WO2004053500A1

WO2004053500A1 - 小粒子低比重リポ蛋白の定量法

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Publication number: WO2004053500A1
Application number: PCT/JP2003/015633
Authority: WO
Inventors: Yasuki Itoh; Tsutomu Hirano
Original assignee: Denka Seiken Co., Ltd.
Priority date: 2002-12-06
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2004-06-24
Also published as: EP1571452B1; JPWO2004053500A1; JP4476814B2; CN101051051A; CN1745303B; US7811826B2; KR20050084130A; KR101079386B1; US7544515B2; CN1745303A; DE60336753D1; US20060154374A1; AU2003289224B2; ATE505731T1; EP1571452A1; CA2508674C; AU2003289224A1; CA2508674A1; US20090148959A1; EP1571452A4

Abstract

　迅速かつ簡便な小粒子LDLの分別測定法の提供。　被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第１工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定する第２工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法。

Description

明細書小粒子低比重リポ蛋白の定量法技術分野

本発明は動脈硬化症の臨床診断に重要な小粒子低比重リポ蛋白の分別定量法に関する。背景技術

低密度リポ蛋白（LDL) は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、 LDL の中でも特に粒子サイズが小さく平均的な LDLより高比重な、小粒子低比重リポ蛋白（以下、「小粒子 LDL」という）は動脈硬化惹起性が通常の LDLより数倍高くなることが知られている。小粒子 LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の 1つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。

従来の小粒子 LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ一を用いる方法などがある。超遠心法は比重の差を利用して小粒子 LDLを分離し、そのコレステロール量や蛋白量を定量する方法であり、小粒子 LDL は比重

1. 040〜 1. 063 に分画される（ Atheroscl eros is, 48 p. 33-49, 1993 :

Atheroscleros is, 106, p. 241-253, 1994 等）。しかしながら、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要する。電気泳動法はポリアクリルアミドゲルを用いて LDL の移動度や粒子直径を測る方法で、小粒子 LDL は粒子サイズ

25. 5nm以下 (JAMA, 260, p. 1917-21, 1988等）または、 LDLの相対移動度 (VLDL から LDLまでの移動距離を VLDLから HDLまでの移動距離で除したもの）が 0. 4 以上である（動脈硬化， 2'5， p. 67-70, 1997)。しかしながら、これらの方法は LDL の小粒子化の程度を測定する方法であって定量法ではない。また、一度に測定する検体数が限られており、測定に時間がかかる。最近、ァガロース電気泳動において泳動後のゲルを脂質染色し、その染色パターンをコンピュータ一解析しリポ蛋白を定量する方法 (特開 2000-356641号公報）が発明されたが、これは酸化 LDL、ァセチル LDL、糖化 LDL、 MDA- LDLなどの変性 LDLを分析する方法であり、小粒子 LDL は正確に測定することができない。また解析に非常に高価な装置を必要とすることから一般的でない。

従来、 HDL測定において HDL以外のリポ蛋白を凝集させ HDLを分離させるための分離剤として、ポリア二オンと 2価の陽イオンを組み合わせて用いることが知られていた。例えば、デキストラン硫酸- Mg²⁺を用いる方法（Cl in. Chem. , 28, p. 1379-88, 1982等）、へパリン - Mn²⁺を用いる方法 (J Lipi d Res. . 19， p. 65-76, 1978等）、へパリン- Ca²⁺を用いる方法（Arch. B ioc em. Biophys. , 170, p. 334-40, 1975等）、リンタングステン酸- Mg²⁺を用いる方法（Cl in. Chem. , 23, p. 882-84, 1977等）などがある。また、複数の分離剤を使用してリポ蛋白を段階的に沈殿させ、計算により LDLや VLDLの分画を測定する方法がすでに報告されている（特開平 7 - 294532号公報、臨床病理臨時増刊特集第 21号， 82， 1975等）。さらに、ポリエチレングリコールを用いて HDL を分離する方法も報告されている（Ann.

Cl in. Biochem. 18 p. 177-81 1981)。

さらに、従来、複数の分離剤を使用してリホ。蛋白を段階的に沈殿させ、濁度の差により各リポ蛋白を測定する方法（臨床病理臨時増刊特集第 21 号， 82， 1975 等）、イオン強度の差により小粒子 LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子 LDLを測定する方法（特開 2003- 28882号公報）などがあった。しかし、吸光度を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。

特許文献 1 特開 2000-356641号公報

特許文献 2 特開平 7-294532号公報

特許文献 3 特開 2003-28882号公報

非特許文献 1 Atherosc leros i s, 48, p. 33-49, 1993

非特許文献 2 Atheroscleros i s, 106, p. 241-253, 1994

非特許文献 3 JAMA, 260, p. 1917-21, 1988

非特許文献 4 動脈硬化， 25， p. 67-70, 1997

非特許文献 5 Cl in. Chem. , 28, p. 1379-88, 1982

非特許文献 6 J Lipid Res. . 19, p. 65-76, 1978

非特許文献 7 ArcL Biochem. Biophys. , 170, p. 334-40, 1975 非特許文献 8 C l in. C em. , 23, p. 882-84, 1977

非特許文献 9 臨床病理臨時増刊特集第 21号， 82, 1975

非特許文献 1 0 Ann. Cl in. B ioc em. 18 p. 177-81 1981 発明の開示

本発明の目的は、迅速かつ簡便な小粒子 LDLの分別測定法を提供することである。

上記のように、ポリア二オン、 2価の陽イオン等を分離剤として用いてリポ蛋白中の HDL以外のリポ蛋白を凝集させるために用いることは報告されていた。しかし、リポ蛋白の代表的な分画である VLDL、 LDLおよび HDLはそれぞれ物性が異なるので分離剤により分離することができるが、 LDL を同様の方法で亜分画に分離することは試みられていなかった。

本発明者等は小粒子 LDLを分離する方法について鋭意検討を行い、被検体試料にポリァニオンおよび 2価の陽イオンを適当な濃度で作用させることにより、小粒子 LDLとそれ以外の LDLが分離されることを見いだした。さらに 1価の陽ィォンを追加して作用させた場合に、 1価の陽イオンはイオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子 LDLの分離を達成することができた。また、ポリア二オンと 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの代わりに PEGを用いても同様の効果を得ることができた。

本発明者等は、ポリア二オンと 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを組み合わせた場合、または PEGを用いた場合のそれぞれの濃度について詳細な検討を行い、これら濃度範囲を規定することで、 LDL粒子の中でも小粒子 LDL以外の LDL を凝集させ小粒子 LDLを分離する条件を見いだした。この反応により小粒子 LDL 以外の LDLは凝集物を形成し、遠心分離やフィルター処理により反応液中から取り除くことができる。さらに分離後の反応液に LDLコレステロール測定用試薬または LDL中中性脂肪測定用試薬または抗ヒ卜アポ蛋白 B抗体を作用させることにより、小粒子 LDL中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を定量することが可能となり、本発明を完成するに至った。

上述のイオン強度の差により小粒子 LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子 LDLを測定する方法（特開 2003-28882号公報）と比べて、本発明では分離後の小粒子 LDLをコレステロール、中性脂肪、蛋白質の形で測定するため特異性や精度において優れている。

すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。

(1) 被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比重リポ蛋白と分離する第 1工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第 2工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法、

(2) 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリア二オンおよび 2価の陽イオンを用いることを特徴とする（ 1 ) の方法、

( 3 ) 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに 1価の陽イオンを用いることを特徴とする（1) または（2) の方法、

(4) 前記第 1工程で使用されるポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸およびデキス卜ラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徴とする（2) または（3) の方法、

(5) 前記第 1工程で使用される 2価の陽イオンが Mn²⁺、 Mg²⁺および Ca²⁺からなる群から選択される 2価の陽イオンであることを特徴とする（2) から（4) のいずれかの方法、

(6) 前記第 1工程で使用される 1価の陽イオンが Na+、 K+および U+からなる群から選択される 1価の陽イオンであることを特徵とする（3) または（5) の方法、

(7) 被検体試料にポリア二オンを添加したときのポリア二オンの最終濃度が、へパリンの場合 10〜250U/mL、デキストラン硫酸の場合 0.02〜1.25%、リンタングステン酸の場合 0.02〜1. である（4) から（6) のいずれかの方法、

(8) 被検体試料に 2価の陽イオンを添加したときの 2価の陽イオンの最終濃度が、 Mn²⁺の場合 2.5〜35mmol/L、 Mg²⁺の場合 2.5〜 125mmol/L、 Ca²⁺の場合 1〜

75MIO1/Lである（5) から（7) のいずれかの方法、 ( 9 ) 被検体試料に 1価の陽ィォンを添加したときの 1価の陽ィオンの最終濃度が、 0〜50inmol/Lである（6) から（8) のいずれかの方法、

(10) 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に PEGを用いることを特徴とする（1) の方法、 '

(11) 被検体試料に PEGを添加したときの PEGの最終濃度が、 2〜5%である（1 0) の方法、

(12) 前記第 2工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徴とする（1).力、ら（11) のいずれかの方法、

(13) 前記第 2工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪定量試薬を用いることを特徴とする（1) から（11) のいずれかの方法、

(14) 前記第 2工程の蛋白測定が、抗ヒトアポ蛋白 B抗体を用いることを特徴とする（1) から（11) のいずれかの方法、

(15) 被検体試料にポリア二オンおょぴ 2価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(16) 被検体試料に、さらに 1価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、（15) の方法、

(17) ポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徵とする（15) または（16) の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(18) 2価の陽イオンが Mn 、 Mg²⁺および Ca²⁺からなる群から選択される 2価の陽イオンであることを特徴とする（15) から（17) のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(19) 1価の陽イオンが Na⁺、 K+および U⁺からなる群から選択される 1価の陽イオンであることを特徴とする（15) から（18) のいずれかに記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(20)被検体試料にポリア二オンを添加したときのポリア二オンの最終濃度が、へパリンの場合 10〜250U/mL、デキストラン硫酸の場合 0.02〜1.25 、リン夕ングステン酸の場合 0.02〜1.25%である（1 7) から（1 9) のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(2 1) 被検体試料に 2価の陽イオンを添加したときの 2価の陽イオンの最終濃度が、は Mn²⁺の場合 2.5〜35mmol/L、 Mg²⁺の場合 2.5〜125mmol/L、 Ca²⁺の場合 1 〜75ιωιο1Λである（18) から（20) のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(2 2) 被検体試料に 1価の陽イオンを添加したときの 1価の陽イオンの最終濃度が、 0〜50imnol/L である（19) から（2 1) のいずれかの小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(23) 被検体試料に PEGを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(24) 被検体試料に PEGを添加したときの PEGの最終濃度が 2〜5%である（2 3) の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法、

(25) ポリア二オンおよび 2価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、

(26) 分離剤が、さらに 1価の陽イオンを含む（25) の小粒子低比重リポ蛋白測定用キッ卜、

(27) PEG を含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット、

(28) ポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徴とする（25) または（16) のキッ卜、

(29) 2価の陽イオンが胞²⁺、 Mg²⁺および Ca"からなる群から選択される 2価の陽イオンであり， 1価の陽イオンが Na⁺、 K+および Li⁺からなる群から選択される 1価の陽イオンであであることを特徵とする（26) または（28)のキット。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002-3551 19号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の第 1工程の方法を示す図である。

図 2は、実施例〗における本発明の第一工程の効果を示す図である。

図 3は、実施例 2における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。

図 4は、実施例 3における本発明法による小粒子 LDL中アポ Bの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中アポ Bの測定値との相関性を示す図である。

図 5は、実施例 4における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。

図 6は、実施例 5における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。

図 7は、実施例 6における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。

図 8は、実施例 7における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。

図 9は、実施例 8における本発明法による小粒子 LDL中中性脂肪の測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中中性脂肪の測定値との相関性を示す図である。

図 1 0は、実施例 9における本発明法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値と、超遠心法による小粒子 LDL中コレステロールの測定値との相関性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の方法は、第 1工程および第 2工程からなる。第 1工程では被検体試料にポリア二オンおょぴ 2価の陽イオンからなる分離液、ポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンからなる分離液または P E Gを添加し、一定時間反応後 VLDLおよび小粒子 LDL以外の LDLを凝集させ、遠心分離やフィルタ一により除去する。続く第 2工程では小粒子 LDL中のコレステロールや中性脂肪や蛋白質を定量する。第 1工程では上記リポ蛋白除去後の溶液中に小粒子 LDLの他 HDLが残るが、 LDLコレステロール測定試薬または LDL中の中性脂肪測定試薬または抗ヒトアポ B抗体を作用させることにより、小粒子 LDLの成分のみを分別測定することができる。

上述のように、リポタンパク質は大きく VLDL、 LDLおよび HDLの分画に分けられ、 LDL はさらに小粒子 LDL とそれ以外の亜分画に分けられる。小粒子 LDL を SLDL (smal l LDL)、 Smal l dense LDL、 dense LDL と呼ぶこともあり、またそれ以外の LDLを LLDL (l arge LDL)、 Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるが VLDL が 30nn！〜 80nm ( 30皿〜 75nm) で、 LDL が 22ηπ！〜 28nm (19nn！〜 30nm)、 HDLが直径 7〜10nmである。比重は、 VLDLが 1. 006以下、 LDL が 1. 019〜1. 063、 HDLが 1. 063〜1. 21である。 LDL粒子直径はグラジェントゲル電気泳動 (GGE) (JAMA, 260, p. 1917-21, 1988) , 醒 R (HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2^nd Edi t ion, Nader Ri fai他編、 . 609-623, AACC PRESS : TheFa t s of L i fe Summer 2002、 LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE, Volume AVI No. 3、 p. 15-16) により測定でき、比重は超遠心分離による分析（Atherosc leros i s, 106, p. 241-253, 1994 : Atheroscl eros i s, 83, p. 59, 1990)に基づいて決定できる。

本発明の方法で測定しょうとする小粒子 LDLは、一般的には LDL画分のうち直径が約 22. 0〜約 25. 5 の亜分画、比重】. 040〜； !. 063の亜分画を指す。 LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、 LDL のうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、 LDLの中でもより悪性度が高いので、 LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があつたからである。 LDL 内で直径分布や比重分布は連続してお

— ~ り、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重 1. 040〜1. 063という値も小粒子 LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえる LDLの比重範囲 1. 019〜1. 063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では 1. 044 〜1. 060に分画される (At erosc l eros i s : 106 24卜 253 1994)。小粒子 LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合の小粒子 LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。

本発明において、小粒子 LDL という場合、 LDLのうち比重が小さいものであつて、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外の LDLよりも大きいもの、好ましくは LDL の比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重 1. 040〜1. 063の範囲に属する LDLをいう。

本発明の方法で用いる被検体試料は、血清または血漿、好ましくは血清である。第 1工程において、適当な体積の被検体試料にポリァニオンおよび 2価の陽ィォン、またはポリァニオン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンをポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽ィォンの最終濃度が特定の範囲内になるように添加する。小粒子 LDLとそれ以外の LDLの分離はポリア二オンと 2価の陽イオンの存在下で行うことができるが、さらに 1価の陽イオンを存在させることにより 1 価の陽イオンがィオン強度調整剤として作用し、より良好な小粒子 LDLおよび HDL を含む画分の分離を達成することができる。この際、特定の濃度のポリア二オンおよび 2価の陽イオンからなる分離液、または特定の濃度のポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンからなる分離液をあらかじめ調製しておいて、これを添加してもよいし、特定の濃度のポリァニオンおよび 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを別々に調整しておいて、それぞれを別々に添加してもよい。別々に添加する場合の被検体試料への添加順序は限定されない。ポリァニオンおよび 2価の陽イオンからなる分離剤、またはポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンからなる分離液を用いる場合、分離液の溶媒として、精製水、生理食塩水および各種緩衝液を用いることができる。分離液の pHは 3〜8が好ましい。

第 1工程で用いるポリア二オンとしてはへパリン、リンタングステン酸、デキス卜ラン硫酸などを好適に用いることができる。被検体試料にポリア二オンおよぴ 2価の陽イオン、またはポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを添加した後のポリア二オンの最終濃度は濃度はへパリンの場合 10〜250U/mL、リンタングステン酸の場合 0. 02〜1. 25 %、デキストラン硫酸の場合 0. 02〜1. 25 % が好ましい。

第 1工程で用いる 2価金属イオンには Mn²⁺、 Mg²⁺、 Ca²⁺、 Co²⁺を用いることができ、好適には Mn²⁺、 Mg²⁺、 Ca²⁺が用いられる。被検体試料にポリア二オンおよび 2 価の陽イオンを添加した後の 2価の陽イオンの最終濃度は、ポリア二オンとしてへパリンを用いた場合の Mn²⁺濃度は 7. 5〜35應 ol/し Mg²⁺濃度は 40〜125匪 ol/L、 Ca²⁺濃度は 50〜75觀 ol/Lが好ましく、リンタングステン酸を用いた場合の Mn²⁺濃度は 2. 5〜7. 5fflmol/L、 Mg²⁺濃度は 2. 5〜50IMO1/L、 Ca²⁺濃度は 1〜30匪 o l/Lが好ましレ^デキストラン硫酸を用いた場合の Mn²⁺濃度は 2. 5〜10匪01/し¾^²⁺濃度は 7. 5 ~30讓 ol/L、 Ca²⁺濃度は 5〜20mmol/Lが好ましい。

また、さらに第 1工程で 1価の陽イオンを用いる場合、 1価金属イオンには Na+、 K Li⁺を好適に用いることができる。 1価の陽イオンの最終濃度は、 0〜50腿 ol/L が望ましい。

例えば、被検体試料にポリア二オンと 2価の陽イオンを含む分離剤、またはポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを含む分離剤 I OO L を添加する。この際の、分離剤中のポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの濃度は被検体試料と分離剤を混合したときのポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの濃度が上記最終濃度になるように調製しておけばよい。分離剤中のポリア二オンの濃度は、へパリンの場合 20〜500U/mL、リン夕ングステン酸の場合 0. 04〜2. 5%、デキストラン硫酸の場合 0. 04〜2. 5%が好ましい。また、分離剤中の 2価陽イオンの濃度は、ポリア二オンとしてへパリンを用いた場合の Mn²⁺濃度は 15〜70画 1/L、 Mg²⁺濃度は 80〜250画 1 /し Ca²⁺濃度は 100〜

150mmol/L が好ましく、リンタングステン酸を用いた場合の Μπ²⁺濃度は 5〜

15画 1/L、 Mg²⁺濃度は 5〜100nimol/し Ca²⁺濃度は 2〜60nmiol/Lが好ましい。デキス卜ラン硫酸を用いた場合の Mn²⁺濃度は 5〜20腿 ol/L、 Mg²⁺濃度は 15〜60mmol/L 、

Ca²⁺濃度は 10〜40mmol/Lが好ましい。 1価の陽イオンの濃度は 0〜100匪 ol/Lが好ましい。

被検体試料にポリア二オンおよび 2価の陽イオン、またはポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを添加した後、反応混液を攪拌し、第 1工程の反応を行わせる。

第 1工程での反応は 2°C〜45°Cの温度で行うことが好ましく、 20° (：〜 37°Cで行うことがさらに好ましい。

第 1工程での反応は 1分〜 30分間の時間で行うことが好ましく、 5分〜 15分間の時間で行うことがさらに好ましい。

なお、第 1工程において被検体試料に添加するポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの至適濃度はポリア二オン、. 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの種類の組み合わせによっても変わり、また被検体試料の pH、イオン強度等の条件によっても変わってくる。従って、本発明の第 1工程の反応を行う場合、常に同じ比重範囲のものが得られるとは限らず、特に上述の一般的に小粒子 LDLの比重範囲とされている 1. 040〜1. 063のものが得られるとは限らなレ^但し、上記濃度条件で第 1工程の反応を行えば、ほぼ同等の比重を有する LDLが得られ、その LDLは上記定義の LDLに含まれる。さらに、小粒子 LDLの比重を 1. 040〜1. 063 に固定して考えた場合であって、本発明の第 1工程により得られる LDLの比重がこの範囲から若干ずれたとしても、そのずれは大きくない。また LDL全体における比較的小粒子の LDLを含んでいることには変わりはないので、本発明の第 1ェ程により得られる小粒子 LDLの量は、ある被検体の動脈硬化を罹患するリスクを反映している。

第 1工程の小粒子 LDLおよび HDLを含む画分の分離は、ポリァニオンおよび 2 価の陽イオン、またはポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンの代わりにポリエチレンダリコール（PEG)を被検体試料に添加することによつても行うことができる。この際に用いられる PEGの分子量は、 4, 000〜20， 000が望ましく、 PEGの最終濃度は 4〜ί0%が望ましい。

第 1工程の反応が終了した後、遠心分離を行い上清を得ることにより、小粒子

LDLおよび HDLを含む画分を採取することができる。この際の遠心分離条件は、

9, 000g〜36， OOOgで 1~30分である。また、第 1工程の反応が終了した後、反応混液をフィルターにかけてもパススルーとして小粒子 LDLおよび HDLを含む画分を採取することができる。フィルタ一は圧力を加えてろ過するタイプのものであっても、遠心操作によりろ過する夕ィプのものであってもよい。この際用いるフィルターの分画サイズは、 0. 10〜0. 80 /x mであり、例えば、市販のマイレクス、ウルトラフリ一（MILLIPORE社製），ミ二ザルト（Sartori us社製）， DISMIC (ADVANTEC社製）， H Tタフリン .ァクロデイスク ·シリンジフィルター（PALL Ge lman Laboratory社製）等を用いることができる。

第 1工程で得られた小粒子 LDLおよび HDLを含む画分中の LDLのみを測定することにより、被検体試料中の小粒子 LDLを定量することができる。

この際、 LDLの測定は、 LDL中のコレステロールを測定するか、 LDL中の中性脂肪を測定するか、 LDL中のアポ Bタンパク質を測定することにより行える。

第 2工程で用いられる分画操作を要しない LDLコレステロール測定方法としていくつかの方法（特開平 1卜 318496 号公報、特開 2002-202314 号公報、特開平 10- 08030Q号公報、特開平 09-313200号公報、特開平 1 1-155595号公報、特許第 3256241号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。

例えば、特開平 1卜 318496号公報の記載に従って、以下のようにして第 1工程で得られた小粒子 LDLおよび HDLを含む画分中の LDLを定量することができる。第 1工程で得られた小粒子 LDLおよび HDLを含む画分を試料とし、 LDL以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤の存在下でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールォキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することにより、試料中の LDL以外のリポタンパク質を消去し（ステップ A)、次いで試料中の残存 LDLを定量することができる（ステップ B )。この際、 LDL以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤としては、 HLB値が 13以上 15以下のポリアルキレンオキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルェ一テル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリォキシェチレンノニルフエニルエーテル等で HLB値が

13以上 15以下の化合物がある。ステップ Aで用いられる上記界面活性剤の濃度は、 0. l〜10g/L程度が好ましく、さらに好ましくは 0. 5〜5. Og/L程度である。過酸化水素を消去する方法としては、力タラ一ゼを作用させて水と酸素に分解する方法、及びペルォキシダーゼを用いてフエノール系又はァニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。ステップ Aの反応液中のコレステロールエステラーゼ濃度は 0. 2〜 1. OU/iL程度が好ましく、由来としてはシユードモナス属細菌から生成されるものが効果的である。また、コレステロールォキシダ一ゼの濃度は 0. 1〜0. 7U/mL程度が好ましく、細菌や酵母由来のものを用いることが好ましい。さらに、力夕ラーゼの濃度は 40〜 100U/iiL程度が好ましい。また、過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルォキシダーゼの濃度は 0. 4〜1. OU/mL が好ましく、フエノール系又はァニリン系水素供与体化合物の濃度としては 0. 4 〜0. 8腿 ol/L が好ましい。ステップ Bでは、被検試料中の残存コレステロールを定量する。これは、例えば、少なくとも LDLに作用する界面活性剤を加え、第 1 工程で加えたコレステロールエステラーゼ及びコレステロ一ルォキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。この際 LDLに作用する界面活性剤として HLB値が 1 1以上 13未満のポリアルキレンォキサイド誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルェ一テポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンォクチルフエニルエーテル、ポリォキシェチレンノニルフェニルエーテル等で HLB値が 1 1以上 13未満の化合物が挙げられる。ステップ Bのその他の好ましい反応条件は、第 1 工程における好ましい反応条件と同様である。

LDL を測定するための測定キットが市販されており、これらの市販の測定キットを利用して、 LDLを測定してもよい。市販のキットとしては、例えば LDL- EX (N)

(デン力生研）がある。

第 2工程で用いられる分画操作を要しない LDL中の中性脂肪測定方法としていくつかの方法（W000/43537号公報）等があるが、これらを好適に用いることがでさる。

第 2工程で用いられる抗ヒトアポ B抗体を作用させる方法としていくつかの方法（特許第 2638137号公報，特開平 02-64458号公報）等があるが、これらを好適に用いることができる。

本発明には、小粒子 LDLを含む画分を分離するための第 1工程を行うための試薬および分離した小粒子 LDLを測定するための試薬を含むキットも包含される。該キットは、例えば、上述の LDL測定試薬キットならびにポリア二オンおよび 2 価の陽イオン（またはポリア二オンと 2価の陽イオンを含む分離剤）等を含む。該キットはさらに遠心分離用チューブ、小粒子 LDL分離用フィルターを含んでいてもよい。また、該キットは、ポリア二オンおよび 2価の陽イオンに加えて 1価の陽イオンを含んでいてもよく、この場合ポリア二オン、 2価の陽イオンおよび 1価の陽イオンを含む分離剤としてこれら.の物質を含んでいてもよい。さらに、該キットは、ポリア二オンおよび 2価の陽イオンの代わりにポリエチレンダリコ —ルを含んでいてもよい。

以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

〔実施例 1〕

電気泳動法により小粒子 LDLを多く含むことが確認される検体及びそれ以外の LDLを多く含む検体を用いて第一工程の効果を求めた。血清に 60U/mLへパリンナトリウム及び 40讓 ol/L MnC l₂からなる分離液を添加し、で 15 分間反応させた。その後 18， 500gで 15分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販のディスク型ポリアクリルアミドゲルリポフォーを用いて反応性を比較した。分離液と反応前の血清は等量の生理食塩水にて希釈した後泳動した。図 1に本発明の第 1工程の方法を示す図を、図 2に結果を示す。図 2は正常な LDLのみが選択的に取り除かれていることを示している。図 2中、レーン No. 1は小粒子 LDL以外の LDLを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レーン No. 2は小粒子 LDLを多く含む検体の反応前の泳動結果を、レ一ン No. 3は小粒子 LDL以外の LDLを多く含む検体の反応後の泳動結果を、レーン No. 4は小粒子 LDLを多く含む検体の反応後の泳動結果を示す。

〔実施例 2〕

血清を試料とし、本発明法により小粒子 LDLを測定し、その測定値を超遠心法によって得られる値と比較した。この結果を図 3に示す。

すなわち、検体 100 Lに 300U/mL へパリンナトリウム及び 150腿 ol/L MgC l₂からなる分離液 100 z Lを添加し、 37°Cで 10分間反応させた。その後 18， 500gで 15 分間遠心分離を行い、上清を回収し、市販されているキット LDL-EX (N) (デン力生研社製）を使用して日立 7170型自動分析装置によって小粒子 LDL中のコレステロールを測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重 1. 040〜 1. 063の分画を回収し、コレステロールを測定して小粒子 LDL中コレステロール値とした。図 3に示すように本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 3〕

血清からなる検体 100 Lに平均分子量 5000の 1. 5 デキストラン硫酸ナ卜リウム及び 40mmol/L MgCl₂からなる分離液 I OO Lを添加し、 25°Cで 10分間反応させた。その後 18， 500gで 15分間遠心分離を行い、上清を回収し、抗ヒトアポ B抗体を用いた免疫比濁法（第一化学薬品アポ Bオート · Ν 「第一」を使用）によって小粒子 LDL中のアポ Β量を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重 1. 040〜1. 063の分画を回収し、アポ Βを測定して小粒子 LDL中アポ Β値とした。その結果を図 4に示す。図 4に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 4〕

実施例 2において、分離液を 0. 3%リンタングステン酸ナトリウム及び 7. 5删 ol/L CaCl ₂とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図 5に示す。図 5に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 5〕

実施例 2において、分離液を 40U/mLへパリンナトリゥム及び 30mmo l/L MnCl₂ とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図 6に示す。図 6に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。 .

〔実施例 6〕

実施例 2において、分離液を 500U/mLへパリンナトリゥム及び 140匪 ol/L MgCl₂ 及び 34匪 ol/L KC1とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図 7に示す。図 7に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 7〕

実施例 2において、分離液を 8% PEG (分子量 6， 000) とする以外は同様の試薬を用いて同様の操作を行い、本発明法による測定値と超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図 8に示す。図 8に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 8〕

血清からなる検体 I OO Lに 150U/mLへパリン Na及び 90匪 o l/L MgC l₂からなる分離液 lOO ^ Lを添加し、 37°Cで 10分間反応させた。その後 18， 500gで 15分間遠心分離を行い、上清を回収し、 LDL中中性脂肪測定試薬によって小粒子 LDL中の中性脂肪を測定した。超遠心法は血清と比重液を混合後、遠心を行い比重 1. 040 〜1. 063の分画を回収し、中性脂肪を測定して小粒子 LDL中中性脂肪値とした。その結果を図 9に示す。図 9に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。

〔実施例 9〕

血清からなる検体 I OO Lに 150U/niLへパリン Na及び 90丽 ol/L MgCl₂からなる分離液を添加し、 37°Cで 10分間反応させた。その後遠心タイプのフィル夕 —濾過（MILLIP0RE社の Ul traf ree- MC (0. l ^ m F i l ter Uni t) を使用）を用いて 10, 000gで 1分間遠心分離を行い、ろ液を回収後、小粒子 LDL中のコレステロ一ルを測定し超遠心法によって得られる値と比較した。その結果を図 1 0に示す。図 1 0に示すように、実施例 2と同様に本発明法による結果は超遠心法による結果と良好な相関性を示した。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明によれば簡便な操作で小粒子 LDLをそれ以外の LDLと分離することができ、小粒子 LDL中のコレステロールまたは中性脂肪またはアポ Bを分別測定することができるため臨床上極めて有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白をそれ以外の低比童リポ蛋白と分離する第 1工程と、分離した小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロール、中性脂肪または蛋白質を測定する第 2工程から成る、被検試料中の小粒子低比重リポ蛋白の定量方法。

2 . 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離にポリア二オンおよび 2価の陽イオンを用いることを特徴とする請求項 1記載の方法。

3 . 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に、さらに 1価の陽イオンを用いることを特徵とする請求項 1または 2 記載の方法。

4 . 前記第 1工程で使用されるポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徴とする請求項 2または 3に記載の方法。

5 . 前記第 1工程で使用される 2価の陽イオンが Mn²⁺、 Mg²⁺および Ca²⁺からなる群から選択される 2価の陽イオンであることを特徴とする請求項 2から 4のいずれか 1項に記載の方法。

6 . 前記第 1工程で使用される 1価の陽イオンが Na+、 K+および Li⁺からなる群から選択される 1価の陽イオンであることを特徴とする請求項 3から 5のいずれか 1項に記載の方法。

7 . 被検体試料にポリア二オンを添加したときのポリア二オンの最終濃度が、へパリンの場合 10〜250U/mL、デキストラン硫酸の場合 0. 02〜1. 25%、リンタンダステン酸の場合 0. 02〜1. 25%である請求項 4から 6のいずれか 1項に記載の方法。

8 . 被検体試料に 2価の陽イオンを添加したときの 2価の陽イオンの最終濃度が、 Mn²⁺の場合 2. 5〜腿 ol/L、 Mg²⁺の場合 2. 5〜 125mniol/L、 Ca²⁺の場合 1〜 75miol/Lである請求項 5から 7のいずれか 1項に記載の方法。

9 . 被検体試料に 1価の陽イオンを添加したときの 1価の陽ィォンの最終濃度が、 0〜50腿 ol/Lである請求項 6から 8のいずれか 1項に記載の方法。

1 0 . 前記第 1工程において小粒子低比重リポ蛋白とそれ以外の低比重リポ蛋白の分離に PEGを用いることを特徴とする請求項 1記載の方法。

1 1 . 被検体試料に PEGを添加したときの PEGの最終濃度が、 2〜5%である請求項 1 0記載の方法。

1 2 . 前記第 2工程のコレステロール測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中コレステロールの定量試薬を用いることを特徵とする請求項 1から 1 1 のいずれか 1項に記載の方法。

1 3 . 前記第 2工程の中性脂肪測定が、分画操作を要しない低比重リポ蛋白中中性脂肪の定量試薬を用いることを特徴とする請求項 1から 1 1のいずれか 1 項に記載の方法。

1 4 . 前記第 2工程の蛋白測定が、抗ヒ卜アポ蛋白 B抗体を用いることを特徴とする請求項 1から 1 1のいずれか 1項に記載の方法。

1 5 . 被検体試料にポリア二オンおよび 2価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

1 6 . 被検体試料に、さらに 1価の陽イオンを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、請求項 1 5記載の方法。

1 7 . ポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸およびデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徴とする請求項 1 5または 1 6に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

1 8 . 2価の陽イオンが Mn²⁺、 Mg²⁺および Ca²⁺からなる群から選択される 2価の陽イオンであることを特徴とする請求項 1 5から 1 7のいずれか 1項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

1 9 . 1価の陽イオンが Na⁺、 K+および Li⁺からなる群から選択される 1価の陽イオンであることを特徴とする請求項 1 5から 1 8のいずれか 1項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 0 . 被検体試料にポリア二オンを添加したときのポリア二オンの最終濃度が、へパリンの場合 10〜250U/mL、デキストラン硫酸の場合 0. 02〜1. 25 、リン夕ングステン酸の場合 0. 02〜1. 25%である請求項 1 7から 1 9のいずれか 1項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 1 - 被検体試料に 2価の陽イオンを添加したときの 2価の陽イオンの最終濃度が、 Mn²⁺の場合 2. 5〜35mmol/L、 Mg²⁺の場合 2. 5〜 125匪 o l/L、 Ca²⁺の場合 1〜 75mniol/L である請求項 1 8から 2 0のいずれか 1項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 2 . 被検体試料に 1価の陽イオンを添加したときの 1価の陽イオンの最終濃度が、 0〜50mmol/L である請求項 1 9から 2 1のいずれか 1項に記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 3 . 被検体試料に PEGを添加し、小粒子低比重リポ蛋白以外の低比重リポ蛋白を沈殿させることを含む、被検体試料から小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 4 . 被検体試料に PEGを添加したときの PEGの最終濃度が 2〜5%である請求項 2 3記載の小粒子低比重リポ蛋白を分離する方法。

2 5 . ポリア二オンおよび 2価の陽イオンを含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。

2 6 . 分離剤が、さらに 1価の陽イオンを含む請求項 2 5記載の小粒子低比重リポ蛋白測定用キッ卜。

2 7 . PEG を含む分離剤および低比重リポ蛋白測定試薬を含む、小粒子低比重リポ蛋白中のコレステロールまたは中性脂肪または蛋白質を測定することによる小粒子低比重リポ蛋白測定用キット。

2 8 . ポリア二オンがへパリン、リンタングステン酸おょぴデキストラン硫酸からなる群から選択されるポリア二オンであることを特徴とする請求項 2 5または 2 6記載のキット。

2 9 . 2価の陽イオンが Mn²⁺、 Mg²⁺および Ca²⁺からなる群から選択される 2価の陽イオンであり， 1価の陽イオンが Na⁺、 K+および U+からなる群から選択される 1価の陽イオンであることを特徴とする請求項 2 6または 2 8に記載のキッ卜。