KR101871209B1 - 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 시약 키트 - Google Patents

고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 시약 키트 Download PDF

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Abstract

번잡한 조작을 필요로 하는 일 없이 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량하는 방법이 개시되어 있다. 콜레스테롤의 정량 방법은 HDL에 포스포리파아제를 작용시켜서 콜레스테롤을 정량하는 것을 포함한다. 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 이외의 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 고밀도 리포 단백질 중 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하고, 제 2 공정을 이 방법에 의해 행함으로써 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤을 정량할 수 있다.

Description

고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법 및 그것을 위한 시약 키트{METHOD FOR QUANTIFYING CHOLESTEROL IN HIGH-DENSITY LIPOPROTEIN 2, AND REAGENT KIT FOR THE METHOD}
본 발명은 고밀도 리포 단백질 2(이하 「HDL2」라고 칭하는 경우가 있음) 중의 콜레스테롤(HDL2 중의 콜레스테롤을 이하 「HDL2 콜레스테롤」이라고 칭하는 경우가 있음)의 정량 방법 및 그것을 위한 시약 키트에 관한 것이다.
고밀도 리포 단백(HDL)은 동맥경화 벽을 포함시킨 각 조직으로부터 콜레스테롤을 수취하기 위해서 세포 내에 축적된 콜레스테롤의 제거 작용에 관계되고, 그 때문에 콜레스테롤 역전송계라고도 칭해지고 있다. 관동맥경화 등의 동맥경화 질환과 부의 상관이 있는 것이 알려져 있고, HDL이 저치인 것은 지방질 이상증 중 하나로서 저치 한계가 설정되어 있어 동맥경화의 지표로서 유용한 것이 알려져 있다.
HDL은 아포 단백질과 인지질, 콜레스테롤, 중성 지방으로 구성되어 있다. HDL은 밀도가 d=1.063~1.210g/㎖이며, d=1.063~1.125g/㎖인 HDL2와 d=1.125~1.210g/㎖인 HDL3의 2개의 분획으로 더 분류된다. 리포 단백의 분포 곡선에 의해 d=1.125g/㎖ 부분에 노치가 확인되어 여기로부터 밀도가 무거운 부분을 HDL3이라고 한다. 또한, HDL 중의 아포 단백질 중 아포 리포 단백 E 함유량차로부터 아포 E의 함유량이 많은 HDL을 아포 E-rich HDL이라고 하는 아분획의 분류 방법도 존재한다.
종래까지 HDL 전체뿐만 아니라 HDL2 및 HDL3 각각의 아분획에 있어서 달랐던 작용을 나타내는 것이 알려져 있다. HDL2에는 항동맥경화 작용이 있다고 전해지고 있다. 임상에 있어서 CETP 결손에 의해 HDL이 LDL이나 IDL로 대사되지 않고 HDL 콜레스테롤량이 증가하는 것이 알려져 있다. CETP 결손에 의해 증가한 HDL은 HDL2라고도 칭해지고 있다. 또한, CETP 결손에 의해 아포 E-rich HDL이 상승한다고도 전해지고 있고, 아포 E-rich HDL은 콜레스테롤 추출능이 강해 항혈소판 작용이 있어 HDL 중에서도 보다 우수하다고 전해지고 있다. 또한, 간성 리파아제 활성의 저하에 의해 HDL3이 HDL2로 변화되지 않고 HDL3이 증가한다. 즉, HDL의 아분획은 각각 병태에 의한 비율이 달라 HDL만을 측정하는 것만으로는 이들의 변동을 보기 어렵다. 이들의 경향으로부터 HDL 아분획 각각을 측정하는 것은 동맥경화 질환이나 지질 이상증 등의 질환의 유무나 원인을 판단할 도움이 되는 것이 예상된다. 또한, 현재 이들 HDL 아분획의 작용을 근거로 해서 CETP의 작용을 저해하고, LDL 콜레스테롤량을 감소시키고, HDL 콜레스테롤량을 증가시키는 치료약의 개발이 각 메이커에서 진행되고 있다.
HDL 아분획의 간편한 측정 방법을 확립하는 것은 상세한 작용의 해명이나 이들의 치료의 효과로 연결될 가능성이 있다.
현재까지 HDL 아분획의 측정법으로서 알려져 있는 것으로서는 초원심법, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)법, HDL3 침전법(특허문헌 1), NMR법 등이 존재한다.
초원심은 원심에 의해 리포 단백의 밀도의 차를 이용해서 획분하는 방법이며, 작업에 숙련이 필요한 점, 일수가 걸리는 점, 또한 비용도 고액이 되는 결점이 있다. 오카자키들에 의한 HPLC를 사용한 HDL2와 HDL3을 나누는 방법에서는 작업에 시간을 요하고, 특별한 기기가 필요하다. HDL3 침전법은 2가 금속 이온 및 덱스트란 황산을 포함하는 시약에 의해 HDL3 이외를 응집시켜서 원심에 의해 상청 부분의 HDL3을 회수하여 자동 분석 장치로 측정하는 방법이다. 역시 작업에 숙련이 필요한 점, 또한 용수법인 검체의 전처리 조작이 필요한 경우도 있어 측정까지 어느 정도의 시간이 걸린다는 결점이 있어 범용적이지는 않았다. 또한, NMR법은 핵자기 공명에 의해 리포 단백의 입자수를 계측하는 방법이지만, 특수한 기계가 필요하여 일반적이지는 않다.
또한, HDL 아획분의 분석 방법(특허문헌 2)이 존재한다. 범용 자동 분석 장치에 의해 측정이 가능하지만, 계면활성제를 사용함으로써 HDL3 이외의 리포 단백을 효소의 작용으로부터 저해하는 방법을 사용하고 있어 HDL3을 측정해 총 HDL로부터 HDL3의 값의 차를 구함으로써 HDL2를 측정하는 것이 가능하지만, 직접 HDL2를 측정할 수 있는 방법은 없다.
이러한 방법을 대신하여 간편하고, 또한 HDL2 중 콜레스테롤량을 보다 선택적으로 정량할 수 있는 시약의 발명이 필요로 되어 있다.
일본 특허 공개 2009-207463호 공보 일본 특허 공개 2001-346598호 공보
본 발명의 목적은 번잡한 조작을 필요로 하는 일 없이 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 번잡한 조작을 필요로 하는 일 없이 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 HDL2를 정량하기 위한 시약 키트를 제공하는 것이다.
본원 발명자들은 예의 연구한 결과 포스포리파아제가 HDL 중에 있어서 HDL2에 작용하지만, HDL3에는 거의 작용하지 않는 조건을 발견하고, 포스포리파아제를 이용함으로써 HDL2를 우선적으로 측정할 수 있는 방법에 도달하고, 이것이 실현 가능한 것을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 HDL에 포스포리파아제를 작용시켜서 콜레스테롤을 정량하는 것을 포함하는 HDL2의 콜레스테롤의 정량 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포스포리파아제를 포함하는 상기 본 발명의 방법에 의해 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤을 정량하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 이외의 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 고밀도 리포 단백질 중 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하고, 상기 제 2 공정을 상기 본 발명의 방법에 의해 행하는 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤의 정량 방법을 제공한다.
(발명의 효과)
본 발명에 의해 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 초원심이나 전처리라는 번잡한 작업을 필요로 하지 않고 자동 분석 장치로 특이적으로 정량하는 것이 가능하게 되었다. 또한, 종래 기술인 피검체 중 HDL 총 콜레스테롤 정량법에 의해 얻어진 총 HDL 콜레스테롤량으로부터 HDL2 콜레스테롤량의 차를 산출함으로써 HDL3 콜레스테롤량을 정량하는 것도 가능하게 되었다.
상기와 같이 본 발명의 HDL2 콜레스테롤의 정량 방법은 HDL에 포스포리파아제를 작용시켜서 콜레스테롤을 정량하는 것을 포함한다. 이 정량 방법을 생체로부터 분리한 피검 시료로부터 미리 HDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 제외한 시료에 적용함으로써 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 즉, 피검 시료 중의 HDL 이외의 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 HDL 중 HDL2 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하는 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤의 정량 방법에 있어서의 제 2 공정으로서 상기 본 발명의 방법을 적용함으로써 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량할 수 있다. 이하 이 두 공정법에 대해서 설명한다. 또한, 이하의 설명에서는 두 공정법을 설명하지만, 이 두 공정법의 제 2 공정이 본 발명의 방법이다(무엇보다, 이 두 공정법 자체도 본 발명의 방법임). 또한, 본 발명의 방법을 행하기 위해서 이하의 제 1 공정은 필수적은 아니고, 생체로부터 분리한 피검 시료로부터 다른 공지의 방법, 예를 들면 초원심법 등에 의해 HDL만을 인출하여 본 발명의 방법(하기 제 2 공정)을 적용함으로써도 피검 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량하는 것이 가능하다. 무엇보다 이 경우에는 콜레스테롤의 정량에 필요한 콜레스테롤옥시다아제 및 콜레스테롤에스테라아제를 새롭게 공급할 필요가 있다(이하의 두 공정법에서는 제 1 공정에서 사용되는 콜레스테롤옥시다아제 및 콜레스테롤에스테라아제를 제 2 공정에서 이어서 이용할 수 있음).
본 발명의 방법에 제공되는 피검 시료로서는 그 시료 중의 HDL2 콜레스테롤을 정량하려고 하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 혈청 또는 혈장 또는 이들의 희석물이며, 특히 혈청 또는 그 희석물이 바람직하다.
본 발명에서 측정하려고 하는 HDL2는 밀도가 d=1.063~1.125g/㎖ 또는 입자 지름이 12.1~16㎚에 상당하는 부분 등 HDL 중에서도 보다 대입자인 HDL이다. 그러나 이들의 정의는 HDL의 연속한 범위 중에서의 단락이며, 반드시 상기 수치에서 명확하게 임상적 의의가 한정되는 것은 아니다. 일반적인 보고에서도 밀도의 범위가 다른 것도 존재하기 때문에 대략 상기 범위의 대입자측의 HDL을 HDL2라고 한다. 또한, 대입자측이면 아포 E-rich HDL 등도 본 발명의 측정 범위에 포함된다.
본 발명의 제 1 공정에서는 피검 시료에 콜레스테롤에스테라아제, 콜레스테롤옥시다아제 또는 콜레스테롤데히드로게나아제 등의 콜레스테롤 반응 효소에 추가해서 포스포리파아제나 리포프로테인리파아제를 첨가해서 반응시킨다. 포스포리파아제, 리포프로테인리파아제는 1종이어도 2종 이상 조합시켜서 첨가해도 좋다. 또한, 제 1 공정에서는 계면활성제를 사용하는 것도 가능하며, 상술한 효소와 계면활성제를 조합시켜서 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법의 제 1 공정에서는 HDL 이외의 리포 단백질 콜레스테롤을 콜레스테롤에스테라아제 등의 작용에 의해 반응계 외로 이행시킨다. 여기서 「반응계 외로 이행시킨다」란 콜레스테롤 및 그 에스테르를 소거 또는 보호함으로써 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 및 그 에스테르가 관여하지 않도록 하는 것을 의미한다.
여기서 「소거」란 피검 시료 중의 리포 단백의 콜레스테롤을 분해하고, 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 측정의 반응에 작용시키지 않도록 하는 것이다. 리포 단백 콜레스테롤을 소거하기 위한 방법으로서는 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 작용시켜 발생한 과산화수소를 카탈라아제를 사용하여 물과 산소로 분해하는 방법을 들 수 있다. 또한, 페록시다아제를 사용하여 수소 공여체와 발생한 과산화수소를 반응시켜 무색 퀴논으로 전화해도 좋지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 콜레스테롤의 소거의 방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이다.
「보호」란 피검 시료 중의 리포 단백을 그 후의 공정에 있어서 콜레스테롤 측정에 반응하지 않도록 보호를 행하는 것이다. 리포 단백을 보호하는데에는 각 리포 단백을 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제가 작용하지 않도록 특이적으로 보호하는 계면활성제를 사용하는 방법을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
제 1 공정은 반응계 외로 이행시키기 위한 효소계나 계면활성제를 단독 또는 동시에 첨가해 둠으로써 양 공정을 단일 공정으로서 동시에 행할 수도 있다.
제 1 공정에 있어서 콜레스테롤에스테라아제, 콜레스테롤옥시다아제를 사용할 경우 콜레스테롤에스테라아제의 농도(본 명세서에 있어서 농도는 특별히 언급하지 않는 한 최종 농도를 의미함)는 0.1~10.0U/㎖ 정도가 바람직하고, 0.2~2.0U/㎖ 정도가 보다 바람직하다. 콜레스테롤옥시다아제의 농도는 0.05~10.0U/㎖ 정도가 바람직하고, 0.1~1.0U/㎖ 정도가 보다 바람직하다. 또한, 콜레스테롤에스테라아제는 에스테르형 콜레스테롤에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 Asahi Kasei Chemicals Corp.제의 콜레스테롤에스테라아제(CEBP, CEN)나 Toyobo Co., Ltd.제의 콜레스테롤에스테라아제(COE-311, COE-313)나 Kikkoman Corporation제의 콜레스테롤에스테라아제(CHE-XE) 등의 시판품을 사용할 수 있다. 또한, 콜레스테롤옥시다아제는 유리형 콜레스테롤에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 Asahi Kasei Chemicals Corp.제의 콜레스테롤옥시다아제(CONII)나 Toyobo Co., Ltd.제의 콜레스테롤옥시다아제(CO0-311, COO-321, C00-331)나 Kikkoman Corporation제의 콜레스테롤옥시다아제(CHO-CE, CHO-PEWL, CHO-BS) 등의 시판품을 사용할 수 있다.
콜레스테롤데히드로게나아제를 사용하는 경우에는 0.01~200U/㎖가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1~100U/㎖가 바람직하다. 또한, 콜레스테롤데히드로게나아제로서는 콜레스테롤을 산화해서 산화형 보효소를 환원하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 예를 들면 Amano Enzyme Inc.제의 콜레스테롤데히드로게나아제(CHDH-5) 등의 시판품을 사용하는 것이 가능하다.
또한, 포스포리파아제나 리포프로테인리파아제를 첨가하는 것이 가능하고, 그 경우는 0.01~0.5U/㎖ 정도가 바람직하고, 0.02~0.5U/㎖가 더욱 바람직하다. 리포프로테인리파아제, 포스포리파아제는 시판품을 사용하는 것이 가능하고, 예를 들면 Toyobo Co., Ltd.제의 리포프로테인리파아제(LPL-311이나 LPL-314), Amano Enzyme Inc.제의 리포프로테인리파아제(LPL-3 등), Asahi Kasei Chemicals Corp.제의 리포프로테인리파아제(LPBP나 LP 등)를 사용할 수 있다. 포스포리파아제는, 예를 들면 Asahi Kasei Chemicals Corp.제의 스핑고미엘리나아제(SPC)나 포스포리파아제인 포스포리파아제 A2(PLA2L), 포스포리파아제 D(PLD 또는 PLDP 또는 PLDPV), 포스포리파아제 C(PLC)를 사용하는 것이 가능하다. 단, 스핑고미엘리나아제를 사용하는 경우에는 스핑고미엘리나아제의 최종 농도는 0.05~50U/㎖ 정도가 바람직하고, 0.1~30U/㎖가 보다 바람직하다. 스핑고미엘리나아제는 적어도 스핑고미엘린에 작용하는 것이면 특별히 제한되는 것은 아니고, 스핑고미엘린 이외의 인지질을 구성하는 성분인 포스파티딜이노시톨 등에 대한 활성을 가져도 좋다. 또한, 제 1 공정에 있어서의 포스포리파아제의 농도와 기타 조건 하에서는 HDL2로의 영향이 적고, HDL 이외의 리포 단백에 작용시킬 수 있기 때문에 HDL 이외를 반응계 외로 유도하기 쉬워진다.
계면활성제를 첨가하는 경우에는 0.001~5.0중량% 농도로 첨가하는 것이 바람직하고, 0.002~3.0중량% 정도가 보다 바람직하다. 계면활성제로서는 폴리옥시에틸렌알킬에테르 황산 나트륨과 같은 음이온 계면활성제; 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 축합물, 아미드 비이온, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, HLB값이 14~17인 폴리옥시에틸렌 다환 페닐에테르와 같은 비이온계 계면활성제를 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는 플루로닉 P123(아데카), 플루로닉 F68(아데카), 플루로닉 F88(아데카), 레베놀 WX(카오), 비이온 HS220(니치유), 나이미드 MT-215(니치유), Newcol-723(닛폰유카자이), Newcol-2614(닛폰유카자이), Newcol-714(닛폰유카자이)를 들 수 있다.
제 1 공정에서 사용하는 반응액에는 통상의 생화학 반응에 사용되는 각종 완충액을 사용할 수 있고, pH가 5~8 사이인 것이 바람직하다. 용액으로서는 굿, 트리스, 인산, 글리신의 완충 용액이 바람직하고, 굿 완충액인 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시에틸)메탄(Bis-Tris), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산)(PIPES), 피페라진-1,4-비스(2-에탄술폰산), 1.5나트륨염, 1수화물(PIPES 1.5Na), 2-히드록시-3-모르폴리노프로판술폰산(MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산(BES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산(HEPES) 및 피페라진-1,4-비스(2-히드록시-3-프로판술폰산)(POPSO)이 바람직하다.
제 1 공정에 있어서는 HDL 이외의 리포 단백질을 차별하기 쉽게 하는 목적에서 1가 또는 2가의 양이온 또는 그들의 염을 첨가할 수 있다. 구체적으로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화망간, 염화칼슘, 염화암모늄, 황산 마그네슘, 황산 칼륨, 황산 리튬, 황산 암모늄, 아세트산 마그네슘 등을 사용하는 것이 가능하다. 농도는 1~50.0g/ℓ가 바람직하고, 5~30g/ℓ가 더욱 바람직하다.
제 1 공정의 반응 온도는 25~40℃ 정도가 바람직하고, 35~38℃가 더욱 바람직하고, 37℃가 가장 바람직하다. 반응 시간은 특별히 한정되지 않고, 통상 2~10분 정도이다.
제 1 공정은 계면활성제의 비존재 하에서 행하는 것이 가능하지만, 스핑고미엘리나아제 등의 효소와 계면활성제를 조합시켜서 사용해도 상관없다.
또한, 제 1 공정에 계면활성제를 공존시키는 경우에도 반응 조건(반응 온도, 시간, 완충액 등)은 상기와 같다.
이어지는 제 2 공정에서는 반응계 내에 잔존하는 HDL 중 HDL2의 콜레스테롤을 정량한다. 이는 반응계 내에 잔존하는 HDL에 포스포리파아제를 작용시켜서 HDL2의 콜레스테롤을 우선적으로 정량시킴으로써 행해진다.
제 2 공정에서 사용하는 포스포리파아제는 적어도 글리세롤린 지질에 대하여 작용하면 좋고, 적어도 포스파티딜콜린에 활성을 더 갖는 것이면 바람직하지만, 포스파티딜콜린 이외의 리조포스파에탄올아민 등이나 또는 글리세롤린 지질 이외의 스핑고미엘린이나 세라미드 등에 대하여 활성을 가지고 있어도 상관없다. 포스포리파아제는 시판품을 사용하는 것이 가능하고, 구체적으로는 Asahi Kasei Chemicals Corp.제의 포스포리파아제 A2(PLA2L), 포스포리파아제 C(PLC), 포스포리파아제 D(PLD 또는 PLDP 또는 PLDPV), 리조포스포리파아제(LYPL)를 사용하는 것이 가능하지만, 특히 포스포리파아제 C와 포스포리파아제 D가 바람직하다.
제 2 공정에 있어서 포스포리파아제를 사용하는 경우에는 1종 또는 2종 이상을 조합시켜서 작용시켜도 좋고, 농도(2종 이상 조합시킬 경우는 그 최종 농도)는 0.5~200U/㎖가 바람직하고, 1.0~100U/㎖가 보다 더 바람직하고, 3.0~50U/㎖가 보다 더 바람직하다. 제 1 공정에서 포스포리파아제를 사용한 경우에는 제 1 공정에서 사용한 농도 이상의 농도를 제 2 공정에서 사용한다.
제 2 공정에 있어서는 포스포리파아제 등의 작용을 이용해서 콜레스테롤을 정량한다. 콜레스테롤의 정량 방법 자체는 주지이며, 주지 중 어느 방법도 채용할 수 있고, 하기 실시예에도 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들면, 리포 단백 중의 에스테르형 콜레스테롤에 콜레스테롤에스테라아제를 사용하여 가수분해하여 유리형 콜레스테롤과 지방산이 발생하고, 발생한 유리형 콜레스테롤과 원래 리포 단백 중에 존재하는 유리 콜레스테롤을 콜레스테롤옥시다아제를 사용하여 콜레스테논과 과산화수소를 발생시켜서 이것을 페록시다아제의 존재 하에서 퀴논 색소를 형성시켜 정량한다. 퀴논 색소를 발생시키는 화합물로서, 예를 들면 HDAOS(N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린), DAOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린) 또는 TOOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린)과 4-아미노안티피린을 들 수 있지만, 퀴논 색소를 발생시킬 수 있는 조합이면 이들에 한정되는 것은 아니다. 제 1 공정에서 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 사용할 경우에는 제 2 공정에서는 제 1 공정에서 사용한 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 그대로 사용할 수 있고, 새롭게 첨가할 필요는 없다.
콜레스테롤에 반응하는 콜레스테롤 측정용 효소로서 콜레스테롤에스테라아제 및 콜레스테롤옥시다아제를 사용할 경우 효소 반응에 의해 과산화수소가 발생한다. 발생한 과산화수소로부터 페록시다아제의 존재 하에서 수소 공여체와 수소 수용체의 커플링 반응에 의해 형성된 색소는 파장 400~700㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 HDL2 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다.
콜레스테롤에 반응하는 콜레스테롤 측정용 효소로서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤데히드로게나아제를 사용할 경우 효소 반응에 의해 NAD(P)로부터 NAD(P)H가 발생한다. 발생한 NAD(P)H는 파장 330~400㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 HDL2 중의 콜레스테롤을 정량할 수 있다.
퀴논 색소를 발생시키는 화합물의 농도는, 예를 들면 HDAOS이면 농도는 0.5~2.0mmol/ℓ 정도가 바람직하고, 4-아미노안티피린이면 0.1~2.0mmol/ℓ가 바람직하고, 또한 페록시다아제의 농도는 0.4~5.0U/㎖가 바람직하다. 또한, 제 1 공정에서 발생한 과산화수소를 카탈라아제로 분해하는 공정에서는 카탈라아제의 조해제인 아지화나트륨를 사용하여 제 2 공정의 반응액 중에 첨가한다. 이 경우의 아지화나트륨의 농도는 통상 0.1g/ℓ~1.0g/ℓ 정도이다.
제 1 공정에 있어서 페록시다아제를 사용할 경우 페록시다아제의 농도는 2.0~5.0U/㎖ 정도가 바람직하고, 3.0~4.0U/㎖ 정도가 더 바람직하다. 또한, 무색 퀴논으로 전화하는 화합물을 사용할 경우 그 농도는 0.4~0.8mmol/ℓ 정도가 바람직하다.
제 2 공정에 있어서는 계면활성제의 존재는 필수가 아니라 첨가하고 있어도 하고 있지 않아도 좋다. 첨가하는 경우에는 제 1 공정에서 사용할 수 있는 계면활성제를 제 1 공정의 동 농도 또는 그 이하의 범위 내에서 첨가한다.
제 2 공정의 다른 반응 조건(반응 온도, 시간, 완충액, pH 등)은 상기 제 1 공정의 반응 조건과 마찬가지이면 좋다.
상기까지의 제 1 공정과 제 2 공정에서 HDL2 콜레스테롤을 측정하는 방법은 상기 각 시약을 포함하는 시약 키트로서 조합시키는 것이 가능하다.
또한, 피검 시료 중의 HDL 콜레스테롤량으로부터 제 1 공정과 제 2 공정으로부터 얻어진 HDL2 콜레스테롤량의 차를 산출하고, 피검 시료 중의 HDL3 콜레스테롤량을 구하는 것도 가능하다. 피검 시료 중의 HDL 콜레스테롤량을 구입하는 방법은 주지이며(예를 들면, 일본 특허 공개 2001-103998호 공보), 그것을 위한 키트도 시판되어 있으므로 그들을 사용하여 용이하게 정량할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 무엇보다 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3을 회수하고, 하기 조제 시약 A를 제 1 공정으로서, 조제 시약 I를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 즉, 이 방법은 구체적으로는 다음과 같이 해서 행했다. 초원심법은 브롬화나트륨 용액 등을 사용함으로써 혈청 등의 피검 시료의 리포 단백의 밀도의 차를 이용해서 CM, LDL, HDL2, HDL3 등의 각 분획을 조제하는 방법이다. 본 특허의 실시예에서는 HDL2 분획은 밀도 d=1.063~1.125g/㎖, HDL3 분획은 밀도 d=1.125~1.210g/㎖의 밀도 범위 중의 리포 단백을 포함하는 분획이다. 측정은 초원심분획 2㎕에 대하여 제 1 공정용 조제 시약을 150㎕ 혼합해서 37℃ 5분 반응 후 제 2 공정용 조제 시약을 50㎕의 비율로 혼합해서 37℃ 5분 반응시킨다. 파장은 주파장 600㎚, 부파장 700㎚를 사용했다.
측정된 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 1에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 A
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.2g/ℓ
조제 시약 I
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 1.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00001
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 2
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3을 회수하고, 하기 조제 시약 B 또는 C를 제 1 공정으로서 조제 시약 I를 제 2 공정으로서 조합하고 반응시켰다. HDL2에 대해서 측정된 흡광도를 HDL3에 대해서 측정된 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 2에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 B
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
스핑고미엘리나아제 0.5U/㎖
조제 시약 C
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
스핑고미엘리나아제 1. 0U/㎖
조제 시약 I
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 1.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00002
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에서 스핑고미엘리나아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 3
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3을 회수하고, 하기 조제 시약 D~F를 제 1 공정으로서 조제 시약 I를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 1 공정에서 제 2 공정보다 저농도의 포스포리파아제 D를 사용하고, 또한 제 2 공정에 있어서도 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 3에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 D
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
포스포리파아제 D(PLDP) 0.1U/㎖
조제 시약 E
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
포스포리파아제 D(PLDP) 0.3U/㎖
조제 시약 F
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
포스포리파아제 D(PLDP) 0.5U/㎖
조제 시약 I
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 1.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00003
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에서 제 2 공정보다 저농도의 포스포리파아제 D를 사용하고, 또한 제 2 공정에 있어서도 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 4
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3을 회수하고, 하기 조제 시약 G 또는 H를 제 1 공정으로서 조제 시약 I를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 1 공정에서 스핑고미엘리나아제와 제 2 공정보다 저농도의 포스포리파아제 D를 사용하고, 또한 제 2 공정에 있어서도 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 4에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 G
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
스핑고미엘리나아제 0.5U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 0.1U/㎖
조제 시약 H
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
스핑고미엘리나아제 0.5U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 0.3U/㎖
조제 시약 I
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 1.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00004
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에서 스핑고미엘리나아제와 제 2 공정보다 저농도의 포스포리파아제 D를 사용하고, 또한 제 2 공정에 있어서도 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 5
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 하기 조제 시약 B를 제 1 공정으로서 조제 시약 J 또는 K를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 1 공정에서 스핑고미엘리나아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 5에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 B
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
스핑고미엘리나아제 0.5U/㎖
조제 시약 J
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 C 1.0U/㎖
조제 시약 K
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 C 2.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00005
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에서 스핑고미엘리나아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 6
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 조제 시약 B를 제 1 공정으로서 하기 조제 시약 L 또는 M을 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C 또는 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는 것을 확인했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 6에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 L
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
포스포리파아제 D(PLDP) 2.0U/㎖
조제 시약 M
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 7.0
아지화나트륨 0.1%
4-아미노안티피린 4.0mmol/ℓ
페록시다아제 2.4U/㎖
플루로닉 F68 0.25g/ℓ
포스포리파아제 C 1.0U/㎖
Figure 112013083137088-pct00006
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C 또는 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 7
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 하기 조제 시약 N을 제 1 공정으로서 조제 시약 J 또는 K를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는 것을 확인했다. 결과는 HDL2를 HDL3로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 7에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 N
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
Figure 112013083137088-pct00007
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 8
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 조제 시약 N을 제 1 공정으로서 조제 시약 L 또는 M을 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C 또는 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는 것을 확인했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 8에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
Figure 112013083137088-pct00008
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 2 공정에 있어서 포스포리파아제 C 또는 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 9
초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 하기 조제 시약 V를 제 1 공정으로서 조제 시약 J~K를 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 1 공정에 리포프로테인리파아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 9에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 V
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
리포프로테인리파아제(LPL-311) 0.1U/㎖
Figure 112013083137088-pct00009
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에 리포프로테인리파아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 C를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 10
실시예 1과 마찬가지의 방법으로 해서 초원심법을 사용하여 HDL2와 HDL3 분획을 회수하고, 하기 조제 시약 W를 제 1 공정으로서 조제 시약 I, L을 제 2 공정으로서 조합하여 반응시켰다. 제 1 공정에 리포프로테인리파아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 D를 사용함으로써 HDL3보다 HDL2에 특이적으로 반응하는지 확인을 행했다. 결과는 HDL2의 흡광도를 HDL3의 흡광도로 나눔으로써 HDL2와 HDL3의 반응성의 배율을 산출해서 HDL 시약으로 측정한 경우와 비교를 행했다. 결과를 표 10에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
조제 시약 W
BES 완충액 100mmol/ℓ pH 6.6
HDAOS 0.7mmol/ℓ
카탈라아제 600U/㎖
염화나트륨 1g/ℓ
콜레스테롤에스테라아제 1.4U/㎖
콜레스테롤옥시다아제 0.8U/㎖
스핑고미엘리나아제 0.5U/㎖
리포프로테인리파아제(LPL-311) 0.1U/㎖
Figure 112013083137088-pct00010
각 조제 시약의 배율은 HDL 시약으로 측정한 배율보다 높은 값을 나타내고, 제 1 공정에 리포프로테인리파아제를 사용하고, 제 2 공정에서 포스포리파아제 C 또는 D를 사용함으로써 HDL 시약보다 HDL2를 우선적으로 측정하고 있는 결과가 얻어졌다.
실시예 11
초원심법을 사용하여 CM, VLDL 분획과 LDL 분획을 회수하고, 조제 시약 B를 제 1 공정으로서 조제 시약 J, K, I, L을 제 2 공정으로서 조합하여 반응시키고, 제 1 공정에 스핑고미엘리나아제를 사용하고, 제 2 공정에 포스포리파아제를 사용함으로써 제 1 공정에 있어서 HDL 이외의 리포 단백질을 소거해서 반응에 영향을 주지 않는 것을 확인했다. 일반적으로 HDL 이외의 리포 단백로의 영향의 적은 HDL 시약과 비교한 비교율을 산출해서 HDL 이외의 리포 단백의 측정으로의 영향을 검토했다. 결과를 표 11에 나타낸다. HDL 시약은 본 실시예에서는 HDL-EX Denka Seiken Co., Ltd.제를 사용했다.
비교율=검토 시약 흡광도/HDL 시약 흡광도×100
Figure 112013083137088-pct00011
CM, VLDL 분획 및 LDL 분획에 대해서는 일반적인 HDL 시약과 동등 정도 또는 그 이하이며, HDL 이외의 리포 단백의 영향은 없었다.

Claims (6)

  1. 고밀도 리포 단백질에 포스포리파아제를 작용시켜 콜레스테롤을 정량하는 것을 포함하는 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법으로서,
    상기 포스포리파아제는 포스포리파아제 C 및/또는 포스포리파아제 D인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 포스포리파아제는 적어도 포스파티딜콜린에 반응성을 갖는 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 포스포리파아제의 농도는 0.1~200U/㎖인 것을 특징으로 하는 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법.
  5. 포스포리파아제 C 및/또는 포스포리파아제 D를 포함하는 키트로서, 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법에 의해 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤을 정량하기 위한 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 이외의 콜레스테롤을 반응계 외로 이행시키는 제 1 공정과, 반응계 내에 잔존하는 고밀도 리포 단백질 중 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤을 정량하는 제 2 공정을 포함하고, 상기 제 2 공정을 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 고밀도 리포 단백질 2 중의 콜레스테롤의 정량 방법에 의해 행하는 것을 특징으로 하는 피검 시료 중의 고밀도 리포 단백질 2 콜레스테롤의 정량 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101598597B1 (ko) * 2014-03-14 2016-03-02 연세대학교 산학협력단 혈장 대사체를 이용한 고-ldl-콜레스테롤 질환 진단 장치 및 방법
JP6582388B2 (ja) * 2014-10-23 2019-10-02 東洋紡株式会社 高密度リポ蛋白コレステロールの測定方法
US20170010290A1 (en) * 2015-07-07 2017-01-12 Mohmed E. Ashmaig Methods of determining a high density lipoprotein phospholipid level in a sample
CN113528609A (zh) * 2021-06-22 2021-10-22 美康生物科技股份有限公司 谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050095658A1 (en) 2002-01-30 2005-05-05 Denka Seiken Co Ltd Method of quantifying cholesterol in high density lipoprotein and reagent compositions

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2653755B2 (ja) * 1994-03-08 1997-09-17 協和メデックス株式会社 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量法
JP3288033B2 (ja) 1996-12-09 2002-06-04 デンカ生研株式会社 高密度リポ蛋白中のコレステロール定量用試薬
JP4708531B2 (ja) 2000-06-07 2011-06-22 シスメックス株式会社 Ｈｄｌ亜画分中のコレステロールの測定法
US7799537B2 (en) * 2004-11-29 2010-09-21 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Cholesterol measuring reagent containing a cholesterol esterase
TWI379904B (en) * 2005-02-14 2012-12-21 Kyowa Medex Co Ltd A method for quantifying cholesterol of remnant-like particles lipoprotein, reagent and kit
US20090181413A1 (en) * 2005-09-30 2009-07-16 Denka Seiken Co., Ltd. Simultaneous and differential quantification of two target analytes in biological sample
JP5534644B2 (ja) * 2005-12-09 2014-07-02 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット
EP2116612B1 (en) * 2007-02-28 2017-08-30 DENKA SEIKEN Co., Ltd. Reagent for determination of quantity of small dense low-density lipoprotein
WO2009048143A1 (ja) * 2007-10-10 2009-04-16 Denka Seiken Co., Ltd. small,dense LDLコレステロールの定量方法およびキット
JP5500777B2 (ja) * 2008-03-06 2014-05-21 デンカ生研株式会社 Ｈｄｌ３−ｃの測定方法及びｈｄｌ３−ｃ測定用試薬
US20130171674A1 (en) 2010-07-23 2013-07-04 Denka Seiken Co., Ltd. Method for quantifying the amount of cholesterol in high-density lipoprotein 3

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050095658A1 (en) 2002-01-30 2005-05-05 Denka Seiken Co Ltd Method of quantifying cholesterol in high density lipoprotein and reagent compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Eur. J. Biochem., Vol. 162, pp. 279-286 (1987.)*

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