KR101833350B1

KR101833350B1 - 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법

Info

Publication number: KR101833350B1
Application number: KR1020137003549A
Authority: KR
Inventors: 마이코 히구치; 야스키 이토
Original assignee: 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2011-07-22
Publication date: 2018-02-28
Also published as: AU2011280489A1; EP2597468A4; US20130157374A1; US8932865B2; CA2811150A1; CN103080748A; AU2011280489B2; CA2811150C; KR20130043184A; DK2597468T3; WO2012011556A1; EP2597468A1; JP5671029B2; JPWO2012011556A1; EP2597468B1; CN103080748B

Abstract

번잡한 조작을 필요로 하는 일 없이 피검 시료 중의 고밀도 리포단백질3(HDL3) 중의 콜레스테롤을 정량하는 방법이 개시되어 있다. HDL3 중의 콜레스테롤의 정량 방법은 피검 시료에 고밀도 리포단백질3 이외의 리포단백질과 반응하는 계면활성제를 반응시켜 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함한다. 피검 시료 중의 HDL3 콜레스테롤을 초원심이나 전처리라는 번잡한 작업을 필요로 하지 않고 자동 분석 장치에 의해 특이적으로 정량하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 종래 기술인 피검체 중 HDL 총 콜레스테롤 정량법에 의해 얻어진 총 HDL 콜레스테롤량으로부터 HDL3 콜레스테롤량의 차를 산출함으로써 HDL2 콜레스테롤량을 정량하는 것도 가능하게 되었다.

Description

고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법{METHOD FOR QUANTIFYING THE AMOUNT OF CHOLESTEROL IN HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN 3}

본 발명은 고밀도 리포단백질3(이하 「HDL3」이라고 부르는 경우가 있다) 중의 콜레스테롤(HDL3 중의 콜레스테롤을 이하 「HDL3 콜레스테롤」이라고 부르는 경우가 있다)의 정량 방법에 관한 것이다.

고밀도 리포단백(HDL) 콜레스테롤은 동맥경화벽을 포함한 각 조직으로부터 콜레스테롤을 받기 위해서 세포 내에 축적한 콜레스테롤의 제거 작용에 관계되고, 그 때문에 콜레스테롤 역전송계라고도 말해지고 있다. 관동맥경화 등의 동맥경화 질환과 부의 상관이 있는 것이 알려져 있고, HDL이 낮은값인 것은 지질이상증의 하나로서 낮은값 한계가 설정되어 있어 동맥경화의 지표로서 유용한 것이 알려져 있다.

HDL은 아포단백질과 인지질, 콜레스테롤, 중성 지방으로 구성되어 있다. HDL은 비중이 d=1.063∼1.210g/mL이며, d=1.063∼1.125g/mL인 HDL2와 d=1.125∼1.210g/mL인 HDL3의 2개의 분획으로 더 분류된다. 리포단백의 분포 곡선에 의해 d=1.125부분에 노치가 확인되고, 여기로부터 비중이 무거운 부분을 HDL3로 한다. 또한, HDL 중의 아포단백질 중 아포리포단백E 함유량 차로부터 아포E의 함유량이 많은 HDL을 아포E-rich HDL로 하는 아분획의 분류 방법도 존재한다.

종래까지의 HDL단백 전체뿐만 아니라 HDL2 및 HDL3 각각의 아분획에 있어서 다른 기능을 나타내는 것이 알려져 있다. 임상에 있어서 CETP 결손에 의해 HDL이 LDL이나 IDL로 대사되지 않아 HDL 콜레스테롤량이 증가하는 것이 알려져 있다. CETP 결손에 의해 증가한 HDL은 HDL2이다. HDL2에는 항동맥경화 작용이 있다고 말해지고 있다. 또한, CETP 결손에 의해 아포E-rich HDL이 상승한다고도 말해지고 있고, Apo-E-richi HDL은 콜레스테롤 추출 능력이 강하고 항혈소판 작용이 있어 HDL 중에서도 보다 좋은 것이라고도 말해지고 있다. 또한, 간성 리파아제 활성의 저하에 의해 HDL3이 HDL2로 변화되지 않고, HDL3이 증가한다. HDL3의 증가에 의한 관동맥 질환의 발증률의 증가가 시사되어 있다. 이들의 경향으로부터 HDL 아분획 각각을 측정하는 것은 동맥경화 질환의 유무나 원인을 판단하는 도움이 되는 것이 예상된다. 또한, 현재 이들 HDL 아분획의 기능을 근거로 해서 CETP의 기능을 저해하여 LDL 콜레스테롤량을 감소시키고 HDL 콜레스테롤량을 증가시키는 치료약의 개발이 각 메이커에서 진행되고 있다.

HDL 아분획의 간편한 측정 방법을 확립하는 것은 상세한 기능의 해명이나 이들의 치료의 효과로 연결될 가능성이 있다.

현재까지 HDL 아분획의 측정법으로서 알려져 있는 것으로서는 초원심법, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법, HDL3 침전법(특허문헌 1), NMR법 등이 알려져 있다.

초원심은 원심에 의해 리포단백의 비중의 차를 이용해서 획분하는 방법이며, 작업에 숙련이 필요한 것, 일수가 걸리는 것, 또한 비용도 고액이 되는 결점이 있다. 오카자키들에 의한 HPLC를 사용한 HDL2와 HDL3을 분류하는 방법에서는 작업에 시간을 필요로 하고, 특별한 기기가 필요하다. HDL3 침전법은 2가 금속 이온 및 덱스트란 황산을 포함하는 시약에 의해 HDL3 이외를 응집시키고, 원심에 의해 상청액 부분의 HDL3을 회수하여 자동 분석 장치로 측정하는 방법이다. 역시 작업에 숙련이 필요한 것, 또한 용수법에 의해 검체 전처리 조작이 필요한 경우도 있고, 측정까지 어느 정도의 시간이 걸린다는 결점이 있어 범용적이지 않았다. 또한, NMR법은 자기 공명에 의해 리포단백의 입자수를 계측하는 방법이지만 특수한 기계가 필요하며, 일반적이지 않다.

또한, HDL 아획분의 분석 방법(특허문헌 2)이 존재한다. 범용 자동 분석 장치에 의해 측정이 가능하지만 계면활성제를 사용함으로써 HDL3 이외의 리포단백을 효소의 작용으로부터 저해하는 방법을 사용하고 있고, HDL3 반응 중에 있어서 목적 이외의 리포단백질이 존재하고 있는 것이나 측정으로의 영향, 또는 전부 저해할 수 없었을 경우에는 HDL3 이외의 리포단백을 측정해야할 우려가 있다.

이러한 방법과 같이 간편하며 또한 콜레스테롤량을 보다 선택적으로 정량할 수 있는 시약의 발명이 필요해지고 있다.

일본 특허 공개 2009-207463호 공보 일본 특허 공개 2001-346598호 공보

본 발명의 목적은 번잡한 조작을 필요로 하는 일 없이 피검 시료 중의 HDL3을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구의 결과 고밀도 리포단백질3 이외의 리포단백질과 반응하지만 고밀도 리포단백질3과는 대부분 반응하지 않는 계면활성제를 발견했다. 그리고 피검 시료에 이러한 계면활성제를 반응시키고, 이어서 잔존하는 HDL3 중의 콜레스테롤을 정량함으로써 피검 시료 중의 HDL3 콜레스테롤을 정량할 수 있는 것에 상도하여 이것이 가능한 것을 실험적으로 확인해서 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 피검 시료에 고밀도 리포단백질3 이외의 리포단백질과 반응하는 계면활성제를 반응시켜 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법을 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의해 피검 시료 중의 HDL3 콜레스테롤을 초원심이나 전처리라는 번잡한 작업을 필요로 하지 않고 자동 분석 장치에 의해 특이적으로 정량하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 종래 기술인 피검체 중 HDL 총 콜레스테롤 정량법에 의해 얻어진 총 HDL 콜레스테롤량으로부터 HDL3 콜레스테롤량의 차를 산출함으로써 HDL2 콜레스테롤량을 정량하는 것도 가능하게 되었다.

도 1은 공지의 HDL침전법(측정법A)과 시판된 HDL 측정 시약을 사용한 측정 결과의 상관도이다.
도 2는 공지의 HDL침전법(측정법A)과 본 발명의 정량 방법에 의한 측정 결과와 상관도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약D를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약D를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약G를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약H를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약I를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약K를 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 있어서 행한 제 2 공정의 시약L을 첨가하고나서의 각 분획의 흡광도 변화의 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명의 방법에 제공되는 피검 시료로서는 그 시료 중의 HDL3 콜레스테롤을 정량하려고 하는 것이면 특별히 한정되지 않지만 바람직하게는 혈청 또는 혈장 또는 이들의 희석물이며, 특히 혈청 또는 그 희석물이 바람직하다.

본 발명의 제 1 공정에서는 피검 시료에 HDL3 이외의 리포단백질에 반응하는 계면활성제를 반응시킨다. HDL3 이외의 리포단백질에 반응하는 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물, 폴리옥시에틸렌-스테아릴아민 등의 비이온 계면활성제; 아미드에테르술페이트 등의 음이온 계면활성제; 야자유 지방산-아미드프로필디메틸-아미노아세트산 베타인, 알킬디메틸-아미노아세트산 베타인 및 라우릴베타인 등의 양성 계면활성제; 및 라우릴트리메틸암모늄클로라이드와 같은 양이온 계면활성제를 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 비이온 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르인 에말겐A500(상품명, Kao Corporation사제, 이하 회사명은 제조 회사이며, 회사명이 병기되어 있는 것은 모두 상품명이다), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물인 플로닉F127(Asahi Denka Co., Ltd.), 플로닉F68(Asahi Denka Co., Ltd.), 플로닉P103(Asahi Denka Co., Ltd.), 폴리옥시에틸렌-스테아릴아민인 나이민S210(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.); 음이온 계면활성제로서는 아미드에테르술페이트인 산아미드CF-10(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.); 양성 계면활성제로서는 야자유 지방산-아미드프로필디메틸-아미노아세트산 베타인인 닛산아논BDF-SF(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 알킬디메틸-아미노아세트산 베타인인 닛산아논BF(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 라우릴베타인인 암히톨24B(Kao Corporation);양이온 계면활성제로서는 라우릴트리메틸암모늄클로라이드인 코타민24P(Kao Corporation)를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합시켜서 사용할 수도 있다.

HDL3 이외의 리포단백질에 반응하는 계면활성제의 농도는 0.01∼5.0중량%가 바람직하고, 0.03∼3.0중량% 정도가 보다 바람직하다.

본 발명 중에 있어서 계면활성제에 대하여 「반응한다」라는 단어를 사용할 경우에는 계면활성제가 리포단백질에 대하여 반응계 외로 유도하기 위해서 효소가 작용하기 쉽게 하거나 또는 리포단백에 대하여 효소가 작용할 수 없도록 보호하는 것을 의미한다.

피검 시료에 상기 계면활성제를 반응시키면 HDL3은 대부분 반응을 받지 않고, 다음 공정에 있어서 정량되는 것이 가능해진다.

본원발명자들은 또한 포스폴리파아제 및 스핑고미엘리나제가 리포단백질에 작용하지만 HDL3 에는 대부분 작용하지 않는 것을 발견했다. 따라서, 상기한 계면활성제에 추가하여 포스폴리파아제 및/또는 스핑고미엘리나제를 공존시킴으로써 HDL3 콜레스테롤을 더욱 정확하게 정량할 수 있으므로 바람직하다.

포스폴리파아제로서는 적어도 포스파티딜콜린에 작용하는 것이면 좋고, 포스폴리파아제A, 포스폴리파아제C 및 포스폴리파아제D가 바람직하고, 특히 포스폴리파아제C 및 포스폴리파아제D가 바람직하다. 포스폴리파아제 등은 시판되어 있으므로 시판품을 바람직하게 사용할 수 있다. 포스폴리파아제 등은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합시켜서 사용할 수도 있다.

포스폴리파아제 등의 최종 농도(2종류 이상의 것이 사용되는 경우에는 그 합계 농도, 이하 동일)는 0.1∼100U/mL정도가 바람직하고, 0.2∼50U/mL정도가 보다 바람직하다.

또한, 제 1 공정에 계면활성제를 공존시키는 경우에도 반응 조건(반응 온도, 시간, 완충액 등)은 상기와 같다.

본 발명의 방법의 제 1 공정에서는 포스폴리파아제 등의 작용에 의해 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시킨다. 여기서 「반응계 외로 이행시킨다」란 콜레스테롤 및 그 에스테르를 소거 또는 보호함으로써 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 및 그 에스테르가 관여하지 않도록 하는 것을 의미한다.

여기서 「소거」란 피검 시료 중의 리포단백의 콜레스테롤을 분해하고, 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 측정의 반응에 작용시키지 않도록 하는 것이다. 리포단백 콜레스테롤을 소거하기 위한 방법으로서는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 카탈라아제를 사용해서 물과 산소로 분해하는 방법을 들 수 있다. 또한, 페록시다아제를 사용해서 수소 공여체와 발생한 과산화수소를 반응시켜 무색 퀴논으로 전화(轉化)해도 좋지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 콜레스테롤 소거의 방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이며, 하기 실시예에도 구체적으로 기재되어 있다.

「보호」란 피검 시료 중의 리포단백을 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 측정에 반응하지 않도록 보호를 행하는 것이다. 리포단백을 보호하는데는 각 리포단백을 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제가 작용하지 않도록 특이적으로 보호하는 계면활성제를 사용하는 방법을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

제 1 공정은 상기 계면활성제를 반응시키는 공정과, 노출한 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 공정을 차차적으로 행하는 것도 가능하지만 시약 중에 상기 계면활성제와, 노출한 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키기 위한 효소계나 계면활성제를 동시에 첨가해 둠으로써 양쪽 공정을 단일 공정으로서 동시에 행할 수도 있다. 후자가 간편하며 바람직하다.

제 1 공정에 있어서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 사용할 경우 콜레스테롤 에스테라제의 농도(본 명세서에 있어서 농도는 특별히 언급이 없는 한 최종 농도를 의미한다)는 0.1∼10.0U/mL정도가 바람직하고, 0.2∼2.0U/mL정도가 보다 바람직하다. 콜레스테롤 옥시다아제의 농도는 0.05∼10.0U/mL정도가 바람직하고, 0.1∼1.0U/mL정도가 보다 바람직하다. 또한, 콜레스테롤 에스테라제는 에스테르형 콜레스테롤에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 Asahi Kasei Corporation제의 콜레스테롤 에스테라제(CEBP, CEN)나 TOYOBO CO., LTD.제의 콜레스테롤 에스테라제(COE-311, COE-312) 등의 시판품을 사용할 수 있다. 또한, 콜레스테롤 옥시다아제는 유리형 콜레스테롤에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 Asahi Kasei Corporation제의 콜레스테롤 옥시다아제(CONII)나 TOYOBO CO., LTD.제의 콜레스테롤 옥시다아제(COO-311, COO-321, COO-331) 등의 시판품을 사용할 수 있다.

제 1 공정에 있어서 페록시다아제를 사용할 경우 페록시다아제의 농도는 2.0∼5.0단위/mL정도가 바람직하고, 3.0∼4.0단위/mL정도가 더욱 바람직하다. 또한, 무색 퀴논으로 전화되는 화합물을 사용할 경우 그 농도는 0.4∼0.8mmol/L정도가 바람직하다.

제 1 공정에서 사용하는 반응액에는 통상의 생화학 반응에 사용되는 각종 완충액을 사용할 수 있고, pH가 5∼8 사이인 것이 바람직하다. 용액으로서는 굿, 트리스, 인산, 글리신 완충 용액이 바람직하고, 굿 완충액인 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시에틸)메탄(Bis-Tris), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산), 1.5나트륨염, 1수화물(PIPES1.5Na), 3-모르폴리노프로판술폰산(MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES) 및 피페라진-1,4-비스(2-히드록시-3-프로판술폰산)(POPSO)이 바람직하다.

제 1 공정의 반응 온도는 25∼40℃ 정도가 바람직하고, 35∼38℃가 더욱 바람직하고, 37℃가 가장 바람직하다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않고, 통상 2∼10분 정도이다.

계속되는 제 2 공정에서는 반응계 내에 잔존하는 콜레스테롤을 정량한다. 이것은 적어도 HDL3과 반응하는 계면활성제를 반응시켜 노출한 콜레스테롤을 정량함으로써 행할 수 있다. 「적어도 HDL3과 반응하는 계면활성제」에는 HDL3과 특이적으로 반응하는 계면활성제, HDL과 특이적으로 반응하는(즉, HDL2와 HDL3에 반응하는) 계면활성제 및 모든 리포단백질에 반응하는 계면활성제가 포함된다.

제 2 공정에 사용할 수 있는 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 및 p-이소옥틸폴리옥시에틸렌페놀포름알데히드 폴리머 등의 비이온 계면활성제; 라우릴디메틸-아미노아세트산 베타인 등의 양성 계면활성제; 지방산족 인산 에스테르 등의 음이온 계면활성제; 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌트리벤질페닐에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌쿠밀페닐에테르 등의 HLB가 11∼14 사이인 비이온 계면활성제; 이미다졸린형의 양성 계면활성제; 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 라우릴알코올알콕실레이트 등의 비이온 계면활성제; 폴리옥시에틸렌-알킬페닐에테르황산 에스테르 나트륨염과 같은 음이온 계면활성제를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종 이상의 것을 조합시켜서 사용할 수도 있다.

보다 구체적으로는 HDL3에 특이적으로 반응하는 계면활성제의 예로서는 비이온 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르인 에말겐A90(Kao Corporation), 폴리옥시에틸렌라우릴에테르인 에말겐120(Kao Corporation), P-이소옥틸폴리옥시에틸렌페놀포름알데히드 폴리머인 Triton-WR-1339(NACALAI TESQUE, INC.), 폴리옥시에틸렌라우릴에테르인 퍼소프트NK-100(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.); 양성 계면활성제로서 라우릴디메틸-아미노아세트산 베타인인 닛산아논BL-SF(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.); 음이온 계면활성제로서 지방산족 인산 에스테르인 아데카콜PS-440E(Asahi Denka Co., Ltd.)를 들 수 있다.

HDL에 특이적으로 반응하는 계면활성제로서는 HLB가 11∼14 사이인 비이온 계면활성제인 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌트리벤질페닐에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌쿠밀페닐에테르 또는 양성 계면활성제의 이미다졸린형을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 에말겐A60(Kao Corporation), 에말겐B66(Kao Corporation), 에말겐LS110(Kao Corporation), Newcol-CMP-11(Nippon Nyukazai Co., Ltd.), Newcol-710(Nippon Nyukazai Co., Ltd.), Newcol-610(Nippon Nyukazai Co., Ltd.), Newcol-2609(Nippon Nyukazai Co., Ltd.), 닛산아논GLM-R-LV(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.)를 사용할 수 있다.

모든 리포단백에 특이적으로 반응하는 계면활성제로서는 비이온 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 라우릴알코올알콕실레이트를 사용할 수 있다. 음이온 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르황산 에스테르 나트륨염을 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 에말겐707(Kao Corporation), 에말겐909(Kao Corporation), 에말겐108(Kao Corporation), 나이민L207(Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), 아데카톨LB83(Asahi Denka Co., Ltd.), 아데카톨LB103(Asahi Denka Co., Ltd.), Newcol-707(Nippon Nyukazai Co., Ltd.)을 사용할 수 있다.

제 2 공정에 있어서의 계면활성제의 농도는 0.01∼5.0%(w/v)가 바람직하고, 0.05∼2.0%(w/v)가 더욱 바람직하다.

제 2 공정에 있어서는 이들 계면활성제의 반응에 의해 콜레스테롤을 정량한다. 또한, 제 1 공정과 제 2 공정에서는 다른 계면활성제를 사용한다. 콜레스테롤의 정량 방법 자체는 주지이며, 주지의 어느 방법이나 채용할 수 있고, 하기 실시예에도 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 리포단백 중의 에스테르형 콜레스테롤에 콜레스테롤 에스테라제를 사용해서 가수분해하여 유리형 콜레스테롤과 지방산이 발생하고, 발생한 유리형 콜레스테롤과 원래 리포단백 중에 존재하는 유리 콜레스테롤을 콜레스테롤 옥시다아제를 사용해서 콜레스테논과 과산화수소를 발생시키고, 이것을 페록시다아제의 존재 하에서 퀴논 색소를 형성시켜 정량한다. 퀴논 색소를 발생시키는 화합물로서 예를 들면 HDAOS(N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린), DAOS(N-에틸-N(-2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린나트륨) 또는 TOOS(N-에틸-N(-2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린나트륨 2수화물)과 4-아미노안티피린을 들 수 있지만 퀴논 색소를 발생시킬 수 있는 조합이면 이들에 한정되는 것은 아니다. 제 1 공정에서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 사용할 경우에는 제 2 공정에서는 제 1 공정에서 사용한 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다아제를 그대로 사용할 수 있고, 새롭게 첨가할 필요는 없다.

퀴논 색소를 발생시키는 화합물의 농도는 예를 들면 HDAOS이면 농도는 0.5∼2.0mmol/L정도가 바람직하고, 4-아미노안티피린이면 0.1∼2.0mmol/L가 바람직하고, 또한 페록시다아제의 농도는 0.4∼5.0U/mL가 바람직하다. 또한, 제 1 공정에서 발생한 과산화수소를 카탈라아제로 분해하는 공정에서는 카탈라아제의 조해제인 아지드화 나트륨을 사용하여 제 2 공정의 반응액 중에 첨가한다. 이 경우의 아지드화 나트륨의 농도는 통상 0.1g/L∼1.0g/L정도이다.

제 2 공정의 다른 반응 조건(반응 온도, 시간, 완충액, pH 등)은 상기한 제 1 공정의 반응 조건과 마찬가지이어도 좋다.

또한, 피검 시료 중의 HDL 콜레스테롤량으로부터 제 1 공정과 제 2 공정으로부터 얻어진 HDL3 콜레스테롤량의 차를 산출하여 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤량을 구하는 것도 가능하다. 피검 시료 중의 HDL 콜레스테롤량을 구하는 방법은 주지이며(예를 들면, 일본 특허 공개 2001-103998호 공보), 그것을 위한 키트도 시판되어 있으므로 그들을 사용해서 용이하게 정량할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

참고예 1

이하의 시약 조성의 시약A와 시약B를 조제하고, 시약A에 각종 계면활성제를 0.1%(w/v) 또는 1.0%(W/V) 농도 첨가한 시약을 각각 조제했다. 측정 직전에 각종 계면활성제가 들어간 하기 시약A와 시약B를 1:3의 비율로 혼합하고, HDL2 분획과 HDL3 분획의 콜레스테롤을 반응시켜 주파장 700㎚, 부파장 600㎚에서의 최종 흡광도를 측정하여 비교했다.

HDL2 분획과 HDL3 분획은 이하와 같이 해서 획분했다. HDL을 포함하는 피검 시료, 즉 혈청에 염화 나트륨 및 브롬화 나트륨을 사용한 용액을 사용해서 초원심에 의해 HDL2와 HDL3의 경계의 비중(1.125)으로 분리되도록 획분하고, 각각의 획분을 회수했다.

하기 표 1에는 HDL2/HDL3의 비율이 0.75 이하이며, CM∼IDL/HDL3, LDL/HDL3이 0.75 이하인 계면활성제를 나타내고, 이들을 HDL3에 반응하는 계면활성제로 한다. 표 2에는 HDL2/HDL3의 비율이 1.25 이상이며, CM∼IDL/HDL2, LDL/HDL2의 비율이 1.25 이상인 계면활성제를 나타내고, 이들을 HDL3 이외에 반응하는 계면활성제로 한다. 표 3에는 HDL2/HDL3의 비율이 0.75∼1.25 사이이며, CM∼IDL/HDL2, LDL/HDL2, CM∼IDL/HDL3, LDL/HDL3의 비율이 0.75 이하인 계면활성제를 나타내고, 이들을 HDL에 반응하는 계면활성제로 한다. 표 4에는 HDL2/HDL3의 비율이 0.75∼1.25 사이이며, CM∼IDL/HDL2, LDL/HDL2, CM∼IDL/HDL3, LDL/HDL3의 비율이 0.75 이상인 계면활성제를 나타내고, 이들을 모든 리포단백에 반응하는 계면활성제로 한다. 표 5에는 상기에 적용되지 않는 계면활성제를 나타내고 이들을 HDL 이외에 반응하는 계면활성제로 한다.

시약A

BES 완충액(pH 7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

시약B

BES 완충액(pH6.6) 100mmol/L

아지드화 나트륨 0.1%

4-아미노안티피린 4.0mmol/L

페록시다아제 2.4U/mL

(단위: Abs×10000)

에말겐A90, 에말겐120, 닛산아논BL-SF, Triton WR-1339, 퍼소프트NK-100, 아데카톨PS-440E가 HDL3에 특이적으로 반응하는 계면활성제이었다.

(단위: Abs×10000)

에말겐A500, 닛산아논BDF-SF, 닛산아논BF, 나이민S210, 플로닉P103, 코타민24P, 산아미드CF-10, 암히톨24B, 플로닉F68, 플로닉F127이 HDL3 이외에 반응하는 계면활성제이었다.

(단위: Abs×10000)

에말겐B66, 에말겐A60, 에말겐LS110, Newcol-610, Newcol-2609, Newcol-CMP-11, 닛산아논GLM-R-LV, Newcol-710이 HDL에 특이하게 반응하는 계면활성제이었다.

(단위: Abs×10000)

에말겐108, 에말겐707, Newcol707, 아데카톨LB83, 아데카톨LB103, 에말겐909가 모든 리포단백에 특이하게 반응하는 계면활성제이었다.

(단위: Abs×10000)

Newcol -714, Newcol-723, Newcol2614, 나이민S215, 플로닉P123, 레베놀WX, 나이밋드MT215, 노니온HS220, 플로닉F88이 HDL 이외에 특이하게 반응하는 계면활성제이었다.

실시예 1

HDL3 이외의 콜레스테롤을 소거하는 시약C와, 시약C를 반응시킨 산물 중의 HDL을 측정하는 공정의 시약D를 이하의 조성으로 조제했다. 혈청 16검체를 측정하고, HDL3 침전법과의 상관을 취했다. 또한, 조제 시약의 비교 대조로서는 HDL 측정 시약(Denka Seiken Co.,Ltd.제)을 사용했다.

측정은 혈청 2㎕에 하기 시약C를 150㎕ 첨가하고, 5분 가온 반응 후 시약D를 첨가하여 5분 더 가온 반응시키고, 주파장 700㎚, 부파장 600㎚의 흡광도를 측정했다. 또한, 공지의 HDL3 침전법의 조작은 일본 특허 공개 2009-207463에 따랐다. 동 혈청을 HDL 측정 시약으로 측정하고, 마찬가지로 HDL3 침전법(측정법A로 한다)과의 상관을 취하여 조제 시약과의 비교를 했다.

시약C

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

산아미드CF-10 1%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

시약D

BES 완충액(pH6.6) 100mmol/L

아지드화 나트륨 0.1%

에말겐B66 1.5%

4-아미노안티피린 4.0mmol/L

페록시다아제 2.4U/mL

상관도를 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1이 측정법A와 HDL 측정 시약과의 상관도, 도 2가 측정법A와 시약C 및 시약D의 상관도이다.

HDL의 HDL3 침전법과의 상관계수는 r=-0.051이며, 시약C, D를 사용해서 측정한 값은 HDL3 침전법과의 상관계수가 r=0.74이었다. 따라서, HDL 측정법보다 보다 HDL3과 양호한 상관 관계가 확인되고, 보다 HDL3을 특이적으로 측정하고 있다.

또한, 초원심을 사용해서 CM∼HDL2 분획과 HDL3 분획을 획분하고, 상기 시약으로 측정을 행하고, 각각의 측정 시간에 있어서의 흡광도를 측정했다. 시약D를 첨가하고나서의 흡광도 변화의 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이 HDL3 이외의 리포단백보다 HDL3에 대하여 특이적으로 반응한다.

실시예 2

초원심을 사용해서 CM∼LDL 분획, HDL2 분획, HDL3 분획을 획분하고, 참고예 1에서 사용한 시약A에 포스폴리파아제D(PLDP)를 첨가한 시약E를 반응시키고, 상기시약D를 더 첨가하여 측정을 행했다. 측정은 혈청 2㎕에 시약E를 150㎕ 첨가하고, 5분 가온 반응 후 시약D를 첨가하고, 5분 더 가온 반응시켜 주파장 700㎚, 부파장 600㎚의 흡광도를 측정했다.

시약E

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

포스폴리파아제D 5.0U/mL

시약D가 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 4에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 3

참고예 1에서 사용한 시약A에 계면활성제와 스핑고미엘리나제를 첨가한 시약F와, 시약F를 반응시킨 산물 중의 HDL3을 측정하는 공정의 시약G를 이하의 조성으로 조제하고, 초원심을 사용해서 CM∼IDL간의 분획, LDL 분획, HDL2 분획, HDL3 분획을 획분하고, 측정을 행했다. 시약의 측정 순서는 실시예 2와 마찬가지로 실시하고, 각각의 측정 시간에 있어서의 흡광도를 측정했다.

시약F

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

플로닉F68 0.03w/v%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

스핑고미엘리나제 0.5U/mL

시약G

BES 완충액(pH6.6) 100mmol/L

아지드화 나트륨 0.1%

에말겐A90 2.0%

4-아미노안티피린 4.0mmol/L

페록시다아제 2.4U/mL

시약G가 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 5에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 4

실시예 3과 마찬가지의 방법을 사용해서 실시예 2에서 사용한 시약E의 포스폴리파아제를 포스폴리파아제C로 변경하고, 계면활성제를 첨가한 시약H를 사용해서 흡광도를 측정했다.

시약H

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

플로닉F68 0.03w/v%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

포스폴리파아제C 5.0U/mL

시약H가 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 6에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 5

실시예 3과 마찬가지의 방법을 사용해서 실시예 4에서 사용한 시약H의 포스폴리파아제를 포스폴리파아제D(PLDP)로 변경하고, 계면활성제를 첨가한 시약I를 사용해서 흡광도를 측정했다.

시약I

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

플로닉F68 0.03w/v%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

포스폴리파아제D 5.0U/mL

시약I가 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 7에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 6

실시예 3과 마찬가지의 방법을 사용해서 하기에 기재된 조성의 시약J 및 시약K를 사용해서 흡광도를 측정했다.

시약J

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

플로닉P103 0.03w/v%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

포스폴리파아제D 5.0U/mL

시약K

BES 완충액(pH6.6) 100mmol/L

아지드화 나트륨 0.1%

에말겐 120 1.0%

4-아미노안티피린 4.0mmol/L

페록시다아제 2.4U/mL

시약K가 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 8에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 7

실시예 3과 마찬가지의 방법을 사용해서 실시예 5에서 사용한 시약J와 하기에 기재된 조성의 시약L을 사용해서 흡광도를 측정했다.

시약L

BES 완충액(pH6.6) 100mmol/L

아지드화 나트륨 0.1%

에말겐 909 1.0%

4-아미노안티피린 4.0mmol/L

페록시다아제 2.4U/mL

시약L이 첨가되고나서의 각 분획에 있어서의 흡광도의 경시 변화의 결과를 도 9에 나타낸다. HDL3에 대하여 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다.

실시예 8

이하의 시약M을 조제하고, 시약D와 조합시킴으로써 피검 시료 중의 HDL-C(C은 콜레스테롤, 이하 동일)를 측정하고, 그 값으로부터 실시예 5의 시약I, 시약D를 사용하여 HDL3-C를 측정한 값을 나눔으로써 HDL2-C를 산출했다. 각각의 검체의 HDL-C, HDL3-C, HDL2-C값을 표 6에 나타낸다.

시약M

BES 완충액(pH7.0) 100mmol/L

HDAOS 0.7mmol/L

플로닉P88 0.1w/v%

카탈라아제 600U/L

콜레스테롤 옥시다아제 1.4U/mL

콜레스테롤 에스테라제 0.8U/mL

포스폴리파아제D 5.0U/mL

(단위: mAbs)

Claims

피검 시료에 고밀도 리포단백질3 이외의 리포단백질과 반응하는 계면활성제를 반응시켜 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 상기 반응계 내에 잔존하는 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르인 적어도 1종의 비이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물 및 폴리옥시에틸렌-스테아릴아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비이온 계면활성제 및/또는 아미드에테르술페이트인 적어도 1종의 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 야자유 지방산-아미드프로필디메틸-아미노아세트산 베타인, 알킬디메틸-아미노아세트산 베타인 및 라우릴베타인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 양성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 계면활성제는 라우릴트리메틸암모늄클로라이드인 양이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 2 공정을 적어도 고밀도 리포단백질3과 반응하는 계면활성제의 존재 하에서 행하는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르 및 p-이소옥틸폴리옥시에틸렌페놀포름알데히드 폴리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌라우릴에테르인 적어도 1종의 비이온 계면활성제 및/또는 라우릴디메틸-아미노아세트산 베타인인 적어도 1종의 양성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 지방산족 인산 에스테르인 적어도 1종의 양이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌디스티렌화 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌트리벤질페닐에테르, 폴리옥시알킬렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르 및 폴리옥시에틸렌쿠밀페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 HLB가 11∼14 사이인 비이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 이미다졸린형의 적어도 1종의 양성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르 및 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 비이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 제 2 공정에서 사용하는 계면활성제는 라우릴알코올알콕실레이트인 적어도 1종의 비이온 계면활성제 및/또는 폴리옥시에틸렌-알킬페닐에테르황산 에스테르 나트륨염인 적어도 1종의 음이온 계면활성제인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포단백질3 중의 콜레스테롤의 정량 방법.