WO2007072896A1 - 急性冠症候群の予後予測方法 - Google Patents

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WO2007072896A1
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coronary syndrome
recurrence
soluble lox
antibody
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Noriaki Kume
Goro Kominami
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Shionogi & Co., Ltd.
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    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G01N2800/324—Coronary artery diseases, e.g. angina pectoris, myocardial infarction

Definitions

  • the present invention relates to a method for predicting the risk of recurrence of a future acute coronary syndrome and a kit for carrying out this method.
  • Unstable angina power A series of conditions from acute myocardial infarction to sudden cardiac death that accompanies these is collectively called acute coronary syndrome (ACS).
  • ACS acute coronary syndrome
  • sudden coronary syndromes are increasing, but most of them suddenly develop without any warning, so they cannot be saved and often follow the course of sudden death. Even if they are admitted to the hospital promptly, emergency cardiac surgery, emergency percutaneous transluminal coronary angioplasty (PCI), etc. are often necessary for lifesaving. unfathomable.
  • recurrence is predicted by performing coronary angiography 'cardiac force test including left ventriculography, echocardiography, or using biomarkers. Yes.
  • the former cannot be simply performed as a time-cost diagnosis, and the burden on the patient is not light.
  • it does not provide complete information from the perspective of recurrence prediction.
  • the degree of coronary artery stenosis in coronary angiography is the risk of onset. It has already been shown in previous studies that it cannot be predicted!
  • the latter uses acute markers such as troponin T, H-FABP, and high-sensitivity CRP, and markers as risk factors such as total cholesterol, triglycerides, HDL cholesterol, and remnant-like lipoprotein (R LP) cholesterol Power Sensitivity 'Specificity was not satisfactory for the effect as a marker for recurrence prediction (non-patent document 5 below)
  • Non-patent literature l Nature, 1997, Vol. 386, ⁇ 73-77
  • Non-patent document 2 Arterioscler. Thromb. Vase. Biol., 2000, 20 (3), p715-720
  • Non-patent document 3 Circulation, 2005, 112 (6), p812-818
  • Non-Patent Document 4 Levine GN et al., N. Engl. J. Med., 1995, 332, 512-5 21: Libby, Circulation, 1995, 91, 2844-2850
  • Non-Patent Literature 5 M. Panteghmi, Role and importance of biochemical markers in clinical cardiology: European Heart J. (2004) 25, 1187—1196 Disclosure of the invention
  • the present inventors conducted a follow-up survey of prognosis for about 7 years in patients suffering from acute coronary syndrome, and investigated the relationship between the blood concentration of soluble LOX-1 and the recurrence rate of acute coronary syndrome. . As a result of finding that there is a high correlation between the concentration of soluble LOX-1 and the recurrence rate of acute coronary syndrome, the present invention was completed.
  • Fig. 1 is a standard curve of human soluble LOX-1.
  • FIG. 2 Median values of human soluble LOX-1 measured in patients whose acute coronary syndrome did not recur and in patients whose acute coronary syndrome recurred or died, 10, 25, 7 5, 90 It is the graph which showed the percentile.
  • FIG. 3 The median results of high-sensitivity CRP measurements for patients whose acute coronary syndromes did not recur and those whose acute coronary syndromes relapsed or died showed the 10th, 25th, 75th, and 90th percentiles. It is a graph.
  • FIG. 4 Median values of left ventricular ejection fraction (LVEF) measured by cardiac ultrasonography for patients who did not recur acute coronary syndrome and patients who relapsed or died of acute coronary syndrome , 10, 25, 75, 90th percentile.
  • LVEF left ventricular ejection fraction
  • FIG. 5 Median values of troponin T measurement, 10th, 25th, 75th, 90th percentiles for patients who did not recur acute coronary syndrome and those who relapsed or died of acute coronary syndrome It is the graph which showed.
  • FIG.6 Acute human soluble LOX-1 blood concentration cut-off set to 5 ngZml The follow-up results of the presence or absence of re-onset of coronary syndrome (including death) are shown as a power plan Meyer curve.
  • FIG.7 The results of follow-up of the presence or absence of re-occurrence of acute coronary syndrome (including death) when the cut-off of human soluble LOX-1 blood concentration is set to 3 ngZml is shown as a power plan Meyer curve. .
  • the present invention includes acute coronary disease, which includes the step of measuring the concentration of soluble LOX-1 in a test sample derived from a subject, and using the measured value as an index of the possibility of recurrence of acute coronary syndrome.
  • the present invention relates to a method for selecting a subject who has a high possibility of recurrence.
  • the present invention includes a step of measuring the concentration of soluble LOX-1 in a test sample derived from a subject, wherein, when the concentration in the test sample is greater than a reference value, the subject
  • the present invention relates to a method for selecting a subject who has a high possibility of recurrence of acute coronary syndrome, using as an index the probability of recurrence of acute coronary syndrome. By using this method, it is possible to easily select a subject who has a high possibility of recurrence of the acute coronary syndrome group or to predict the risk of developing it.
  • test sample A sample (hereinafter referred to as "test sample") is collected from the subject.
  • the test sample is preferably urine, whole blood, plasma, serum, or force serum or plasma containing blood.
  • the soluble LOX-1 of the present invention is produced, for example, by cleaving a part of the extracellular domain of human LOX-1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with a protease.
  • Various soluble LOX-1s are present in the blood depending on the cut site. Specific examples of such amino acid sequences include, for example, those listed in SEQ ID NOs: 2 and 3. These may have 1 to 5 amino acids deleted, added, or substituted.
  • an anti-human soluble LOX-1 antibody preferably a monoclonal antibody (first antibody)
  • a solid support eg, a plate
  • a target protein eg, sushi serum albumin
  • human soluble LOX-1 standard solution or test sample is added to the immobilized plate and allowed to react.
  • the plate is washed and reacted with an anti-human soluble LOX-1 antibody (second antibody) labeled with an enzyme marker.
  • the substrate is added to perform the enzyme reaction, and the enzyme activity remaining on the plate is read as the absorbance.
  • a polyclonal antibody can be used as the first antibody, and a monoclonal antibody can be used as the second antibody.
  • the higher the soluble LOX-1 concentration in the standard solution or test sample used the stronger the enzyme activity (absorbance) is observed.
  • the concentration of soluble LOX-1 contained in the test sample can be easily determined. Can be read. By comparing this value with a preset reference value (cutoff), it is possible to determine the possibility of suffering from acute coronary syndrome in the subject who is the subject of the test sample.
  • the subject when the measured value obtained is higher than the reference value compared with the reference value, the subject is selected as a group having a high possibility of recurrent acute coronary syndrome, that is, a high-risk group. Will be.
  • the reference value depends on the subject's age, gender, other diseases, etc., but those skilled in the art will be able to use different criteria depending on the acceptable false positive or false negative results for individual patients.
  • a quasi-value can be set. For example, when serum such as the result of Example 3 described later is also judged and serum is collected from a subject and used as a test sample, the reference value can be set to 3 ngZml.
  • the risk of recurrence of acute coronary syndrome is very high in subjects who exceed this reference value.
  • the values measured in a random human control group that has never suffered from acute coronary syndromes in the past or previously measured in the same patient can be used as a reference value for risk prediction.
  • the present invention provides a judgment material extremely useful in predicting recurrence of acute coronary syndrome.
  • One aspect of the present invention is to provide a method for screening a subject having a high possibility of recurring acute coronary syndrome, comprising a step of measuring the concentration of soluble LOX-1.
  • Another aspect of the present invention is the use of soluble LOX-1 as a marker for the diagnosis of recurrence of acute coronary syndrome.
  • kits comprising an antibody or antibody fragment that specifically binds to human soluble LOX-1 used in the above method.
  • kit of the present invention and a method for measuring the soluble LOX-1 concentration in a test sample using the kit will be described in detail to further clarify the present invention.
  • the IgG fraction of antiserum was digested with pepsin and then purified with a gel filtration column to obtain the F (ab ′) fraction. Further, the F (ab ') fraction was reduced with mercaptoethylamine, and gel filtration H

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Abstract

　本発明は、急性冠症候群の予後予測のための診断用マーカーを提供することを目的とする。本発明に従って、血中における可溶性ＬＯＸ－１の濃度を測定することにより、急性冠症候群の再発リスクの予測が可能となる。

Description

明 細 書
急性冠症候群の予後予測方法
技術分野
[0001] 本発明は、将来の急性冠症候群の再発リスクを予測する方法及びこの方法を実施 するためのキットに関する。
背景技術
[0002] 不安定狭心症力 急性心筋梗塞、さらにはこれらに合併する心臓性突然死までの 一連の病態は包括的に急性冠症候群 (ACS)と呼ばれる。いずれも心臓に栄養を供 給する冠動脈の動脈硬化により生じた粥腫 (プラーク)が崩壊し、これに血栓が付着 した結果、冠動脈の狭窄や閉塞が生じて発症するとされる。現代社会において、急 性冠症候群は増加の一途をたどっているが、その大部分は何の前兆もなく突然に発 症するため、救命できず突然死の経過をたどることも多い。また、たとえ速やかに病 院に収容された場合でも、救命のために緊急心臓手術、緊急経皮経管冠動脈血管 形成術 (PCI)等が必要になることも多ぐその医療経済上の負担は計り知れない。
[0003] 抗血小板剤や、コレステロール低下剤 (スタチン)などの治療により、急性冠症候群 の再発はある程度は防止できるようになったが、それでも大規模臨床試験の示すとこ ろでは、スタチンによる再発症の減少は 30%程度であり、残りの 70%の患者ではこ のような薬物での治療でも予防できて ヽな 、ことになる。したがって急性冠症候群の 再発症を完全に阻止する新しい治療法が期待されるが、現在のところこのような治療 法はない。このような状況下においては、発症リスクの高い症例を正確に同定し、集 中的に管理することで発症を未然に防ぐ力、それができな力つたとしても病院外での 突然の発症を防ぐことが救命と予後の改善のためには有用であろうと考えられる。
[0004] 現在のところ臨床の現場においては、冠動脈造影 '左室造影を含む心臓力テーテ ル検査や心エコーなどの機器検査を行う、もしくはバイオマーカーを利用することに よって再発の予知を行っている。しかし、前者は時間'コスト面力 診断として簡便に 行えるものではなく患者の負担も決して軽くない。また再発予知という観点からは完 全な情報を提供しない。例えば、冠動脈造影での冠動脈の狭窄度では、発症の危 険を予知できな!/ヽことがすでにこれまでの研究で示されて ヽる（後記非特許文献 4)。 後者においては、トロポニン T、 H— FABP、高感度 CRPなど急性期のマーカーや、 総コレステロール、トリグリセリド、 HDLコレステロール、レムナント様リポタンパク質 (R LP)コレステロールなどの危険因子としてのマーカーが利用されている力 その感度 '特異度から、再発予知のためのマーカーとしての効果については満足できるもので はなかった (後記非特許文献 5)
急性冠症候群の発症は、粥状動脈硬化プラークの破綻ある 、は糜爛に続発して生 じる閉塞性の血栓形成に起因することが近年明らかになつてきた。プラークの破綻、 糜爛には血管壁内での催炎症反応、酸化ストレスが重要な役割を担うことが示されて きたが、中でも酸ィ匕変性を受けた LDL (低比重リポタンパク質）により惹起された、プ 口テアーゼ活性の増加及びアポトーシス (細胞死）を中心とする血管壁の機能障害が その主要な原因として知られている。 LOX—l (Lectin— like oxidized low -de nsity lipoprotein receptor— 1 :レクチン様酸化低比重リポタンパク質受容体 1 )は、この酸化 LDLの受容体タンパク質として同定されたものである（後記非特許文 献 1)。この LOX— 1は、生体内において通常膜タンパク質として細胞表面に発現し ているが、プロテアーゼの作用により膜貫通部近傍の細胞外ドメインにて切断されて 可溶性 (soluble) LOX- 1として血中に遊離することが知られて 、る（後記非特許文 献 2)。また急性冠症候群の急性期（acute phase)においては、この可溶性 LOX— 1の血中濃度が著明に上昇することから、急性冠症候群の一次的診断マーカーとし ての可能性が報告されている（後記非特許文献 3)。しかし、急性冠症候群の再発を 予測するためのマーカーとしての可能性については未知であった。
非特許文献 l :Nature、 1997, Vol. 386、 ρ73~ 77
非特許文献 2 :Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.、 2000、 20 (3)、 p715— 720 非特許文献 3 : Circulation、 2005, 112 (6) , p812-818
非特許文献 4:Levine GN等、 N. Engl. J. Med.、 1995年、第 332卷、 512〜5 21ページ： Libby、 Circulation, 1995年、第 91卷、 2844〜2850頁
非特干文献 5 : M. Panteghmi、 Role and importance of biochemical mar kers in clinical cardiology： European Heart J. (2004) 25、 1187—1196 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 急性冠症候群の再発を未然に防ぐため、感度が高い予後予測方法を提供すること が本発明の目的である。 課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、急性冠症候群に罹患した患者について約 7年間における予後の追 跡調査を行ない、可溶性 LOX— 1の血中濃度と急性冠症候群の再発率との関係を 調べた。そして、可溶性 LOX—1の濃度と急性冠症候群の再発率との間には高い相 関があることを見出した結果、本発明を完成させた。
発明の効果
[0008] 本発明に従って被験者由来の被検試料に含まれる可溶性 LOX— 1濃度を測定す ることにより、急性冠症候群の再発を予知することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]ヒト可溶性 LOX— 1の標準曲線である。
[図 2]急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡 に至った患者群について、ヒト可溶性 LOX—1を測定した結果の中間値、 10、 25、 7 5、 90パーセンタイルを示したグラフである。
[図 3]急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡 に至った患者群について、高感度 CRPを測定した結果の中間値、 10、 25、 75、 90 パーセンタイルを示したグラフである。
[図 4]急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡 に至った患者群について、心臓超音波法による左室駆出分画 (LVEF)を測定した 結果の中間値、 10、 25、 75、 90パーセンタイルを示したグラフである。
[0010] [図 5]急性冠症候群が再発しなかった患者群及び急性冠症候群が再発もしくは死亡 に至った患者群について、トロポニン Tを測定した結果の中間値、 10、 25、 75、 90 パーセンタイルを示したグラフである。
[図 6]ヒト可溶性 LOX— 1の血中濃度のカットオフを 5ngZmlに設定した場合に急性 冠症候群の再発症 (死亡も含む）の有無の追跡結果を力プラン マイヤー曲線で示 したものである。
[図 7]ヒト可溶性 LOX— 1の血中濃度のカットオフを 3ngZmlに設定した場合に急性 冠症候群の再発症 (死亡も含む）の有無の追跡結果を力プラン マイヤー曲線で示 したものである。
発明を実施するための最良の形態
[0011] 本発明は、被検者由来の被検試料における可溶性 LOX—1の濃度を測定するェ 程を含む、その測定値を急性冠症候群が再発する可能性の指標とする、急性冠症 候群を再発する可能性の高い被検者の選別方法に関するものである。また、本発明 は、被検者由来の被検試料における可溶性 LOX— 1の濃度を測定する工程を含み 、ここで、被検試料における濃度が、基準値よりも大きくなる場合、前記被検者に急 性冠症候群が再発する可能性が高 ヽことを指標とする、急性冠症候群を再発する可 能性が高い被検者の選別方法に関するものである。この方法を用いれば、急性冠症 候群を再発する可能性が高 ヽ被検者を容易に選別、もしくはその発症リスクを予測 することができる。
[0012] 具体的には、本発明には、被検者に由来する試料中の可溶性 LOX—1の濃度を 測定する工程が含まれる。「被検者」は特に限定されないが、健常人のほかに急性冠 症候群に罹患して 、る者 (測定の結果、罹患して!/、たことが判明した者も含む)や、 急性冠症候群に罹患して!/、ると疑われる者が好ま U、。
[0013] 上記被検者から試料 (以下、「被検試料」という）を採取する。被検試料には、尿、全 血、血漿、血清、または血液に由来するものが含まれる力 血清や血漿が好ましい。
[0014] 次 、で、上記被検試料における可溶性 LOX— 1の濃度を測定する。本発明の可溶 性 LOX— 1は、例えば、配列番号 1のアミノ酸配列で示されるヒト LOX— 1の細胞外 ドメインの一部が、プロテアーゼにより切断されることにより生じる。そして切断箇所の 違!ヽによって種々の可溶性 LOX— 1が血中に存在する。このようなアミノ酸配列の具 体例としては、例えば配列番号 2や 3に記載したものが挙げられる力 これらに 1〜5 個のアミノ酸が欠失、付加、あるいは置換されたものでもよい。このとき、可溶性 LOX 1の濃度は当業者に周知の種々の方法 (例えば、ウェスタンプロット法、ラジオィム ノアッセィ）により測定することが可能である力 一般にはヒト可溶性 LOX— 1と特異 的に結合する抗体または抗体断片を用いる ELIS A法が望ましい。抗体は、可溶性し OX- 1ポリペプチドまたはその一部を特異的に認識するものである。このような抗体 は常法を用いて (例えば、新生化学実験講座 1、タンパク質 389ページ、 1992年 )得ることができる。また、公知の方法 (単クローン抗体、講談社サイエンティフィック、 1983年）に従えば、モノクローナル抗体を得ることもできる。そして、力かる抗体は、 被検試料中の可溶性 LOX— 1濃度を測定するための診断キットの構成品として、ま た診断用マーカーとして使用することも可能である。
[0015] ELISA法につき詳述すれば、その原理は酵素免疫測定法に基づいている。即ち、 この方法によれば、例えば、まず固体支持体 (例えばプレート）に抗ヒト可溶性 LOX — 1抗体、好ましくはモノクローナル抗体 (第 1抗体)を固相化し、更に非特異吸着を防 ぐために非特異的タンパク質 (例えば、ゥシ血清アルブミン)でブロッキングを行う。次 に、上記固相化プレートにヒト可溶性 LOX— 1標準液又は被検試料を加えて反応さ せる。反応後、プレートを洗浄し、酵素マーカーで標識した抗ヒト可溶性 LOX—1抗 体 (第 2抗体)を加えて反応させる。プレートを洗浄後、基質を加えて酵素反応を行い 、プレートに残った酵素活性を吸光度として読みとる。
[0016] 上記において、第 1抗体としてポリクローナル抗体を、第 2抗体としてモノクローナル 抗体を用いることもできる。上記方法に従えば、用いる標準液又は被検試料中の可 溶性 LOX— 1濃度が高いほど、強い酵素活性 (吸光度)が認められる。上記標準液の 吸光度をプロットして標準曲線 (検量線)を作成し、被検試料の吸光度を該標準曲線 と対比させれば、被検試料中に含まれる可溶性 LOX— 1の濃度を簡便に読みとるこ とができる。この値を、予め設定した基準値 (カットオフ）と比較することにより被検試 料の提供者である被検者の急性冠症候群に罹患する可能性を判断することができる
[0017] 具体的には、得られた測定値を、基準値と比較し基準値より高い場合、被検者は急 性冠症候群を再発する可能性が高い群、即ち高リスク群として選別されることになる 。基準値は被検者の年齢、性別、罹患している他の疾患等にも依存するが、当業者 であれば個々の患者について許容できる擬陽性または擬陰性結果に応じて別の基 準値を設定することができる。例えば、後述の実施例 3の結果など力も判断して被検 者から血清を採取し、被検試料とした場合にその基準値として、 3ngZmlと設定する ことができる。そして、この基準値を越える被検者においては急性冠症候群が再発す るリスクは非常に高いといえる。また、過去に急性冠症候群に罹患したことがないラン ダムなヒト対照群における測定値や、同一患者において以前に測定した値を基準値 として、リスクの予測に利用することができる。
[0018] 力べして、本発明は急性冠症候群の再発を予測する上で極めて有用な判断材料を 提供するものである。
本発明の一つの側面は、可溶性 LOX—1の濃度を測定する工程を含む、急性冠 症候群を再発する可能性が高い被検者の選別方法を提供することである。
本発明の別の側面は、可溶性 LOX— 1の急性冠症候群の再発診断用マーカーと しての使用である。
本発明の別の側面は、上記方法において使用される、ヒト可溶性 LOX— 1と特異 的に結合する抗体または抗体断片を含むキットの提供である。以下、本発明キット及 びこれを利用して被検試料中の可溶性 LOX—1濃度を測定する方法につき詳述し、 本発明をさらに明らかにする。
[0019] 本発明キットを利用した測定法において、被検試料としては血清や血漿が好ましく 、これらは被検者より採血後に、常法に従い調製できる。
本発明に係わるキットは、ヒト可溶性 LOX— 1に対するモノクローナル抗体又はポリ クローナル抗体 (抗ヒト可溶性 LOX— 1抗体)を必須成分として、これと可溶性 LOX— 1に対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のそれぞれとの組み合わせ、 あるいは 2種類のモノクローナル抗体の組み合わせを含有して 、ることが好まし 、。 プレート上に固定ィ匕する抗体はモノクローナル抗体が好ましぐ予め固定化された プレート形態として用いられるのがよい。また、ァフィニィティゲル形態としてそのまま 用いることができ、また該ゲルを振とう及び遠心分離が可能であってァフィニィティゲ ル非結合フラクションを除去可能な適当な容器もしくはテストチューブに調製して用 いることちでさる。
[0020] また予め適当な緩衝液で上記固相化プレート又はゲルを平衡ィ匕しておくことも好ま しい。更に上記固相化プレート又はゲルには、プロクリン 150等の通常の保存剤を含 ませることができる。更なる本発明キット成分として ELISAのための第 2抗体として、 酵素標識した抗ヒト可溶性 LOX—1抗体を供給するのがより好ましい。尚、本発明キ ットには、必要に応じてゥシ血清アルブミン等の安定化剤及び Z又は保存剤を添カロ 配合することができる。この保存剤はキットの使用に際し、実験値に影響を与えないも のから選択される。
[0021] また本発明キットには、吸着防止のための 3— [(3 コールアミドプロピル)ジメチル アンモ-ォ]プロパンスルホン酸等の界面活性剤や、水溶性もしくは水と混和し得るグ リセリン、アルコール類、グリコール類等を含有させること、及び脱脂質のためのェタノ 一ルとジェチルエーテル、クロ口ホルムとメタノールのような混合有機溶媒等を含有さ せることちでさる。
実施例
[0022] 実施例 1
(1)可溶性 LOX— 1を認識するポリクローナル抗体の作製
ヒト LOX— 1細胞外ドメイン (hisタグ付き)発現大腸菌を培養し、この大腸菌から Ni — NTAゲルカラムにより、ヒト LOX—1細胞外ドメインタンパク質を精製した。本タン パク質約 0. 8mgZmlを含む生理食塩液を、等量のフロインドコンプリートアジュバン トと良く混和してェマルジヨンとした。このェマルジヨン 0. 5mlをゥサギ（日本白色種、 雌性)の背部に 3週間隔で 6回免疫した。最終免疫終了後、 10日目に全採血を行つ て、抗血清を得た。
[0023] (2)酵素標識抗体の作製
酵素（ホースラディッシュペルォキシダーゼ）4. 61mgを 0. ImolZlリン酸塩緩衝 液（pH6. 0) 0. 4mlに溶力し、そこにスクシンィミジル 4— (N—マレイミドメチル）シク 口へキサン 1 カルボキシレート 0. 4mgを加えて 30°Cで 60分間反応させた.反応 液をゲルろ過カラムにより精製しマレイミドィ匕酵素 3. lOmgを得た。
[0024] 一方、抗血清の IgG画分をペプシン消化した後、ゲルろ過カラムにて精製し F (ab' ) 画分を得た。さらに F (ab' ) 画分をメルカプトェチルァミンにて還元し、ゲルろ過 H
2 2
PLCで精製して Fab '画分を得た。 得られたマレイミド化酵素 3. lOmgと Fab，画分 3. l lmgを 0. ImolZlリン酸塩緩 衝液 (pH6. 0) 0. 52ml中 4°Cで 18時間反応させた後、ゲルろ過 HPLCで精製して 酵素標識抗体 3. 47mgを得た。得られた酵素標識抗体の Fab'画分 1分子あたりに 導入された酵素分子は、平均 1. 0個であった。防腐剤としてプロクリン 150を 0. Ivol %となるよう酵素標識抗体溶液に添加した後、分注し— 80°Cで凍結保管した。
[0025] (3)抗体固相化プレートの作製
抗血清の IgG画分 0. lmgを 0. lvol%プロクリン 150を含む 0. ImolZlリン酸塩緩 衝液（pH7. 0) 10mlにカロえ混合後、 96穴マイクロプレートの各ゥエルに 0. 1ml添カロ し、室温で一夜静置した。測定緩衝液 (0. 5gZdlゥシ血清アルブミン、 0. lg/dl 3 [(3—コールアミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ]プロパンスルホン酸及び 0. lvol% プロクリン 150を含む 0. ImolZlリン酸塩緩衝液、 PH7. 0)約 0. 2mlで 2回洗浄し、 さらに測定緩衝液 0. 2mlを加えて室温で 2時間以上ブロッキングした。
[0026] (4)ELISA
抗体固相化プレートのゥエルに測定緩衝液 0. 1ml及び標準試料溶液又はヒト血清 試料 0. 01mlをカ卩えて室温で 2時間インキュベーションした後、測定緩衝液約 0. 2m 1で 2回洗浄した。次いで、酵素標識抗体溶液希釈液 (約 900ngZml) 0. 1mlをカロえ 、室温で 16時間インキュベーションし、測定緩衝液約 0. 2mlで 2回洗浄した後、基質 液 (たとえば TMB +、 DAKO製) 0. 1mlをカ卩ぇ遮光下室温で正確に 30分間静置し た。さらに 0. 5molZl硫酸 0. 1mlで反応を停止させ、 450nmの吸光度をプレートリ ーダ一で測定した。
(5)ELISAの標準曲線
ヒト血清中の可溶性 LOX— 1を定量限界 lngZml、定量範囲 1〜 lOOngZmlで 測定可能な ELIS A法を確立した。標準曲線の例を図 1に示す。
[0027] 実施例 2
急性冠症候群発症後の再発の予見における可溶性 LOX— 1の有用性
急性冠症候群患者（ 107例)から、急性冠症候群初発時の急性期に採取した末梢 静脈血に含まれる可溶性 LOX—1の濃度を、上記 ELISA法により測定した。全ての 患者については、その後の臨床経過を最長で約 7年間追跡しており、この結果に基 づ 、て、急性冠症候群が再発 (それによつて死亡した患者も含む）した患者群（15例 )と非発症である患者群 (88例）に分けた。そして各群と可溶性 LOX— 1濃度の相関 関係について、クラスカルーウォリスによる検定 (新版 医学への統計学、朝倉書店、 1993年）を行った。
また、現在臨床において急性冠症候群の一次マーカーとして使用されている血中 高感度 CRP値（71例）、血中トロポニン T濃度（89例）、左室駆出分画 (LVEF) (88 例）と比較した。なお、トロポニン Tについては、電気化学発光ィムノアッセィキット (R oche社）により、高感度 CRPについてはィムノネフエロメトリーアツセィキット（Dade B ehring社）により、そして LVEFについては心臓超音波法により測定を行った。具体 的な測定方法については製造業者の指定に従った。
[0028] 検定の結果、可溶性 LOX— 1の血中濃度については、再発症群と非再発症群に おいて、 P< 0. 003と統計学的に有意性を示した（図 2)。一方その他のマーカーや 検査法については、血中高感度 CRP値（0. 348)、血中トロポニン T濃度（0. 782) 、左室駆出分画 (LVEF 0. 782)といずれも有意性を示さな力つた（図 3〜5)。この ように、可溶性 LOX— 1については、その他のマーカーや検査法と異なり、急性冠症 候群の再発 (再発に基づく死亡も含む）と高い相関を示すことがわかる。
[0029] 実施例 3
可溶性 LOX— 1について、再発もしくは死亡までの時間も考慮に入れた統計処理 に基づき、力プラン—マイヤー曲線 (新版 医学への統計学、朝倉書店、 1993年)を 求めた。カットオフを 3ngZmlおよびは 5ngZmlに設定した。その結果、いずれの場 合も、陽性 (カットオフ値よりも高い値)の患者群は、陰性 (カットオフ値よりも低い値） の患者群よりも、高い頻度で早期の急性冠症候群の再発もしくは再発による死亡例 がみられた（図 6、図 7)。
これらの結果は、可溶性 LOX—1は、一次的診断マーカーとしてのみならず急性 冠症候群の再発予測 (予後予測)のマーカー（二次的診断マーカー）としても有用で あることを示すものである。 産業上の利用可能性 本発明は、今後患者数の増加が予想される急性冠症候群の再発リスクの高い患者 を正確に同定し集中的に管理することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 被検者由来の被検試料における可溶性 LOX— 1の濃度を測定する工程を含む、そ の測定値を急性冠症候群が再発する可能性の指標とする、急性冠症候群を再発す る可能性の高 、被検者の選別方法。
[2] 前記測定値が、基準値よりも大きくなる場合、前記被検者に急性冠症候群が再発す る可能性が高いことの指標とする、請求項 1記載の選別方法。
[3] 前記測定がヒト可溶性 LOX—1と特異的に結合する抗体または抗体断片を用いて 行うものである請求項 1または 2のいずれかに記載の方法。
[4] 前記測定力 ¾LISAによるものである請求項 3記載の方法。
[5] 請求項 1から 4のいずれかの方法に使用するためのキット。
[6] 可溶性 LOX— 1の急性冠症候群の再発診断用マーカーとしての使用。
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