JP2001066307A - 血液中の変性リポ蛋白の検出方法 - Google Patents
血液中の変性リポ蛋白の検出方法Info
- Publication number
- JP2001066307A JP2001066307A JP24444099A JP24444099A JP2001066307A JP 2001066307 A JP2001066307 A JP 2001066307A JP 24444099 A JP24444099 A JP 24444099A JP 24444099 A JP24444099 A JP 24444099A JP 2001066307 A JP2001066307 A JP 2001066307A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipoprotein
- antibody
- denatured
- human
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 動脈硬化症やアルツハイマー病の発症・進展
と深く関わる、各種変性リポ蛋白の新規な検出方法を提
供する。 【解決手段】 LDL、HDL、VLDL、IDL、Lp（a）、LDL（s
mall，dense LDL）などのリポ蛋白が変性されてなる各
種変性リポ蛋白と、他の血漿蛋白との複合体を測定対象
にして血液中の変性リポ蛋白を検出する。
と深く関わる、各種変性リポ蛋白の新規な検出方法を提
供する。 【解決手段】 LDL、HDL、VLDL、IDL、Lp（a）、LDL（s
mall，dense LDL）などのリポ蛋白が変性されてなる各
種変性リポ蛋白と、他の血漿蛋白との複合体を測定対象
にして血液中の変性リポ蛋白を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、血液中に存在するLD
L、HDL、VLDL、IDL、Lp（a）、Small,denseLDLなどのリ
ポ蛋白の変性（特に酸化変性）リポ蛋白がα１−アンチ
トリプシン、フィブリノーゲン又はフィブリン（各々の
分解産物を含む）、IgAもしくはフィブロネクチンと複
合体を形成して存在することを見出すとともに、この点
に着目した新規な変性リポ蛋白の検出方法に関するもの
で、動脈硬化性病変やアルツハイマー病などの早期診断
や治療上での薬効評価などに寄与せんとするものであ
る。
L、HDL、VLDL、IDL、Lp（a）、Small,denseLDLなどのリ
ポ蛋白の変性（特に酸化変性）リポ蛋白がα１−アンチ
トリプシン、フィブリノーゲン又はフィブリン（各々の
分解産物を含む）、IgAもしくはフィブロネクチンと複
合体を形成して存在することを見出すとともに、この点
に着目した新規な変性リポ蛋白の検出方法に関するもの
で、動脈硬化性病変やアルツハイマー病などの早期診断
や治療上での薬効評価などに寄与せんとするものであ
る。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】動脈硬化症は大動脈、
冠状動脈、脳動脈および頚動脈に多く発生し、心筋梗
塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。また、最近で
はアルツハイマー病も動脈硬化症と関係性の大きい疾患
であることがわかってきた。従来、血液中で、これらの
生体内での動脈硬化症の状態を直接反映する測定対象が
なく、血清中あるいは血漿中のLDL、Lp（a）、レムナン
トリポ蛋白、Small，dense LDL、酸化LDLなど、LDLを主
体とした血管壁脂質蓄積と関わりの深い、動脈硬化性病
変に関わるリポ蛋白として測定されてきた。なかんず
く、酸化LDLと粥状動脈硬化病変の進展との関連性がス
タインバーグ（Steinberg，D．et al. Engl．Med．32
0：915，1989）により、一方、Rossらが提唱した傷害反
応仮説（Ross，R．Nature．362：801，1993）によって
指摘されて以来、動脈硬化の進展における酸化LDLの関
与が注目されてきた。
冠状動脈、脳動脈および頚動脈に多く発生し、心筋梗
塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。また、最近で
はアルツハイマー病も動脈硬化症と関係性の大きい疾患
であることがわかってきた。従来、血液中で、これらの
生体内での動脈硬化症の状態を直接反映する測定対象が
なく、血清中あるいは血漿中のLDL、Lp（a）、レムナン
トリポ蛋白、Small，dense LDL、酸化LDLなど、LDLを主
体とした血管壁脂質蓄積と関わりの深い、動脈硬化性病
変に関わるリポ蛋白として測定されてきた。なかんず
く、酸化LDLと粥状動脈硬化病変の進展との関連性がス
タインバーグ（Steinberg，D．et al. Engl．Med．32
0：915，1989）により、一方、Rossらが提唱した傷害反
応仮説（Ross，R．Nature．362：801，1993）によって
指摘されて以来、動脈硬化の進展における酸化LDLの関
与が注目されてきた。
【０００３】しかし、最近の研究では酸化LDLのみなら
ず酸化HDL（Nakajima，T et al.Biochem Biophys Biopy
s Res Conmmun．217：407，1995）が動脈硬化症患部に
局在する事実、大村らは（大村寛敏，他．動脈硬化．2
5：No4,126，1997）冠動脈硬化症において、血清HDL中
の過酸化脂質量が増大しているのを認め、動脈硬化の形
成にHDLの酸化変性も関与していることを報告してい
る。同様に、楠実らは（楠美嘉晃，他．動脈硬化．24：
327，1996）動脈内膜に酸化等による変性Lp（a）が沈着
しているのを認め、Lp（a）の動脈硬化進展機序に変性L
p（a）の関与の可能性を示唆している。また最近の疫学
調査では、アルツハイマー病の発症の背景には動脈硬化
があることが指摘されており（Kalaria,RN.Pharmacol＆
Ther.72：193，1996）、リポ蛋白の酸化変性やapoEの表
現型と動脈硬化症やアルツハイマー病の発症との関連が
注目されている（Prem Kumar，DRD.et al.Am J Patho
l.148：2083，1996）。
ず酸化HDL（Nakajima，T et al.Biochem Biophys Biopy
s Res Conmmun．217：407，1995）が動脈硬化症患部に
局在する事実、大村らは（大村寛敏，他．動脈硬化．2
5：No4,126，1997）冠動脈硬化症において、血清HDL中
の過酸化脂質量が増大しているのを認め、動脈硬化の形
成にHDLの酸化変性も関与していることを報告してい
る。同様に、楠実らは（楠美嘉晃，他．動脈硬化．24：
327，1996）動脈内膜に酸化等による変性Lp（a）が沈着
しているのを認め、Lp（a）の動脈硬化進展機序に変性L
p（a）の関与の可能性を示唆している。また最近の疫学
調査では、アルツハイマー病の発症の背景には動脈硬化
があることが指摘されており（Kalaria,RN.Pharmacol＆
Ther.72：193，1996）、リポ蛋白の酸化変性やapoEの表
現型と動脈硬化症やアルツハイマー病の発症との関連が
注目されている（Prem Kumar，DRD.et al.Am J Patho
l.148：2083，1996）。
【０００４】即ち、活性酸素によりVLDLが酸化修飾され
てヘパリン結合能を失い、難溶性の沈澱を形成すること
によって脂質過酸化物が血管や神経組織に蓄積し、細胞
を傷害することが予想されている（平村和行，他.Jpn J
Electroph.42：27，1998）。 最近までは、動脈硬化
の発症進展に関して、LDLに関する生化学的、分子生物
学的研究の進歩が大きく、酸化LDLがatherogenicityの
主役であることが強調されすぎているきらいがある。し
かし、近年の研究の成果として、上述のごとく動脈硬化
症やアルツハイマー病の発症・進展への関与物質とし
て、LDLのみでなく、HDL、Lp（a）、VLDLなど多種の酸
化変性リポ蛋白が含まれることが明らかとなった。
てヘパリン結合能を失い、難溶性の沈澱を形成すること
によって脂質過酸化物が血管や神経組織に蓄積し、細胞
を傷害することが予想されている（平村和行，他.Jpn J
Electroph.42：27，1998）。 最近までは、動脈硬化
の発症進展に関して、LDLに関する生化学的、分子生物
学的研究の進歩が大きく、酸化LDLがatherogenicityの
主役であることが強調されすぎているきらいがある。し
かし、近年の研究の成果として、上述のごとく動脈硬化
症やアルツハイマー病の発症・進展への関与物質とし
て、LDLのみでなく、HDL、Lp（a）、VLDLなど多種の酸
化変性リポ蛋白が含まれることが明らかとなった。
【０００５】さらに、各リポ蛋白の被酸化性に大きな差
があり、HDL、Lp（a）、Small，dense LDLは酸化され易
く、粒子径の大きなLDLやVLDLは酸化されにくい特性を
有することもわかってきた。また、LDLに分類されるsma
ll，dense LDLは糖尿病罹患者に多く出現するLDLであ
り、動脈硬化症全てを反映できないことも明かとなっ
た。そこで、LDLのみならず、特に被酸化性の強いHDLや
Lp(a）の酸化変性体にも注目する必要が生じてきた。
があり、HDL、Lp（a）、Small，dense LDLは酸化され易
く、粒子径の大きなLDLやVLDLは酸化されにくい特性を
有することもわかってきた。また、LDLに分類されるsma
ll，dense LDLは糖尿病罹患者に多く出現するLDLであ
り、動脈硬化症全てを反映できないことも明かとなっ
た。そこで、LDLのみならず、特に被酸化性の強いHDLや
Lp(a）の酸化変性体にも注目する必要が生じてきた。
【０００６】しかし、現状ではこれら各種リポ蛋白の変
性体を血中で安易に測定する方法が存在しなかった。し
たがって、本研究は、動脈硬化症やアルツハイマー病の
発症・進展と深く関わる、各種変性リポ蛋白の新規な検
出方法を提供することを課題とする。
性体を血中で安易に測定する方法が存在しなかった。し
たがって、本研究は、動脈硬化症やアルツハイマー病の
発症・進展と深く関わる、各種変性リポ蛋白の新規な検
出方法を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手投】生体の主要な構成成分と
して蛋白質、脂質、糖質、核酸があげられるが、最も酸
化されやすいのは脂質であり、酸素添加反応が起こり、
いわゆる過酸化脂質が生成する。脂質が酸化されやすい
のは多くの脂質がリノール酸やアラキドン酸のような高
度不飽和脂肪酸のエステルとなっているためである。リ
ポ蛋白は脂質と蛋白質から構成されており、リポ蛋白が
酸化された場合には、脂質、蛋白質共に酸化変性を受け
る。この生体脂質が非酵素的に酸化される引き金として
は、活性酸素が考えられている。この過酸化脂質の測定
は順相HPLC法などの分析化学的手法が用いられ、健常人
の生体内でも確実に脂質の非酵素的酸化が起きているこ
とが証明されている（山本順寛，他.蛋白質・核酸・酵
素・44：1253，1999）。
して蛋白質、脂質、糖質、核酸があげられるが、最も酸
化されやすいのは脂質であり、酸素添加反応が起こり、
いわゆる過酸化脂質が生成する。脂質が酸化されやすい
のは多くの脂質がリノール酸やアラキドン酸のような高
度不飽和脂肪酸のエステルとなっているためである。リ
ポ蛋白は脂質と蛋白質から構成されており、リポ蛋白が
酸化された場合には、脂質、蛋白質共に酸化変性を受け
る。この生体脂質が非酵素的に酸化される引き金として
は、活性酸素が考えられている。この過酸化脂質の測定
は順相HPLC法などの分析化学的手法が用いられ、健常人
の生体内でも確実に脂質の非酵素的酸化が起きているこ
とが証明されている（山本順寛，他.蛋白質・核酸・酵
素・44：1253，1999）。
【０００８】上述のごとく現状では、血液中の総過酸化
脂質量の把握は可能であるが、リポ蛋白個別の酸化変性
度を知る方法は現在のところ存在せず、LDLの酸化変性
体が血液中に存在することの実証は、本発明者らの特願
平8-317162号による方法によって初めて成された。さら
に本発明者は、特願平11-109001号、特願平11-207913号
に開示した手法によっても血液中の酸化変性LDLの検出
が可能であることを発見した。
脂質量の把握は可能であるが、リポ蛋白個別の酸化変性
度を知る方法は現在のところ存在せず、LDLの酸化変性
体が血液中に存在することの実証は、本発明者らの特願
平8-317162号による方法によって初めて成された。さら
に本発明者は、特願平11-109001号、特願平11-207913号
に開示した手法によっても血液中の酸化変性LDLの検出
が可能であることを発見した。
【０００９】そして、その後、更なる研究と検討を繰り
返した結果、循環血液中にLDL以外のリポ蛋白の酸化変
性体が存在する事実を発見して本発明に至った。即ち、
特願平8-317162号、特願平11-109001号および、特願平1
1-207913号の手法を発展させて、血液中の各種リポ蛋白
の変性体を個別に測定可能な検出方法を確立して本発明
を完成させたものである。
返した結果、循環血液中にLDL以外のリポ蛋白の酸化変
性体が存在する事実を発見して本発明に至った。即ち、
特願平8-317162号、特願平11-109001号および、特願平1
1-207913号の手法を発展させて、血液中の各種リポ蛋白
の変性体を個別に測定可能な検出方法を確立して本発明
を完成させたものである。
【００１０】より具体的に説明すると、本発明は、各種
リポ蛋白（カイロミクロン、VLDL、IDL、LDL、Lp(a)、H
DL）が酸化変性を受けると血漿蛋白（特にα１−アンチ
トリプシンやフィブリノーゲン又はフィブリン（各々の
分解産物を含む）、IgA、フィブロネクチンなど）と複
合体を形成し、且つ、いずれの複合体も動脈硬化症疾患
と関連性が高い点を見出して完成されたものである。
リポ蛋白（カイロミクロン、VLDL、IDL、LDL、Lp(a)、H
DL）が酸化変性を受けると血漿蛋白（特にα１−アンチ
トリプシンやフィブリノーゲン又はフィブリン（各々の
分解産物を含む）、IgA、フィブロネクチンなど）と複
合体を形成し、且つ、いずれの複合体も動脈硬化症疾患
と関連性が高い点を見出して完成されたものである。
【００１１】なお典型的には、本発明は、各種酸化変性
リポ蛋白とα１−アンチトリプシンの複合体を特異的に
認識する抗体、各種酸化変性リポ蛋白とIgAの複合体を
認識する特異抗体、各種酸化変性リポ蛋白とフィブロネ
クチンの複合体を認識する特異抗体、もしくは、抗ヒト
フィブリノーゲン抗体を固相抗体として用い、各リポ蛋
白の酸化変性体と反応させた後に、酵素をはじめとする
標識物をラベルした各リポ蛋白を構成するアポ蛋白に対
する抗体を反応させて、血液中の酸化変性リポ蛋白を分
別測定する検出方法である。
リポ蛋白とα１−アンチトリプシンの複合体を特異的に
認識する抗体、各種酸化変性リポ蛋白とIgAの複合体を
認識する特異抗体、各種酸化変性リポ蛋白とフィブロネ
クチンの複合体を認識する特異抗体、もしくは、抗ヒト
フィブリノーゲン抗体を固相抗体として用い、各リポ蛋
白の酸化変性体と反応させた後に、酵素をはじめとする
標識物をラベルした各リポ蛋白を構成するアポ蛋白に対
する抗体を反応させて、血液中の酸化変性リポ蛋白を分
別測定する検出方法である。
【００１２】この場合、血液中のリポ蛋白を超遠心法や
化学物質を用いた沈澱法で分画したものを試料とするこ
とも、血清や血漿をそのまま試料として測定することも
可能である。リポ蛋白を分画して試料とする場合は、固
相抗体として抗ヒトIgA、抗ヒトα１−アンチトリプシ
ン、抗ヒトフィブロネクチン抗体が使える。この検出方
法によれば、生体内でフリーラジカル連鎖酸化反応が進
行している状況を、各リポ蛋白の被酸化の状態として
（HDL、Lp(a)、Small，dense LDLは特に易酸化性であ
る）把握することが可能となる。また、この検出の臨床
応用としては、動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診
断や、動脈硬化症治療薬投与時の薬効評価などに好適で
ある。
化学物質を用いた沈澱法で分画したものを試料とするこ
とも、血清や血漿をそのまま試料として測定することも
可能である。リポ蛋白を分画して試料とする場合は、固
相抗体として抗ヒトIgA、抗ヒトα１−アンチトリプシ
ン、抗ヒトフィブロネクチン抗体が使える。この検出方
法によれば、生体内でフリーラジカル連鎖酸化反応が進
行している状況を、各リポ蛋白の被酸化の状態として
（HDL、Lp(a)、Small，dense LDLは特に易酸化性であ
る）把握することが可能となる。また、この検出の臨床
応用としては、動脈硬化症やアルツハイマー病の早期診
断や、動脈硬化症治療薬投与時の薬効評価などに好適で
ある。
【００１３】
【実施例】以下、本発明について具体的に説明する。 ［血清中あるいは血漿中の変性LDL／α１−アンチトリ
プシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し４
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで３回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μl／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well文注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性LDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性LDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
プシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し４
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで３回洗浄する。 3.マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μl／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well文注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性LDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性LDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
【００１４】［血清中あるいは血漿中の変性Lp（a）／
α１−アンチトリプシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-Lp（a）ポリクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性Lp（a）／α１−アンチトリ
プシン複合体により求めた検量線から試料中の変性Lp
（a）／α１−アンチトリプシン複合体濃度を算出す
る。
α１−アンチトリプシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-Lp（a）ポリクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性Lp（a）／α１−アンチトリ
プシン複合体により求めた検量線から試料中の変性Lp
（a）／α１−アンチトリプシン複合体濃度を算出す
る。
【００１５】［血清中あるいは血漿中の変性HDL／α１
−アンチトリプシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoAlポリクローナル抗体
を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15. 人工的に調整した変性HDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性HDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
−アンチトリプシン複合体の測定］ 1．IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，
0.15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイク
ロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin含有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoAlポリクローナル抗体
を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15. 人工的に調整した変性HDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性HDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
【００１６】［血清中あるいは血漿中の変性VLDL／α１
−アンチトリプシン複合体の測定］ 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，0.
15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイクロ
プレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 ３．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globuli
nとRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μ1／we
ll分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加す
る。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 ６．ビオチン標識Fab´化IgG-apoEポリクローナル抗体
を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性VLDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性VLDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
−アンチトリプシン複合体の測定］ 1.IgG-O.AT-4モノクローナル抗体を0.05M Tris-HCl，0.
15M NaCl pH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解し、マイクロ
プレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 ３．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globuli
nとRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μ1／we
ll分注し、これに血清あるいは標準液を50μl添加す
る。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 ６．ビオチン標識Fab´化IgG-apoEポリクローナル抗体
を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる。 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15.人工的に調整した変性VLDL／α１−アンチトリプシ
ン複合体により求めた検量線から試料中の変性VLDL／α
１−アンチトリプシン複合体濃度を算出する。
【００１７】［血清中の変性LDL／フィブリノーゲンま
たはフィブリン（各々の分解産物を含む）複合体の測
定］ 1．IgG-フィブリノーゲンポリクローナル抗体を0.05M T
ris-HCl，0.15M NaClpH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解
し、マイクロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる． 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性LDL／フィブリノーゲン複合
体により求めた検量線から試料中の変性LDL／フィブリ
ノーゲンまたはフィブリン（各々の分解産物を含む）複
合体濃度を算出する。
たはフィブリン（各々の分解産物を含む）複合体の測
定］ 1．IgG-フィブリノーゲンポリクローナル抗体を0.05M T
ris-HCl，0.15M NaClpH8.0緩衝液に20μg／mlで溶解
し、マイクロプレートに100μ1／wellで分注する。 2．4℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で3回洗浄し、0.1％
ショ糖と牛血清アルブミン、0.05％アジ化ナトリウムを
含む0.05M、pH7.5で調整したTris-HCl緩衝液を100μ1／
wellで分注し室温で30分以上静置した後、液を廃棄し4
℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水25
0μ1／wellで3回洗浄する。 3．マイクロプレートに55mg／ml Mouse Gamma Globulin
とRabbit Gamma Globulin合有1％BSA溶液を100μ1／wel
l分注し、これに血清あるいは標準液を50μ1添加する。 4．室温下一晩反応させる。 5．0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回洗浄する。 6．ビオチン標識Fab´化IgG-apoB-427モノクローナル抗
体を1％BSA溶液で1.6μg／mlとし、100μ1／well分注す
る。 7．37℃下1.5時間反応させる． 8．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 9．HRP標識アビジンD（Vector Laboratories社製）を1
％カゼイン溶液で15000倍希釈とし、100μ1／well分注
する。 10．37℃下30分間反応させる。 11．3．と同様、0.005％Tween20溶液250μ1／wellで5回
洗浄する。 12．発色試薬を100μ1／well分注し、室温下30分間反応
させる。 13．1Mリン酸水溶液を100μ1／well分注し、反応を停止
する。 14．主波長450nm、副波長620nmで測光する。 15．人工的に調整した変性LDL／フィブリノーゲン複合
体により求めた検量線から試料中の変性LDL／フィブリ
ノーゲンまたはフィブリン（各々の分解産物を含む）複
合体濃度を算出する。
【００１８】［血清中の変性Lp（a）、変性HDL／フィブ
リノーゲンまたはフィブリン複合体の測定］上述と同様
にビオチン標識Fab´化抗体にLp（a）抗体、apoAl抗体
を用いればよい。
リノーゲンまたはフィブリン複合体の測定］上述と同様
にビオチン標識Fab´化抗体にLp（a）抗体、apoAl抗体
を用いればよい。
【００１９】[冠動脈疾患における血中変性（LDL、Lp
（a）、HDL濃度）]冠動脈造影検査により、1segmentに5
0％以上の有意狭窄病変を有するものを冠動脈硬化症と
定め、これに基づき冠動脈硬化症と診断された者、CAD
（＋）群（n＝26）、基準値以下のCAD（-）群（n＝21）
を対象に変性（LDLおよびLp（a）／α１−アンチトリプ
シン複合体、変性HDL／α１−アンチトリプシン複合体
を測定し、比較的検討したところ、いずれの変性リポ蛋
白についてもCAD（＋）群が有意な高値を示した（図
1）。
（a）、HDL濃度）]冠動脈造影検査により、1segmentに5
0％以上の有意狭窄病変を有するものを冠動脈硬化症と
定め、これに基づき冠動脈硬化症と診断された者、CAD
（＋）群（n＝26）、基準値以下のCAD（-）群（n＝21）
を対象に変性（LDLおよびLp（a）／α１−アンチトリプ
シン複合体、変性HDL／α１−アンチトリプシン複合体
を測定し、比較的検討したところ、いずれの変性リポ蛋
白についてもCAD（＋）群が有意な高値を示した（図
1）。
【図１】冠動脈硬化症における血中の変性リポ蛋白（LD
L、Lp(ａ)、HDL）の濃度を図示したものである。
L、Lp(ａ)、HDL）の濃度を図示したものである。
Claims (4)
- 【請求項１】低比重リポ蛋白（LDL）、高比重リポ蛋白
（HDL）、超低比重リポ蛋白（VLDL）、中間型リポ蛋白
（IDL）、Lp（a）、小型かつ高密度のLDL（small，dens
e LDL）などのリポ蛋白が変性されてなる各種変性リポ
蛋白と、他の血漿蛋白との複合体を測定対象にする血液
中の変性リポ蛋白の検出方法。 - 【請求項２】α１−アンチトリプシン、フィブリノーゲ
ン又はフィブリン（各々の分解産物を含む）、IgAもし
くはフィブロネクチンと各種変性リポ蛋白との複合体を
測定対象とする請求項1に記載の変性リポ蛋白の検出方
法。 - 【請求項３】酵素免疫法、ラテックス凝集法、免疫発光
分析法、イムノクロマト法などの免疫学的測定法を用い
る請求項1または2に記載の変性リポ蛋白の検出方法。 - 【請求項４】固相抗体として抗ヒトα１−アンチトリプ
シン／リポ蛋白複合体中のα１−アンチトリプシンを特
異的に認識する抗体、抗ヒトフィブロネクチン／リポ蛋
白複合体中のフィブロネクチンを特異的に認識する抗
体、抗ヒトIgA／リポ蛋白複合体中のIgAを特異的に認識
する抗体もしくは、抗ヒトフィブリノーゲン抗体を用
い、標識抗体には測定対象に応じて酵素をはじめとする
標識物質を標識した抗ヒトapo B 100抗体、抗ヒトapo A
l抗体、抗ヒトapo E抗体、抗ヒトLp（a）抗体、抗ヒトa
po C抗体、抗ヒトapo B 48抗体などの免疫反応検出試薬
を用いる請求項2ないし3に記載の変性リポ蛋白の検出方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24444099A JP3491743B2 (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 血液中の変性リポ蛋白の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24444099A JP3491743B2 (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 血液中の変性リポ蛋白の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001066307A true JP2001066307A (ja) | 2001-03-16 |
| JP3491743B2 JP3491743B2 (ja) | 2004-01-26 |
Family
ID=17118695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24444099A Expired - Lifetime JP3491743B2 (ja) | 1999-08-31 | 1999-08-31 | 血液中の変性リポ蛋白の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3491743B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003006989A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procede de quantification de lipoproteines denaturees, reactifs pour la quantification de lipoproteines denaturees, procede de detection de maladies du systeme circulatoire et reactifs pour la detection de maladies du systeme circulatoire |
| JP2003028882A (ja) * | 2001-07-18 | 2003-01-29 | Eiken Chem Co Ltd | ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 |
| JP2007522473A (ja) * | 2004-02-12 | 2007-08-09 | ナショナル スクリーニング インスティテュート，エルエルシー | アテローム発生源タンパク質及び急性期反応物質を用いる無症状性冠状動脈疾患の検出 |
| JP2020106474A (ja) * | 2018-12-28 | 2020-07-09 | サンスター株式会社 | 血管組織機能低下リスクマーカー |
-
1999
- 1999-08-31 JP JP24444099A patent/JP3491743B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003006989A1 (fr) * | 2001-07-12 | 2003-01-23 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Procede de quantification de lipoproteines denaturees, reactifs pour la quantification de lipoproteines denaturees, procede de detection de maladies du systeme circulatoire et reactifs pour la detection de maladies du systeme circulatoire |
| JP2003028882A (ja) * | 2001-07-18 | 2003-01-29 | Eiken Chem Co Ltd | ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 |
| JP4593026B2 (ja) * | 2001-07-18 | 2010-12-08 | 栄研化学株式会社 | ＳｍａｌｌｄｅｎｓｅＬＤＬの測定方法 |
| JP2007522473A (ja) * | 2004-02-12 | 2007-08-09 | ナショナル スクリーニング インスティテュート，エルエルシー | アテローム発生源タンパク質及び急性期反応物質を用いる無症状性冠状動脈疾患の検出 |
| JP2020106474A (ja) * | 2018-12-28 | 2020-07-09 | サンスター株式会社 | 血管組織機能低下リスクマーカー |
| JP7193082B2 (ja) | 2018-12-28 | 2022-12-20 | サンスター株式会社 | 血管組織機能低下リスクマーカー |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3491743B2 (ja) | 2004-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Reganon et al. | Association between inflammation and hemostatic markers in atherothrombotic stroke | |
| JP2016511394A (ja) | ｐＫａｌ関連疾病の評価、アッセイおよび治療 | |
| Kataoka et al. | Activation of thrombosis and fibrinolysis following brain infarction | |
| Scanu | The role of lipoprotein (a) in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular disease and its utility as predictor of coronary heart disease events | |
| Hellenthal et al. | Circulating biomarkers and abdominal aortic aneurysm size | |
| Marcovina et al. | Lipoprotein (a) and coronary heart disease risk | |
| JP3558643B2 (ja) | 心臓トロポニンｉの超高感度アッセイ法 | |
| Örem et al. | The significance of autoantibodies against oxidatively modified low-density lipoprotein (LDL) in patients with psoriasis | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| CN108445215A (zh) | 一种定量检测髓过氧化物酶的试剂盒及制备方法 | |
| JP3491748B2 (ja) | 血液中の低比重リポ蛋白（ｌｄｌ）もしくは変性低比重リポ蛋白の検出方法 | |
| JP3491743B2 (ja) | 血液中の変性リポ蛋白の検出方法 | |
| Jun-Jun et al. | Correlation between susceptibility of LDL subfractions to in vitro oxidation and in vivo oxidized LDL | |
| WO2007072896A1 (ja) | 急性冠症候群の予後予測方法 | |
| US7713747B2 (en) | Method of assessing risk of atherosclerosis | |
| US20030077668A1 (en) | Method for arteriosclerosis diagnosis | |
| Stubbs et al. | A prospective study of the role of lipoprotein (a) in the pathogenesis of unstable angina | |
| JP3561218B2 (ja) | 動脈硬化性病変の診断用キット | |
| JP4384634B2 (ja) | 酸化度の定量法 | |
| JP3774177B2 (ja) | 急性冠症候群の発症を予知するための診断用キット | |
| JP3507407B2 (ja) | 血液中の変性リポ蛋白の検出方法および動脈硬化症の診断用キット | |
| JP2003227837A (ja) | 血液中の低比重リポ蛋白（ｌｄｌ）もしくは変性低比重リポ蛋白の検出方法 | |
| JP5651890B2 (ja) | 再灌流療法の治療効果を判定するキット | |
| Mowafy | Prognostic Value of Serum Lipoprotein (a) and Apo lipoprotein-B in diabetics with Myocardial Infarction and Chronic limb Threatening ischemia | |
| US20080090261A1 (en) | Method For The In Vitro Diagnosis Of The Exclusion Of Acute Coronary Syndromes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20030930 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 3491743 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071114 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081114 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081114 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091114 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101114 Year of fee payment: 7 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111114 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121114 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131114 Year of fee payment: 10 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |