JCA-BM1650, JCA-BM2250 (manufactured by JEOL Ltd.), and HITACHI7180. , HITACHI7170 (manufactured by Hitachi), AU2700, AU5800, AU680 (manufactured by OLYMPUS), cobas c501, cobas c701 (manufactured by Roche), and the like.
  • Quantification of sdLDL-C is carried out, for example, by measuring absorbance in a wavelength range of 580 to 720 nm, preferably in a wavelength range of 600 to 700 nm.
  • Examples 1 to 7, Comparative Examples 1 and 2 A first reagent composition of each example with varying contact angles was prepared and combined with a second reagent composition to quantify sdLDL-C. The gender) was evaluated.
  • a first reagent composition and a second reagent composition of each example were prepared by blending each component shown below at the following concentrations.
  • each composition was prepared by changing the type and concentration of the nonionic surfactant.
  • the compositions of the first reagent composition and second reagent composition used in the measurement are shown below.
  • Nonionic surfactant First reagent compositions a to i were prepared using a polyoxyethylene benzyl phenyl ether derivative and a polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative and varying the amounts added.
  • sdLDL-C sdLDL-C was measured using the first reagent composition and the second reagent composition of each example. Specifically, a first reagent composition and a second reagent composition having different contact angles were prepared for each example. Add 150 ⁇ L of the first reagent composition to 3 ⁇ L of serum sample and react at 37°C for 5 minutes, then add 50 ⁇ L of the second reagent composition and react for 5 minutes. Measure the absorbance at the main wavelength of 600 nm and secondary wavelength of 700 nm, and calibrate. The sdLDL-C concentration was calculated from the line.
  • a visually transparent PET (amorphous polyester) resin board manufactured by Takiron C.I., PET board (PETEC) product number 6010, thickness 2 mm
  • the surface of an unused PET base material was wiped with a 70% ethanol aqueous solution, and measurements were performed within 5 minutes thereafter.
  • a contact angle meter manufactured by Kyowa Kaimen Kagaku Co., Ltd., DMo-501
  • temperature: 15 to 25°C, syringe: Teflon coat 18G dropping method
  • dropping amount dropping amount: 2 ⁇ L.
  • the contact angle was measured 1 second after dropping.
  • Each example was measured five times, and the average value of the five measurements was calculated. The measurement results are shown in Table 1.
  • FIGS. 1(a) to 1(i) A summary of the measurement results is shown in Table 1. Further, detailed data of each example is shown in FIGS. 1(a) to 1(i). In FIGS. 1(a) to 1(i), the horizontal axis indicates the measured value of the sample before dilution, and the vertical axis indicates the measured value after diluting the sample multiplied by a dilution factor of 2. The evaluation criteria are shown below.
  • FIGS. 2(a) to 2(i) A summary of the measurement results is shown in Table 1. Further, detailed correlation data for each example is shown in FIGS. 2(a) to 2(i). The horizontal axis in FIGS. 2(a) to 2(i) shows the sdLDL-C value calculated by the ultracentrifugation method, which is the standard method, and the vertical axis shows the sdLDL-C value in each example.
  • the evaluation criteria are shown below. Those with the following evaluations of A and B were deemed to have passed.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship with the correlation coefficient when reagent compositions are arranged in order from those with larger contact angles to those with smaller contact angles. The results showed that the correlation coefficients were higher for the contact angles of reagent compositions b to h.
  • FIGS. 4(a) to 4(d) A summary of the measurement results is shown in Table 1, and detailed data are shown in FIGS. 4(a) to 4(d).
  • the horizontal axis (dilute Lv.) shows the dilution series of high-concentration samples
  • the vertical axis shows the sdLDL-C value. show.
  • the horizontal axis (dilute Lv.) indicates the dilution series of the high concentration sample
  • the vertical axis (Nonlinearity [mg/dL]) indicates the sdLDL-C value. shows nonlinearity.
  • Nonlinearity value (circle plot in the right figure of Figure 4) is within the permissible range at all points (inside the two solid lines in the right figure of Figure 4: Linear fit sdIf LDL-C ⁇ 30 mg/dL, ⁇ 3 mg/dL, Linear fit sdLDL-C ⁇ 30 mg/dL (within ⁇ 10%) Fit sdLDL-C ⁇ 30mg/dL ⁇ 3mg/dL, Linear fit sdLDL-C ⁇ 30mg/dL ⁇ 10%)
  • Example 8 (Preparation of reagent composition)
  • the first reagent composition of each example was prepared by blending the components shown below at the following concentrations and changing the type of surfactant.
  • the composition of the first reagent composition is shown below.
  • Example 8 POE monostyrenated phenyl ether, degree of polymerization of POE 11-33
  • Example 9 POE monostyrenated phenyl ether, degree of polymerization of POE 13-37
  • Example 10 Polyoxyethylene benzyl phenyl ether derivative
  • Table 3 also shows the contact angle and viscosity measurement results (Table 1) of Example 4 described above. Further, detailed data is shown in FIGS. 5(a) and 5(b). 5(a) and 5(b) are the measurement results of the first reagent composition having the same formulation as Example 4 and Comparative Example 3, respectively.

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Abstract

第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、第１試薬組成物を試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、を含む、試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、ノニオン界面活性剤を含み、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有し、試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６３．０°以上６７．０°以下である、試薬組成物。

Description

試薬組成物およびキット
　本発明は、試薬組成物およびキットに関する。
　ＬＤＬコレステロールの測定方法に関する技術として、特許文献１（特開２０００－３２５０９７号公報）に記載のものがある。同文献には、リポ蛋白質を含有する試料に、酵素と第１界面活性剤を加えることによりＨＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第１工程、次いで、第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第２工程、及び第１または第２工程において、酵素との反応により消費される化合物または生成される化合物を測定することにより、ＨＤＬコレステロール及び／またはＬＤＬコレステロールを測定することを含むリポ蛋白質コレステロールの測定方法について記載されており、かかる方法では、反応液の濁度を上昇させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせず、使用する酵素に制限がない上、ＬＤＬコレステロールを反応させる工程で新たに別の酵素を加える必要もなく、簡便でかつ安価にＬＤＬコレステロールを定量することができ、また必要に応じてＨＤＬコレステロールを光学的な測定を妨害するリポ蛋白質の凝集を形成することなく正確かつ安価に測定することができる測定方法及び測定試薬を提供することができるため、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野に有用であるとされている。
特開２０００－３２５０９７号公報
　本発明者らは、ＬＤＬコレステロールの中でも、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を測定することを検討した。すると、特許文献１に記載の技術においては、反応特異性（具体的には基準法との相関性）、および検体希釈後の正確性の点で改善の余地があることが見出された。
　本発明は、検体希釈後の正確性、および特異性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供するものである。
　本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量の反応特異性（具体的には基準法との相関性）、および検体希釈後の正確性を向上すべく検討した。その結果、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる試薬組成物の接触角を特定の範囲とすることにより、基準である超遠心法との相関性が良好であり、検体希釈後の正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明によれば、以下の試薬組成物およびキットが提供される。
［１］　第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
　第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
　ノニオン界面活性剤を含み、
　コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有し、
　以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６３．０°以上６７．０°以下である、試薬組成物。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロン（登録商標、以下同じ。）コート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
［２］　以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．５ｍＰａ・ｓ以下である、［１］に記載の試薬組成物。
（方法２－１）
（１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［３］　以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が１．０５ｍＰａ・ｓ以下である、［１］または［２］に記載の試薬組成物。
（方法２－２）
（１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［４］　前記ノニオン界面活性剤がポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルを含む、［１］乃至［３］いずれか一つに記載の試薬組成物。
［５］前記ポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルにおけるポリオキシエチレンの重合度ｎが５以上８０以下である、［４］に記載の試薬組成物。
［６］　当該試薬組成物中の前記ポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルの含有量が当該試薬組成物全体に対して０．０５％（ｗ／ｖ）以上０．６％（ｗ／ｖ）以下である、［４］または［５］に記載の試薬組成物。
［７］　当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、［１］乃至［６］いずれか一つに記載の試薬組成物。
［８］　当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、［１］乃至［７］いずれか一つに記載の試薬組成物。
［９］当該試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性をさらに有する、［１］乃至［８］いずれか一つに記載の試薬組成物。
［１０］　［１］乃至［９］いずれか一つに記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
　前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
［１１］　前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、［１０］に記載のキット。
　本発明によれば、反応特異性（具体的には基準法との相関性）、および検体希釈後の正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供することができる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の検体希釈後の正確性の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の反応特異性（基準法との相関性）の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の反応特異性（基準法との相関における相関係数）と接触角との関連性を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の希釈直線性の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の希釈直線性の評価結果を示す図である。
　以下、実施の形態について説明する。本実施形態において、測定試薬等の組成物は、各成分を単独でまたは２種以上を組み合わせて含むことができる。また、本明細書において、数値範囲の「ｘ～ｙ」は「ｘ以上ｙ以下」を表し、下限値ｘおよび上限値ｙをいずれも含む。
　はじめに、リポタンパク質について説明する。
　リポタンパク質は、大きくVery Low Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh Density Lipoprotein（ＨＤＬ）の分画に分けられ、ＬＤＬはさらにsmall dense ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）とそれ以外の亜分画に分けられる。ｓｄＬＤＬを小粒子ＬＤＬ、small ＬＤＬ（ＳＬＤＬ）、dense ＬＤＬ、small, dense ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをlarge ＬＤＬ（Ｌ　ＬＤＬ）、Light ＬＤＬと呼ぶこともある。
　これらのリポタンパク質の分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。
　リポタンパク質の粒子サイズの直径については、報告者により異なるが、たとえば、ＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（または３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（または１９ｎｍ～３０ｎｍ）であり、ＨＤＬが７～１０ｎｍである。
　リポタンパク質の比重については、たとえば、ＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１である。
　リポタンパク質のうち、ＬＤＬ粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition、Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS:TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定できる。また、比重は、たとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。
　本実施形態において、測定しようとするｓｄＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０～約２５．５ｎｍの亜分画、または、比重１．０４０～１．０６３の亜分画を指す。
　ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものがとりわけ悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０～１．０６３という値もｓｄＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９～１．０６３を中央点で分けた高比重側の値である。たとえば、ｓｄＬＤＬの比重について、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のｓｄＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
　本明細書において、ｓｄＬＤＬという場合、具体的には、ＬＤＬのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいものをいう。また、ｓｄＬＤＬは、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より高い比重範囲に属するもの、より好ましくは比重１．０４４～１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。また、ＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、ＶＬＤＬまたはＨＤＬを指し、さらにカイロミクロン、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）を含めることもある。
　本発明者は、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する際の正確性を向上すべく検討した。その結果、第１試薬組成物を試料に作用させる工程（第１工程）と、その後、ｓｄＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程（第２工程）と、を含む方法によりｓｄＬＤＬ－Ｃを定量しようとすると、第１工程において、第１試薬組成物のｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬへの作用の選択性を高度に制御することが重要であることが明らかになった。さらに具体的には、第１工程において、第１試薬組成物がｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬに選択的に作用することが重要であって、選択性が低すぎると、すなわち、第１試薬組成物が測定対象であるｓｄＬＤＬにも作用しやすい試薬であると、第２工程での試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの定量の正確性が低下する懸念があることがわかった。
　そこで、本発明者は、第１試薬組成物の作用の選択性をより好ましいものとすべくさらに検討したところ、第１試薬組成物が特定の酵素活性を有するとともに、接触角が特定の範囲にある構成とすることにより、ｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬに高い選択性で作用し、反応特異性（基準法との相関性）および検体希釈後の正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となる第１試薬組成物が安定的に得られることを見出した。
　本実施形態において、第１試薬組成物は、特定の成分を含むとともに接触角が特定の範囲にあるため、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に好適に用いることができ、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定の正確性を優れたものとすることができる。
　たとえば、第１試薬組成物は、後述する第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられる。
　以下、各試薬組成物についてさらに具体的に説明する。
　（試薬組成物（第１試薬組成物））
　本実施形態において、試薬組成物は、第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、第１試薬組成物を試料に作用させる工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、を含む、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の第１試薬組成物として用いられる試薬組成物である。
　以下、第１試薬組成物として用いられる試薬組成物を、単に「第１試薬組成物」とも呼ぶ。
　第１試薬組成物は、ノニオン界面活性剤を含み、コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する。そして、以下の方法１により測定される、第１試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６３．０°以上６７．０°以下である。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
　上記（２）では、ＰＥＴ基材の塵などを測定前に拭き取る。静電気は接触角に影響するため、極力摩擦などが発生しないよう拭き取り、その後５分以内に測定を実施する。
　本実施形態において、接触角は、具体的にはたとえば協和界面化学社製ＤＭｏ－９０１、７０１、６０１、５０１、ＤＭＣ－ＭＣ３等により測定される静的接触角である。
　本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角を特定の範囲とすることにより、反応特異性（基準法との相関性）、および検体希釈後の正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、たとえば、第１試薬組成物は第１工程でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク中コレステロールを消去するが、その際接触角が検体希釈後の正確性に関連している可能性がある。理由は明らかではないが、検体を希釈した際に検体に含まれる蛋白質成分や測定対象（ｓｄＬＤＬ）が希釈されてしまうため、第１試薬生成物と混合された際にその影響で誤ってｓｄＬＤＬが反応し、ｓｄＬＤＬ－Ｃが消去されてしまう可能性がある。接触角を制御することにより、この誤った反応が抑制されるため、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを想定できると考えられる。また接触角が特定の範囲から外れた場合、希釈していない検体でも第１工程で第１試薬組成物と混合された際に検体中に含まれるリポタンパク質と第１試薬組成物中のノニオン界面活性剤や特定の酵素との反応が変化してしまうことが予想される。この誤った反応により正確なｓｄＬＤＬ－Ｃの測定が難しく、反応特異性に関する基準法との相関性が低下すると考えられる。ここで、基準法とは具体的には超遠心法である。
　試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の反応特異性（基準法との相関性）、および検体希釈後の正確性をより高める観点から、６３．０°以上であり、好ましくは６３．８°以上である。
　また、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の反応特異性（基準法との相関性）をより高める観点から、試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、６７．０°以下であり、好ましくは６６．５°以下、より好ましくは６６．０°以下である。
　本実施形態では、たとえば第１試薬組成物に含まれる各成分の種類、組み合わせ、配合量等を適切に選択することにより、ＰＥＴ基材との接触角を制御することが可能である。これらの中でも、たとえば界面活性剤の種類や配合量、酵素やタンパク質の種類や配合量を調整すること等が、ＰＥＴ基材との接触角を所望の数値範囲とするための要素として挙げられる。
（粘度）
　第１試薬組成物の性状は、具体的には液体である。
　第１試薬組成物の５℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、第１試薬組成物の５℃における粘度は、たとえば２．５ｍＰａ・ｓ以下であってよく、好ましくは２．２ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２．０ｍＰａ・ｓ以下である。
　また、第１試薬組成物の５℃における粘度は、たとえば１．６ｍＰａ・ｓ以上であってよく、また、たとえば１．８ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。
　第１試薬組成物の３７℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、好ましくは１．０５ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは１．００ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは０．９５ｍＰａ・ｓ以下である。
　また、第１試薬組成物の３７℃における粘度は、たとえば０．８０ｍＰａ・ｓ以上であってもよく、また、たとえば０．９０ｍＰａ・ｓ以上であってよい。
　ここで、各温度における第１試薬組成物の粘度は、以下の方法２により測定される。方法２において、測定温度を５℃とするのが方法２－１であり、３７℃とするのが方法２－２である。
（方法２）
（１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃（方法２－１）および３７℃（方法２－２）、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
　本実施形態において、粘度は、たとえば京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００等により測定される。
　本発明者らは、またｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物の粘度を特定の範囲とすることにより、さらに正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、測定の際にはたとえば試薬プローブが一定量の第１試薬組成物を吸い込み反応セル内に吐出する。ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する工程に用いる第１試薬組成物の粘度が高すぎる場合、粘性により吐出量が変わり消去量が変動する可能性があるが、粘度を的確に制御することにより試薬の液離れを適切に制御できるため、その結果、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを測定できると考えられる。
　第１試薬組成物は、ノニオン界面活性剤を含むとともに、特定の酵素活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用して消去することができる。また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール、中でもｌｂ　ＬＤＬ中のコレステロールを安定的に反応系外に導くことができる。
　ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポタンパク質を分解し、リポタンパク質中のコレステロールが遊離することをいう。たとえば、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がｓｄＬＤＬに全く作用しないことは要求されず、主にｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用すればよい。「ｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬに作用（反応）する界面活性剤」という場合も同様に、界面活性剤が主にｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬに作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を分解し、その分解産物であるこれらリポタンパク質中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。「ｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬ中のコレステロールを消去する」についても同様に、被検体試料中のｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬ中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。
　「反応系外に導く」とは、具体的には、ＨＤＬやＶＬＤＬ、Ｌ　ＬＤＬなどに含まれるコレステロールがｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に影響を及ぼさないように、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌ　ＬＤＬなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりすることをいう。
　以下、第１試薬組成物に含まれる成分をさらに具体的に説明する。
（界面活性剤）
　第１試薬組成物は、少なくともノニオン界面活性剤を含む。この界面活性剤は、具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤であり、より好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用するとともにｓｄＬＤＬに作用しない界面活性剤である。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の検体希釈後の正確性、および特異性をより高める観点から、ノニオン界面活性剤は、好ましくはポリオキシエチレン誘導体であり、より好ましくはポリオキシエチレン多環フェニルエーテル誘導体であり、さらに好ましくはポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体およびポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体からなる群から選択される一種または二種であり、より好ましくはポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテル（ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテル）を含む。同様の観点から、ノニオン界面活性剤がポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体およびポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体を含むことも好ましい。
　ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルは、ＰＯＥ部分の重合度の異なる複数の化合物で構成されてもよい。このとき、オキシエチレンの平均重合度は、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量における正確性向上の観点から、たとえば１以上であり、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上であり、また、たとえば１００以下であり、好ましくは８０以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは４０以下であり、また、たとえば３０以下であってもよい。
　ここで、平均重合度は、ＮＭＲにより測定されるＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルのオキシエチレンシグナルの強度から求められる。たとえば、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルのＴＭＳ誘導体のＮＭＲスペクトルにおいて、０．０８ｐｐｍのＴＭＳ基のプロトン（９個）の強度を基準にして３．５ｐｐｍのＰＯＥ部分のメチレンプロトン（４個）のシグナル強度の比により計算できる。
　また、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量における正確性をより安定的に向上する観点から、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルにおけるオキシエチレンの平均重合度ｎがｎ＝１０～２０である化合物からなる群から選択される一種以上を含むことが好ましい。
　ここで、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルを構成する成分のオキシエチレンの重合度は、液体クロマトグラフ質量分析による構造解析によって求められる。たとえば、液体クロマトグラフ（ＬＣ）により、第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルを分離したのちに、四重極飛行時間型質量分析計（ＱＴＯＦ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）に導入すると、成分ごとのオキシエチレンの重合度の違いにより４４ａｍｕ間隔のピークからなるマススペクトルが得られる。それぞれのピークのｍ／ｚから推定される分子量からモノスチレン化フェノールの質量数（ＭＷ１９８）を減算し、４４で除することにより各成分のオキシエチレンの重合度を計算できる。さらに、ピークごとに精密質量より得られた組成式からモノスチレン化フェノールの化学組成（Ｃ14Ｈ14Ｏ）を減算すること、あるいはプロダクトイオンスキャンを行い詳細な構造解析を行うことで各成分のオキシエチレンの重合度を解析できる。
　第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルの含有量は、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量における正確性向上の観点から、第１試薬組成物全体に対して好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、同様の観点から、第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルの含有量は、第１試薬組成物全体に対して好ましくは０．６％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．３５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以下である。
　ここで、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルは、工業用原料または研究用試薬として入手可能であり、たとえば市販品を用いることができる。
　また、たとえばＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルを製造し、これを用いてもよい。具体的には、下記の方法、条件により製造できる。
　すなわち、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルは、モノスチレン化フェノールに、塩基性触媒存在下で所定量のエチレンオキシドを付加することにより得られる。塩基性触媒としては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アルカリ金属のアルコラート等が挙げられる。付加反応温度は１２０～２００℃が好ましい。
　一方、スチレン化フェノールは、フェノールとスチレンを、酸触媒下で７０℃～２００℃の温度でアルキル化反応させることにより得られる。酸触媒としては、硫酸やリン酸などの無機酸、ｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸などの有機酸、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体などのルイス酸等を使うことができる。この反応において、フェノールとスチレンの当量比、酸触媒の種類、反応温度などの条件を制御することにより、フェノールとベンゼン環にスチレンが１個結合されたモノスチレン化フェノールを得ることができる。
　モノスチレン化フェノールは、たとえば、リン酸触媒下でフェノールにスチレンを滴下し加えてアルキル反応を行った後、未反応のフェノールとスチレンを除去するために、硫酸または硫酸マグネシウム触媒を添加してアルキル反応を完結させることによって合成することができる。このときリン酸触媒の使用量はフェノールに対して０．００１～０．０１当量が好ましい。硫酸または硫酸マグネシウム触媒の使用量は、リン酸触媒の質量を基準にして２質量％～１０質量％が好ましい。またフェノールとスチレンの当量比は、フェノールに対するスチレンの当量比として０．９～１．３が好ましい。
　続いてアルキル化反応が終了した後に、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの水溶液を添加してアルキル化反応の生成物を中和し、濾過により生成した中和塩を除去することによって、モノスチレン化フェノールを回収できる。
　そして、オートクレーブ等耐圧容器中で、得られたモノスチレン化フェノールおよびエチレンオキサイドを、水酸化カリウムを触媒とし、加熱加圧下で付加反応させることにより、ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルを得ることができる。加熱加圧条件は、たとえば圧力１．５ｋｇ／ｃｍ3程度、温度１３０℃程度とする。また、モノスチレン化フェノール１モルに対するエチレンオキサイドのモル比を調整することにより、オキシエチレンユニットの繰り返し単位数すなわちオキシエチレンの重合度を調整することができる。
　また、以上の方法において、スチレン化フェノールとしてモノスチレン化フェノール、スチレンが２個結合されたジスチレン化フェノールおよびスチレンが３個結合されたトリスチレン化フェノールの混合物を得、混合物からモノスチレン化フェノールを分離精製して用いることもできる。
　第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルは、たとえば、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって確認できる。第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルの構造を決定する方法としてはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。
　また、第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルの濃度は、たとえばＨＰＬＣまたはＬＣ／ＭＳ測定により算出することができる。また、ＮＭＲ測定により第１試薬組成物中のＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルの濃度を得ることもできる。
　第１試薬組成物中のノニオン界面活性剤の濃度は、ノニオン界面活性剤をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に安定的に作用させ希釈直線性、検体希釈後の正確性をより高める観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０２５（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上、よりいっそう好ましくは０．０７５％（ｗ／ｖ）以上、よりいっそう好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、よりいっそう好ましくは０．１２５％（ｗ／ｖ）以上、よりいっそう好ましくは０．２５％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、第１試薬組成物中のノニオン界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１．５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以下、さらに好ましくは０．８７５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは０．７５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは０．６％（ｗ／ｖ）以下、よりいっそう好ましくは０．３（ｗ／ｖ）以下である。
　第１試薬組成物中のノニオン界面活性剤は、たとえば、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。第１試薬組成物中のノニオン界面活性剤の構造を決定する方法としてはＬＣ－ＭＳＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。
（酵素）
　第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）活性、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ）活性およびスフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）活性を有する。これにより、第１試薬組成物をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質により安定的に作用させそのコレステロールを反応系外に導くことができる。
　また、第１試薬組成物は、具体的には、コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素、コレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素を含む。第１試薬組成物は、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼを含む。
　コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼとして、それぞれ、たとえば細菌や菌類由来のものや、植物由来のものを用いることができる。
　ここで、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、具体的には、コレステロールエステラーゼが存在し、コレステロールエステラーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性等の他の酵素活性についても同様である。
　第１試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは５０Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２５００Ｕ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０００Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば１８００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば１５００Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
　同様の観点から、第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性は、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１５０Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは８００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは７５０Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは７００Ｕ／Ｌ以下、よりいっそう好ましくは６５０Ｕ／Ｌ以下、さらにまた好ましくは６００Ｕ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物は、スフィンゴミエリナーゼ活性を有するため、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く工程（後述の第１工程）中でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質、中でもＬ　ＬＤＬに対する反応性を高めることができる。
　第１試薬組成物のスフィンゴミエリナーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２８００Ｕ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくはペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性をさらに有する。第１試薬組成物は、より好ましくは、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素およびカタラーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される少なくとも一つの酵素をさらに含み、より好ましくはペルオキシダーゼおよびカタラーゼの少なくとも一つをさらに含み、さらに好ましくはカタラーゼをさらに含む。
　第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは３００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２５００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば２０００Ｕ／Ｌ以下であることも好ましい。また、第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば５０００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば４０００Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
　第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、試料に第１試薬組成物を適用した際に生じる過酸化水素を安定的に除去する観点、および、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１００ＫＵ／Ｌ以上であり、より好ましくは２００ＫＵ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０００ＫＵ／Ｌ以下であり、より好ましくは１５００ＫＵ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性、コレステロールエステラーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性およびカラターゼ活性は、それぞれ、たとえば、以下の方法にて測定できる。
　コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として６ｍＭコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を２～４Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（０．１Ｍ　リン酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．０）を加え、希釈後の溶液３ｍＬを３７℃５分加温後に基質液０．０５ｍＬを加える。その後、混合液を３７℃で反応させ波長２４０ｎｍ吸光度変化量を測定する。３７℃にて反応後、２分から７分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールオキシダーゼが含まれているといえる。
　コレステロールエステラーゼ活性の測定では、基質（０．０４％リノレン酸コレステロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．６％コール酸ナトリウム溶液）、３００Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、０．２％　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）、反応液（０．０６％　４－アミノアンチピリン、０．４％　フェノール、７．５ＫＵ／Ｌ　ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））を用いる。反応液１．７５ｍＬと基質液１．０ｍＬを混合後、３７℃で５分加温し、０．１ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。３７℃、２分加温後に希釈液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加え、混合液を３７℃で反応させ、波長５００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が８Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のスフィンゴミエリナーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液（０．００８％　スフィンゴミエリン、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液、１０Ｕ／ｍＬ　アルカリ性フォスファターゼ、１０Ｕ／ｍＬ　コレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、０．０２％　４－アミノアンチピリン、０．０２％　ＴＯＤＢ混合液）、反応停止液（１％　ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（１０ｍＭ　トリス緩衝液、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いる。反応液０．０８ｍＬと希釈液で希釈した測定対象０．００３ｍＬを混合し３７℃で５分加温後に反応停止液０．１６ｍＬを加える。反応停止後に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が２Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、スフィンゴミエリナーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液１（１．５ｍＭ　ＨＤＡＯＳ、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、および、反応液２（５ｍＭ　４－アミノアンチピリン、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％　過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、希釈液（５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。０．３ｍＬの反応液１と希釈液で希釈した測定対象０．０８ｍＬを混合し、３７℃で５分加温する。その後０．１ｍＬの反応液２を加え、３７℃で反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、２分から５分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、ペルオキシダーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、カタラーゼ活性測定では基質（０．０６％過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。基質溶液２．０ｍＬを２５℃で予備加温後、測定対象０．１ｍＬと混合し、２４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。たとえば２５℃反応後、０分から３分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が５０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、カタラーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物は、他の酵素活性をさらに有してもよく、具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼ活性およびリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）活性からなる群から選択される一または二以上の酵素活性をさらに有してもよい。
　また、第１試薬組成物は、たとえばアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素およびリポプロテインリパーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される一または二以上の酵素活性を有する酵素を含んでもよく、さらに具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼおよびリポプロテインリパーゼからなる群から選択される一または二以上の酵素を含む。
　第１試薬組成物は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有し、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する。
　同様の観点から、第１試薬組成物は、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素を含み、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼを含む。
　第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１５Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下である。
　第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定では基質（１０ｍＭアスコルビン酸溶液－０．１３ｍＭ　ＥＤＴＡを９０ｍＭ　ＫＨ2ＰＯ4－５ｍＭ　ＮａＨＰＯ4で２０倍に希釈）を用いる。基質１ｍＬを３０℃で予備加温し、５分経過後に０．０５％ＢＳＡを含む９０ｍＭ　ＮａＨＰＯ4溶液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加えて混和し、反応を開始する。５分経過後、反応停止液（０．２Ｎ　ＨＣｌ）３．０ｍＬを加え反応を停止後、２４５ｎｍにおける吸光度を測定しアスコルビン酸オキシダーゼ活性を算出する。たとえば活性量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はアスコルビン酸オキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、「アスコルビン酸オキシダーゼ」が含まれているといえる。
　第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくは２Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５０Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは３００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬ以下である。
　第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、リポプロテインリパーゼ活性の測定では、基質液としてオリーブ油エマルジョン溶液（オリーブ油５ｇ、エタノール２ｍＬに５．０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００　５ｍＬを加え２０分間超音波処理し、その後４％ＢＳＡ　２５ｍＬ、０．１Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ７．０　１５ｍＬを加え室温で１～２時間攪拌したもの）を用いる。３７℃、５分間予備加温した基質液に、０．９～１．６Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ７．５）を加え、希釈した検体０．２ｍＬを加え、３７℃１５分加温後に反応停止液（０．２Ｍトリクロル酢酸）２．０ｍＬを加える。その後、濾過（東洋濾紙No. 131またはWhatman No. 42）を行い、濾液を回収する。濾液０．０５ｍＬに発色試薬（５０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液２００ｍＬ、５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００　４ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｍ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　４０μＬ、４アミノアンチピリン４ｍｇ、ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ　２４．２ｍｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ　４０．７ｍｇ、グリセロールキナーゼ　２００Ｕ、Ｌαグリセロリン酸オキシダーゼ　５００Ｕ、ペルオキシダーゼ　３００Ｕ）３．０ｍＬを加え、混合液を３７℃で１５分間反応させ波長５４５ｎｍ吸光度を測定し、リポプロテインリパーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はリポプロテインリパーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、リポプロテインリパーゼが含まれているといえる。
　リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
　また、本実施形態において、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、まず、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳデータ）をデータベース検索（たとえば、Ｍａｓｃｏｔサーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試薬組成物中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいるとみなせる。
　また、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素はたとえば以下の定量でも同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、ＨＰＬＣに接続した三連四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＭＲＭモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。
（その他の成分）
　第１試薬組成物は、上述の成分以外の成分を含んでもよい。他の成分として、たとえば、緩衝液、塩、酵素作用を有しないタンパク質、アジ化ナトリウム等の防腐剤、水素供与体、カップラーが挙げられる。
　緩衝液の種類は、たとえば適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下であり、好ましくは２００ｍＭ以下、さらに好ましくは１５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００ｍＭ以下である。
　塩は、具体的には、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤として配合される。塩の具体例として、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム等のナトリウム塩；水酸化カリウム等のカリウム塩；塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩等の塩基性物質が挙げられる。また、第１試薬組成物が１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも一つまたはそれらの塩を含むことにより、ｓｄＬＤＬとＬ　ＬＤＬの分別がさらに容易となる。
　第１試薬組成物中の塩濃度は、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤としてより安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６．０以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８．０以下であり、より好ましくは７．５以下である。
　酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のアルブミンが挙げられる。
　第１試薬組成物中のＢＳＡ等のアルブミン濃度は、第１試薬組成物中の酵素を安定化させる観点から、またｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く第１工程を安定化させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物は、好ましくは水素供与体およびカップラー少なくとも一方を含み、より好ましくは水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む。このとき、水素供与体およびカップラーのいずれか一方は、第１工程でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導くために使用される。さらに具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼを作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で無色キノンに転化させるために水素供与体およびカップラーのいずれか一方が用いられる。
　水素供与体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ'－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等のアニリン誘導体が挙げられる。
　第１試薬組成物中の水素供与体の試薬中濃度は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは１．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは５ｍＭ以下であり、より好ましくは３ｍＭ以下である。
　また、水素供与体が後述の第２試薬組成物で用いられる場合、カップリング反応に用いるカップラーが第１試薬組成物中に含まれることが好ましい。カップラーとしては、たとえば、４－アミノアンチピリン（４ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン等を用いることができるが、これらに限定されない。
　第１試薬組成物中のカップラーの濃度は、第１試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．２ｍＭ以上であり、より好ましくは０．３ｍＭ以上であり、また、好ましくは５．０ｍＭ以下であり、より好ましくは３．３ｍＭ以下である。
　（キット）
　本実施形態において、キットは、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるものであり、上述の第１試薬組成物と、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を含む。
　また、キットは、具体的には２以上の工程を含むｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
　以下、第２試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
（第２試薬組成物）
　第２試薬組成物は、具体的には、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
　第２試薬組成物に含まれる成分の具体例として、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤、酵素作用を有しないタンパク質、防腐剤、ならびに、水素受供与体およびカップラーのいずれか一方が挙げられる。
　また、キットの好ましい構成においては、第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、第２試薬組成物が、水素供与体およびカップラーの一方を含まず他方を含む。
　酵素として、たとえば、ペルオキシダーゼが挙げられる。また、第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する。第２試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、第２工程でｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定する観点から、好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下である。ただし、第１試薬組成中にペルオキシダーゼ活性が含まれる場合は、第２工程にもペルオキシダーゼ活性が持ち越されるため、第２試薬中の濃度を減量する、あるいは含まなくすることもできる。
　緩衝液および塩の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
　第２試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６．０以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８．０以下であり、より好ましくは７．５以下である。
　界面活性剤として、たとえばｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、好ましくはｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む。
　ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤は、ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤等のｓｄＬＤＬに選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
　第２試薬組成物中の界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレン誘導体をあげることができ、また、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤を使用することができる。かかる界面活性剤として、たとえば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（たとえば、エマルゲン９０９（花王社製）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（たとえばエマルゲン７０７、エマルゲン７０９（以上、花王社製））が挙げられる。
　第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第２試薬組成物添加後の混合溶液に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、同様の観点から、第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは８．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは５．０％（ｗ／ｖ）以下である。
　第２試薬組成物がカップラーを含むとき、カップラーは、好ましくは４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンからなる群から選択される一または二以上の化合物である。
　第２試薬組成物中のカップラーの濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１．０ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
　一方、カップラーが第１試薬組成物中に含まれる場合、水素供与体は好ましくは第２試薬組成物中に含まれる。水素供与体の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。この場合の水素供与体の試薬中濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは３ｍＭ以上であり、より好ましくは４．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１２ｍＭ以下である。
　酵素作用を有しないタンパク質および防腐剤の具体例としては、それぞれ、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
　（方法）
　本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
　第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。かかる方法において、本実施形態における第１試薬組成物を用いることにより、検体希釈後の正確性、および特異性に優れた測定をおこなうことができるため、たとえば、良好な希釈直線性、基準法との高い相関性を有する試薬として、安定的にｓｄＬＤＬ－Ｃを定量することも可能となる。
　また、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法は、たとえば試料（被検体試料）に第１試薬組成物を添加し反応させ、次いで第２試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することによりおこなえばよい。
　被検体試料は、たとえば血清、血漿等の血液由来試料であり、好ましくは血清である。
　第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
　試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬５０～３００μＬ、第２試薬２５～２００μＬを用いればよい。
　以下、各工程をさらに具体的に説明する。
（第１工程）
　第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
　さらに具体的には、第１工程では、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、スフィンゴミエリナーゼおよびコレステロールエステラーゼの存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
　第１試薬組成物が電子供与体を有するとき、第１工程において、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質から生じたコレステロールを消去し反応系外に導く工程は、たとえば、第１試薬組成物におけるスフィンゴミエリナーゼ、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびに、電子供与体の存在下で無色キノンを形成させることを含んでもよい。
　また、第１工程においては、イオン強度調整剤として１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも一つまたはそれらの塩をさらに反応液に添加して用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、ｓｄＬＤＬとＬ　ＬＤＬを差別化しやすくなる。
（第２工程）
　第２工程では、第１工程を経て残存したｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する。第２工程には、従来から用いられているＬＤＬの定量方法を用いることができる。たとえば、ＬＤＬ凝集剤を添加して形成されたＬＤＬ特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、ＬＤＬ特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。定量方法は、たとえば第２試薬組成物に含まれる成分や組成に応じて選択される。
　第２試薬組成物が酵素を含むとき、酵素を用い分解生成物を定量する方法とすることができる。具体的には、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される一または二以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてｓｄＬＤＬ－Ｃを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
　本実施形態において、各工程における、反応温度は２℃～４５℃でおこなうことが好ましく、２５℃～４０℃でおこなうことがより好ましい。
　反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓ　ｃ５０１、ｃｏｂａｓ　ｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられる。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量は、たとえば５８０～７２０ｎｍの波長域、好ましくは６００～７００ｎｍの波長域の吸光度測定によりおこなう。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
　（実施例１～７、比較例１、２）
　接触角を変動させた各例の第１試薬組成物を調製し、第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量をおこない測定の検体希釈後の正確性、特異性（基準法との相関性）を評価した。
（試薬組成物の調製）
　以下に示す各成分を以下の濃度で配合することにより、各例の第１試薬組成物および第２試薬組成物を調製した。
　第１試薬組成物については、ノニオン界面活性剤の種類および濃度を変えて、各例の組成物を調製した。
　測定に用いた第１試薬組成物、第２試薬組成物の配合組成を以下に示す。
（第１試薬組成物）
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０　　　　　　　　　　　　　　５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　３００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　６００Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　２７００Ｕ／Ｌ
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２００ＫＵ／Ｌ
牛血清アルブミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％（ｗ／ｖ）
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
ノニオン界面活性剤　＊１
＊１　ノニオン界面活性剤：ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体およびポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体を用い、これらの添加量を変えて、第１試薬組成物ａ～ｉを調整した。
（第２試薬組成物）
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０　　　　　　　　　　　　５０ｍＭ
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　４０００Ｕ／Ｌ
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％（ｗ／ｖ）
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
（ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定）
　各例の第１試薬組成物および第２試薬組成物用いてｓｄＬＤＬ－Ｃの測定をおこなった。具体的には、各例の、すなわち接触角の異なる第１試薬組成物、および、第２試薬組成物を調製した。血清試料３μＬに第１試薬組成物１５０μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬組成物５０μＬを加え５分間反応させ主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍでの吸光度を測定し、検量線よりｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度を算出した。
（接触角の測定方法）
　ＰＥＴ基材として、目視にて透明なＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板（タキロンシーアイ社製、ＰＥＴ板（ペテック）品番６０１０、厚さ２ｍｍ）を用いた。未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取り、その後５分以内に測定を実施した。
　接触角計（協和界面科学社製、ＤＭｏ－５０１）を用い、液滴法、θ／２法により、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬの条件で、滴下後１秒後に接触角の測定をおこなった。
　各例について５回測定し、５回の平均値を算出した。測定結果を表１に示す。
（粘度の測定方法）
　実施例および比較例について、ＥＭＳ粘度計（京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００）を用いて、電磁スピニング法により、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃および３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬとして各例の第１試薬組成物の粘度を測定した。各例について各温度で５回ずつ測定を実施し、５回の平均値を算出した。測定結果を表１に示す。
（検体希釈後の正確性試験）
　ｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度既知の各濃度のヒト血清を生理食塩水で２倍に希釈し、希釈前後の各例におけるｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度を測定した。希釈後の検体測定値に希釈倍数２を乗じて希釈前の測定値と比較し、一次回帰式を算出した。
　測定結果のまとめを表１に示す。また、各例の詳細なデータを図１（ａ）～図１（ｉ）に示す。図１（ａ）～図１（ｉ）において、横軸は希釈前の検体測定値を示し、縦軸は希釈倍率２を乗じた検体希釈後の測定値を示す。評価基準を以下に示す。
Ａ：一次回帰式の傾きが１．００±０．０６（０．９４～１．０６）以内、かつ、一次回帰式の相関係数ｒ（以下同じ）がｒ＞０．９（ｒ2＞０．８１）
Ｂ：一次回帰式の傾きが１．００±０．０６超１．００±０．１０以内、かつ、ｒ＞０．９（ｒ2＞０．８１）
Ｃ：一次回帰式の傾きが１．００±０．１０超、あるいは、ｒ≦０．９（ｒ2≦０．８１）
　表１および図１（ａ）～図１（ｉ）より、各実施例では良好な検体希釈後の正確性が得られた。
（基準法との相関性試験）
　比較対象法として各ヒト検体における超遠心法ｓｄＬＤＬ－Ｃ（比重１．０４４～１．０６３）の値を算出し、各例のｓｄＬＤＬ－Ｃ値と比較した。
　測定結果のまとめを表１に示す。また、各例の詳細な相関性データを図２（ａ）～図２（ｉ）に示す。図２（ａ）～図２（ｉ）の横軸は基準法である超遠心法により算出したｓｄＬＤＬ－Ｃ値を示し、縦軸は各例におけるｓｄＬＤＬ－Ｃ値を示す。評価基準を以下に示す。以下のＡおよびＢの評価のものを合格とした。
Ａ：傾きが１．００±０．１１（０．８９～１．１１）以内、かつ、一次回帰式の相関係数ｒ（以下同じ。）＞０．９０５（ｒ2＞０．８１９）
Ｂ：傾きが１．００±０．１１超１．００±０．２０以内、かつ、ｒ＞０．９００（ｒ2＞０．８１０）
Ｃ：傾きが１．０００±０．２００超、または、０．９００≦ｒ（ｒ2≦０．８１）
　表１および図２（ａ）～図２（ｉ）より、各実施例では超遠心法と良好な相関性が得られた。
　また、図３は、試薬組成物を接触角が大きいものから小さなものへと順に並べたときの相関係数との関係性を示す図である。試薬組成物ｂ～ｈの接触角において相関係数がより高くなる結果であった。
（希釈直線性試験）
　表１に記載の例のうち、比較例１ならびに実施例２、４および６について希釈直線性試験をおこなった。具体的には、濃度既知の高濃度ｓｄＬＤＬ－Ｃ検体を生理食塩水で１０段階に希釈し、それぞれの希釈系列における各実施例のｓｄＬＤＬ－Ｃ濃度を測定した。ＣＬＳＩガイドラインＥＰ０６－Ａに従い解析を行い、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｌｏｔ　ｏｆ　ｎｏｎｌｉｎｅａｒｉｔｙを算出し、希釈直線性を評価した。
　測定結果のまとめを表１に示し、詳細なデータを図４（ａ）～図４（ｄ）に示す。図４（ａ）～図４（ｄ）の左図において、横軸（dilute Lv.）は高濃度検体の希釈系列を示し、縦軸（Measured value [mg/dL]）はｓｄＬＤＬ－Ｃ値を示す。また、図４（ａ）～図４（ｄ）の右図において、横軸（dilute Lv.）は高濃度検体の希釈系列を示し、縦軸（Nonlinearity [mg/dL]）はｓｄＬＤＬ－Ｃ値の非直線性を示す。評価基準はＣＬＳＩガイドラインＥＰ０６－Ａに従い、以下のとおりとした。以下のＡおよびＢの評価のものを合格とした。
Ａ：Nonlinearity値（図４右図の丸プロット）が、全点において許容範囲（図４右図の２本の実線の内側：Linear fit sdLDL-C＜30mg/dLの場合±3mg/dL、Linear fit sdLDL-C≧30mg/dLの場合±10％）以内
Ｃ：Nonlinearity値（図４右図の丸プロット）が、少なくとも１点において許容範囲（図４右図の２本の実線の内側：Linear fit sdLDL-C＜30mg/dLの場合±3mg/dL、Linear fit sdLDL-C≧30mg/dLの場合±10％）から外れる
　表１および図４（ａ）～図４（ｄ）より、各実施例では良好な希釈直線性が得られた。
　図１（ａ）～図１（ｉ）、図２（ａ）～図２（ｉ）、図３、図４（ａ）～図４（ｄ）ならびに表１より、各実施例では、希釈直線性、検体希釈後の正確性、基準法との相関性に優れたｓｄＬＤＬ－Ｃ測定が可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例８～１０）
（試薬組成物の調製）
　以下に示す各成分を以下の濃度で配合し、界面活性剤の種類を変えて、各例の第１試薬組成物を調製した。第１試薬組成物の配合組成を以下に示す。
（第１試薬組成物）
ＰＩＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０　　　　　　　　　　５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　９００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　４５０Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ　　　　　　　　　　　　５２５Ｕ／Ｌ
牛血清アルブミン　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７５％（ｗ／ｖ）
カタラーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　１２００ＫＵ／Ｌ
４ＡＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍＭ
界面活性剤　＊２　　　　　　　　　　　　　　　　　
＊２　界面活性剤
実施例８：ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテル、ＰＯＥの重合度１１～３３
実施例９：ＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテル、ＰＯＥの重合度１３～３７
実施例１０：ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル誘導体
（リポタンパク質選択性の評価）
　第１試薬組成物での反応におけるリポタンパク質選択性を評価するため、ｓｄＬＤＬおよびｌｂＬＤＬと上記試薬組成物との反応性をそれぞれ測定した。
　具体的には、検体として、超遠心によりヒト血清より分離したｓｄＬＤＬおよびｌｂＬＤＬを用いた。界面活性剤の検体に対する反応性を確認するため、第１試薬組成物を調製した。評価の際に第１試薬組成物のみで発色反応を生じさせて吸光度測定により簡便に評価するため、各例の評価用の第１試薬組成物として、上記組成における１２００ＫＵ／Ｌのカタラーゼに代えて１．５ｍＭ　ＴＯＯＳおよび１２５０Ｕ／Ｌのペルオキシダーゼを配合したものを用いた。
　検体３μＬと、各例の第１試薬組成物１５０μＬを混合し、３７℃、５分後の６００ｎｍ（主波長）および７００ｎｍ（副波長）の吸光度の差分（表２中、「吸光度　波長６００ｎｍ／７００ｎｍ」と記載。）［ｍＡｂｓ］を測定し、ｓｄＬＤＬの吸光度に対するｌｂＬＤＬの吸光度の比を求めた。測定結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２より、各実施例の第１試薬組成物を用いることにより、試料中のｓｄＬＤＬをより正確に定量することができる。また、表２より、各実施例の中でもＰＯＥモノスチレン化フェニルエーテルを含む第１試薬組成物がＬＤＬの吸光度比が、第１工程におけるｌｂＬＤＬへの選択性にさらに優れていることが示されている。
（比較例３）
（試薬組成物の調製）
　実施例１～７、比較例１および２において前述の方法に準じて、アニオン界面活性剤としてポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル硫酸塩を用いた第１試薬組成物を調製し、上記例における方法に準じて接触角および粘度を測定し、検体希釈後の正確性を評価した。検体希釈後の正確性の測定においては、比較例３の第１試薬組成物に加えて、対照として、前述の実施例４と同じ配合の第１試薬組成物を調製し、測定した。測定結果を表３に示す。表３には前述の実施例４の接触角および粘度の測定結果（表１）をあわせて示す。また、詳細なデータを図５（ａ）および図５（ｂ）に示す。図５（ａ）および図５（ｂ）は、それぞれ、実施例４と同じ配合の第１試薬組成物および比較例３の測定結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　図５（ｂ）より、アニオン界面活性剤を用いた比較例３では試料中の検体を希釈後はｓｄＬＤＬを正確に定量することができなかったのに対し、ノニオン界面活性剤を使用した実施例４の配合（図５（ａ））では検体希釈後でも正確に定量することができた。また、図５（ａ）および図１（ｅ）より、同じ配合の組成物について、優れた再現性で検体希釈後の選択性を評価できることが確認された。
　この出願は、２０２２年４月１１日に出願された日本出願特願２０２２－０６４９６６号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (11)

  1. 　第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
    　第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
    　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
    　ノニオン界面活性剤を含み、
    　コレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性を有し、
    　以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６３．０°以上６７．０°以下である、試薬組成物。
    （方法１）
    （１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
    （２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
    （３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
    （４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
  2. 　以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．５ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１に記載の試薬組成物。
    （方法２－１）
    （１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
    （２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
    （３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
  3. 　以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が１．０５ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１または２に記載の試薬組成物。
    （方法２－２）
    （１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
    （２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
    （３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
  4. 　前記ノニオン界面活性剤がポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルを含む、請求項１または２に記載の試薬組成物。
  5. 　前記ポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルにおけるポリオキシエチレンの重合度ｎが５以上８０以下である、請求項４に記載の試薬組成物。
  6. 　当該試薬組成物中の前記ポリオキシエチレンモノスチレン化フェニルエーテルの含有量が当該試薬組成物全体に対して０．０５％（ｗ／ｖ）以上０．６％（ｗ／ｖ）以下である、請求項４に記載の試薬組成物。
  7. 　当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、請求項１または２に記載の試薬組成物。
  8. 　当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、請求項１または２に記載の試薬組成物。
  9. 　当該試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも一つの活性をさらに有する、請求項１または２に記載の試薬組成物。
  10. 　請求項１または２に記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
    　前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
    　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
  11. 　前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、請求項１０に記載のキット。
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