JP6835332B2 - 動脈硬化を検出するための血中バイオマーカー - Google Patents
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Description
本発明は、血中ミオシン重鎖１１レベルを指標として動脈硬化を検出する方法に関する。
人口の高齢化と生活習慣の変化により、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、大動脈瘤などの動脈硬化を主体とする疾患は増加している。非侵襲的又は比較的簡便な検査により動脈硬化性疾患を診断し、適切な検査・治療計画を立てることが予後の改善に必要である。
動脈硬化を非侵襲的に検出する手法としては、頚動脈エコーにより内中膜複合体厚、プラークの存在などを計測する手法がある。しかしながら、頚動脈という限られた部位での診断となり、必ずしもその他の部位での動脈硬化を検出できるものではない。
動脈硬化の発症には、糖尿病、喫煙、脂質異常症、高血圧などがリスクファクターとして知られているが（非特許文献１）、高血圧や脂質異常症に対する薬物治療の進歩により、現在ではこれらの古典的なリスクファクターだけで動脈硬化のリスクを判断することは出来ない。動脈硬化そのものは無症状であるためにその進行を患者が自覚できない。このため、動脈硬化を診断できるバイオマーカーが求められている。
動脈硬化の発症メカニズムに基づくバイオマーカーの研究が近年多くなされている。動脈硬化は、血管内皮機能の障害、凝固・線溶系異常、炎症、脂質代謝異常などが関与して進行することが知られており、これらの因子に関与する蛋白と急性冠動脈症候群との関連が示されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの蛋白は感染やがん、外傷などでも上昇し得るため血管特異性は低く、単一分子で動脈硬化診断ができるものではない。非特許文献２では、脂質や代謝、凝固、血管新生、腎機能炎症、酸化ストレスなどに関連する２０以上の因子を検討しているが、古典的なリスクファクターを上回るバイオマーカーは見出されていない。
特許文献１には、腫瘍壊死因子α前駆体などを含む多数のタンパク質が心血管イベントを予測できるバイオマーカーとして挙げられている。心血管イベントの中には大動脈瘤破裂、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈疾患など種々の動脈硬化性疾患が含まれるが、これらのバイオマーカーは動脈硬化自体を診断するものではない。
特許文献２には、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患の予後バイオマーカーとして血中YKL-40が開示されている。このバイオマーカーも動脈硬化自体を診断するものではない。さらに、YKL-40はがんや炎症でも血中に検出されるため（非特許文献３、４）、疾患特異性は低い。
特許文献３には、動脈硬化病変の進行に従って発現が変動するマーカータンパク質を指標として動脈硬化病変を評価する手法が開示されている。しかしながら、それらのマーカータンパク質は動脈硬化モデル動物を用いて同定されたものであり、ヒトの動脈硬化病変を評価できるかどうかは不明である。また、動脈組織病変部でのタンパク質発現量を調べる手法であり、頚動脈エコーと同様に必ずしも検査対象部位以外の部位での動脈硬化の存在を検出できるものではない。
Anderson KM. et al., Am Heart J, 1991;121:293-8
Blankengerg S. et al., Circulation, 2010;121:2388-97
Kring TS., et al., Biomark Cancer, 2015;7:57-61
Ural UM., et al., Clin Exp Obstet Gynecol, 2015;42:495-7
本発明は、侵襲の少ない簡便な方法により体内の動脈硬化病変を検出することができる手段を提供することを目的とする。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、重篤な動脈硬化病変を有する動脈疾患患者において、血中ミオシン重鎖１１レベルが健常者よりも顕著に高いことを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、動脈硬化の検出を補助する方法であって、被検者から分離された血液試料中のミオシン重鎖１１レベルを測定することを含み、健常者よりも高いミオシン重鎖１１レベルは、当該被検者が動脈硬化を有することの指標となる、方法を提供する。また、本発明は、抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片を含む、血液試料中のミオシン重鎖１１レベルに基づき動脈硬化を検出するためのキットであって、健常者よりも高い血中ミオシン重鎖１１レベルが動脈硬化の存在の指標となる、キットを提供する。
本発明により、ミオシン重鎖１１が体内の動脈硬化の存在を反映する血中バイオマーカーとして利用可能であることが初めて明らかとなった。血液検査によって動脈硬化を検出できるので、低侵襲で簡便に検査を実施できる。また頚動脈エコーのように特定箇所のみを検査対象とする手法ではないので、全身の血管の状態を反映していると期待される。本発明により動脈硬化そのものを検出することで、動脈硬化性疾患を発症する前に発症のリスクを知ることができるので、自発的な生活習慣の改善を促すきっかけとなり、疾患の発症防止につながり、医療費の削減に貢献できる。また自覚症状が乏しい動脈硬化性疾患の発症初期の患者であれば、本発明の方法により重篤な動脈硬化の存在を知ることで疾患の早期発見につながり、より早期に治療計画を立てることが可能となり、患者の生命予後の改善に貢献できる。本発明によれば、動脈硬化病変の存在を検出するために有用なデータを提供することができ、医師による動脈硬化そのものの評価・診断の大きな補助となる。
ミオシン重鎖には５、７、１０、１１等のアイソフォームが知られているが、このうち本発明で対象とするのはミオシン重鎖１１（Gene ID 4629）である。ミオシン重鎖１１は平滑筋に特異的に発現するアイソフォームであり、平滑筋ミオシン重鎖とも呼ばれる。平滑筋で発現したミオシン重鎖１１は、２分子の重鎖が２種類のミオシン軽鎖各２分子と共に六量体の平滑筋ミオシン分子を形成する。
ミオシン重鎖１１には、主としてC末端部分の配列が異なる４種類のアイソフォームSM1A, SM1B, SM2A, SM2B（GenBankアクセッション番号: NP_002465.1, NP_001035203.1, NP_074035.1, NP_001035202.1、アミノ酸配列を配列番号１〜４にそれぞれ示す）が知られている。本発明で測定するミオシン重鎖１１のアイソフォームは特に限定されず、４種のアイソフォームを全て測定してもよいし、一部のアイソフォームのみを測定してもよい。
血中ミオシン重鎖１１レベルは、血液試料中のミオシン重鎖１１タンパク質又はその断片の測定により調べることができる。ミオシン重鎖１１は分泌タンパク質ではないため、血中では断片化した形態でも存在するものと考えられる。測定されるミオシン重鎖１１タンパク質又はその断片には、血中に単量体として存在するもの、及び他のタンパク質等と結合ないしは会合した形態で血中に存在するもの（例えば、完全な又は一部分解した平滑筋ミオシン分子を構成している形態で血中に存在するもの）が包含される。従って、動脈硬化病変検出のための血中バイオマーカーとして使用される「ミオシン重鎖１１」という語には、血中に単量体として存在するミオシン重鎖１１の全長タンパク質及びその部分断片、並びに他のタンパク質又はタンパク質断片と結合ないしは会合した形態にあるミオシン重鎖１１タンパク質及びその部分断片が包含される。
血液試料は、血清でも血漿でもよいが、血漿を好ましく用いることができる。
本発明で対象となる動脈硬化には、初期の動脈硬化から、進行した後期の動脈硬化までが包含される。また動脈硬化は病理学的に粥状硬化、細動脈硬化、及び中膜石灰化の３タイプがあるが、本発明で対象となる動脈硬化にはこれらの３タイプが包含される。対象となる動脈硬化の典型例としては粥状硬化を挙げることができる。
動脈硬化により引き起こされる疾患（動脈硬化性疾患）としては、虚血性心疾患（狭心症、心筋梗塞）、大動脈瘤（胸部・腹部大動脈瘤、腸骨動脈瘤など）、閉塞性動脈硬化症、大動脈弁狭窄症、脳血管疾患（脳梗塞、脳卒中）などが挙げられる。本発明により動脈硬化そのものを検出することで、このような疾患を発症する前に発症のリスクを知ることができるので、自発的な生活習慣の改善を促し、動脈硬化性疾患の発症防止にもつながる。また、重篤な動脈硬化が検出された被検者においては、精密検査の実施及びその後の慎重な経過観察により、疾患の早期発見、早期治療が可能となる。
血中ミオシン重鎖１１レベルを測定する手段としては、ポリペプチドを測定可能な手段であれば特に限定されない。ポリペプチドを測定する手法としては免疫測定法や質量分析等を挙げることができるが、免疫測定法は大掛かりな機器類が不要であり測定操作も簡便なので、本発明においてもミオシン重鎖１１レベルの測定に好ましく用いることができる。ミオシン重鎖１１を検出可能な抗体は公知であり、市販品も存在する。市販品の抗ミオシン重鎖１１抗体は、典型的には、マウス、ウサギ等の非ヒト動物で調製された非ヒト動物ポリクローナル又はモノクローナル抗体である。また、上述の通りミオシン重鎖１１のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列も公知であるので、常法のハイブリドーマ法等によりミオシン重鎖１１を特異的に認識する抗ミオシン重鎖１１抗体を調製して用いてもよい。
抗ミオシン重鎖１１抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。ポリクローナル抗体として抗血清を用いてもよい。いずれも周知の常法により調製することができる。
具体的には、抗ミオシン重鎖１１ポリクローナル抗体は、例えば、化学合成又は遺伝子工学的手法により調製したミオシン重鎖１１タンパク質又はその部分断片を適宜アジュバントと共に非ヒト動物に免疫し、該動物から採取した血液から抗血清を得て、該抗血清中のポリクローナル抗体（非ヒト動物抗ミオシン重鎖１１ポリクローナル抗体）を精製することで得ることができる。免疫は、被免疫動物中での抗体価を上昇させるため、通常数週間かけて複数回行なう。抗血清中の抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、アフィニティーカラム精製等により行なうことができる。
モノクローナル抗体の周知の作製方法の一例として、ハイブリドーマ法を挙げることができる。具体的には、例えば、上記のように免疫した非ヒト動物から脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、ミオシン重鎖１１タンパク質と結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖させて培養上清から非ヒト動物抗ミオシン重鎖１１モノクローナル抗体を得ることができる。
免疫測定自体はこの分野において周知である。免疫測定法を反応形式に基づいて分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等があり、また、標識に基づいて分類すると、酵素免疫分析、放射免疫分析、蛍光免疫分析等がある。本発明においては、定量的検出が可能な免疫測定方法のいずれを用いてもよい。特に限定されないが、例えば、サンドイッチELISA等のサンドイッチ法を好ましく用いることができる。
上述した通り、平滑筋ミオシン分子には２分子のミオシン重鎖１１が含まれるが、そのような、ミオシン重鎖１１タンパク質又はその断片を２分子含む複合体は、ミオシン重鎖１１の同一部位を認識する同一の抗体を用いたサンドイッチ法で測定することができる。ミオシン重鎖１１タンパク質の単量体やその断片、又はミオシン重鎖１１を１分子しか含まない複合体をサンドイッチ法により測定したい場合には、ミオシン重鎖１１の異なる部位を認識する２種類の抗体を用いればよい。ポリクローナル抗体であれば、標識抗体と固相抗体の両者に同一のポリクローナル抗体を使用して単量体や断片を含めた測定が可能である。上述の通り、ミオシン重鎖１１には４種のアイソフォームが知られているが、４種に共通する領域を認識する抗体を用いれば、４種のアイソフォームの全てを網羅して測定することができる。４種のアイソフォームのそれぞれに特異的な抗体を用いれば、アイソフォームを区別しての測定や、特定のアイソフォームのみの測定も可能である。なお、図９−１〜９−５に示した通り、配列番号１〜４に示した４種のアイソフォームに共通する領域は、配列番号４における1番〜211番アミノ酸、219番〜1936番アミノ酸の領域であり、これらの領域ないしはその部分領域を抗体調製時の免疫原として用いれば、４種のアイソフォームの全てに反応する抗体を調製できる。また、配列番号４における第212番〜219番アミノ酸の領域がSM1B及びSM2Bに特異的な領域であり、配列番号４における1937番〜1945番アミノ酸の領域がSM2A及びSM2Bに特異的な領域であり、配列番号１における1930番〜1972番アミノ酸の領域がSM1A及びSM1Bに特異的な領域であるので、これらの領域ないしはその部分領域を認識する抗体を適宜組み合わせて用いることで、アイソフォームを区別しての測定や特定のアイソフォームのみの測定が可能である。
本発明においては、典型的にはミオシン重鎖１１タンパク質のC末端側領域を認識する抗体を好ましく使用できるが、N末端側領域を認識する抗体を用いてもよいし、またC末端側領域を認識する抗体とN末端側領域を認識する抗体を組み合わせて用いてもよい。なお、本発明において、N末端側領域とは、モータードメイン及び調節ドメインで構成される頭部とコイルドコイル構造をとる尾部の一部とを含むN末端側の領域であり、C末端側領域とは、コイルドコイル構造をとる尾部の大部分を含むC末端側の領域である。具体的には、例えば、配列番号４におけるアミノ酸配列の第840番アミノ酸付近からN末端側がN末端側領域、第840番アミノ酸付近からC末端側がC末端側領域である。C末端側領域を認識する抗体とは、ミオシン重鎖１１タンパク質のC末端側領域内にエピトープを有し、該C末端側領域内のいずれかの部位に結合する抗体である。N末端側領域を認識する抗体という語も同様である。
免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、ミオシン重鎖１１に結合する抗体を固相に不動化し（固相化抗体）、試料と反応させ、洗浄後、固相化抗体と同一又は異なる部位でミオシン重鎖１１に結合する抗体に標識を付した標識抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識抗体を測定する。固相化抗体と標識抗体は、いずれもポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。なお、免疫測定では、抗体に代えて該抗体の抗原結合性断片を用いることもできる。
「抗原結合性断片」とは、例えば免疫グロブリンのFab断片やF(ab')2断片のような、当該抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。このような抗原結合性断片もイムノアッセイに利用可能であることは周知であり、もとの抗体と同様に有用である。Fab断片やF(ab')2断片は、周知の通り、抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Fab断片やF(ab')2断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域 (scFv: single chain fragment of variable region) を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。scFvの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からscFvを回収することによりscFvを作製することができる。このようなscFvも「抗原結合性断片」に包含される。
標識抗体の測定は、標識物質からのシグナルを測定することにより行なうことができる。シグナルの測定方法は、標識物質の種類に応じて適宜選択される。例えば、酵素標識の場合、該酵素の基質を反応系内に添加し、酵素反応により生じる発色や発光の量を吸光光度計やルミノメータを用いて測定すればよい。ミオシン重鎖１１を種々の濃度で含む濃度既知の標準試料について、抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片を用いて免疫測定を行ない、標識からのシグナルの量と標準試料中のミオシン重鎖１１濃度との相関関係をプロットして検量線を作成しておき、ミオシン重鎖１１濃度が未知の検体について同じ操作を行なって標識からのシグナル量を測定し、測定値をこの検量線に当てはめることにより、検体中のミオシン重鎖１１を定量することができる。
固相化抗体と標識抗体の両者をモノクローナル抗体とする場合、モノクローナル抗体の組み合わせが好ましいかどうかは、実際に免疫測定を行なってみることで容易に調べることができる。所望により、抗体の認識部位の同定を行なって、異なるエピトープを認識するかどうかを調べてもよい。抗体の認識部位の同定は、この分野で周知の常法により行なうことができる。簡潔に説明すると、例えば、対応抗原であるミオシン重鎖１１をトリプシン等のようなタンパク質分解酵素により部分消化し、認識部位を調べるべき抗体を結合させたアフィニティーカラムに部分消化物溶液を通じて消化物を結合させ、次いで結合した消化物を溶出させて常法の質量分析を行なうことにより、抗体の認識部位を同定することができる。
健常者よりも高い血中ミオシン重鎖１１レベルは動脈硬化を有することの指標となる。血中ミオシン重鎖１１レベルの測定により、動脈硬化の検出を補助するデータを提供することができる。動脈硬化の検出という語には、重篤な動脈硬化の検出が包含される。被検者の血中ミオシン重鎖１１レベル測定値が健常者よりも高い場合、該被検者は動脈硬化病変を有するおそれがあると判断することができる。また、血中ミオシン重鎖１１レベルが高いほど、動脈硬化病変が体内に存在する可能性が高い、又は動脈硬化の重篤度がより高いおそれがあると判断することができる。「重篤度の高い動脈硬化」及び「重篤な動脈硬化」という語には、体内に存在する動脈硬化病変部の数が多い状態、及び体内に存在する動脈硬化病変の進行度が高い状態が包含される。「進行度が高い動脈硬化」及び「進行した動脈硬化」という語は、血管造影で５０％以上、例えば６０％以上、７０％以上、又は７５％以上の狭窄を認めるレベルの動脈硬化をいう。なお、血管造影での狭窄の割合は、この分野で周知の通り、狭窄の前後の健常と考えられる血管直径に比べてどの程度狭くなっているかを表したものであり、例えば７５％狭窄とは、造影されている部分の直径が、その前後の血管直径を１００％とした時に２５％であることをいう。
健常者より血中ミオシン重鎖１１レベルが高いか否かは、例えば、多数の健常者について測定された血中ミオシン重鎖１１レベルから定められた健常基準値をカットオフ値とし、このカットオフ値との比較により判断することができる。健常者は、動脈硬化を有しない人であり、動脈硬化性疾患の症状を有する人は当然に除外される。健常者の選定においては、動脈硬化を有しない人を自己申告等に基づいて選定すればよいが、例えば、動脈硬化性疾患に加え、動脈硬化の危険因子として知られる脂質異常症、高血圧、糖尿病、肥満などの生活習慣病を有していない人を選定してもよいし、あるいはさらに、喫煙習慣がないこと、動脈硬化性疾患の家族歴等も考慮して選定してもよい。健常基準値は、例えば、健常者の血中ミオシン重鎖１１レベルの平均値、又は該平均値に標準誤差を加算した値であり得る。被検者の血中ミオシン重鎖１１レベルの測定値がこのカットオフ値よりも高い場合には動脈硬化病変を有するおそれがあり、その測定値が高いほど動脈硬化病変を有する可能性が高い、あるいは動脈硬化の重篤度がより高いおそれがある、と判断することができる。このカットオフ値は、年代ごと（例えば、３０歳未満、３０歳代、４０歳代、５０歳代、６０歳代、７０歳以上など）に設定してもよい。
要治療処置レベルまで進行しているおそれのある特に重篤な動脈硬化を検出する目的で本発明を実施することも可能である。この場合、冠動脈疾患や末梢動脈疾患等の重篤な動脈硬化性疾患を発症している患者群について測定された血中ミオシン重鎖１１レベルから、重度動脈硬化基準値を定めてもよい。重度動脈硬化基準値は、当該患者群の血中ミオシン重鎖１１レベルの測定値の平均値、又はその平均値から標準誤差を差し引いた値などを採用することができる。被検者の測定値がこの重度動脈硬化基準値に近い場合、又は該基準値を超える場合、当該被検者は特に重篤な動脈硬化を有しているおそれがあると判断することができる。そのような被検者に対して早急に精密検査を行ない、異常が確認された場合にはただちに治療処置、ないしは経過観察を慎重に行なうことで、動脈硬化性疾患の早期発見・早期治療が可能になる。
また、本発明は、動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療処置の治療効果判定や、臨床試験等における治療薬候補物質の治療効果の判定にも活用することができる。治療処置を受けた患者において、治療処置前と比較して血中ミオシン重鎖１１レベルが低下した場合、その治療処置により治療効果が得られていると判断することができる。また、治療薬候補物質の投与を受けた患者において、投与前と比較して血中ミオシン重鎖１１レベルが低下した場合、その治療薬候補物質に動脈硬化又は動脈硬化性疾患の治療効果があると判断することができる。
抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片は、動脈硬化検出キットとして提供することができる。抗ミオシン重鎖１１抗体は、上述した通り、４種のアイソフォームに共通する領域を認識し、４種のアイソフォームの全てを網羅して測定できる抗体でもよいし、４種のアイソフォームを区別して認識するアイソフォーム特異的な抗体であってもよい。抗ミオシン重鎖１１抗体がアイソフォーム特異的な抗体の場合、動脈硬化検出キットは、４種のアイソフォームに特異的な各抗体を全て含んでいてもよいし、いずれか一部のみを含んでいてもよい。また、該キットの好ましい例としては、ミオシン重鎖１１タンパク質のC末端側領域を認識する抗体を含むキットが挙げられるが、N末端側領域を認識する抗体を含むキットであってもよいし、C末端側領域を認識する抗体とN末端側領域を認識する抗体の両者を含むキットであってもよい。
動脈硬化検出キットには、通常、使用説明書が含まれる。サンドイッチ法による検出キットの場合、固相としてプレートや磁性粒子などの粒子がさらにキットに含まれ得る。抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片は、標識抗体及び固相化抗体として含まれ得る。標識抗体と固相化抗体は、上述した通り、同一の抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片でもよいし、異なる抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片でもよい。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．サンドイッチELISAによる血中ミオシン重鎖１１の定量（その１）
＜材料及び方法＞
動脈硬化の進行により冠動脈や大動脈、末梢血管に狭窄、梗塞、瘤等の動脈疾患を発症し、カテーテル治療又はステント治療を受けた患者を対象とした。各患者における動脈硬化病変の存在は、血管造影（狭窄・梗塞の確認）又はCT（石灰化の確認）により確認した。動脈硬化性が確定できない患者は除外した。インターベンション前又はインターベンション直後〜数日以内に各患者から採取した血液より血漿を分離し、血漿中のミオシン重鎖１１（MYH11）レベルを血中MYH11レベルとして測定した。陰性対照の正常血漿サンプル50名分（コーカサス人、ヒスパニック系、黒人を含む）は市販品を購入して使用した。
＜材料及び方法＞
動脈硬化の進行により冠動脈や大動脈、末梢血管に狭窄、梗塞、瘤等の動脈疾患を発症し、カテーテル治療又はステント治療を受けた患者を対象とした。各患者における動脈硬化病変の存在は、血管造影（狭窄・梗塞の確認）又はCT（石灰化の確認）により確認した。動脈硬化性が確定できない患者は除外した。インターベンション前又はインターベンション直後〜数日以内に各患者から採取した血液より血漿を分離し、血漿中のミオシン重鎖１１（MYH11）レベルを血中MYH11レベルとして測定した。陰性対照の正常血漿サンプル50名分（コーカサス人、ヒスパニック系、黒人を含む）は市販品を購入して使用した。
血漿中のMYH11レベルの測定は、抗MYH11抗体を固相抗体及び標識抗体とするヒトミオシン重鎖11 ELISAキット（CUSABIO社）を用いたサンドイッチELISAにより行なった。抗MYH11抗体の標識としてHRPを使用し、検出にはTMBを基質として用いてルミノメータにより発色を検出した。平滑筋ミオシンを種々の濃度で含む標準試料を用いて検量線を作成し、この検量線に当てはめて各検体中のMYH11濃度を算出した。平滑筋ミオシンは上記キット（CUSABIO社）に付随したリコンビナント蛋白を使用した。
なお、ここで使用した抗MYH11抗体の認識領域について、MYH11のアイソフォームSM2Bの全長（配列番号４）をおよそ半分に分けてN末端側断片（R1）とC末端側断片（R2）を調製し、各断片との反応性をELISAにより調べたところ、当該抗体はR1とは反応せず、R2とのみ反応した。このことから、当該抗体はMYH11のC末側半分の領域内（配列番号４における950番〜1945番アミノ酸の領域内）のいずれかの部位を認識していることが確認された。また、上記ELISAキットの固相抗体は、MYH11の異なる二つの断片に反応があることが確認され、ポリクローナル抗体と推察された。
＜結果＞
図１−１は、正常50名及び動脈硬化を有する患者計78名の、血中MYH11レベルの測定結果である。正常群と比較して、動脈硬化患者群では明らかに血中MYH11が高値であった。
＜結果＞
図１−１は、正常50名及び動脈硬化を有する患者計78名の、血中MYH11レベルの測定結果である。正常群と比較して、動脈硬化患者群では明らかに血中MYH11が高値であった。
図１−２は、血中MYH11レベルによる動脈硬化群の検出能をROC解析により評価した結果である。この結果より、独立変数である血漿中のMYH11濃度と二分変数である動脈硬化の有無というアウトカムとの関係が有意に強いということが示された。また、ROC曲線下面積（AUC: area under the curve）は0.9290であった。AUCは0.5〜1.0の値をとり、AUC 0.5〜0.7はLow accuracy、AUC 0.9〜0.7はModerate accuracy、AUC 0.9〜1.0 High accuracyと判断される。本件ではAUCが0.9以上となっており、血中MYH11レベルを指標とした動脈硬化病変診断の有用性が高いことが示された。
図２−１は、動脈硬化を有する患者群のうち、経皮的冠動脈形成術（PCI）を受けた患者29名及び末梢動脈血管内治療（EVT）を受けた患者17名について、正常群と血中MYH11レベルの測定値を対比した結果である。これらの患者群は、下肢動脈等の末梢動脈や冠動脈に治療処置が必要なほどの非常に進行した動脈硬化を有する患者であり、このような非常に重篤な動脈硬化病変においては血中MYH11レベルが特に高いことが確認された。図２−２は、各動脈硬化患者群の血中MYH11レベルによる検出能をROC解析により評価した結果であるが、いずれもAUCは0.95を超える高い値であった。
２．サンドイッチELISAによる血漿中ミオシン重鎖１１の定量（その２）
＜材料及び方法＞
動脈硬化検体として、上記１．の動脈硬化患者血漿のうち、PCI適用患者29名（69.5±1.4歳、BMI: 22.4±0.5、男：女＝26:3）及びEVT適用患者17名（72.4±1.4歳、BMI: 23.6±1.1、男：女＝13:4）に由来する血漿を用いた。正常検体として、動脈硬化及びそのリスクファクターのない日本人健常者40名（70.4±0.6歳、BMI: 23.3±0.2、男：女＝33:7）の血漿を用いた。サンドイッチELISAは、上記１．と同じくCUSABIO社のELISAキットを用いて行なった。
＜材料及び方法＞
動脈硬化検体として、上記１．の動脈硬化患者血漿のうち、PCI適用患者29名（69.5±1.4歳、BMI: 22.4±0.5、男：女＝26:3）及びEVT適用患者17名（72.4±1.4歳、BMI: 23.6±1.1、男：女＝13:4）に由来する血漿を用いた。正常検体として、動脈硬化及びそのリスクファクターのない日本人健常者40名（70.4±0.6歳、BMI: 23.3±0.2、男：女＝33:7）の血漿を用いた。サンドイッチELISAは、上記１．と同じくCUSABIO社のELISAキットを用いて行なった。
＜結果＞
図３−１は、PCI適用動脈硬化患者及びEVT適用動脈硬化患者について、正常日本人40名と血中MYH11レベルの測定値を対比した結果である。図３−２は、各動脈硬化患者群の血中MYH11レベルによる検出能をROC解析により評価した結果である。日本人健常者との対比でも、動脈硬化患者の血中MYH11レベルは有意に高く、AUCも0.9を超える高い値であった。
図３−１は、PCI適用動脈硬化患者及びEVT適用動脈硬化患者について、正常日本人40名と血中MYH11レベルの測定値を対比した結果である。図３−２は、各動脈硬化患者群の血中MYH11レベルによる検出能をROC解析により評価した結果である。日本人健常者との対比でも、動脈硬化患者の血中MYH11レベルは有意に高く、AUCも0.9を超える高い値であった。
３．血中ミオシン重鎖１１レベルによる動脈硬化の診断性能の検討
(１) CRPとの診断性能の比較
C-reactive protein (CRP)は心血管イベント予測のマーカーであり、動脈硬化でも血中CRP値が上昇することが知られている（Blankengerg S, et al., Circulation 2010; 121: 2388-97）。血中ミオシン重鎖１１レベルによる動脈硬化の診断性能について評価するため、上記２．と同じ動脈硬化患者（PCI患者29名、EVT患者17名）及び日本人健常者の血漿中CRPレベルを調べた。
(１) CRPとの診断性能の比較
C-reactive protein (CRP)は心血管イベント予測のマーカーであり、動脈硬化でも血中CRP値が上昇することが知られている（Blankengerg S, et al., Circulation 2010; 121: 2388-97）。血中ミオシン重鎖１１レベルによる動脈硬化の診断性能について評価するため、上記２．と同じ動脈硬化患者（PCI患者29名、EVT患者17名）及び日本人健常者の血漿中CRPレベルを調べた。
図４は動脈硬化患者46名の血中MYH11レベルと血中CRPレベルの相関を調べた結果である。両者の間に相関は無く、独立した因子であることが確認された。
図５は、各動脈硬化患者群の血中CRPレベルによる検出能をROC解析により評価した結果である。いずれもAUCは0.9を下回る低い値であり、MYH11と比べてCRPによる動脈硬化の診断能は低いことが確認された。
(２) 動脈硬化リスクファクターとの関係性
喫煙は主要な動脈硬化リスクファクターの１つであり、喫煙と動脈硬化は相関することが知られている。日本人健常者、PCI患者、EVT患者の血漿中MYH11レベルとブリンクマンインデックス（１日の喫煙本数×喫煙年数）との相関を調べたところ、図６に示す通り、両者の間には相関があった。健常であっても動脈硬化は加齢とともにゆるやかに進行することから、健常者集団の中にはごく軽度の動脈硬化を有する者も含まれていると考えられる。PCI患者及びEVT患者は、治療処置が必要なレベルの動脈硬化重症例である。図６に示したデータは、軽度の動脈硬化でも血中MYH11レベルによって検出し得ることを示唆している。
喫煙は主要な動脈硬化リスクファクターの１つであり、喫煙と動脈硬化は相関することが知られている。日本人健常者、PCI患者、EVT患者の血漿中MYH11レベルとブリンクマンインデックス（１日の喫煙本数×喫煙年数）との相関を調べたところ、図６に示す通り、両者の間には相関があった。健常であっても動脈硬化は加齢とともにゆるやかに進行することから、健常者集団の中にはごく軽度の動脈硬化を有する者も含まれていると考えられる。PCI患者及びEVT患者は、治療処置が必要なレベルの動脈硬化重症例である。図６に示したデータは、軽度の動脈硬化でも血中MYH11レベルによって検出し得ることを示唆している。
４．ミオシン重鎖１１の血中様態の解析
＜材料及び方法＞
（１）抗体固定化微粒子の調製
抗体を固相する磁性微粒子（Dynabeads(登録商標) M-280 Tosylactivated; Thermo Fisher Scientific）をプロトコルに記載されている緩衝液にて懸濁し、Anti MYH11 Human（HPA015310; コスモバイオ）を混合させ、３７℃で１７時間抗体を固定化した。抗体固定化後、１０％のBlockmaster CE510（JSR）を含む0.05 mol/L Tris-HCl緩衝液（pH8.0）中に抗体固定化微粒子を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートしてブロッキングを行い、0.2 mg/mL beadsの抗MYH11抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。
＜材料及び方法＞
（１）抗体固定化微粒子の調製
抗体を固相する磁性微粒子（Dynabeads(登録商標) M-280 Tosylactivated; Thermo Fisher Scientific）をプロトコルに記載されている緩衝液にて懸濁し、Anti MYH11 Human（HPA015310; コスモバイオ）を混合させ、３７℃で１７時間抗体を固定化した。抗体固定化後、１０％のBlockmaster CE510（JSR）を含む0.05 mol/L Tris-HCl緩衝液（pH8.0）中に抗体固定化微粒子を懸濁し、３７℃で５時間インキュベートしてブロッキングを行い、0.2 mg/mL beadsの抗MYH11抗体固定化磁性微粒子（Ａ）を得た。
（２）内部標準ペプチドの調整
MYH11のターゲットペプチドであるMyosin Motor構造由来ペプチド（N末端側構造由来のペプチドとして; ALELDPNLYR; 配列番号４の760番〜769番残基の領域）及びCoiled-coil構造由来ペプチド（C末端側構造由来のペプチドとして; LEVNMQALK; 配列番号４の1572番〜1580番残基の領域）を選定し、安定同位体標識（１３Ｃ及び１５Ｎ）したペプチドを合成した（AQUAペプチド; Sigma-Aldrich）。
MYH11のターゲットペプチドであるMyosin Motor構造由来ペプチド（N末端側構造由来のペプチドとして; ALELDPNLYR; 配列番号４の760番〜769番残基の領域）及びCoiled-coil構造由来ペプチド（C末端側構造由来のペプチドとして; LEVNMQALK; 配列番号４の1572番〜1580番残基の領域）を選定し、安定同位体標識（１３Ｃ及び１５Ｎ）したペプチドを合成した（AQUAペプチド; Sigma-Aldrich）。
（３）測定サンプルの調整
上記１．で用いた患者検体のうち、血漿中MYH11レベルが比較的高い値で検出された患者数名の血漿をプールした検体を患者検体として用いた。陰性対照の健常者検体には、日本人健常者６名分のプール血漿検体を用いた。
上記１．で用いた患者検体のうち、血漿中MYH11レベルが比較的高い値で検出された患者数名の血漿をプールした検体を患者検体として用いた。陰性対照の健常者検体には、日本人健常者６名分のプール血漿検体を用いた。
磁性微粒子を用いた免疫反応は、検体をPBSTで希釈した溶液中に（Ａ）を懸濁し、３時間室温にて撹拌反応させた。溶出液には８Ｍ尿素を含む0.1Nの塩酸を用い、溶出液（Ｂ）を得た。（Ｂ）を1M Trisで中和後、常法に従い還元アルキル化した。終濃度5.0μg/mLとなるようにトリプシンを加えて３７℃で１７時間インキュベーションし、タンパク質消化産物（Ｃ）を得た。得られた（Ｃ）の溶液に対して、内部標準ペプチド（１０ ｆmol）を添加しGL-Tip SDB（ジーエルサイエンス）で脱塩・濃縮を行い、MRM測定用サンプル（Ｄ）を得た。
（４）Multiple Reaction Monitoring（MRM）法によるペプチド情報の取得
得られたMRM測定用サンプル（Ｄ）を、三連四重極型質量分析装置QTRAP 5500（AB SCIEX）に供して、二つのペプチド、MYH11-Myosin MotorペプチドおよびMYH11-Coiled-coilペプチドの測定を行った。両ペプチドを検出、定量するためのMRMメソッドを表1に示した。測定結果はSkylineソフトウェアにて解析した。定量用チャネル（Quantitation）におけるMRMシグナルの溶出時間が、対応する確認用チャネル（Verification）のシグナルと一致していることを確認することで、シグナルの信頼性を評価した。次に、各ペプチドの定量用チャネルにおいて、Heavyペプチドに対するLightペプチドのピーク面積比を算出することで、分析サンプル中に含まれる両ペプチドのモル濃度を計算した。
得られたMRM測定用サンプル（Ｄ）を、三連四重極型質量分析装置QTRAP 5500（AB SCIEX）に供して、二つのペプチド、MYH11-Myosin MotorペプチドおよびMYH11-Coiled-coilペプチドの測定を行った。両ペプチドを検出、定量するためのMRMメソッドを表1に示した。測定結果はSkylineソフトウェアにて解析した。定量用チャネル（Quantitation）におけるMRMシグナルの溶出時間が、対応する確認用チャネル（Verification）のシグナルと一致していることを確認することで、シグナルの信頼性を評価した。次に、各ペプチドの定量用チャネルにおいて、Heavyペプチドに対するLightペプチドのピーク面積比を算出することで、分析サンプル中に含まれる両ペプチドのモル濃度を計算した。
＜結果＞
内部標準ペプチドを指標に、検体中にあるMYH11について、二つのターゲットペプチドの定量用チャネルよりモル濃度を測定した。結果を図７に示す。比較対象とした健常者検体では、どちらのペプチドも検出限界以下であった。一方、動脈硬化検体では、MYH11のＣ末端側構造に由来するペプチドが非常に高値で検出され、健常者よりも有意に高いことが判明した。N末端側構造に由来するペプチドは、C末端側構造に由来するペプチドと比べると低値ではあるものの、やはり同様に健常者と比較して動脈硬化検体の方が有意に高いことが判明した。
内部標準ペプチドを指標に、検体中にあるMYH11について、二つのターゲットペプチドの定量用チャネルよりモル濃度を測定した。結果を図７に示す。比較対象とした健常者検体では、どちらのペプチドも検出限界以下であった。一方、動脈硬化検体では、MYH11のＣ末端側構造に由来するペプチドが非常に高値で検出され、健常者よりも有意に高いことが判明した。N末端側構造に由来するペプチドは、C末端側構造に由来するペプチドと比べると低値ではあるものの、やはり同様に健常者と比較して動脈硬化検体の方が有意に高いことが判明した。
５．血中MYH11レベルの動脈硬化性疾患の予後との関係性
PCI又はEVTを受けた患者の術後経過を観察したところ（観察期間1〜2.5年）、３名の死亡例があった。インターベンション直後の死亡ではないことから、インターベンションの手技による死亡ではないことは明らかである。
１．EVTインターベンション後64日後 感染症により死亡
２．EVTインターベンション後294日後 感染症により死亡
３．PCIインターベンション後163日後 播種性血管内凝固症候群（DIC）により死亡
PCI又はEVTを受けた患者の術後経過を観察したところ（観察期間1〜2.5年）、３名の死亡例があった。インターベンション直後の死亡ではないことから、インターベンションの手技による死亡ではないことは明らかである。
１．EVTインターベンション後64日後 感染症により死亡
２．EVTインターベンション後294日後 感染症により死亡
３．PCIインターベンション後163日後 播種性血管内凝固症候群（DIC）により死亡
これら死亡群と生存患者群との間でインターベンション前又はインターベンション直後〜数日以内の血中MYH11レベルを比較したところ、図８に示す通り、死亡群の方が血中MYH11レベルが高かった。末梢動脈の狭窄や閉塞で生じる末梢動脈疾患では、重篤な感染症のリスクが高まることが知られている（https://www.nhlbi.nih.gov/health/health-topics/topics/atherosclerosis）。また、DICは様々な基礎疾患をベースに起こり得る病態であり、インターベンションを要する冠動脈狭窄はDICの基礎疾患の１つである。このデータは、血中MYH11レベルが動脈硬化性疾患の予後の指標としても有用であることを示唆している。
Claims (2)
- 動脈硬化の検出を補助する方法であって、被検者から分離された血液試料中のミオシン重鎖１１レベルを測定することを含み、健常者よりも高いミオシン重鎖１１レベルは、当該被検者が動脈硬化を有することの指標となる、方法。
- 抗ミオシン重鎖１１抗体又はその抗原結合性断片を含む、血液試料中のミオシン重鎖１１レベルに基づき動脈硬化を検出するためのキットであって、健常者よりも高い血中ミオシン重鎖１１レベルが動脈硬化の存在の指標となる、キット。
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