JP4593026B2 - SmalldenseLDLの測定方法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、検体中のSmall dense LDLのみを特異的且つ高感度に測定し得るSmall dense LDLの測定方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
血液中における脂質は、リポ蛋白の形で存在し、生体内組織間で輸送されている。リポ蛋白は、その比重からカイロミクロン、超低比重リポ蛋白(VLDL)、低比重リポ蛋白(LDL)、高比重リポ蛋白(HDL)に大別される。
【0003】
各リポ蛋白の機能としては、カイロミクロンは、腸管から吸収した中性脂肪を肝に運搬し、肝で生成されたVLDLは、中性脂肪を末梢組織に運搬しながらLDLへと変化し、コレステロールを多く含むLDLは、末梢組織において吸収される。
これに対し、肝で生成されたHDLは、末梢組織のコレステロールを逆に肝へと運搬する役目を果たし、末梢組織への脂質蓄積を促す低比重リポ蛋白群とは明らかに異なった機能を有する。
【0004】
低比重リポ蛋白群のLDL、VLDLは、起源は一であるが、生体内の代謝機能の変化または疾病によりいずれかまたは両者の血中濃度の上昇が認められ、動脈硬化性疾患との関連が指摘されている。
【0005】
従来、リポ蛋白の分画法としては、超遠心法と電気泳動法以外には有効な方法は無かったが、1972年にScholnickらによりヘパリンおよび塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよび塩化ナトリウムによりカイロミクロン+VLDL+LDLを濁らせる試薬と、カイロミクロン+VLDLを濁らせる試薬と、カイロミクロンだけを濁らせる試薬とが調製可能であることが報告されている(Fluids,19:289,1972)。
【0006】
その後、小出らによりヘパリンと、塩化カルシウムおよび塩化ナトリウムとを適当な濃度を選択することにより同様の試薬が調製できるだけでなく、その濁りの差によりLDL、VLDLが定量可能であることが報告されている(臨床病理、臨時増刊特集第21号:82,1975)。
【0007】
本発明者も、動物由来のヘパリンに代えて合成可能な硫酸デキストランを用い、この硫酸デキストランと、一価のカチオンおよび/または二価のカチオンとの量を変えることによりリポ蛋白分画を段階的に混濁させる血清リポ蛋白分画の測定法を提案している(特開平7−294532号公報)。
【0008】
ところで、LDLは、比重1.006〜1.063の幅広いリポ蛋白の集合であり、粒子サイズの異なる亜分画より構成される。このうち比重1.044〜1.060の亜分画はSmall dense LDLと呼ばれている(Progress in Medicine 19:1854-1859,1999)。また、本出願においては、比重1.006〜1.044の亜分画をLarge LDLと呼ぶことにする。
【0009】
LDL亜分画のうち、小型で比重の重いSmall dense LDLが主として出現しているヒトは、Large LDLが出現しているヒトに比べて冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている2型糖尿病が高頻度で出現していることが報告されている(JAMA 260:1917-1921,1988)。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
このようにSmall dense LDLは、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている2型糖尿病の鋭敏なマーカーとなり得るため、それらの診断法の確立が強く期待されている。
【0011】
従って本発明は、このような従来の課題に着目してなされたものであって、LDLのうち、Small dense LDLのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense LDLの測定方法を提供することを目的とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定の濃度の1価のカチオンおよび/または2価のカチオンと、ポリアニオンとの存在下で、Small dense LDLを特異的且つ高感度に測定できることを見出し、本発明を完成した。
【0013】
本発明のSmall dense LDLの測定方法は、0を超えて310mmol/Lの範囲にある1価のカチオンおよび/または0.1〜500mmol/Lの範囲にある2価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させることを特徴とする。
以下、本発明について更に詳細に説明する。
【0014】
1価のカチオンは、イオン強度の調整に用いられるため、イオンの活量係数の高い化合物から選択することが好ましい。このような1価のカチオンとしては、Na+、K+、およびLi+から成る群から選択される少なくとも1種が挙げられる。
【0015】
この1価のカチオンの濃度は、0を超えて310mmol/Lの範囲、好ましくは、150〜220mmol/Lの範囲である。1価のカチオンの濃度が310mmol/Lを超えると、Small dense LDL分別定量が困難になる。また、1価のカチオン濃度は使用するポリアニオンの種類や濃度によりその使用量が変動するので、至適濃度を限定することはできない。
【0016】
2価のカチオンは、公知のカチオンの中から適宜選択すれば良い。その具体例としては、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、およびSr2+から成る群から選択される少なくとも1種が挙げられる。
【0017】
この2価のカチオンの濃度は、0.1〜500mmol/Lの範囲、好ましくは、1〜200mmol/Lの範囲である。2価のカチオンの濃度が0.1mmol/L未満になると、十分な感度が得られない。一方、2価のカチオン濃度は、一定濃度以上あれば良く、上限濃度は規定されないが、溶解度を考慮すると、濃度は500mmol/L以下が好ましい。また、2価のカチオン濃度は、使用するポリアニオンの種類や濃度によりその使用量が変動するので、その至適濃度を限定することはできない。
【0018】
本発明に使用されるポリアニオンも、公知のポリアニオンの中から適宜選択することができる。その具体例としては、硫酸多糖類、硫酸アミロペクチン、およびリンタングステン酸から成る群から選択される少なくとも1種が挙げられる。
【0019】
上記硫酸多糖類としては、硫酸デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸が挙げられ、その中でも、特に原料入手の容易さや価格の面から硫酸デキストランが好ましい。その分子量は、5,000〜50,000の範囲内が好ましい。
【0020】
本発明の実施の態様としては、所定量の一価のカチオン、好ましくはナトリウムイオンを含有する第1試薬と検体を混合後、一回目の測定を行い、次いで第2試薬で一価のカチオンの濃度を減少させて、2回目の測定を行い、その吸光度の増加からSmall dense LDLの量を求める方法が挙げられる。
具体的には、一価のカチオンを含む第1試薬でカイロミクロン+VLDL+Large LDLを混濁させ、次いで第2試薬で一価のカチオンを減少させて、Small dense LDLを混濁させ、吸光度の増加としてSmall dense LDLを測定する。
【0021】
本発明の別の態様としては、第1試薬でカイロミクロン+VLDL+Large LDL+Small dense LDLを混濁させ、次いで第2試薬で一価のカチオン濃度を増加させることにより、Small dense LDLのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense LDLを特異的に測定する方法が挙げられる。
【0022】
本発明におけるSmall dense LDLの測定には、透過光による比濁法や散乱光による比ろう法があり、いずれも広く普及している。本発明に係るSmall dense LDLとポリアニオンとは、均質な混濁を形成するため、いずれの測定法を用いても正確な測定値が得られる。
【0023】
【発明の効果】
本発明は、Small dense LDLのみを特異的且つ高感度に測定し得る検体中のSmall dense LDLの測定方法を提供する。従って、本発明の測定法によれば、冠状動脈硬化性心疾患やインスリン抵抗性を生じている2型糖尿病を精度良く診断することができる。
【0024】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき更に詳細に説明するが、本発明はこれによって限定されるものではない。
【0025】
実施例1
(1)各リポ蛋白の分離
新生化学実験講座 脂質I(1993)に基づいて、超遠心法によりヒト血清を下記のような3つの各リポ蛋白質に分画したものを試料として実験に用いた。
【0026】
(2)試薬組成
硫酸デキストラン(特開平7−294532の実施例1に記載のものと同じ)0.02w/v%、塩化カルシウム80mmol/L、アジ化ナトリウム7.7mmol/Lの溶液に、塩化ナトリウムを溶解してその濃度が0〜450mmol/Lとなるように31種類の試薬を調製した。
【0027】
(3)測定法
日立7170型自動分析装置を用いて、上記のように塩化ナトリウム濃度が異なる31種類の試薬をR1にセットし、分画した各リポ蛋白と血清を試料として吸光度を測定した。すなわち、超遠心により分画した血清5μLを反応セルに分注し、次いで試薬200μLを分注撹拌し37℃で反応させて、10分後にその吸光度を主波長660nmで測定した。
【0028】
(4)結果
その結果を図1に示す。図1に示すように、Large LDLとSmall dense LDLとは、塩化ナトリウム濃度により濁度パターンが異なっている。すなわち、Large LDLは、塩化ナトリウム濃度0〜280mmol/Lで一定の濁度を示すが、これを超える濃度では、吸光度が低下し、350mmol/Lで澄明化する。
これに対して、Small dense LDLは、塩化ナトリウム濃度200mmol/Lのとき最も強い濁度を示し、これを超える濃度では、吸光度が徐々に低下し、300mmol/Lで澄明になる。一方、カイロミクロン+VLDLは、塩化ナトリウム濃度0〜325mmol/Lの範囲で一定の濁度を示す。また、データは省略したが、HDLはこの濃度範囲で混濁を生じない。
従って塩化ナトリウム濃度200mmol/Lのときの濁度は、カイロミクロン+VLDL+Large LDL+Small dense LDLの合計量の濁度を示す。これに対し、塩化ナトリウム280mmol/Lのときの濁度は、カイロミクロン+VLDL+Large LDLの濁度の合計量を示す。従ってSmall dense LDL量は、この2つの組成における吸光度の差として測定することができる。
【0029】
実施例2
実施例1で示したように、塩化ナトリウム濃度が異なる2種類の試薬を用いて濁度を測定し、この2つの試薬の濁度の差からSmall dense LDL量を測定することが可能である。
しかし、この方法では2つの試薬を自動分析装置の2つのチャンネルにセットし、1検体を2回測定するため、つまり2つのチャンネルで1項目を測定するため効率が悪い。
本発明者らは、更に考えを進めて、1チャンネルで測定できる方法を考案した。通常、自動分析装置は、1つのチャンネルに第1試薬と第2試薬の2試薬をセットできるので、すなわち、第1試薬と第2試薬で塩化ナトリウム濃度を変化させることにより、自動分析装置の1チャンネルで測定できることを見出した。
この方法は、臨床検査に必要な試薬チャンネルの使用が少なく、かつ2チャンネルを使用しないため、演算が容易である。
【0030】
すなわち、塩化ナトリウム濃度280mmol/Lを含む第1試薬と試料を混和後1回目の測光を行い、次いで第2試薬により塩化ナトリウム濃度を200mmol/Lに希釈して2回目の測光を行い、液量補正後その吸光度の増加量からSmall dense LDL量を求める方法である。つまり第1試薬でカイロミクロン+VLDL+Large LDLを混濁させ、次いで第2試薬により塩化ナトリウム濃度を減少させて、Small dense LDLを混濁させ、すなわち吸光度の増加としてSmall dense LDLを測定する方法である(以下、1チャンネル法と呼ぶ)。
【0031】
逆に、第1試薬でカイロミクロン+VLDL+Large LDL+Small dense LDLを混濁させ、第2試薬で塩化ナトリウム濃度を増加させることにより、Small dense LDLのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense LDLを特異的に測定することも可能である。
【0032】
実施例3
(1)公知の方法
文献(動脈硬化 Vol.25 No.1-2:67-70,1997)によれば、LDL粒子サイズがLipophor System(製造元:Quantimetrix,CALIFORNIA,U.S.A. 輸入元:株式会社常光)により、簡便に測定でき、LDL-MI値(相対移動度)が0.40以上の場合、Small dense LDLが存在することが示されている。そこで、本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるLDL-MI値との相関性について検討した。
【0033】
(2)本発明による測定
以下の試薬組成に基づいて1チャンネル法によりSmall dense LDLを測定した。
試薬組成
第1試薬
硫酸デキストラン 0.02w/v%
塩化カルシウム 80mmol/L
アジ化ナトリウム 7.7mmol/L
塩化ナトリウム 280mmol/L
第2試薬
硫酸デキストラン 0.02w/v%
塩化カルシウム 80mmol/L
アジ化ナトリウム 7.7mmol/L
塩化ナトリウム 60mmol/L
【0034】
(3)測定法
日立7170型自動分析装置のR1に第1試薬をセットし、R3に第2試薬をセットし、ヒト血清30例を測定した。具体的には、まず検体7μLを反応セルに分注し、次に第1試薬180μLを分注撹拌して37℃で5分間反応させ、更に第2試薬90μLを分注撹拌して5分間反応させた後、その濁度を主波長660nmで測定した。
【0035】
(4)結果
上記ヒト血清をLipophor Systemにより電気泳動を行い、動脈硬化Vol.25 No1-2:67-70,1997に従って、LDL−MI値を算出した。その結果を図2に示す。図2に示すように、本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるLDL−MI値とは、良好な相関性を示すことが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図1】各リポ蛋白と血清の濁度を測定した結果を示すグラフである。
【図2】本発明の測定法による測定値とLipophor SystemによるLDL−MI値との相関性を示すグラフである。
Claims (6)
- 0を超えて310mmol/Lの範囲にある1価のカチオンおよび/または0.1〜500mmol/Lの範囲にある2価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させる検体中のSmall dense LDLの測定方法であって、第1試薬でカイロミクロン+VLDL+LargeLDLを混濁させ、次いで第2試薬で1価のカチオン濃度を減少させて、Small dense LDLを混濁させ、吸光度の増加としてSmall dense LDLを測定する方法。
- 0を超えて310mmol/Lの範囲にある1価のカチオンおよび/または0.1〜500mmol/Lの範囲にある2価のカチオンと、ポリアニオンとを存在させる検体中のSmall dense LDLの測定方法であって、第1試薬でカイロミクロン+VLDL+Large LDL+Small dense LDLを混濁させ、第2試薬で1価のカチオン濃度を増加させてSmall dense LDLのみを溶解させて、吸光度の減少としてSmall dense LDLを測定する方法。
- 1価のカチオンがNa+、K+、およびLi+から成る群から選択される少なくとも1種である請求項1又は2記載の測定方法。
- 2価のカチオンがCa2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、およびSr2+から成る群から選択される少なくとも1種である請求項1又は2記載の測定方法。
- ポリアニオンが硫酸多糖類、硫酸アミロペクチン、およびリンタングステン酸から成る群から選択される少なくとも1種である請求項1又は2記載の測定方法。
- 硫酸多糖類が硫酸デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン硫酸である請求項5記載の測定方法。
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