WO2023079599A1 - 試薬組成物およびキット - Google Patents

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WO2023079599A1
WO2023079599A1 PCT/JP2021/040433 JP2021040433W WO2023079599A1 WO 2023079599 A1 WO2023079599 A1 WO 2023079599A1 JP 2021040433 W JP2021040433 W JP 2021040433W WO 2023079599 A1 WO2023079599 A1 WO 2023079599A1
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reagent composition
sdldl
activity
cholesterol
reagent
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PCT/JP2021/040433
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English (en)
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Inventor
康樹 伊藤
Original Assignee
デンカ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Definitions

  • the present invention relates to reagent compositions and kits.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2000-325097 describes a technique relating to a method for measuring LDL cholesterol.
  • a first step of selectively enzymatically reacting HDL cholesterol by adding an enzyme and a first surfactant to a sample containing lipoproteins, and then adding a second surfactant, LDL cholesterol HDL cholesterol and/or LDL cholesterol are measured by measuring the compound consumed or produced by the reaction with the enzyme in the second step of selectively enzymatically reacting cholesterol and in the first or second step.
  • This method does not require a lipoprotein agglutinating agent that increases the turbidity of the reaction solution, has no restrictions on the enzymes used, and reacts LDL cholesterol with LDL cholesterol can be easily and inexpensively quantified without the need to newly add another enzyme in the step of obtaining, and if necessary, lipoprotein aggregation that interferes with optical measurement of HDL cholesterol is formed. Since it is possible to provide a measuring method and a measuring reagent capable of accurately and inexpensively measuring the presence of hemoglobin, it is considered to be particularly useful in the field of clinical examination of arteriosclerosis and the like.
  • the present invention provides a technique for measuring sdLDL-C with excellent accuracy.
  • the present inventors investigated to improve the accuracy of sdLDL-C quantification. As a result, it was newly discovered that sdLDL-C can be quantified with excellent accuracy by setting the contact angle of the reagent composition used for quantification of sdLDL-C to a specific range. Arrived.
  • the following reagent compositions and kits are provided. [1] a step of acting a first reagent composition on a sample; After the step of applying the first reagent composition to the sample, the remaining lipoprotein cholesterol is quantified by applying a second reagent composition for quantifying small dense LDL cholesterol (sdLDL-C).
  • sdLDL-C small dense LDL cholesterol
  • a reagent composition used as the first reagent composition in the method for quantifying the sdLDL-C in the sample comprising containing an anionic surfactant, Having cholesterol esterase activity and cholesterol oxidase activity and at least one activity selected from the group consisting of peroxidase activity and catalase activity, A reagent composition having a contact angle between the reagent composition and a polyethylene terephthalate (PET) substrate of 65° or more and 77° or less, as measured by Method 1 below.
  • PET substrate PET (amorphous polyester) resin plate, transparent, thickness 2 mm
  • Pretreatment The surface of an unused PET substrate is wiped with a 70% ethanol aqueous solution.
  • Measurements are taken within 5 minutes after wiping.
  • Measurement method and conditions droplet method, ⁇ /2 method, temperature: 15 to 25° C., syringe: Teflon (registered trademark, hereinafter the same) coat 18G, dropping method, dropping amount: 2 ⁇ L, 1 second after dropping Measure later.
  • Calculation of contact angle Measure 5 times and obtain the average value of 5 times.
  • Method 2-1 (1) Apparatus: EMS (Electro Magnetically Spinning Viscometer) viscometer (2) Measurement method and conditions: Measurement method: electromagnetic spinning method, motor rotation speed: 1000 rpm, holding time: 600 seconds, measurement temperature: 5 ° C., sequence loop: 1 time, sample: 500 ⁇ L (3) Calculation of viscosity: Measure five times and calculate the average value of the five times. [7] The reagent composition according to any one of [1] to [6], wherein the viscosity of the reagent composition at 37° C. is 0.89 mPa ⁇ s or less, as measured by the following method 2-2. .
  • Method 2-2 (1) Apparatus: EMS (Electro Magnetically Spinning Viscometer) viscometer (2) Measurement method and conditions: Measurement method: electromagnetic spinning method, motor rotation speed: 1000 rpm, holding time: 600 seconds, measurement temperature: 37°C, sequence loop: 1 time, sample: 500 ⁇ L (3) Calculation of viscosity: Measure five times and calculate the average value of the five times.
  • a first reagent composition comprising the reagent composition according to any one of [1] to [7]; a second reagent composition for quantifying the sdLDL-C; A kit used to quantify said sdLDL-C in said sample.
  • the kit according to [8], wherein the second reagent composition has peroxidase activity [10] the first reagent composition contains either one of a hydrogen donor and a coupler but does not contain the other; The kit according to claim 8 or 9, wherein said second reagent composition does not contain said one of said hydrogen donor and said coupler but contains said other.
  • a technique for measuring sdLDL-C with excellent accuracy can be provided.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of the accuracy of measured values of sdLDL-C.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of the accuracy of measured values of sdLDL-C.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of the accuracy of measured values of sdLDL-C.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of evaluation of the accuracy of measured values of sdLDL-C.
  • a composition such as a measurement reagent can contain each component alone or in combination of two or more.
  • the numerical range "x to y" represents “x or more and y or less” and includes both the lower limit value x and the upper limit value y.
  • Lipoproteins are roughly divided into very low density lipoprotein (VLDL), low density lipoprotein (LDL) and high density lipoprotein (HDL) fractions, and LDL is further divided into small dense LDL (sdLDL) and other subfractions. divided. sdLDL is sometimes called small LDL, small LDL (SLDL), dense LDL, small, dense LDL, and other LDL is sometimes called large LDL (LLDL) and light LDL.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • sdLDL small dense LDL
  • SLDL small LDL
  • dense LDL small, dense LDL
  • LLDL large LDL
  • light LDL light LDL
  • lipoprotein fractions and subfractions can be distinguished by particle size or specific gravity.
  • the diameter of the lipoprotein particle size varies among reporters, but for example, VLDL is 30 nm to 80 nm (or 30 nm to 75 nm), LDL is 22 nm to 28 nm (or 19 nm to 30 nm), and HDL is 7 nm to 30 nm. 10 nm.
  • VLDL is 1.006 or less
  • LDL is 1.019 to 1.063
  • HDL is 1.063 to 1.21.
  • the LDL particle diameter can be measured, for example, by gradient gel electrophoresis (GGE) (JAMA, 260, p.1917-21, 1988), NMR (HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition, edited by Nader Rifai et al., p.609-623 , AACC PRESS: The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No.3, p.15-16).
  • GGE gradient gel electrophoresis
  • NMR HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition, edited by Nader Rifai et al., p.609-623 , AACC PRESS: The Fats of Life Summer 2002, LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No.3, p.15-16).
  • the specific gravity can be determined, for example, based on analysis by ultracentrifugation (Atherosclerosis, 106, p.241-253
  • the sdLDL to be measured is generally a subfraction of the LDL fraction with a diameter of about 22.0 to about 25.5 nm, or a subfraction with a specific gravity of 1.040 to 1.063. Point to the picture.
  • LDL is divided into sub-fractions according to size is that LDL with a small particle size is highly arteriosclerogenic and has a higher degree of malignancy than LDL. because it was necessary.
  • the diameter distribution and specific gravity distribution are continuous in LDL, and it is not possible to clearly distinguish between specific gravity levels and higher levels of malignancy. Therefore, the value of the specific gravity of 1.040 to 1.063 is not established as a characteristic of sdLDL.
  • sdLDL specifically refers to LDL that has a higher specific gravity and is clinically more arteriosclerogenic than other LDL.
  • sdLDL preferably refers to LDL belonging to a specific gravity range higher than the central point of the specific gravity range of LDL, more preferably belonging to a specific gravity range of 1.044 to 1.063.
  • lipoproteins other than LDL refer to VLDL or HDL, and may also include chylomicrons, IDL (intermediate density lipoprotein) or VHDL (very high density lipoprotein).
  • the reagent composition is used for quantifying small dense LDL cholesterol (sdLDL-C) after the step of allowing the first reagent composition to act on the sample and the step of allowing the first reagent composition to act on the sample. and quantifying cholesterol in remaining lipoproteins by acting the second reagent composition of is.
  • the reagent composition used as the first reagent composition is also simply referred to as the "first reagent composition”.
  • the first reagent composition contains an anionic surfactant, has cholesterol esterase activity and cholesterol oxidase activity, and has at least one activity selected from the group consisting of peroxidase activity and catalase activity.
  • the contact angle between the first reagent composition and the polyethylene terephthalate (PET) substrate measured by Method 1 below is 65° or more and 77° or less.
  • PET substrate PET (amorphous polyester) resin plate, transparent, thickness 2 mm
  • Pretreatment The surface of an unused PET substrate is wiped with a 70% ethanol aqueous solution. Measurements are taken within 5 minutes after wiping.
  • Measurement method and conditions drop method, ⁇ /2 method, temperature: 15 to 25° C., syringe: Teflon coated 18G, drop method, drop amount: 2 ⁇ L, measure 1 second after drop.
  • Calculation of contact angle Measure 5 times and obtain the average value of 5 times.
  • dust and the like on the PET substrate are wiped off before measurement. Since static electricity affects the contact angle, wipe it off so as not to generate friction as much as possible, and then measure within 5 minutes.
  • the contact angle is specifically a static contact angle measured by DMo-901, 701, 601, 501, DMC-MC3 manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd., or the like.
  • sdLDL-C can be quantified with excellent accuracy. I discovered something new. The reason for this is not necessarily clear, but is considered as follows.
  • the first reagent composition is placed in a reagent bottle (PET or the like) in a biochemical automatic analyzer and measured. During measurement, the reagent probe draws in a certain amount of the first reagent composition and discharges it into the reaction cell.
  • the contact angle (wettability) of the first reagent composition used in the step of eliminating cholesterol in lipoproteins other than sdLDL it is possible to appropriately control the liquid separation of the reagent, so that the adsorption of the reagent components to the reagent bottle is improved. , ejection from the probe, adsorption in the reaction cell, etc. can be controlled, and as a result, sdLDL-C can be measured more accurately.
  • the contact angle between the reagent composition and the PET substrate is 65° or more, preferably 66° or more, more preferably 67° or more, from the viewpoint of increasing the accuracy of sdLDL-C measurement.
  • the contact angle between the reagent composition and the PET substrate is 77° or less, preferably 76° or less, more preferably 75° or less.
  • the contact angle with the PET substrate can be controlled by appropriately selecting the type, combination, compounding amount, etc. of each component contained in the first reagent composition.
  • adjusting the type and blending amount of the surfactant, the type and blending amount of the protein, and the like are factors for making the contact angle with the PET substrate within the desired numerical range.
  • the first reagent composition contains an anionic surfactant and has at least one activity selected from the group consisting of cholesterol esterase activity and cholesterol oxidase activity
  • the first reagent composition is added to the sample. For example, it can act on and eliminate lipoproteins other than sdLDL in the sample. In addition, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL can be led out of the reaction system.
  • the surfactant acts (reacts) means that the surfactant decomposes the lipoproteins and liberates the cholesterol in the lipoproteins.
  • a surfactant that acts on (reacts with) lipoproteins other than sdLDL it is not required that the surfactant does not act on sdLDL at all, as long as it acts mainly on lipoproteins other than sdLDL.
  • Erasure means degrading substances in the specimen sample so that the degradants are not detected in the next step.
  • to eliminate cholesterol in lipoproteins other than sdLDL means that lipoproteins other than sdLDL in the subject sample are degraded, and the cholesterol in these lipoproteins, which are degradation products thereof, is not detected in subsequent steps. It means to do something.
  • “Leading out of the reaction system” specifically means that the cholesterol contained in HDL, VLDL, LDL, etc. does not affect the quantification of sdLDL-C, so that it is contained in HDL, VLDL, LDL, etc. Eliminates cholesterol, aggregates it, or prevents it from reacting in later processes.
  • cholesterol esterase activity specifically means that cholesterol esterase exists and that a reaction catalyzed by cholesterol esterase can occur. The same is true for other enzymatic activities such as cholesterol oxidase activity.
  • the components contained in the first reagent composition will be described in more detail below.
  • the first reagent composition contains at least an anionic surfactant.
  • the anionic surfactant is a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL, more preferably a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL but does not act on sdLDL.
  • anionic surfactants include sulfate-type anionic surfactants, sulfonate-type anionic surfactants, phosphate-type anionic surfactants, carboxylic acid-type anionic surfactants, and amino acid-based surfactants. is mentioned.
  • the anionic surfactant preferably contains a sulfate-type anionic surfactant, more preferably a sulfate salt.
  • Sulfate ester salts are specifically alkyl sulfate ester salts, polyoxyalkylene alkyl ether sulfate ester salts, amide ether sulfate salts, polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate ester salts, polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate ester salts, One or more selected from the group consisting of polyoxyethylene fatty acid amide sulfate salts and polyoxyethylene alkylamine sulfate ester salts, more preferably polyoxyethylene alkylphenyl ether sulfate salts and polyoxyethylene multi-sulfate ester salts. It is one or more selected from the group consisting of cyclic phenyl ether sulf
  • the sulfonate-type anionic surfactant is specifically one or more selected from the group consisting of alkylbenzenesulfonates and alkylnaphthalenesulfonates.
  • amino acid-based surfactants are specifically N-acyl amino acid salt type anionic surfactants such as alkyl taurate.
  • cations constituting salts include alkali metal ions such as sodium ions and potassium ions; alkaline earth metal ions such as magnesium ions and calcium ions; Ammonium is mentioned.
  • the cation constituting the salt is preferably at least one selected from the group consisting of alkali metal ions and ammonium, more preferably alkali metal ions, and further Sodium ions are preferred.
  • the concentration of the anionic surfactant in the first reagent composition is preferably 0.00% with respect to the entire composition of the first reagent composition. 005% (w/v) or more, more preferably 0.007% (w/v) or more, still more preferably 0.009% (w/v) or more, and even more preferably 0.010% (w/v) or more. v) above.
  • the concentration of the anionic surfactant in the first reagent composition is preferably 0.05% (w/v) or less, more preferably 0.045%, based on the total composition of the first reagent composition.
  • % (w/v) or less more preferably 0.04% (w/v) or less, even more preferably 0.035% (w/v) or less, and even more preferably 0.03% (w/v) or less.
  • the anionic surfactant in the first reagent composition can be identified, for example, by an analytical method combining IR, NMR, LC-MS, and the like. Methods for determining the structure of the anionic surfactant in the first reagent composition include analysis using LC-MSMS and NMR.
  • the first reagent composition has cholesterol esterase (CHE) activity, cholesterol oxidase (COO) activity, and at least one activity selected from the group consisting of peroxidase (POD) activity and catalase activity.
  • CHE cholesterol esterase
  • COO cholesterol oxidase
  • POD peroxidase
  • catalase activity This allows the first reagent composition to act stably on lipoproteins other than sdLDL and guide the cholesterol out of the reaction system.
  • the first reagent composition specifically contains an enzyme having cholesterol esterase activity and an enzyme having cholesterol oxidase activity, and is further selected from the group consisting of an enzyme having peroxidase activity and an enzyme having catalase activity.
  • the first reagent composition contains cholesterol esterase, cholesterol oxidase, and at least one of peroxidase and catalase, preferably cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase.
  • cholesterol esterase cholesterol oxidase, peroxidase, and catalase, for example, those derived from bacteria or fungi, or those derived from plants can be used.
  • the cholesterol esterase activity of the first reagent composition is preferably 50 U/L or more, more preferably 100 U/L or more, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. , Also preferably 400 U/L or less, more preferably 350 U/L or less, still more preferably 300 U/L or less, and even if it is, for example, 150 U/L or less, or, for example, 180 U/L or less good.
  • the cholesterol oxidase activity of the first reagent composition is preferably 100 U/L or more, more preferably 150 U/L or more, and preferably 800 U/L or less, more preferably 750 U. /L or less, more preferably 700 U/L or less, and may be, for example, 200 U/L or less, or, for example, 250 U/L or less.
  • the peroxidase activity of the first reagent composition is preferably 200 U/L or more, more preferably 300 U/L or more, from the viewpoint of more stably guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system, Further, it is preferably 3000 U/L or less, more preferably 2500 U/L or less, and also preferably 2000 U/L or less. Also, the peroxidase activity of the first reagent composition may be, for example, 5000 U/L or less, or, for example, 4000 U/L or less.
  • the catalase activity of the first reagent composition has the viewpoint of stably removing hydrogen peroxide generated when the first reagent composition is applied to the sample, and more stably removing cholesterol in lipoproteins other than sdLDL in the sample. It is preferably 100 U/mL or more, more preferably 200 U/mL or more, and preferably 1000 U/mL or less, more preferably 800 U/mL or less, from the viewpoint of effectively leading it out of the reaction system.
  • the cholesterol oxidase activity, cholesterol esterase activity, peroxidase activity and catalase activity of the first reagent composition can each be measured, for example, by the following methods.
  • a 6 mM cholesterol solution (dissolved in isopropanol) is used as the substrate solution.
  • Dilution solution 0.1M phosphate buffer, Triton X100, pH 7.0
  • the measurement target is 2 to 4 U/mL
  • 3 mL of the diluted solution is heated at 37°C for 5 minutes, and then added to 0.05 mL of the substrate solution.
  • the mixture is reacted at 37° C. and the amount of change in absorbance at a wavelength of 240 nm is measured. For example, after reacting at 37° C., the change in absorbance is measured from 2 minutes to 7 minutes to calculate the cholesterol oxidase activity.
  • the amount of change in absorbance is 3 U/L or more, it can be said that the object to be measured has cholesterol oxidase activity, and more specifically, contains cholesterol oxidase.
  • substrate 0.04% cholesterol linolenate, 1% Triton X100, 0.6% sodium cholate solution
  • enzyme diluent 20 mM phosphate buffer, 0.6% sodium cholate solution
  • reaction solution 0.06% 4-aminoantipyrine, 0.4% phenol, 7.5 KU/L peroxidase ( POD)
  • POD peroxidase
  • the object to be measured has cholesterol esterase activity, and more specifically, contains cholesterol esterase.
  • the peroxidase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, reaction solution 1 (1.5 mM HDAOS, 0.05% Triton X100, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) and reaction solution 2 (5 mM 4-aminoantipyrine, 0.05% Triton X100, 1% peroxide hydrogen, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0), diluent (50 mM phosphate buffer, pH 7.0). 0.3 mL of reaction liquid 1 and 0.08 mL of the measurement target diluted with a diluent are mixed and heated at 37° C. for 5 minutes.
  • reaction liquid 2 After that, 0.1 mL of reaction liquid 2 is added, reacted at 37° C., and the amount of change in absorbance at a dominant wavelength of 600 nm and a sub-wavelength of 700 nm is measured.
  • the peroxidase activity is calculated by measuring the amount of change in absorbance from 2 minutes to 5 minutes. For example, if the amount of change in absorbance is 10 U/L or more, it can be said that the object to be measured has peroxidase activity, and more specifically, it can be said that peroxidase is contained.
  • the catalase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, a substrate (0.06% hydrogen peroxide, 50 mM phosphate buffer, pH 7.0) is used in catalase activity measurement. After preheating 2.0 mL of the substrate solution at 25° C., it is mixed with 0.1 mL of the object to be measured, and the amount of change in absorbance at 240 nm is measured. For example, after the reaction at 25° C., the amount of change in absorbance from 0 to 3 minutes is measured to calculate the catalase activity. For example, if the amount of change in absorbance is 50 U/L or more, it can be said that the object to be measured has catalase activity, and more specifically, contains catalase.
  • the first reagent composition may further have other enzymatic activities, specifically one or more enzymatic activities selected from the group consisting of ascorbate oxidase activity and lipoprotein lipase (LPL) activity may further have
  • the first reagent composition may contain an enzyme having one or more enzymatic activities selected from the group consisting of an enzyme having ascorbic acid oxidase activity and an enzyme having lipoprotein lipase activity, for example. contains one or more enzymes selected from the group consisting of ascorbate oxidase and lipoprotein lipase.
  • the first reagent composition preferably further has ascorbate oxidase activity, more preferably ascorbate oxidase activity, from the viewpoint of avoiding the influence of ascorbic acid coexisting in the specimen on the accuracy of measurement. From a similar point of view, the first reagent composition preferably contains an enzyme having ascorbate oxidase activity, more preferably ascorbate oxidase.
  • the ascorbic acid oxidase activity of the first reagent composition is preferably 0.1 U/mL or more, more preferably 0.1 U/mL or more, from the viewpoint of avoiding the influence of ascorbic acid coexisting in the specimen on the measurement accuracy. It is 2 U/mL or more, preferably 15 U/mL or less, and more preferably 10 U/mL or less.
  • the ascorbate oxidase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, a substrate (10 mM ascorbic acid solution, 0.1% methacrylic acid) is used in ascorbate oxidase activity measurement.
  • the lipoprotein lipase activity of the first reagent composition is preferably 2 U/mL or more, more preferably 50 U/mL or more, and preferably 300 U/mL, from the viewpoint of preferably adjusting the action on various lipoproteins. or less, more preferably 200 U/mL or less.
  • the lipoprotein lipase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method.
  • an olive oil emulsion solution (5 g of olive oil, 2 mL of ethanol, 5 mL of 5.0% Triton X100 was added as a substrate solution and sonicated for 20 minutes, followed by 25 mL of 4% BSA and 0.1 M phosphate buffer. 15 mL of pH 7.0 solution was added and stirred at room temperature for 1 to 2 hours). Diluted solution (20 mM phosphate buffer, 2 mM MgCl 2 , 0.5 mM EDTA-2Na, pH 7.5) was added to the substrate solution preheated at 37° C. for 5 minutes to give a concentration of 0.9 to 1.6 U/mL.
  • a coloring reagent 200 mL of 50 mM MES-NaOH buffer, 4 mL of 5% Triton X100, 40 ⁇ L of N,N-dimethyl-m-toluidine, 4 mg of 4-aminoantipyrine, 24.2 mg of ATP.2Na.3H 2 O, MgCl 2 6H 2 O 40.7 mg, glycerol kinase 200 U, L ⁇ glycerophosphate oxidase 500 U, peroxidase 3.0 mL) was added, the mixture was reacted at 37° C.
  • lipoprotein lipase is not limited as long as it is an enzyme capable of degrading lipoproteins, and for example, lipoprotein lipase derived from animals or microorganisms can be used.
  • the first reagent composition does not excessively eliminate sdLDL-C, which is the object to be measured, during the step of liberating cholesterol in lipoproteins other than sdLDL and leading it out of the reaction system (the first step described later). From a viewpoint, it preferably does not have sphingomyelinase activity. From a similar point of view, the first reagent composition preferably does not substantially contain an enzyme having sphingomyelinase activity, more preferably substantially does not contain sphingomyelinase.
  • having no sphingomyelinase activity specifically means that the sphingomyelinase activity measured by the following method is less than 2 U/L, more preferably 1 U/L or less, further preferably is 0.1 U/L or less, even more preferably 0 U/L.
  • substantially free of an enzyme having sphingomyelinase activity and sphingomyelinase specifically means that these enzymes identified by the method described later in the first reagent composition are below the detection limit.
  • the sphingomyelinase activity of the first reagent composition is measured, for example, by the following method. That is, the reaction solution (0.008% sphingomyelin, 0.05% Triton X100 solution, 10 U/mL alkaline phosphatase, 10 U/mL cholesterol oxidase, 2 U/mL peroxidase, 0.02% 4-aminoantipyrine, 0.02% TODB mixed solution), reaction stop solution (1% sodium dodecyl sulfate solution), and dilution solution (10 mM Tris buffer, 0.1% Triton X100, pH 8.0).
  • the reaction solution 0.008% sphingomyelin, 0.05% Triton X100 solution, 10 U/mL alkaline phosphatase, 10 U/mL cholesterol oxidase, 2 U/mL peroxidase, 0.02% 4-aminoantipyrine, 0.02% TODB mixed solution
  • reaction stop solution 1% sodium dodecy
  • the amount of change in absorbance at a dominant wavelength of 546 nm and a minor wavelength of 700 nm is measured to calculate the sphingomyelinase activity. For example, if the amount of change in absorbance is 2 U/L or more, it can be said that the object to be measured has sphingomyelinase activity, and more specifically, contains sphingomyelinase.
  • the enzymes in the first reagent composition and the second reagent composition described below can also be identified by the following method. That is, first, fragment peptides obtained by digesting a sample containing the target enzyme with trypsin are detected with a hybrid mass spectrometer. Proteins were identified by database searching (e.g., Mascot search) of peptide masses obtained by a mass spectrometer and fragment ion spectra (MS/MS data) obtained by colliding with argon gas in the mass spectrometer. can be identified. If the sequence of the fragment peptide derived from the amino acid sequence in the reagent composition uniquely matches the amino acid sequence registered in the database, it can be considered to contain the target enzyme.
  • database searching e.g., Mascot search
  • MS/MS data fragment ion spectra
  • the enzymes in the first reagent composition and the second reagent composition to be described later can also be identified, for example, by the following quantification. That is, among the fragment peptides obtained by digesting the target enzyme with trypsin, a peptide that is specific to the target enzyme and gives a strong signal in mass spectrometry is selected as a peptide to be quantified. An unlabeled peptide and a peptide labeled with a stable isotope as an internal standard are chemically synthesized for the peptide to be quantified.
  • a sample containing the target enzyme was completely digested with trypsin, a known amount of stable isotope labeled peptide was added, and analyzed by a triple quadrupole mass spectrometer (LC-MS/MS) connected to HPLC in MRM mode (multiple reaction monitoring mode).
  • LC-MS/MS triple quadrupole mass spectrometer
  • MRM mode multiple reaction monitoring mode
  • a mixture of unlabeled peptide and a known amount of stable isotope-labeled peptide is measured in the same way to create a calibration curve for the concentration ratio and peak area ratio of the internal standard, and the absolute amount of the peptide to be quantified in the sample.
  • the target enzyme can be quantified by calculating
  • the first reagent composition may contain components other than those described above.
  • Other components include, for example, buffers, salts, proteins having no enzymatic activity, preservatives, hydrogen donors, and couplers.
  • the type of buffer solution can be selected as appropriate, for example.
  • Specific examples of buffers include MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid) buffer, phosphate buffer, Tris buffer, PIPES (piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)) buffer, HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffers.
  • the concentration of the buffer solution is preferably 1 mM or higher, more preferably 5 mM or higher, and still more preferably 10 mM or higher, from the viewpoint of retaining the enzyme activity in the composition and improving the storage stability of the reagent. Also, it is preferably 300 mM or less, preferably 200 mM or less, more preferably 150 mM or less, and even more preferably 100 mM or less.
  • Salts are specifically added as pH adjusters or ionic strength adjusters.
  • Specific examples of salts include sodium salts such as sodium hydroxide and sodium sulfate; potassium salts such as potassium hydroxide; and basic substances such as ammonium salts such as ammonium sulfate and ammonium chloride.
  • the salt concentration in the first reagent composition is preferably 0.2 g/L with respect to the entire composition of the first reagent composition from the viewpoint of acting more stably as a pH adjuster or an ionic strength adjuster. More preferably 0.5 g/L or more, preferably 5 g/L or less, and more preferably 3 g/L or less.
  • the pH of the first reagent composition is preferably 6 or higher, more preferably 6.5 or higher, from the viewpoint of maintaining the enzymatic activity in the composition and improving the storage stability of the reagent. is 8 or less, more preferably 7.5 or less.
  • a specific example of a protein having no enzymatic activity is albumin such as BSA.
  • the concentration of albumin such as BSA in the first reagent composition stabilizes the first step from the viewpoint of stabilizing the enzyme in the first reagent composition, and also leads cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. From the viewpoint of the total composition of the first reagent composition, it is preferably 1 g/L or more, more preferably 2 g/L or more, and preferably 20 g/L or less, more preferably 10 g/L. L or less.
  • the first reagent composition preferably contains either one of a hydrogen donor and a coupler.
  • either one of the hydrogen donor and the coupler is used in the first step to guide cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. More specifically, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is reacted with cholesterol esterase or cholesterol oxidase, and either a hydrogen donor or a coupler is used to convert the generated hydrogen peroxide into colorless quinone in the presence of peroxidase. is used.
  • hydrogen donors include N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOOS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)- 3,5-dimethylaniline (MAOS), N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOPS), N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-(3-sulfopropyl)aniline (HALPS), N-(3-sulfopropyl)-3-methoxy-5-aniline (HMMPS), N-ethyl-N-(2-hydroxy-3- Aniline derivatives such as sulfopropyl)-4-fluoro-3,5-dimethoxyaniline (FDAOS) and N-ethyl-N-(3-methylphenyl)-N'-succinylethylene
  • the concentration of the hydrogen donor in the reagent in the first reagent composition is preferably 1 mM or more, more preferably 1.5 mM or more, from the viewpoint of guiding cholesterol in lipoproteins other than sdLDL out of the reaction system. , preferably 5 mM or less, more preferably 3 mM or less.
  • the coupler used in the coupling reaction is used in the first reagent composition.
  • couplers include, but are not limited to, 4-aminoantipyrine, aminoantipyrine derivatives, vanillindiaminesulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone, and sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone.
  • the property of the first reagent composition is liquid.
  • the viscosity of the first reagent composition at 5° C. may be, for example, 3.0 mPa ⁇ s or less, preferably 2.0 mPa ⁇ s or less, and more preferably 1.9 mPa. ⁇ It is less than or equal to s. Also, the viscosity of the first reagent composition at 5° C. may be, for example, 1.4 mPa ⁇ s or more, or may be, for example, 1.5 mPa ⁇ s or more.
  • the viscosity of the first reagent composition at 37° C. is preferably 0.89 mPa ⁇ s or less, more preferably 0.87 mPa ⁇ s or less, and even more preferably 0.85 mPa ⁇ s or less, from the viewpoint of improving measurement accuracy. s or less, and preferably 0.80 mPa ⁇ s or less or 0.75 mPa ⁇ s or less. Also, the viscosity of the first reagent composition at 37° C. may be, for example, 0.5 mPa ⁇ s or more.
  • the viscosity of the first reagent composition at each temperature is measured by method 2 below.
  • the measurement temperature is set to 5°C in Method 2-1, and to 37°C in Method 2-2.
  • Method 2 (1) Apparatus: EMS viscometer (Electro Magnetically Spinning Viscometer) (2) Measurement method and conditions: measurement method: electromagnetic spinning method, motor rotation speed: 1000 rpm, holding time: 600 seconds, measurement temperature: 5 ° C. (method 2-1) and 37 ° C. (method 2-2), sequence loop : 1 time, sample: 500 ⁇ L (3) Calculation of viscosity: Measure five times and calculate the average value of the five times.
  • the viscosity is measured by EMS-1000 manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd., for example.
  • the present inventors have also found that, among the reagents for measuring sdLDL-C, setting the viscosity of the first reagent composition to a specific range makes it possible to quantify sdLDL-C with even greater accuracy. Found it. The reason for this is not necessarily clear, but is considered as follows.
  • the reagent probe draws a certain amount of the first reagent composition and discharges it into the reaction cell during measurement. If the viscosity of the first reagent composition used in the step of scavenging cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is too high, the ejection volume may change due to the viscosity, and the scavenging volume may fluctuate. However, the viscosity should be controlled accurately. Since the liquid separation of the reagent can be appropriately controlled by the method, it is thought that sdLDL-C can be measured more accurately as a result.
  • the first reagent composition contains a specific component and has a contact angle within a specific range, it can be suitably used for quantification of sdLDL-C, and the accuracy of sdLDL-C measurement can be improved. can be excellent.
  • the first reagent composition is used for sdLDL-C quantification in combination with the second reagent composition described below.
  • the kit is used for quantifying sdLDL-C in a sample, and includes the first reagent composition described above and the second reagent composition for quantifying sdLDL-C.
  • the kit is specifically used for a sdLDL-C quantification method comprising two or more steps.
  • the first and second reagent compositions are used in different steps, preferably in the order of the first and second reagent compositions.
  • the configuration of the second reagent composition will be described in more detail below.
  • the second reagent composition is specifically a reagent composition for quantifying sdLDL-C.
  • the components of the second reagent composition differ depending on the structure of the first reagent composition, but any composition that allows quantification of sdLDL-C may be used, and known substances can be used.
  • the second reagent composition includes enzymes, buffers, salts, surfactants, proteins having no enzymatic activity, preservatives, and hydrogen donors and couplers.
  • the first reagent composition contains either one of the hydrogen donor and the coupler but not the other, and the second reagent composition contains neither the hydrogen donor nor the coupler but the other. including.
  • Enzymes include, for example, peroxidase.
  • the second reagent composition has peroxidase activity, for example. From the viewpoint of accurately measuring sdLDL-C in the second step, the peroxidase activity of the second reagent composition is preferably 500 U/L or more, more preferably 1000 U/L or more, and preferably 10000 U/L. L or less. However, when peroxidase activity is contained in the composition of the first reagent, the peroxidase activity is carried over to the second step, so the concentration in the second reagent can be reduced or eliminated.
  • the type of buffer solution and salt can be appropriately selected, for example, depending on the type of enzyme contained in the second reagent composition.
  • Specific examples of buffers include those described above for the first reagent composition.
  • the pH of the second reagent composition is preferably 6 or higher, more preferably 6.5 or higher, from the viewpoint of maintaining the enzymatic activity in the composition and improving the storage stability of the reagent. is 8 or less, more preferably 7.5 or less.
  • surfactants examples include surfactants that act on sdLDL.
  • the second reagent composition preferably contains a surfactant that acts on sdLDL from the viewpoint of stably quantifying sdLDL-C.
  • the surfactant that acts on sdLDL may be a surfactant that selectively acts on sdLDL, such as a surfactant that acts only on sdLDL, or a surfactant that acts on lipoproteins other than sdLDL. It may be a surfactant that acts on lipoproteins.
  • surfactants in the second reagent composition include polyoxyethylene derivatives, and surfactants used in commercial reagents for measuring total cholesterol can be used.
  • surfactants include polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as polyoxyethylene octylphenyl ether (e.g., Emulgen 909 (manufactured by Kao Corporation), Triton X-100), polyoxyethylene alkyl ethers (e.g., Emulgen 707, Emulgen 709 (manufactured by Kao Corporation)).
  • the concentration of the surfactant in the second reagent composition is preferably 0.01% (w/v) or more from the viewpoint of stably acting on sdLDL in the mixed solution after addition of the second reagent composition. , more preferably 0.02% (w/v) or more, still more preferably 0.03% (w/v) or more. From the same point of view, the surfactant concentration in the second reagent composition is preferably 2.0% (w/v) or less, more preferably 1.0% (w/v) or less. be.
  • the coupler is preferably 4-aminoantipyrine (4-AA), aminoantipyrine derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone, sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone
  • concentration of the coupler in the second reagent composition is preferably 0.5 mM or more, more preferably 0.5 mM or more, from the viewpoint of stably acting on sdLDL with respect to the entire composition of the reaction solution after addition of the second reagent composition. It is 1.0 mM or more, preferably 15 mM or less, and more preferably 10 mM or less.
  • the hydrogen donor is preferably contained in the second reagent composition.
  • the concentration of the hydrogen donor in the reagent is preferably 3 mM or more, more preferably 4.0 mM or more, from the viewpoint of stably acting on sdLDL with respect to the total composition of the reaction solution after addition of the second reagent composition. It is 5 mM or more, preferably 15 mM or less, and more preferably 12 mM or less.
  • proteins that do not have enzymatic activity include those described above for the first reagent composition.
  • the method of this embodiment is a method of quantifying sdLDL-C in a sample using the first and second reagent compositions described above.
  • the quantification method in this embodiment includes the following first step and second step.
  • First step Step of allowing the above-described first reagent composition to act on the sample
  • second step After the first step, the above-described second reagent composition is allowed to act to remove cholesterol in the remaining lipoproteins.
  • Step of Quantifying The configurations of the first and second reagent compositions are as described above. In such a method, by using the first reagent composition of the present embodiment, highly accurate measurement can be performed. Therefore, for example, sdLDL-C can be stably quantified with high accuracy. Become.
  • the method for quantifying sdLDL-C may be carried out by, for example, adding the first reagent composition to a sample (test sample) to react, then adding the second reagent composition to react, and measuring the absorbance.
  • the subject sample is, for example, a blood-derived sample such as serum or plasma, preferably serum.
  • the first and second steps are usually performed in an automated analyzer.
  • the amount of the sample and the amount of each reagent composition can be appropriately determined in consideration of, for example, the concentration of the reagent in each reagent composition, but are determined within the range applicable to the automatic analyzer. For example, 1 to 10 ⁇ L of the sample to be tested, 50 to 300 ⁇ L of the first reagent composition, and 25 to 200 ⁇ L of the second reagent composition may be used. Each step will be described in more detail below.
  • First step In the first step, the sample is exposed to the first reagent composition. As a result, lipoproteins other than sdLDL are eliminated, and cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is liberated and led out of the reaction system. More specifically, in the first step, a surfactant that preferably acts on lipoproteins other than sdLDL is allowed to act on the sample in the presence of cholesterol esterase. Cholesterol produced by liberation from lipoproteins is reacted with an enzyme such as cholesterol oxidase that reacts with cholesterol and led out of the reaction system.
  • an enzyme such as cholesterol oxidase that reacts with cholesterol and led out of the reaction system.
  • the first step for example, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is eliminated and led out of the reaction system, cholesterol in lipoproteins other than sdLDL is aggregated, and it is inhibited so that it does not react in later steps.
  • a known technique can be used.
  • the step of eliminating cholesterol generated from lipoproteins other than sdLDL and leading it out of the reaction system includes, for example, cholesterol esterase activity in the first reagent composition and Hydrogen peroxide generated by cholesterol oxidase activity and forming a colorless quinone in the presence of an electron donor may also be included.
  • At least one of monovalent cations and divalent cations or a salt thereof can be added to the reaction solution as an ionic strength adjusting agent.
  • an ionic strength adjusting agent By adding an ionic strength adjusting agent, it becomes easier to differentiate sdLDL and LLDL.
  • sdLDL-C remaining after the first step is quantified.
  • a conventional LDL quantification method can be used. For example, a method of quantifying the content of LDL-specific aggregates formed by adding an LDL-aggregating agent by turbidimetry, a method of using an antigen-antibody reaction with an LDL-specific antibody, and a method of quantifying degradation products using an enzyme. There are methods to The quantification method is selected, for example, according to the components and composition contained in the second reagent composition.
  • the enzyme can be used to quantify the decomposition products.
  • a second reagent composition containing, for example, one or more cholesterol-measuring enzymes selected from the group consisting of cholesterol esterase, cholesterol oxidase, cholesterol dehydrogenase, and peroxidase is added to the reaction solution after the first step.
  • sdLDL-C is liberated and degraded, and the reaction products are quantified.
  • each step is preferably carried out at a reaction temperature of 2°C to 45°C, more preferably 25°C to 40°C.
  • the reaction time for each step is preferably 1 to 10 minutes, more preferably 3 to 7 minutes.
  • Examples of automatic analyzers used for quantification of sdLDL-C include TBA-120FR, TBA-200FR (manufactured by Toshiba Corporation), JCA-BM1250, JCA-BM1650, JCA-BM2250 (manufactured by JEOL Ltd.), and HITACHI7180. , HITACHI7170 (manufactured by Hitachi), AU2700, AU5800, AU680 (manufactured by OLYMPUS), cobas c501, cobas c701 (manufactured by Roche), and the like.
  • Quantitation of sdLDL-C is performed, for example, by absorbance measurement in a wavelength range of 580 to 720 nm, preferably 600 to 700 nm.
  • Examples 1 to 7, Comparative Examples 1 and 2 The first reagent composition of each example was prepared and combined with the second reagent composition to evaluate the accuracy of measurement when sdLDL-C was quantified.
  • a first reagent composition and a second reagent composition of each example were prepared by blending each component shown below at the following concentration.
  • concentrations of bovine serum albumin and anionic surfactant were used to prepare each example composition.
  • the formulations of the first reagent composition and the second reagent composition used for the measurement are shown below.
  • (First reagent composition) MOPS buffer, pH 7.0 50 mM Cholesterol esterase 300U/mL Cholesterol oxidase 600U/mL Peroxidase 2500U/L bovine serum albumin TOOS 2.0 mM Ascorbate oxidase 3.0 U/mL
  • Anionic surfactant polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate
  • a visually transparent PET (amorphous polyester) resin plate manufactured by Takiron C.I., PET plate (Petec) product number 6010, thickness 2 mm
  • the surface of the unused PET substrate was wiped with 70% ethanol aqueous solution, and the measurement was performed within 5 minutes thereafter.
  • a contact angle meter manufactured by Kyowa Interface Science Co., Ltd., DMo-501
  • the contact angle was measured 1 second after the dropping.
  • Each example was measured 5 times, and the average value of the 5 times was calculated.
  • the measurement results are shown in Table 1 or Table 3.
  • EMS viscometer (EMS-1000 manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.) was used by an electromagnetic spinning method, motor rotation speed: 1000 rpm, holding time: 600 seconds, measurement temperature: 5 ° C. and 37 ° C., The viscosity of the first reagent composition of each example was measured with sequence loop: 1 time and sample: 500 ⁇ L. Each example was measured five times at each temperature, and the average value of the five times was calculated. The measurement results are shown in Table 2 or Table 3.
  • the accuracy of measurement of sdLDL-C of known concentration using the first reagent composition of each example was evaluated by a comparative control method. Specifically, for each example, a first reagent composition and a second reagent composition with different contact angles were prepared. After 75 ⁇ L of the first reagent composition was added to 2 ⁇ L of the serum sample and allowed to react at 37° C. for 5 minutes, 75 ⁇ L of the second reagent composition was added and allowed to react for 5 minutes to measure the absorbance at a dominant wavelength of 600 nm and a minor wavelength of 700 nm. As a comparative control method, the sdLDL cholesterol concentration was compared using the sdLDL cholesterol measuring reagent sd LDL-C “SEIKEN” manufactured by Denka Seiken Co., Ltd.
  • the axis represents the measured value (concentration) of sdLDL-C by the comparative control method
  • the vertical axis represents the bias of the comparative examples and examples with respect to the comparative control method.
  • Tables 1 and 3 also show the average bias values. When the average value of the bias was within ⁇ 15%, it was judged as acceptable.

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Abstract

第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、上記工程の後、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、を含む、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、アニオン界面活性剤を含み、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である、試薬組成物。

Description

試薬組成物およびキット
　本発明は、試薬組成物およびキットに関する。
　ＬＤＬコレステロールの測定方法に関する技術として、特許文献１（特開２０００－３２５０９７号公報）に記載のものがある。同文献には、リポ蛋白質を含有する試料に、酵素と第１界面活性剤を加えることによりＨＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第１工程、次いで、第２界面活性剤を加えることにより、ＬＤＬコレステロールを選択的に酵素反応させる第２工程、及び第１または第２工程において、酵素との反応により消費される化合物または生成される化合物を測定することにより、ＨＤＬコレステロール及び／またはＬＤＬコレステロールを測定することを含むリポ蛋白質コレステロールの測定方法について記載されており、かかる方法では、反応液の濁度を上昇させるリポ蛋白質凝集剤を必要とせず、使用する酵素に制限がない上、ＬＤＬコレステロールを反応させる工程で新たに別の酵素を加える必要もなく、簡便でかつ安価にＬＤＬコレステロールを定量することができ、また必要に応じてＨＤＬコレステロールを光学的な測定を妨害するリポ蛋白質の凝集を形成することなく正確かつ安価に測定することができる測定方法及び測定試薬を提供することができるため、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野に有用であるとされている。
特開２０００－３２５０９７号公報
　本発明者らは、ＬＤＬコレステロールの中でも、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を測定することを検討した。すると、特許文献１に記載の技術においては、測定の正確性の点で改善の余地があることが見出された。
　本発明は、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供するものである。
　本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量の正確性を向上すべく検討した。その結果、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる試薬組成物の接触角を特定の範囲とすることにより、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明によれば、以下の試薬組成物およびキットが提供される。
［１］　第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
　第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
　アニオン界面活性剤を含み、
　コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、
　以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である、試薬組成物。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロン（登録商標、以下同じ。）コート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
［２］　当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、［１］に記載の試薬組成物。
［３］　当該試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない、［１］または［２］に記載の試薬組成物。
［４］　前記アニオン界面活性剤が硫酸エステル塩を含む、［１］乃至［３］いずれか１つに記載の試薬組成物。
［５］　当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、［１］乃至［４］いずれか１つに記載の試薬組成物。
［６］　以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、［１］乃至［５］いずれか１つに記載の試薬組成物。
（方法２－１）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［７］　以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が０．８９ｍＰａ・ｓ以下である、［１］乃至［６］いずれか１つに記載の試薬組成物。
（方法２－２）
（１）装置：ＥＭＳ（Electro Magnetically Spinning Viscometer）粘度計
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
［８］　［１］乃至［７］いずれか１つに記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
　前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
［９］　前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、［８］に記載のキット。
［１０］　前記第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、
　前記第２試薬組成物が、前記水素供与体および前記カップラーの前記一方を含まず前記他方を含む、請求項［８］または［９］に記載のキット。
　本発明によれば、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定技術を提供することができる。
ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。 ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値の正確性の評価結果を示す図である。
　以下、実施の形態について説明する。本実施形態において、測定試薬等の組成物は、各成分を単独でまたは２種以上を組み合わせて含むことができる。また、本明細書において、数値範囲の「ｘ～ｙ」は「ｘ以上ｙ以下」を表し、下限値ｘおよび上限値ｙをいずれも含む。
　はじめに、リポタンパク質について説明する。
　リポタンパク質は、大きくVery Low Density Lipoprotein（ＶＬＤＬ）、Low Density Lipoprotein（ＬＤＬ）およびHigh Density Lipoprotein（ＨＤＬ）の分画に分けられ、ＬＤＬはさらにsmall dense ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ）とそれ以外の亜分画に分けられる。ｓｄＬＤＬを小粒子ＬＤＬ、small ＬＤＬ（ＳＬＤＬ）、dense ＬＤＬ、small, dense ＬＤＬと呼ぶこともあり、またそれ以外のＬＤＬをlarge ＬＤＬ（Ｌ　ＬＤＬ）、Light ＬＤＬと呼ぶこともある。
　これらのリポタンパク質の分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。
　リポタンパク質の粒子サイズの直径については、報告者により異なるが、たとえば、ＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（または３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（または１９ｎｍ～３０ｎｍ）であり、ＨＤＬが７ｎｍ～１０ｎｍである。
　リポタンパク質の比重については、たとえば、ＶＬＤＬが１．００６以下、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１である。
　リポタンパク質のうち、ＬＤＬ粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS: The Fats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定できる。また、比重は、たとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。
　本実施形態において、測定しようとするｓｄＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０～約２５．５ｎｍの亜分画、または、比重１．０４０～１．０６３の亜分画を指す。
　ＬＤＬを大きさにより亜分画に分けているのは、ＬＤＬのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、ＬＤＬの中でもより悪性度が高いので、ＬＤＬの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。ＬＤＬ内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものがとりわけ悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重１．０４０～１．０６３という値もｓｄＬＤＬの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるＬＤＬの比重範囲１．０１９～１．０６３を中央点で分けた高比重側の値である。たとえば、ｓｄＬＤＬの比重について、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のｓｄＬＤＬの存在が臨床的な悪性度と関連している。
　本明細書において、ｓｄＬＤＬという場合、具体的には、ＬＤＬのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいものをいう。また、ｓｄＬＤＬは、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より高い比重範囲に属するもの、より好ましくは比重１．０４４～１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。また、ＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、ＶＬＤＬまたはＨＤＬを指し、さらにカイロミクロン、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）またはＶＨＤＬ（very high density lipoprotein）を含めることもある。
　（試薬組成物（第１試薬組成物））
　本実施形態において、試薬組成物は、第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、第１試薬組成物を試料に作用させる工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、を含む、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の第１試薬組成物として用いられる試薬組成物である。
　以下、第１試薬組成物として用いられる試薬組成物を、単に「第１試薬組成物」とも呼ぶ。
　第１試薬組成物は、アニオン界面活性剤を含み、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。そして、以下の方法１により測定される、第１試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である。
（方法１）
（１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
（２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
（３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
（４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
　上記（２）では、ＰＥＴ基材の塵などを測定前に拭き取る。静電気は接触角に影響するため、極力摩擦などが発生しないよう拭き取り、その後５分以内に測定を実施する。
　本実施形態において、接触角は、具体的にはたとえば協和界面化学社製ＤＭｏ－９０１、７０１、６０１、５０１、ＤＭＣ－ＭＣ３等により測定される静的接触角である。
　本発明者らは、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物とＰＥＴ基材との屈折率を特定の範囲とすることにより、正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、たとえば、第１試薬組成物は試薬ボトル（ＰＥＴなど）に入った状態で生化学自動分析装置にセットされ、測定される。測定の際には試薬プローブが一定量の第１試薬組成物を吸い込み反応セル内に吐出する。ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する工程に用いる第１試薬組成物の接触角（ぬれ性）を制御することにより試薬の液離れを適切に制御できるため、試薬ボトルへの試薬成分の吸着、プローブからの吐出、反応セル内での吸着などを制御することができ、その結果、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを測定できると考えられる。
　試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、６５°以上であり、好ましくは６６°以上、より好ましくは６７°以上である。
　また、ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、試薬組成物とＰＥＴ基材との接触角は、７７°以下であり、好ましくは７６°以下、より好ましくは７５°以下である。
　本実施形態では、たとえば第１試薬組成物に含まれる各成分の種類、組み合わせ、配合量等を適切に選択することにより、ＰＥＴ基材との接触角を制御することが可能である。これらの中でも、たとえば界面活性剤の種類や配合量、タンパク質の種類や配合量を調整すること等が、ＰＥＴ基材との接触角を所望の数値範囲とするための要素として挙げられる。
　第１試薬組成物は、アニオン界面活性剤を含むとともに、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用して消去することができる。また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。
　ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポタンパク質を分解し、リポタンパク質中のコレステロールが遊離することをいう。たとえば、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤がｓｄＬＤＬに全く作用しないことは要求されず、主にｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を分解し、その分解産物であるこれらリポタンパク質中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。
　「反応系外に導く」とは、具体的には、ＨＤＬやＶＬＤＬ、Ｌ　ＬＤＬなどに含まれるコレステロールがｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に影響を及ぼさないように、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、Ｌ　ＬＤＬなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりすることをいう。
　また、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、具体的には、コレステロールエステラーゼが存在し、コレステロールエステラーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性等の他の酵素活性についても同様である。
　以下、第１試薬組成物に含まれる成分をさらに具体的に説明する。
（アニオン界面活性剤）
　第１試薬組成物は、少なくともアニオン界面活性剤を含む。アニオン界面活性剤は、具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤であり、より好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用するとともにｓｄＬＤＬに作用しない界面活性剤である。
　アニオン界面活性剤として、具体的には、硫酸塩型アニオン界面活性剤、スルホン酸塩型アニオン界面活性剤、リン酸塩型アニオン界面活性剤、カルボン酸型アニオン界面活性剤、アミノ酸系界面活性剤が挙げられる。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、アニオン界面活性剤は、好ましくは硫酸塩型アニオン界面活性剤を含み、より好ましくは硫酸エステル塩を含む。硫酸エステル塩は、具体的には、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、アミドエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩およびポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩からなる群から選択される１種または２種以上であり、より好ましくはポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩およびポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩からなる群から選択される１種または２種以上であり、さらに好ましくはポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩から選択される１種または２種以上である。
　他のアニオン界面活性剤については、スルホン酸塩型アニオン界面活性剤は、具体的には、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩からなる群から選択される１種または２種以上である。
　また、アミノ酸系界面活性剤は、具体的には、アルキルタウリン酸塩等のＮ－アシルアミノ酸塩型アニオン界面活性剤である。
　また、アニオン界面活性剤において、塩を構成するカチオンの具体例として、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン；
マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；
アンモニウムが挙げられる。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃ測定の正確性をより高める観点から、塩を構成するカチオンは、好ましくはアルカリ金属イオンおよびアンモニウムからなる群から選択される少なくとも１つであり、より好ましくはアルカリ金属イオンであり、さらに好ましくはナトリウムイオンである。
　第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の濃度は、アニオン界面活性剤をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．００７％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．００９％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．０１０％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは０．０４５％（ｗ／ｖ）以下であり、さらに好ましくは０．０４％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは０．０３５％（ｗ／ｖ）以下、よりいっそう好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以下、さらにまた好ましくは０．０２８％（ｗ／ｖ）以下である。
　なお、第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤は、たとえば、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。第１試薬組成物中のアニオン界面活性剤の構造を決定する方法としてはＬＣ－ＭＳＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。
（酵素）
　第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ）活性、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ）活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。これにより、第１試薬組成物をｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質により安定的に作用させそのコレステロールを反応系外に導くことができる。
　また、第１試薬組成物は、具体的には、コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素とコレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素とを含み、さらに、ペルオキシダーゼ活性を有する酵素およびカタラーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。第１試薬組成物は、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼと、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼの少なくとも１つと、を含み、好ましくはコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼおよびペルオキシダーゼを含む。
　コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよびカタラーゼとして、それぞれ、たとえば細菌や菌類由来のものや、植物由来のものを用いることができる。
　第１試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは５０Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは４００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは３５０Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは３００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば１５０Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば１８０Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
　同様の観点から、第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性は、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１５０Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは８００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは７５０Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは７００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば２００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば２５０Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
　第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは３００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２５００Ｕ／Ｌ以下であり、また、たとえば２０００Ｕ／Ｌ以下であることも好ましい。また、第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば５０００Ｕ／Ｌ以下、または、たとえば４０００Ｕ／Ｌ以下であってもよい。
　第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、試料に第１試薬組成物を適用した際に生じる過酸化水素を安定的に除去する観点、および、試料中のｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１００Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１０００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは８００Ｕ／ｍＬ以下である。
　第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性、コレステロールエステラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性およびカラターゼ活性は、それぞれ、たとえば、以下の方法にて測定できる。
　コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として６ｍＭコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を２～４Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（０．１Ｍ　リン酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．０）を加え、希釈後の溶液３ｍＬを３７℃５分加温後に基質液０．０５ｍＬを加える。その後、混合液を３７℃で反応させ波長２４０ｎｍ吸光度変化量を測定する。たとえば３７℃にて反応後、２分から７分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールオキシダーゼが含まれているといえる。
　コレステロールエステラーゼ活性の測定では、基質（０．０４％リノレン酸コレステロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．６％コール酸ナトリウム溶液）、３００Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、０．２％　牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）、反応液（０．０６％　４－アミノアンチピリン、０．４％　フェノール、７．５ＫＵ／Ｌ　ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））を用いる。反応液１．７５ｍＬと基質液１．０ｍＬを混合後、３７℃で５分加温し、０．１ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。３７℃、２分加温後に希釈液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加え、混合液を３７℃で反応させ、波長５００ｎｍの吸光度変化量を測定する。たとえば３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が８Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液１（１．５ｍＭ　ＨＤＡＯＳ、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、および、反応液２（５ｍＭ　４－アミノアンチピリン、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％　過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、希釈液（５０ｍＭ　リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。０．３ｍＬの反応液１と希釈液で希釈した測定対象０．０８ｍＬを混合し、３７℃で５分加温する。その後０．１ｍＬの反応液２を加え、３７℃で反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定する。たとえば３７℃反応後、２分から５分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、ペルオキシダーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、カタラーゼ活性測定では基質（０．０６％過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。基質溶液２．０ｍＬを２５℃で予備加温後、測定対象０．１ｍＬと混合し、２４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。たとえば２５℃反応後、０分から３分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が５０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、カタラーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物は、他の酵素活性をさらに有してもよく、具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼ活性およびリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）活性からなる群から選択される１または２以上の酵素活性をさらに有してもよい。
　また、第１試薬組成物は、たとえばアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素およびリポプロテインリパーゼ活性を有する酵素からなる群から選択される１または２以上の酵素活性を有する酵素を含んでもよく、さらに具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼおよびリポプロテインリパーゼからなる群から選択される１または２以上の酵素を含む。
　第１試薬組成物は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有し、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する。
　同様の観点から、第１試薬組成物は、好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼ活性を有する酵素を含み、より好ましくはアスコルビン酸オキシダーゼを含む。
　第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、検体中に共存するアスコルビン酸が測定の正確性に与える影響を回避するという観点から、好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．２Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは１５Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは１０Ｕ／ｍＬ以下である。
　第１試薬組成物のアスコルビン酸オキシダーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、アスコルビン酸オキシダーゼ活性測定では基質（１０ｍＭアスコルビン酸溶液、０．１％メタクリン酸）を用いる。緩衝液（１００ｍＭジメチルグリチル酸　ｐＨ６．５を３．０ｍＬと１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０）で希釈した測定対象０．２５ｍＬを混合し３７℃で２分間予備加温後、基質液０．０７５ｍＬを加え、３７℃で反応させ２４５ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。たとえば３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定しアスコルビン酸オキシダーゼ活性を算出する。たとえば吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はアスコルビン酸オキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、アスコルビン酸オキシダーゼが含まれているといえる。
　第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくは２Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは５０Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは３００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬ以下である。
　第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、リポプロテインリパーゼ活性の測定では、基質液としてオリーブ油エマルジョン溶液（オリーブ油５ｇ、エタノール２ｍＬに５．０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００　５ｍＬを加え２０分間超音波処理し、その後４％ＢＳＡ　２５ｍＬ、０．１Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ７．０　１５ｍＬを加え室温で１～２時間攪拌したもの）を用いる。３７℃、５分間予備加温した基質液に、０．９～１．６Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２ｍＭ　ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ７．５）を加え、希釈した検体０．２ｍＬを加え、３７℃１５分加温後に反応停止液（０．２Ｍトリクロル酢酸）２．０ｍＬを加える。その後、濾過（東洋濾紙No. 131またはWhatman No. 42）を行い、濾液を回収する。濾液０．０５ｍＬに発色試薬（５０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液２００ｍＬ、５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００　４ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｍ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　４０μＬ、４アミノアンチピリン４ｍｇ、ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ　２４．２ｍｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ　４０．７ｍｇ、グリセロールキナーゼ　２００Ｕ、Ｌαグリセロリン酸オキシダーゼ　５００Ｕ、ペルオキシダーゼ　３００Ｕ）３．０ｍＬを加え、混合液を３７℃で１５分間反応させ、反応前後の波長５４５ｎｍ吸光度を測定し、リポプロテインリパーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はリポプロテインリパーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、リポプロテインリパーゼが含まれているといえる。
　リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
　また、第１試薬組成物は、測定対象物であるｓｄＬＤＬ－Ｃを、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く工程（後述の第１工程）中で過剰に消去しない観点から、好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない。同様の観点から、第１試薬組成物は、好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素を実質的に含まず、より好ましくはスフィンゴミエリナーゼを実質的に含まない。
　ここで、スフィンゴミエリナーゼ活性を有しないとは、具体的には、以下の方法で測定されるスフィンゴミエリナーゼ活性が２Ｕ／Ｌ未満であることをいい、より好ましくは１Ｕ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１Ｕ／Ｌ以下、さらにより好ましくは０Ｕ／Ｌである。
　また、スフィンゴミエリナーゼ活性を有する酵素およびスフィンゴミエリナーゼを実質的に含まないとは、具体的には、第１試薬組成物において後述の方法で同定されるこれらの酵素が検出限界以下であることをいう。
　第１試薬組成物のスフィンゴミエリナーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、反応液（０．００８％　スフィンゴミエリン、０．０５％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液、１０Ｕ／ｍＬ　アルカリ性フォスファターゼ、１０Ｕ／ｍＬ　コレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、０．０２％　４－アミノアンチピリン、０．０２％　ＴＯＤＢ混合液）、反応停止液（１％　ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（１０ｍＭ　トリス緩衝液、０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いる。反応液０．０８ｍＬと希釈液で希釈した測定対象０．００３ｍＬを混合し３７℃で５分加温後に反応停止液０．１６ｍＬを加える。反応停止後に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が２Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、スフィンゴミエリナーゼが含まれているといえる。
　また、本実施形態において、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、まず、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳデータ）をデータベース検索（たとえば、Ｍａｓｃｏｔサーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試薬組成物中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいるとみなせる。
　また、第１試薬組成物および後述する第２試薬組成物中の酵素はたとえば以下の定量でも同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、ＨＰＬＣに接続した三連四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＭＲＭモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。
（その他の成分）
　第１試薬組成物は、上述の成分以外の成分を含んでもよい。他の成分として、たとえば、緩衝液、塩、酵素作用を有しないタンパク質、防腐剤、水素供与体、カップラーが挙げられる。
　緩衝液の種類は、たとえば適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下であり、好ましくは２００ｍＭ以下、さらに好ましくは１５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００ｍＭ以下である。
　塩は、具体的には、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤として配合される。塩の具体例として、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム等のナトリウム塩；水酸化カリウム等のカリウム塩；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩等の塩基性物質が挙げられる。また、第１試薬組成物が１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩を含むことにより、ｓｄＬＤＬとＬ　ＬＤＬの分別がさらに容易となる。
　第１試薬組成物中の塩濃度は、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤としてより安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８以下であり、より好ましくは７．５以下である。
　酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、ＢＳＡ等のアルブミンが挙げられる。
　第１試薬組成物中のＢＳＡ等のアルブミン濃度は、第１試薬組成物中の酵素を安定化させる観点から、またｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く第１工程を安定化させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
　第１試薬組成物は、好ましくは水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む。このとき、水素供与体およびカップラーのいずれか一方は、第１工程でｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導くために使用される。さらに具体的には、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼを作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で無色キノンに転化させるために水素供与体およびカップラーのいずれか一方が用いられる。
　水素供与体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ'－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等のアニリン誘導体が挙げられる。
　第１試薬組成物中の水素供与体の試薬中濃度は、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは１．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは５ｍＭ以下であり、より好ましくは３ｍＭ以下である。
　また、水素供与体が後述の第２試薬組成物で用いられる場合、カップリング反応に用いるカップラーが第１試薬組成物中に用いられる。カップラーとしては、たとえば、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン等を用いることができるが、これらに限定されない。
　次に、第１試薬組成物の物性を説明する。
　第１試薬組成物の性状は、具体的には液体である。
　第１試薬組成物の５℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、たとえば３．０ｍＰａ・ｓ以下であってよく、好ましくは２．０ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは１．９ｍＰａ・ｓ以下である。
　また、第１試薬組成物の５℃における粘度は、たとえば１．４ｍＰａ・ｓ以上であってよく、また、たとえば１．５ｍＰａ・ｓ以上であってもよい。
　第１試薬組成物の３７℃における粘度は、測定の正確性向上の観点から、好ましくは０．８９ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは０．８７ｍＰａ・ｓ以下、さらにより好ましくは０．８５ｍＰａ・ｓ以下であり、また、０．８０ｍＰａ・ｓ以下または０．７５ｍＰａ以下であることも好ましい。
　また、第１試薬組成物の３７℃における粘度は、たとえば０．５ｍＰａ・ｓ以上であってよい。
　ここで、各温度における第１試薬組成物の粘度は、以下の方法２により測定される。方法２において、測定温度を５℃とするのが方法２－１であり、３７℃とするのが方法２－２である。
（方法２）
（１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
（２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃（方法２－１）および３７℃（方法２－２）、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
（３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
　本実施形態において、粘度は、たとえば京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００等により測定される。
　本発明者らは、またｓｄＬＤＬ－Ｃの測定試薬のうち、第１試薬組成物の粘度を特定の範囲とすることにより、さらに正確性に優れるｓｄＬＤＬ－Ｃの定量が可能となることを新たに見出した。この理由は必ずしも明らかでないが、次のように考えられる。ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量においては、測定の際には試薬プローブが一定量の第１試薬組成物を吸い込み反応セル内に吐出する。ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する工程に用いる第１試薬組成物の粘度が高すぎる場合、粘性により吐出量が変わり消去量が変動する可能性があるが、粘度を的確に制御することにより試薬の液離れを適切に制御できるため、その結果、より正確にｓｄＬＤＬ－Ｃを測定できると考えられる。
　本実施形態において、第１試薬組成物は、特定の成分を含むとともに接触角が特定の範囲にあるため、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に好適に用いることができ、ｓｄＬＤＬ－Ｃの測定の正確性を優れたものとすることができる。
　たとえば、第１試薬組成物は、後述する第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられる。
　（キット）
　本実施形態において、キットは、試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるものであり、上述の第１試薬組成物と、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物を含む。
　また、キットは、具体的には２以上の工程を含むｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
　以下、第２試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
（第２試薬組成物）
　第２試薬組成物は、具体的には、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
　第２試薬組成物に含まれる成分の具体例として、酵素、緩衝液、塩、界面活性剤、酵素作用を有しないタンパク質、防腐剤、ならびに、水素供与体およびカップラーのいずれか一方が挙げられる。
　また、キットの好ましい構成においては、第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、第２試薬組成物が、水素供与体およびカップラーの一方を含まず他方を含む。
　酵素として、たとえば、ペルオキシダーゼが挙げられる。また、第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する。第２試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、第２工程でｓｄＬＤＬ－Ｃを正確に測定する観点から、好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下である。ただし、第１試薬組成中にペルオキシダーゼ活性が含まれる場合は、第２工程にもペルオキシダーゼ活性が持ち越されるため、第２試薬中の濃度を減量する、あるいは含まなくすることもできる。
　緩衝液および塩の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
　第２試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８以下であり、より好ましくは７．５以下である。
　界面活性剤として、たとえばｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、ｓｄＬＤＬ－Ｃを安定的に定量する観点から、好ましくはｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤を含む。
　ｓｄＬＤＬに作用する界面活性剤は、ｓｄＬＤＬのみに作用する界面活性剤等のｓｄＬＤＬに選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
　第２試薬組成物中の界面活性剤としては、たとえば、ポリオキシエチレン誘導体をあげることができ、また、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤を使用することができる。かかる界面活性剤として、たとえば、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（たとえば、エマルゲン９０９（花王社製）、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（たとえばエマルゲン７０７、エマルゲン７０９（以上、花王社製））が挙げられる。
　第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第２試薬組成物添加後の混合溶液に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以上である。
　また、同様の観点から、第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、好ましくは２．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以下である。
　第２試薬組成物がカップラーを含むとき、カップラーは、好ましくは４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンからなる群から選択される１または２以上の化合物である。
　第２試薬組成物中のカップラーの濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１．０ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
　一方、カップラーが第１試薬組成物中に含まれる場合、水素供与体は好ましくは第２試薬組成物中に含まれる。この場合の水素供与体の試薬中濃度は、第２試薬組成物添加後の反応液全組成に対して、ｓｄＬＤＬに安定的に作用させる観点から、好ましくは３ｍＭ以上であり、より好ましくは４．５ｍＭ以上であり、また、好ましくは１５ｍＭ以下であり、より好ましくは１２ｍＭ以下である。
　酵素作用を有しないタンパク質の具体例としては、それぞれ、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
　（方法）
　本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
　第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。かかる方法において、本実施形態における第１試薬組成物を用いることにより、正確性に優れた測定をおこなうことができるため、たとえば、ｓｄＬＤＬ－Ｃを高い正確性で安定的に定量することも可能となる。
　また、ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量方法は、たとえば試料（被検体試料）に第１試薬組成物を添加し反応させ、次いで第２試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することによりおこなえばよい。
　被検体試料は、たとえば血清、血漿等の血液由来試料であり、好ましくは血清である。
　第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
　試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬組成物５０～３００μＬ、第２試薬組成物２５～２００μＬを用いればよい。
　以下、各工程をさらに具体的に説明する。
（第１工程）
　第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質を消去し、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
　さらに具体的には、第１工程では、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、コレステロールエステラーゼの存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
　第１試薬組成物が電子供与体を有するとき、第１工程において、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質から生じたコレステロールを消去し反応系外に導く工程は、たとえば、第１試薬組成物におけるコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびに、電子供与体の存在下で無色キノンを形成させることを含んでもよい。
　また、第１工程においては、イオン強度調整剤として１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩をさらに反応液に添加して用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、ｓｄＬＤＬとＬ　ＬＤＬを差別化しやすくなる。
（第２工程）
　第２工程では、第１工程を経て残存したｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する。第２工程には、従来から用いられているＬＤＬの定量方法を用いることができる。たとえば、ＬＤＬ凝集剤を添加して形成されたＬＤＬ特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、ＬＤＬ特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。定量方法は、たとえば第２試薬組成物に含まれる成分や組成に応じて選択される。
　第２試薬組成物が酵素を含むとき、酵素を用い分解生成物を定量する方法とすることができる。具体的には、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてｓｄＬＤＬ－Ｃを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
　本実施形態において、各工程における、反応温度は２℃～４５℃でおこなうことが好ましく、２５℃～４０℃でおこなうことがより好ましい。
　反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いる自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓ　ｃ５０１、ｃｏｂａｓ　ｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられる。
　ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量は、たとえば５８０～７２０ｎｍの波長域、好ましくは６００～７００ｎｍの波長域の吸光度測定によりおこなう。
　以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
　（実施例１～７、比較例１、２）
　各例の第１試薬組成物を調製し、第２試薬組成物と組み合わせてｓｄＬＤＬ－Ｃの定量をおこなった際の測定の正確性を評価した。
（試薬組成物の調製）
　以下に示す各成分を以下の濃度で配合することにより、各例の第１試薬組成物および第２試薬組成物を調製した。
　第１試薬組成物については、牛血清アルブミンおよびアニオン界面活性剤の濃度を変えて、各例の組成物を調製した。
　測定に用いた第１試薬組成物、第２試薬組成物の配合組成を以下に示す。
（第１試薬組成物）
ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０　　　　　　　　　　　　　　５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ　　　　　　　　　　　　　　３００Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　６００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５００Ｕ／Ｌ
牛血清アルブミン
ＴＯＯＳ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍＭ
アスコルビン酸オキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　３．０Ｕ／ｍＬ
アニオン界面活性剤（ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩）
（第２試薬組成物）
ＭＯＰＳ緩衝液、ｐＨ７．０　　　　　　　　　　　　　　５０ｍＭ
４－アミノアンチピリン　　　　　　　　　　　　　　　　４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０００Ｕ／Ｌ
アジ化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０５％（ｗ／ｖ）
ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル　　　　　　１％（ｗ／ｖ）
（接触角の測定方法）
　ＰＥＴ基材として、目視にて透明なＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板（タキロンシーアイ社製、ＰＥＴ板（ペテック）品番６０１０、厚さ２ｍｍ）を用いた。未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取り、その後５分以内に測定を実施した。
　接触角計（協和界面科学社製、ＤＭｏ－５０１）を用い、液滴法、θ／２法により、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬの条件で、滴下後１秒後に接触角の測定をおこなった。
　各例について５回測定し、５回の平均値を算出した。測定結果を表１または表３に示す。
（粘度の測定方法）
　実施例１～７について、ＥＭＳ粘度計（京都電子工業社製ＥＭＳ－１０００）を用いて、電磁スピニング法により、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃および３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬとして各例の第１試薬組成物の粘度を測定した。各例について各温度で５回ずつ測定を実施し、５回の平均値を算出した。測定結果を表２または表３に示す。
（正確性試験）
　各例の第１試薬組成物を用いて濃度既知のｓｄＬＤＬ－Ｃの測定をおこなった際の正確性を、比較対照法により評価した。具体的には、各例の、すなわち接触角の異なる第１試薬組成物、および、第２試薬組成物を調製した。血清試料２μＬに第１試薬組成物７５μＬを加え、３７℃で５分間反応させた後に、第２試薬組成物７５μＬを加え５分間反応させ主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍでの吸光度を測定した。
　比較対照法として、デンカ生研社製のｓｄＬＤＬコレステロール測定用試薬ｓｄ　ＬＤＬ－Ｃ「生研」を用いてｓｄＬＤＬコレステロール濃度を比較した。
　評価結果を図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）に示す。図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）において、横軸は比較対照法によるｓｄＬＤＬ－Ｃの測定値（濃度）を表し、縦軸は比較対照法に対する比較例、実施例のバイアスを表す。あわせて、バイアスの平均値を表１および表３に示す。バイアスの平均値が±１５％以内であるものを合格とした。
　図１（ａ）～図１（ｃ）、図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）、図３（ｂ）、図４（ａ）および図４（ｂ）ならびに表１および表３より、各実施例では、正確性の高いｓｄＬＤＬ－Ｃが可能であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003

Claims (10)

  1. 　第１試薬組成物を試料に作用させる工程と、
    　第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、ｓｍａｌｌ　ｄｅｎｓｅ　ＬＤＬコレステロール（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）を定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
    　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量する方法の前記第１試薬組成物として用いられる試薬組成物であって、
    　アニオン界面活性剤を含み、
    　コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有するとともに、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、
    　以下の方法１により測定される、当該試薬組成物とポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）基材との接触角が、６５°以上７７°以下である、試薬組成物。
    （方法１）
    （１）ＰＥＴ基材：ＰＥＴ（非晶性ポリエステル）樹脂板、透明、厚さ２ｍｍ
    （２）前処理：未使用のＰＥＴ基材の表面を７０％エタノール水溶液で拭き取る。拭き取り後、５分以内に測定を実施する。
    （３）測定方法および条件：液滴法、θ／２法、温度：１５～２５℃、シリンジ：テフロンコート１８Ｇ、滴下方法、滴下量：２μＬ、滴下後１秒後に測定する。
    （４）接触角の算出：５回測定し、５回の平均値を求める。
  2. 　当該試薬組成物が、アスコルビン酸オキシダーゼ活性をさらに有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  3. 　当該試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有しない、請求項１または２に記載の試薬組成物。
  4. 　前記アニオン界面活性剤が硫酸エステル塩を含む、請求項１乃至３いずれか１項に記載の試薬組成物。
  5. 　当該試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む、請求項１乃至４いずれか１項に記載の試薬組成物。
  6. 　以下の方法２－１により測定される、当該試薬組成物の５℃における粘度が２．０ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１乃至５いずれか１項に記載の試薬組成物。
    （方法２－１）
    （１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
    （２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：５℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
    （３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
  7. 　以下の方法２－２により測定される、当該試薬組成物の３７℃における粘度が０．８９ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１乃至６いずれか１項に記載の試薬組成物。
    （方法２－２）
    （１）装置：ＥＭＳ粘度計（Electro Magnetically Spinning Viscometer）
    （２）測定方法および条件：測定方式：電磁スピニング法、モーター回転数：１０００ｒｐｍ、保持時間：６００秒、測定温度：３７℃、シーケンスループ：１回、試料：５００μＬ
    （３）粘度の算出：５回測定を実施し、５回の平均値を算出する。
  8. 　請求項１乃至７いずれか１項に記載の試薬組成物からなる第１試薬組成物と、
    　前記ｓｄＬＤＬ－Ｃを定量するための第２試薬組成物と、
    　を含む、前記試料中の前記ｓｄＬＤＬ－Ｃの定量に用いられるキット。
  9. 　前記第２試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性を有する、請求項８に記載のキット。
  10. 　前記第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、
    　前記第２試薬組成物が、前記水素供与体および前記カップラーの前記一方を含まず前記他方を含む、請求項８または９に記載のキット。
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