JP2012165761A - 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット - Google Patents

小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット Download PDF

Info

Publication number
JP2012165761A
JP2012165761A JP2012131602A JP2012131602A JP2012165761A JP 2012165761 A JP2012165761 A JP 2012165761A JP 2012131602 A JP2012131602 A JP 2012131602A JP 2012131602 A JP2012131602 A JP 2012131602A JP 2012165761 A JP2012165761 A JP 2012165761A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cholesterol
small
dense ldl
ldl
polyoxyethylene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2012131602A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5548733B2 (ja
Inventor
Yasuki Ito
康樹 伊藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Denka Seiken Co Ltd
Original Assignee
Denka Seiken Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Denka Seiken Co Ltd filed Critical Denka Seiken Co Ltd
Priority to JP2012131602A priority Critical patent/JP5548733B2/ja
Publication of JP2012165761A publication Critical patent/JP2012165761A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5548733B2 publication Critical patent/JP5548733B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

【課題】検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定ができる方法の提供。
【解決手段】被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの定量方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、動脈硬化の診断に重要なsmall,dense LDL中のコレステロール測定方法と測定試薬に関する。
低密度リポ蛋白（LDL）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なLDLより高比重な、small,dense LDLは動脈硬化惹起性が通常のLDLより数倍高くなることが知られている。small,dense LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。
従来のsmall,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではない。
自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子LDLを測定する方法（特開2003-28882号公報）がある。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。
また、small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリアニオンと二価陽イオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬の組み合わせて測定する方法（WO2004/053500）が知られている。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便にsmall,dense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れているが、検体を前処理しLDLをsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに分離する操作が必要であった。
特開2003-28882号公報 WO2004/053500号公報
本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定法を提供することである。
本発明者らは種々のリポ蛋白を含有する被検体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼにて測定する際、あらかじめsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに対する反応性が異なる界面活性剤を作用させることによりsmall,dense LDL中のコレステロールを選択的に測定することを検討し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体がsmall,dense LDLに選択的に作用し、small,dense LDL中のコレステロールを測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。
（１） 被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの定量方法。
（２） さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする（１）の方法。
（３） コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなることを特徴とする（１）または（２）の方法。
（４） さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを添加することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６） 被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下でコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を含むsmall,dense LDLコレステロールの定量用キット。
（７） さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含む（６）のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（８） コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼからなる（６）または（７）のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（９） さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを含む（６）〜（８）のいずれかのsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（１０） ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む（６）〜（９）のいずれかのsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（１１） 被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量する方法において、被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロールを測定する工程からなる方法。
（１２） small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含むsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬。
（１３） small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質を含む被検体試料に添加することにより、リポ蛋白中のsmall,dense LDLをフィルターや遠心分離を用いた分離操作をすることなく、直接、選択的に測定することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-252091号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
リポプロテインリパーゼを添加した場合の、Large LDLおよびsmall,dense LDLに対する反応性を示す図である。
以下、本発明について詳細に説明する。
リポタンパク質は大きくVLDL、LDLおよびHDLの分画に分けられ、LDLはさらにsmall,dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。small,dense LDLを小粒子LDL 、SLDL(small LDL)、dense LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外のLDLをLLDL(large LDL)、Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm(19nm〜30nm)、HDLが直径７〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。LDL粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（GGE）(JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、NMR（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition、 Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS：TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重は超遠心分離による分析(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。
本発明の方法で測定しようとするsmall,dense LDLは、一般的にはLDL画分のうち直径が約22.0〜約25.5nmの亜分画、比重1.040〜1.063の亜分画を指す。LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、LDLの中でもより悪性度が高いので、LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重1.040〜1.063という値もsmall,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるLDLの比重範囲1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では1.044〜1.060に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のsmall,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。
本発明において、small,dense LDLという場合、LDLのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のLDLよりも大きいもの、好ましくはLDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重1.040〜1.063の範囲に属するLDLをいう。
本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。本発明の方法ではLarge LDLコレステロールから分離、差別化してsmall,dense LDLコレステロールを測定するために、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDLに選択的に作用させる界面活性剤の存在下で行う。また、コレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用するのを抑制する界面活性剤の存在下で行うこともできる。コレステロール測定用酵素をsmall,dense LDLに選択的に作用させることは、見方を変えればコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制することとも言えるので、結果的に同じことを意味し、両目的を達成する界面活性剤は同一のものを指す場合がありうる。前記界面活性剤はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素の活性を上昇させる界面活性剤と共に用いても良いし、単独で用いることができる。
上記small,dense LDLに対するコレステロール測定用酵素を選択的に作用させる界面活性剤としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体はsmall,dense LDLに選択的に作用し、結果的にコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼのsmall,dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制する。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を被検体試料中のsmall,dense LDLに選択的に作用させることでsmall,dense LDL中のコレステロールが選択的に遊離し、次いでコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL中のコレステロールに反応させる。「ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質の中のsmall,dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中のsmall,dense LDL中のコレステロールをポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の作用により選択的に遊離させることをいう。「small,dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中のsmall,dense LDLに主に作用させること、好ましくはsmall,dense LDLのみに作用させることをいう。遊離したコレステロールにコレステロール測定用酵素を反応させることにより、コレステロールを測定することができる。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体としては、例えば一般式（I）および（II）および（III）
RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H（I）
RO-(C3H6O)d-(C2H4O)e-(C3H6O)f-H（II）
［式中a、b、およびcならびにd、e、およびfは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］
Figure 2012165761
［式中x、yは整数を表す］
で表される化合物が挙げられる。（I）においてポリオキシプロピレンの数（式中のb）は1〜200が好ましく、20〜150がより好ましく、30〜100が特に好ましい。ポリオキシエチレンの数（式中のaおよびc）はそれぞれ1〜200が好ましく、1〜100がより好ましく、1〜60が特に好ましい。Rで示される直鎖または分岐のアルキル基としては炭素数1〜30が好ましく、炭素数2〜25が特に好ましい。（II）においてポリオキシプロピレンの数（式中のe）は20〜100が好ましく、ポリオキシエチレンの数（式中のdおよびf）はそれぞれ1〜60が好ましい。（III）においてポリオキシプロピレンの数（式中のy）は2〜30が好ましい。ポリオキシエチレンの数（式中のx）は1〜50が好ましく、1〜30が特に好ましい。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の濃度としては0.1〜10g／Lが好ましく、0.3〜5g／Lがより好ましく、0.5〜3g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜1％（w/w)が好ましく、0.03〜0.5％(w/w)がより好ましく、0.05〜0.3％（w/w)が特に好ましい。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は、疎水基の分子量およびエチレンオキシド付加量を変えることにより、作用するリポ蛋白の比重が変化し得る。例えば、疎水基分子量が950〜3850であり、総エチレンオキシド％が10〜80％のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は好適にsmall,dense LDLに作用し得る。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体がsmall,dense LDL以外のLDLに作用する場合は、あらかじめポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が作用するLDLをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導けばよい。
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプルロニック17R-4、プルロニックL-64、プルロニックPE3100、プルロニックP-85、プルロニックF-88、プルロニックP-103、プルロニックF-127等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（BASF社、旭電化工業株式会社）などが挙げられる。
また、上記界面活性剤にさらに非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤を加えることができる。これらの界面活性剤は、コレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を上昇させる。
前記非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤の親水性親油性バランス（HLB）は１２〜１４が好ましい。
非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレン誘導体等が挙げられ、特にポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましく、アルキル基としては炭素数8以上が好ましく、例えばオクチル基、ノニル基が好ましい。具体的には、エマルゲン（登録商標）909、エマルゲン100シリーズ、エマルゲン210P、220、306P、320P、404、408、409P、420、430、705、707、709、1108、1118S-70、1135S-70、1150S-70、4085、2020G-HA、2025G、PI-20T（花王株式会社）、パーソフトNK60（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンアルキルエーテル、エマルゲンLS-106、LS-110、LS-114、MS-110（花王株式会社）等のポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ノニオンHS-208、HS-210、NS-208.5、NS210（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、その他ノニオンL-4、O-6（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。その中でも、エマルゲン909、109P、409P、709P、PI-20T、LS110（花王株式会社）、パーソフトNK60、ノニオンHS-208、HS-210、L-4、NS-208.5、NS-210、O-6（日本油脂株式会社）が好ましい。
ポリオキシエチレン誘導体の濃度は0.1〜50g／Lが好ましく、0.5〜10g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜5％(w/w)が好ましく、0.05〜1％(w/w)が特に好ましい。
陰イオン性界面活性剤としてはアルキル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウムが好ましい。具体的には、トラックスH-45（日本油脂株式会社）、ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラウリル２ナトリウムであるサクシニード３LN（日本油脂株式会社）が好ましい。
陰イオン性界面活性剤の濃度は0.1〜20g／Lが好ましく、0.5〜10g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜2％(w/w)が好ましく、0.05〜1％(w/w)が特に好ましい。
本発明のsmall,dense LDLコレステロールの測定は水溶液中、好ましくは緩衝液中で行われる。緩衝液に使用する緩衝剤としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましく、特にグッドの緩衝液としてはBis-Tris、PIPES、BES、MOPSO、HEPESおよびPOPSOが好ましい。緩衝液のpHは5〜9が好ましく、緩衝液の濃度は10〜500mmol/Lが好ましい。
リポ蛋白質に界面活性剤を作用させることにより、リポ蛋白質中のコレステロールが遊離し、該コレステロールに酵素（コレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ）を反応させることによりコレステロールが分解、酸化される。
本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。コレステロールエステラーゼの濃度は0.01〜50U/mLが好ましく、0.1〜10U/mLが特に好ましい。
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。コレステロールオキシダーゼの濃度は0.01〜20U/mLが好ましく、0.1〜1U/mLが特に好ましい。
コレステロールデヒドロゲナーゼとしてはコレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は0.01〜200U/mLが好ましく、0.1〜100U/mLが特に好ましい。
本発明ではsmall,dense LDLに対する反応選択性を高めるためにさらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを用いることができる。
ホスホリパーゼとしてはホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD、リゾホスホリパーゼ等を用いることができ、使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。
リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼの使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が生成する。発生した過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により形成される色素（有色キノン）により波長400〜700nmで測定することにより定量することができる。
水素供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOOS）、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン（MAOS）、N−エチル−N−（3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOPS）、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン（HDAOS）、N−（3−スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N−（3−スルホプロピル）−3−メトキシ−5−アニリン（HMMPS）等があげられる。水素供与体の使用濃度は最終濃度で0.1〜1.5mmol/Lが好ましい。
水素受容体としては4−アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応によりNAD（P）からNAD（P）Hが発生する。発生したNAD（P）Hは330〜400nmでの吸光度を測定することにより定量することができる。
本発明ではsmall,dense LDLに対する反応選択性をさらに高めるために被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導いてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くとは、HDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。
消去とは被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。この場合、small,dense LDL以外に作用する界面活性剤としてHDL値が13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でHLB値が13以上15以下の化合物がある。上記界面活性剤の濃度は、0.1〜10g/L程度が好ましく、さらに好ましくは0.3〜5.0g/L程度である。あるいは、0.01〜1％(w/w)程度が好ましく、さらに好ましくは0.03〜0.5％(w/w)程度である。
この場合、small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールの消去には上記界面活性剤の他、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法、およびペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させ無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明にはイオン強度調整剤として1価の陽イオンおよび／または2価の陽イオンおよびその塩を用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、small,dense LDLが分離しやすくなる。具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。濃度は0〜100mmol／Lで使用される。
反応温度は2℃〜45℃で行うことが好ましく、25℃〜40℃で行うことがさらに好ましい。
反応時間は1〜30分間で行うことが好ましく、3〜15分で行うことがさらに好ましい。
本発明の被検体試料として血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
凝集とは、被検体試料中の物質を凝集させる凝集剤や、被検体試料中の物質に対する抗体等を用いその凝集物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。ここで凝集剤とは、化学反応によって凝集を惹起させるものであり、また抗体とは、特定のリポ蛋白分画に対する抗体であって、免疫凝集反応を生じさせるものである。例えば反応液には必要に応じてリポ蛋白凝集剤を含有させることができる。リポ蛋白凝集剤としてはリンタングステン酸、ヘパリン、デキストラン硫酸などのポリアニオンやその塩、およびマグネシウム、マンガン、カルシウム等の2価陽イオンが挙げられる。
本発明で用いる自動分析装置として、例えば、TBA-120FR・200FR(東芝)、JCA-BM1250・1650・2250（日本電子）、HITACHI7180・7700（日立）、AU2700（OLYMPUS）等が挙げられる。
本発明の方法においては、第１工程において被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を添加し、small,dense LDL中のコレステロールを遊離、分解し、第２工程において、コレステロールの分解物を定量する。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体はsmall,dense LDLへの選択性が高いため、上記工程により、small,dence LDLを選択的に定量することができる。第１工程の前に、被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程を含んでいてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程とは、HDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の工程のことである。
第１工程の前の被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程においては、例えば、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素を添加し、small,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールに作用させ、発生した過酸化水素をカタラーゼにより分解することにより、small,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことができる。その後、系にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を、必要に応じて界面活性剤と共に添加すればよい。系中のコレステロール測定用酵素、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、あるいはさらに界面活性剤の作用で、small,dense LDLコレステロールから過酸化水素が発生し、該過酸化水素を定量すればよい。
本発明の測定方法を実施するに当たり、用いる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素、界面活性剤、過酸化水素を分解するカタラーゼ、過酸化水素からカップリング反応により色素を形成させるためのペルオキシダーゼ、水素供与体、緩衝液等が用いられる。これらの試薬の各試薬組成物への振り分けは、試薬の安定性等を考慮して適宜分配される。例えば、試薬を第１試薬組成物と第２試薬組成物の２つに分け、第１試薬組成物にコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素等を含ませ、第２試薬組成物にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロール測定用酵素の活性を上昇させるための界面活性剤等が含ませることができる。第２試薬組成物には、さらにホスホリパーゼ又はリポプロテインリパーゼを含ませてもよい。このような２つの試薬組成物を用いる場合、被検体試料に第１試薬組成物を添加し、１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させたのち、第２試薬組成物を添加し、さらに１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させ、形成された色素を定量すればよい。
また、あらかじめsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消失させた被検体試料を用いて、本発明の上記第１工程及び第２工程を実施してもよい。例えば、被検体から遠心分離によりsmall, dense LDL分画を分離し、測定してもよい。
本発明は、small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含むsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬をも包含する。
本発明は、small,dense LDLコレステロールの定量用キットをも包含する。該キットは、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む。該キットは、さらにコレステロール測定用酵素を含んでいてもよい。該キットは、さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。該キットは、さらに、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含んでいてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬は、上記の、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去、凝集、阻害するための試薬である。
本発明は、さらにsmall,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用をも包含する。
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
第２試薬組成物中に各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いた以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ 0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ 0.5U/mL
カタラーゼ 600U/mL
牛血清アルブミン 0.5%
TOOS 2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体 0.3%
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 4.0単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%
被検体試料としてヒト血清30例を使用した。
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表１に示す。表１は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
表１に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を含む試薬組成物を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。これは、本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
Figure 2012165761
実施例２
実施例１の第２試薬組成物中に、更に非イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ 0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ 0.5U/mL
カタラーゼ 600U/mL
牛血清アルブミン 0.5%
TOOS 2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体 0.3%
ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル
エマルゲン909 [花王株式会社社製] 1%
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 4.0単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画および同含有量100mg/dLのLarge LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
その結果、small,dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、Large LDL分画は67%のみしか測定されなかった。つまり、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加する。
また、非イオン性界面活性剤である109P、409P、709P、PI-20T、LS110（花王株式会社）、パーソフトNK60、ノニオンHS-208、210、L-4、NS-208.5、210、O-6（日本油脂株式会社）をエマルゲン909の代わりに用いて同様の実験を行い、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加することも確認できた。
従って、非イオン性界面活性剤を添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
実施例３
被検体試料としてのヒト血清30例に対し、実施例２で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表２に示す。表２は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と非イオン性界面活性剤を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
表２に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と非イオン性界面活性剤を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例１の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、非イオン性界面活性剤を添加した本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
Figure 2012165761
実施例４
実施例１の第２試薬組成物中に、更に陰イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ 0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ 0.5U/mL
カタラーゼ 600U/mL
牛血清アルブミン 0.5%
TOOS 2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体 0.3%
ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル
トラックスH-45 [日本油脂株式会社製] 1%
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 4.0単位/mL
アジ化ナトリウム 0.05%
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画および同含有量100mg/dLのLarge LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
その結果、small,dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、Large LDL分画は69%のみしか測定されなかった。つまり、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加する。
また、陰イオン性界面活性剤であるサクシニード3LN（日本油脂株式会社）をトラックスH-45の代わりに用いて同様の実験を行い、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加することも確認できた。
従って、陰イオン性界面活性剤を添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
実施例５
被検体試料としてのヒト血清30例に対し、実施例４で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表３に示す。表３は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と陰イオン性界面活性剤を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
表３に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と陰イオン性界面活性剤を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例１の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、陰イオン性界面活性剤を添加した本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
Figure 2012165761
実施例６
実施例１の第２試薬組成物中に、更にリポプロテインリパーゼを各0、2、4、5U/mL添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
コレステロールエステラーゼ 0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ 0.5U/mL
カタラーゼ 600U/mL
牛血清アルブミン 0.5%
TOOS 2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0 50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体
プルロニック17R-4またはプルロニックL-64［旭電化工業(株)社製］0.3%
４−アミノアンチピリン 4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ 4.0単位/mL
リポプロテインリパーゼ LPL-311［東洋紡績(株)社製］0, 2, 4, 5U/mL
アジ化ナトリウム 0.05%
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画、Large LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
その結果を図１に示す。
図１に示すように、試薬組成物中にリポプロテインリパーゼを加えることにより、small,dense LDLの反応性がLarge LDL反応性に比べて著しく増加する。従って、リポプロテインリパーゼを添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 被検体試料に
    (i) RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H
    ［式中a、b、およびcは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］又は
    (ii)
    Figure 2012165761
    ［式中x、yは整数を表す］であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの選択的定量方法。
  2. さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを添加することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 被検体試料に
    (i) RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H
    ［式中a、b、およびcは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］又は
    (ii)
    Figure 2012165761
    ［式中x、yは整数を表す］であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体の存在下でコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、上記のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体およびコレステロール測定用酵素を含むsmall,dense LDLコレステロールの定量用キット。
  7. さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含む請求項６記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
  8. コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼからなる請求項６または７に記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
  9. さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを含む請求項６〜８のいずれか１項に記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
  10. ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む請求項６〜９のいずれか１項に記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
JP2012131602A 2005-08-31 2012-06-11 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット Active JP5548733B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012131602A JP5548733B2 (ja) 2005-08-31 2012-06-11 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005252091 2005-08-31
JP2005252091 2005-08-31
JP2012131602A JP5548733B2 (ja) 2005-08-31 2012-06-11 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007533333A Division JP5042023B2 (ja) 2005-08-31 2006-08-31 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2012165761A true JP2012165761A (ja) 2012-09-06
JP5548733B2 JP5548733B2 (ja) 2014-07-16

Family

ID=37808912

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007533333A Active JP5042023B2 (ja) 2005-08-31 2006-08-31 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット
JP2012131602A Active JP5548733B2 (ja) 2005-08-31 2012-06-11 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2007533333A Active JP5042023B2 (ja) 2005-08-31 2006-08-31 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8697378B2 (ja)
EP (1) EP1930442B1 (ja)
JP (2) JP5042023B2 (ja)
DE (1) DE602006018035D1 (ja)
WO (1) WO2007026829A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021040516A (ja) * 2019-09-10 2021-03-18 デンカ生研株式会社 キットおよび方法
WO2023079599A1 (ja) * 2021-11-02 2023-05-11 デンカ株式会社 試薬組成物およびキット
JP7437263B2 (ja) 2020-07-31 2024-02-22 デンカ株式会社 試薬組成物およびキット

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007126099A1 (ja) * 2006-05-01 2007-11-08 Denka Seiken Co., Ltd. 家族性複合型高脂血症の検出方法
DE602007012455D1 (de) * 2006-10-18 2011-03-24 Kyowa Medex Co Ltd Verfahren zur quantifizierung von cholesterin in kleinem dichtem low-density-lipoprotein
JP5325093B2 (ja) * 2007-02-28 2013-10-23 デンカ生研株式会社 小粒子低比重リポ蛋白の定量試薬
US8440419B2 (en) * 2007-10-10 2013-05-14 Denka Seiken Co., Ltd. Method and kit for quantitatively determining small, dense LDL cholesterol
JP5500777B2 (ja) * 2008-03-06 2014-05-21 デンカ生研株式会社 Ｈｄｌ３−ｃの測定方法及びｈｄｌ３−ｃ測定用試薬
WO2012057333A1 (ja) * 2010-10-29 2012-05-03 アークレイ株式会社 低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
JP6054051B2 (ja) * 2012-04-11 2016-12-27 デンカ生研株式会社 高密度リポ蛋白（ｈｄｌ）中のコレステロール（−ｃ）の亜分画定量方法
JP6729995B2 (ja) * 2014-10-09 2020-07-29 デンカ株式会社 免疫分析方法及び試薬
JP6851576B2 (ja) * 2016-04-20 2021-03-31 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 検体中の脂質による濁り抑制剤
JPWO2019044973A1 (ja) * 2017-09-01 2020-10-15 日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
CN111398607B (zh) * 2019-01-03 2024-02-23 中元汇吉生物技术股份有限公司 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂
JP6869300B2 (ja) * 2019-09-10 2021-05-12 デンカ株式会社 ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット
CN110794155B (zh) * 2019-11-26 2020-06-23 浙江夸烨生物科技有限公司 一种用于检测小而密低密度脂蛋白胆固醇的试剂盒及其检测方法
CN111551512B (zh) * 2020-06-11 2023-07-25 安徽大千生物工程有限公司 一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒及其制备使用方法
WO2023199890A1 (ja) * 2022-04-11 2023-10-19 デンカ株式会社 試薬組成物およびキット

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000017388A1 (fr) * 1998-09-18 2000-03-30 Kyowa Medex Co., Ltd. Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification
JP2000325097A (ja) * 1999-05-21 2000-11-28 Showa Denko Kk リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬
WO2004035816A1 (ja) * 2002-10-16 2004-04-29 Kyowa Medex Co., Ltd. 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
WO2004053500A1 (ja) * 2002-12-06 2004-06-24 Denka Seiken Co., Ltd. 小粒子低比重リポ蛋白の定量法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5870208A (ja) * 1981-10-22 1983-04-26 Toyo Contact Lens Co Ltd コンタクトレンズ用洗浄剤
DE3220012A1 (de) 1982-05-27 1983-12-01 Akzo Gmbh, 5600 Wuppertal Polyaetherderivate und deren verwendung als dispergatoren in mitteln zum weichspuelen von textilien auf der basis quaternaerer ammoniumsalze
US5858279A (en) * 1997-10-31 1999-01-12 Church & Dwight Co., Inc Stabilized triple defoamer composition
US6096702A (en) 1998-10-01 2000-08-01 Imaginative Research Associates, Inc. Post foaming clear gels and solutions
JP4456715B2 (ja) * 2000-02-28 2010-04-28 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000017388A1 (fr) * 1998-09-18 2000-03-30 Kyowa Medex Co., Ltd. Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification
JP2000325097A (ja) * 1999-05-21 2000-11-28 Showa Denko Kk リポ蛋白質コレステロールの測定方法及び測定試薬
WO2004035816A1 (ja) * 2002-10-16 2004-04-29 Kyowa Medex Co., Ltd. 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
WO2004053500A1 (ja) * 2002-12-06 2004-06-24 Denka Seiken Co., Ltd. 小粒子低比重リポ蛋白の定量法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021040516A (ja) * 2019-09-10 2021-03-18 デンカ生研株式会社 キットおよび方法
JP7437263B2 (ja) 2020-07-31 2024-02-22 デンカ株式会社 試薬組成物およびキット
WO2023079599A1 (ja) * 2021-11-02 2023-05-11 デンカ株式会社 試薬組成物およびキット

Also Published As

Publication number Publication date
US20090263844A1 (en) 2009-10-22
JP5548733B2 (ja) 2014-07-16
EP1930442A1 (en) 2008-06-11
EP1930442A4 (en) 2008-09-10
WO2007026829A1 (ja) 2007-03-08
JP5042023B2 (ja) 2012-10-03
DE602006018035D1 (de) 2010-12-16
US8697378B2 (en) 2014-04-15
EP1930442B1 (en) 2010-11-03
JPWO2007026829A1 (ja) 2009-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5548733B2 (ja) 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット
JP5730344B2 (ja) 小粒子低比重リポ蛋白の定量試薬
JP5450080B2 (ja) ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット
JP5111389B2 (ja) 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
EP1849876B1 (en) Method, reagent and kit for determination of cholesterol in remnant-like particles (rlp)
JP4647927B2 (ja) 低密度リポ蛋白中コレステロールのマルチ定量法
JPWO2004055204A1 (ja) 低密度リポ蛋白中コレステロールのマルチ定量法
JP6829009B2 (ja) トリグリセリドリッチリポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び定量試薬
JP2011505866A (ja) 脂質測定方法
JP7396965B2 (ja) ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅ ＬＤＬコレステロールの定量方法およびキット
JP7427522B2 (ja) キットおよび方法
JP4865880B2 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20120710

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20140121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20140324

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140507

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140519

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5548733

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

S111 Request for change of ownership or part of ownership

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250