JP2023156159A - がんリスクの試験方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】 がんリスクを試験する新たな方法を提供する。【解決手段】 本発明は、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１タンパク質レベルを取得する取得工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１ががんマーカであることを特徴とする、がんリスクを試験する方法である。前記検体は、例えば、体液であり、具体例として、血液、尿等があげられる。【選択図】図１
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り ▲１▼ 刊行物等：第４１回日本分子腫瘍マーカー研究会 プログラムおよび抄録 ウェブサイトの掲載日：令和３年９月１０日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｃｏｍｕ．ｊｐ／ｊｓｍｔｍｒ２０２１／ ▲２▼刊行物等：第４１回日本分子腫瘍マーカー研究会 プログラム集・抄録集 発行日：令和３年９月２９日 ▲３▼ 刊行物等：第４１回日本分子腫瘍マーカー研究会 発表資料 開催日：令和３年９月２９日 集会名：第４１回日本分子腫瘍マーカー研究会 開催場所：パシフィコ横浜 ▲４▼ 刊行物等：第６回Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ研究会 プログラム ウェブサイトの掲載日：令和３年１２月２９日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｍｕｒａａ９．ｗｉｘｓｉｔｅ．ｃｏｍ／ｌｉｑｕｉｄｂｉｏｐｓｙ／ｈｉｓｔｏｒｙ ｈｔｔｐｓ：／／７９ｃｂｃｃ１１－ｄ６ａｅ－４ｃａａ－ａ６４ａ－５２２ａｃｆ７６９ａ２．ｆｉｌｅｓｕｓｒ．ｃｏｍ／ｕｇｄ／ｄ０ｂｆｆｂ＿ｄｅ１ｄｂｃ８ａ６７５ｅ４９ｂ９ｂｃｅ３８９３ａ２ｂｆ２ｆ７６７．ｐｄｆ ▲５▼ 刊行物等：第６回Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ研究会 プログラム抄録集 発行日：令和４年１月８日 ▲６▼ 刊行物等：第６回Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ研究会 発表資料 開催日：令和４年１月２９日 集会名：第６回Ｌｉｑｕｉｄ Ｂｉｏｐｓｙ研究会 開催場所：ＷＥＢ開催
本発明は、がんリスクの試験方法に関する。
医療の発達により、がんは不治の病ではなくなってきているが、そのためにも重要なのが、がんの早期発見と予後の判断といわれている。このため、がんの診断においては、早期発見や予後の判断に利用できる新たなマーカが求められている。
そこで、本発明は、がんリスクを試験する新たな方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明は、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得する取得工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１ががんマーカであることを特徴とする、がんリスクを試験する方法である。
ＬＡＴ１タンパク質は、アミノ酸トランスポーターであり、正常細胞にも存在するが、がん細胞において特異的に発現が増加することが知られている。しかしながら、ＬＡＴ１タンパク質は、細胞膜上のタンパク質であるため、これをバイオマーカとして検出するには、細胞そのものに対するＬＡＴ１タンパク質の検出が必要であった。一方、本発明者らは、鋭意研究の結果、がん細胞から分泌される細胞外小胞が、細胞外小胞上にＬＡＴ１タンパク質を有すること、また、分泌された細胞外小胞が体液中に放出されることを初めて見出した。このことから、まず、細胞そのものではなく、細胞から分泌された細胞外小胞についてＬＡＴ１タンパク質を検出することにより、被検者ががんに罹患している可能性を試験することが可能になった。さらに、例えば、血液等の体液を検体とし、前記体液に放出された細胞外小胞のＬＡＴ１タンパク質を検出することも可能であるため、患者および医師等の医療従事者の負担となる生検も回避できる。したがって、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用な技術といえる。
本発明において、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）は、以下、ＥＶｓともいう。本発明のがんリスクを試験する方法は、以下、本発明の試験方法ともいう。
本発明の試験方法は、例えば、前記ＬＡＴ１が、ＬＡＴ１タンパク質である。
本発明の試験方法は、例えば、前記検体が、被検者から採取した体液である。
本発明の試験方法は、例えば、前記検体が、被検者から採取した血液または尿である。
本発明の試験方法は、例えば、前記検体が、細胞が除去された検体である。
本発明の試験方法は、例えば、さらに、前記被検者由来の検体のＬＡＴ１レベルと評価基準とを比較する比較工程を含み、前記評価基準は、がんに罹患していない陰性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルであり、前記被検者のＬＡＴ１レベルが、前記評価基準と比較して高い場合、前記被検者はがんに罹患している可能性があることを意味する。
本発明の試験方法は、例えば、さらに、前記被検者由来の検体のＬＡＴ１レベルと評価基準とを比較する比較工程を含み、前記評価基準は、がんに罹患している陽性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの検出結果であり、前記被検者の検出結果が、前記評価基準と比較して同一または高い場合、前記被検者はがんに罹患している可能性があることを意味する。
本発明の試験方法は、例えば、前記被検者由来の経時的な複数の検体について、前記取得工程を行い、前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの経時変化情報を得る。
本発明の試験方法は、例えば、前記がんが、前立腺がんまたは乳がんである。
本明細書において、「健常者」とは、本発明における試験の対象となるがんに罹患していない者（がんを発症していない者）を意味する。本明細書における健常者は、例えば、試験の対象となるがん以外の疾患に罹患しているか否かは制限されず、好ましくは、試験の対象となるがん以外の疾患にも罹患していない者である。
＜がんリスクの試験方法＞
本発明の試験方法は、前述のように、がんリスクを試験する方法であり、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得する取得工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１ががんマーカであることを特徴とする。本発明のがんリスクの試験方法は、例えば、がんリスクの判定方法ともいえる。また、前記細胞外小胞のＬＡＴ１レベルは、例えば、がんリスクの診断のための情報になることから、本発明の試験方法は、がんリスクの診断のための情報を取得する方法または提供する方法ともいえる。
本発明の試験方法は、前述のように、がんリスクを試験する方法であり、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得する取得工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１ががんマーカであることを特徴とする。本発明のがんリスクの試験方法は、例えば、がんリスクの判定方法ともいえる。また、前記細胞外小胞のＬＡＴ１レベルは、例えば、がんリスクの診断のための情報になることから、本発明の試験方法は、がんリスクの診断のための情報を取得する方法または提供する方法ともいえる。
本発明において、ＬＡＴ１を有する細胞外小胞を、以下、「ＬＡＴ１陽性細胞外小胞」ともいう。
本発明において、がんリスクとは、例えば、罹患可能性、がんステージ（病期）、外科的手術または化学治療、ホルモン療法、もしくは免疫療法等の各種治療の経過状況、または予後等があげられる。罹患可能性とは、例えば、がんに罹患している可能性、またはがんに罹患する可能性を含む。
がんステージは、例えば、ステージ分類（臨床進行期分類）により決定される。ステージは、例えば、Ｉ、II、III、およびIV、より詳細には、ステージ０、Ｉ、IIＡ、IIＢ、IIIＡ、IIIＢ、IIIＣ、およびＩＶに分類できる。
ＬＡＴ１（L-type amino acid transporter 1）は、例えば、ヒト由来の配列情報が、データベース（NCBIデータベース）にアクセッションNo. NP_003477で登録されている。
前記診断のための情報は、例えば、前記検体に含まれる前記細胞外小胞におけるＬＡＴ１レベルである。前記ＬＡＴ１レベルは、例えば、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベルがあげられるが、ＬＡＴ１タンパク質レベルが好ましい。前記レベルは、例えば、ＬＡＴ１の存在の程度を示す指標である。前記存在の程度を示す指標は、例えば、有無、量、または濃度等であり、これらを実質的、または間接的もしくは相対的に示す数値が好ましい。実質的な数値は、例えば、量または濃度であり、間接的または相対的な数値は、例えば、後述する発色シグナル、放射線シグナル等の測定値があげられる。量または濃度の実質的な数値は、例えば、間接的または相対的な数値（例えば、測定値）から換算された値でもよい。前記細胞外小胞におけるＬＡＴ１レベルは、例えば、検体に含まれる全細胞外小胞の量または濃度と、前記検体に含まれるＬＡＴ１タンパク質（細胞外小胞上のＬＡＴ１タンパク質）の量または濃度との相対関係により表すこともできる。
また、前記検体に含まれる前記細胞外小胞におけるＬＡＴ１レベルは、例えば、その膜上にＬＡＴ１タンパク質を有する細胞外小胞、すなわちＬＡＴ１陽性細胞外小胞のレベルでもよい。具体例として、例えば、検体中のＬＡＴ１陽性細胞外小胞の量もしくは濃度、または全細胞外小胞におけるＬＡＴ１陽性細胞外小胞の割合等により表すこともできる。
本発明において試験の対象となるがん（以下、対象がんともいう）は、特に制限されず、例えば、前立腺がん、乳がん、膵臓がん、大腸がん、胃がん、食道がん、肝がん、肺がん、前立腺がん、腎がん、頭頸部がん等があげられる。
本発明において、細胞外小胞は、例えば、エンドサイトーシスパスウェイにより分泌されるエクソソーム、マイクロベシクル（微小小胞体）、アポトーシス小体等であり、中でも、例えば、エクソソームである。エクソソームは、一般的に、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、フロチリン等のマーカ分子により検出できる。
本発明における前記検体は、例えば、被検者から採取した体液があげられ、具体例としては、例えば、血液、尿があげられる。前記血液は、例えば、全血、血漿、血清があげられ、中でも、細胞を除去した血液、すなわち、血漿または血清が好ましい。本発明において、血液や尿等の前記体液を検体とする場合、例えば、前述のように、生検等を回避でき、被検者や医療従事者の負担を軽減できる。そして、本発明において、前記体液を検体とすることによって、例えば、被検者について、前述したいずれかの対象がんリスクを試験できる。
また、前記検体は、例えば、体液そのものでもよいし、体液から回収した細胞外小胞を含む検体でもよい。細胞外小胞の回収方法は、特に制限されず、例えば、体液を超遠心分離することにより、沈殿画分として回収できる。また、前記体液が血液の場合、例えば、血清から回収でき、具体例としては、前記血清を超遠心分離することにより、沈殿画分として回収できる。前記超遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、３０，０００～５０，０００ｒｐｍ、２０～９０分、２～６℃であり、具体例として、ベックマンコールター社製のローター ＴＬＳ－５５を用いた場合、４９，５００ｒｐｍ、３２分、４℃、もしくはベックマンコールター社製のローター ＳＷ４１－Ｔｉを用いた場合、３５，０００ｒｐｍ、７０分、４℃等が例示できる。
本発明における前記検体は、血液、尿等の体液には制限されず、例えば、被検者から採取した試料（体液以外）から調製した検体でもよい。前記試料としては、例えば、細胞があげられる。前記細胞は、例えば、所望の器官、臓器、組織等から採取できる。前記被検者から細胞を採取した場合、例えば、採取した細胞を培養した培養物を前記検体として使用できる。前記細胞を培地で培養することによって、例えば、前記細胞から分泌される細胞外小胞を、前記培地中に放出できる。前記検体は、例えば、前記培養物から細胞を除去した上清（液体画分ともいう）が好ましい。前記細胞を除去した検体を使用することによって、例えば、前記細胞がＬＡＴ１を有する場合でも、前記細胞外小胞のＬＡＴ１のみを検出できる。そして、本発明において、前記細胞を検体とすることによって、例えば、被検者について、前記細胞の採取元である組織におけるがんリスクを試験できる。
また、前記検体は、例えば、前記上清から回収した細胞外小胞を含む検体でもよい。細胞外小胞の回収方法は、特に制限されず、例えば、前記上清から回収でき、具体例としては、前記上清を超遠心分離することにより、沈殿画分として回収できる。前記超遠心分離の条件は、特に制限されず、例えば、前述と同様である。
本発明の試験方法において、前記取得工程は、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得する工程である。前記ＬＡＴ１レベルは、例えば、前記検体を用いて前記検体の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを検出することにより取得してもよいし、前記検体についてすでに検出結果として得られているＬＡＴ１レベルを取得してもよい。前記検出は、例えば、定性でも定量でもよく、測定でもよい。
前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを検出する方法は、特に制限されず、例えば、ＬＡＴ１に結合する物質（以下、ＬＡＴ１用結合物質という）が使用でき、前記細胞外小胞のＬＡＴ１と前記ＬＡＴ１用結合物質との結合を検出することで、前記細胞外小胞のＬＡＴ１を検出できる。前記結合物質は、ＬＡＴ１に特異的に結合する物質であることが好ましい。前記細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの検出は、例えば、細胞外小胞上のＬＡＴ１タンパク質の検出が好ましい。
前記ＬＡＴ１用結合物質の種類は、特に制限されず、前記ＬＡＴ１レベルがＬＡＴ１タンパク質レベルの場合、例えば、抗体、抗原結合断片（抗原結合ペプチド）、アプタマー等があげられる。
前記抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体のいずれでもよく、また、そのアイソタイプは、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹ等があげられる。前記抗原結合断片は、例えば、ＬＡＴ１タンパク質を認識して結合できればよく、抗体の一部（部分断片）を含むタンパク質またはペプチド等があげられる。前記抗原結合断片は、例えば、前記抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有している断片があげられ、具体例として、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖともいう）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２ともいう）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（またはトリボディ）、テトラボディ（または［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖともいう）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、またはそれらの重合体等があげられる。
前記アプタマーは、例えば、核酸分子（核酸アプタマーともいう）があげられる。前記アプタマーの構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基または非ヌクレオチド残基である。前者は、例えば、糖と、プリンまたはピリミジン等の塩基と、リン酸とを含む、デオキシリボヌクレオチド骨格またはリボヌクレオチド骨格があげられ、後者は、例えば、ピロリジンまたピペリジン等の塩基を含む非ヌクレオチド骨格があげられる。前記構成単位は、例えば、天然型でも、人工の非天然型でもよい。前記アプタマーは、例えば、同じ構成単位から形成されてもよいし、二種類以上の構成単位から形成されてもよい。前記アプタマーは、例えば、修飾型でも非修飾型でもよく、前者の場合、例えば、糖、塩基、ヌクレオシド間結合等のいずれが修飾されてもよい。
前記細胞外小胞上のＬＡＴ１と前記ＬＡＴ１用結合物質との結合の検出方法は、特に制限されず、例えば、前記結合を可視化する方法があげられる。前記可視化とは、例えば、目視可能な可視化でもよいし、シグナル検出としての可視化でもよい。前記標識物質を使用する方法としては、例えば、標識物質として蛍光色素を使用した蛍光法、標識物質として酵素を使用し、酵素反応により呈色する基質を併用する酵素法、標識物質として放射性同位体（ＲＩ）を使用するＲＩ法等があげられる。前記蛍光法は、例えば、蛍光色素による蛍光を発色シグナルとして検出でき、前記酵素法は、例えば、基質の呈色を発色シグナルとして検出でき、前記ＲＩ法は、例えば、放射線をシグナルとして検出できる。
前記蛍光物質は、例えば、ＤＡＰＩ、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ（登録商標）９、ＴＯ－ＰＲＯ（登録商標）－３、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ｃｙ（登録商標）３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ（商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｅｅｎ（商標）、Ｃｙ（登録商標）５、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４等の蛍光色素があげられる。前記酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等があげられる。前記ＲＩは、例えば、３２Ｐ、１３１Ｉ、３５Ｓ、４５Ｃａ、３Ｈ、１４Ｃ等があげられる。
前記ＬＡＴ１用結合物質は、例えば、前記標識物質により標識化されてもよい。前記ＬＡＴ１用結合物質が前記標識化物質で標識化されている場合、例えば、標識化された前記ＬＡＴ１用結合物質（以下、標識化ＬＡＴ１用結合物質という）と前記検体との接触により、前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１（例えば、ＬＡＴ１タンパク質）と前記標識化ＬＡＴ１用結合物質とを結合させ、前記ＬＡＴ１に結合した前記標識化ＬＡＴ１用物質について、その標識物質を検出することにより、前記結合を検出することができる。具体的には、例えば、前記検体中の細胞外小胞を固定化してから、前記標識化ＬＡＴ１用結合物質を接触させ、未結合の前記標識化ＬＡＴ１用結合物質を除去した後、前記固定化された細胞外小胞に結合した前記標識化ＬＡＴ１用結合物質を検出することで、前記結合を検出することができる。前記細胞外小胞の固定化は、例えば、前記細胞外小胞に特異的に結合する結合物質（以下、ＥＶｓ用結合物質）を担体に固定化し、前記ＥＶｓ用結合物質に前記検体中の細胞外小胞を結合させることによって、行うことができる。前記ＥＶｓ用結合物質は、例えば、抗体、抗原結合断片（抗原結合ペプチド）、アプタマー等があげられる。前記ＥＶｓ用結合物質は、例えば、前記ＬＡＴ１用結合物質が細胞外小胞のＬＡＴ１に結合可能なように、ＬＡＴ１に対して非結合性であることが好ましい。前記ＬＡＴ１用結合物質および前記ＥＶｓ用結合物質は、例えば、それぞれ抗体が好ましく、このような抗体の使用により、免疫組織化学が利用できる。
前記ＬＡＴ１用結合物質が非標識の場合は、例えば、さらに、前記ＬＡＴ１用結合物質に結合する二次結合物質を併用する方法があげられる。前記二次結合物質は、例えば、前記標識化物質で標識化されていることが好ましい（以下、標識化二次結合物質という。）この方法では、例えば、標識化されていない前記ＬＡＴ１用結合物質（以下、非標識化ＬＡＴ１用結合物質という）と前記検体との接触により、前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１（例えば、ＬＡＴ１タンパク質）と前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質とを結合させ、さらに、前記標識化二次結合物質を接触させることにより、前記ＬＡＴ１に結合した前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質に前記標識化二次結合物質を結合させる。そして、前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質を介してＬＡＴ１に結合した前記標識化二次結合物質について、その標識物質を検出することにより、ＬＡＴ１と前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質との結合を検出することができる。具体的には、例えば、前記検体中の細胞外小胞を固定化してから、前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質を接触させ、未結合の前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質を除去した後、さらに、前記標識化二次結合物質を接触させる。そして、前記固定化された細胞外小胞に結合した前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質に対して、さらに前記標識化二次結合物質を結合させ、結合した前記標識化二次結合物質を検出することで、間接的にＬＡＴ１と前記非標識化ＬＡＴ１用結合物質との結合を検出することができる。前記細胞外小胞の固定化は、例えば、前述と同様に、前記ＥＶｓ用結合物質が使用できる。前記ＬＡＴ１用結合物質、前記ＥＶｓ用結合物質、および前記二次結合物質は、例えば、それぞれ抗体が好ましく、前記二次結合物質は、例えば、ＥＬＩＳＡ等で使用される二次抗体が好ましい。このような抗体の使用により、免疫組織化学が利用できる。
また、前記細胞外小胞上のＬＡＴ１タンパク質は、例えば、前記細胞外小胞自体のマーカに対する結合物質（例えば、抗マーカ抗体）と、ＬＡＴ１タンパク質に対する結合物質（例えば、抗ＬＡＴ１抗体）とを用いて、発明者らが開発したＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法により検出することもできる。この方法によれば、例えば、１つの細胞外小胞に対して、前記抗マーカ抗体と前記抗ＬＡＴ１抗体と結合させることで、前記抗マーカ抗体と前記抗ＬＡＴ１抗体との間における相互作用を利用できるため、前記細胞外小胞の中でも、ＬＡＴ１タンパク質を有する細胞外小胞を検出することができる。このため、例えば、前述のような培養物または血液等から細胞外小胞を回収することなく、容易に細胞外小胞上のＬＡＴ１タンパク質を検出できる。前記ＥｘｏＳｃｒｅｅｎ法は、例えば、国際特許公報ＷＯ２０１３／０９４３０７号等の記載を援用できる。前記細胞外小胞自体のマーカは、例えば、前述のようなマーカ分子の例示があげられ、具体例としては、ＣＤ９である。
前記検体の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの検出は、例えば、前記検体におけるＬＡＴ１タンパク質／前記マーカタンパク質（例えば、ＣＤ９タンパク質）共陽性の細胞外小胞の検出でもよい。
本発明の試験方法は、例えば、さらに、前記被検者由来の検体の検出結果と評価基準とを比較する比較工程を含んでもよい。前記検体の検出結果と前記評価基準との比較によって、がんリスクを判断できる。前記評価基準は、特に制限されず、例えば、以下のような基準が例示できる。
第１の評価基準として、がんに罹患していない陰性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルが例示できる。前記陰性比較対象者は、例えば、試験の対象がんに罹患していない健常者である。前述のように、前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得した場合、試験の対象がんに罹患したがん患者は、対象がんに罹患していない健常者と比較して、ＬＡＴ１レベルが高い（ＬＡＴ１陽性細胞外小胞が多い）。このため、例えば、前記陰性比較対象者に関して、前記被検者と同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得し、そのＬＡＴ１レベルを評価基準とすれば、前記評価基準と前記被検者のＬＡＴ１レベルとの比較により、前記被検者について、試験の対象がんのリスクを判断できる。具体的には、例えば、前記被検者のＬＡＴ１レベルが前記陰性比較対象者の評価基準と比較して高い場合（例えば、有意に高い値の場合）、前記被検者は、対象がんの罹患可能性がある、または罹患可能性が高いと判断することができる。一方、前記被検者のＬＡＴ１レベルが前記陰性比較対象者の評価基準と比較して同程度の場合（例えば、有意差がない場合）、前記被検者は、対象がんの罹患可能性がない、または罹患可能性が低いと判断することができる。
第２の評価基準として、がんに罹患している陽性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルが例示できる。前記陽性比較対象者は、例えば、試験の対象がんに罹患しているがん患者である。この場合、例えば、試験の対象がんに罹患した陽性比較対象者に関して、前記被検者と同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得し、そのＬＡＴ１レベルを評価基準とすれば、前記評価基準と前記被検者の検出結果との比較により、前記被検者について、試験の対象がんのリスクを判断することができる。具体的には、例えば、前記被検者のＬＡＴ１レベルが前記陽性比較対象者の評価基準と比較して同程度の場合（例えば、有意差がない場合）またはより高い場合、前記被検者は、対象がんの罹患可能性がある、または罹患可能性が高いと判断することができる。一方、前記被検者のＬＡＴ１レベルが前記陽性比較対象者の評価基準と比較して低い場合（例えば、有意に低い場合）、前記被検者は、対象がんの罹患可能性がない、または罹患可能性が低いと判断することができる。
本発明の試験方法は、例えば、同じ被検者に由来する経時的な複数の検体について、前記取得工程を行い、前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの経時変化情報を得てもよい。前述のように、細胞外小胞のＬＡＴ１は、がんマーカであることから、例えば、同じ被検者について、細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの経時変化情報を得ることによって、前記被検者について試験の対象がんのリスクの変化を判断することができる。具体例として、被検者のＬＡＴ１レベルが経時的に増加している場合、例えば、がんの罹患可能性が高くなっている等の判断が可能である。また、治療中の被検者であれば、例えば、ＬＡＴ１レベルが治療開始時から経時的に増加している場合、治療方法が効果的でない、ＬＡＴ１レベルが治療開始時から経時的に低下している場合、治療方法が効果的である、として治療方法が適切か否かの判断が可能である。また、治療後の被検者であれば、例えば、ＬＡＴ１レベルが治療終了時から経時的に増加している場合、予後が不良である、ＬＡＴ１レベルが治療終了時から経時的に変化していないまたは低下している場合、予後が良好である、として予後の判断が可能である。
前記治療中の患者の場合、具体例として、以下のような判断が可能である。前立腺がんは、男性ホルモンのアンドロゲン（テストステロン）の刺激により病気が進行することから、男性ホルモン受容体をブロックするというホルモン療法がある。一方、このホルモン療法に対して、抵抗性（去勢耐性またはホルモン抵抗性ともいう）を獲得し、ホルモン療法が有効に使用できなる患者もいる。これに対して、本発明らは、前立腺がん患者の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルが、前述のように、健常者の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルよりも高く、さらに、抵抗性を有した前立腺がん患者の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルが、抵抗性を有していない前立腺がん患者の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルよりも高くなることを見出した。このため、ホルモン療法を施す患者について、細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの経時変化情報を取得し、前記ＬＡＴ１レベルの増加を確認することによって、ホルモン療法によって抵抗性を獲得しているか否かの偏移を判断することもできる。そして、ＬＡＴ１レベルが増加して、抵抗性を獲得していると判断した場合、例えば、その患者には、ホルモン療法が有効な療法ではなくなったとして、他の治療方法への切り替えを決定することもできる。また、すでに抵抗性を獲得している患者の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを第４の評価基準とすれば、前記被検者のＬＡＴ１レベルが、前記第４の評価基準と同等に達した場合、または前記第４の評価基準を超えた場合、抵抗性を獲得したと客観的に判断することもできる。
＜がんの診断方法＞
本発明のがんの診断方法は、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを検出する検出工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１レベルががんマーカであることを特徴とする。本発明の診断方法は、前記本発明のがんリスクの試験方法における記載を援用できる。
本発明のがんの診断方法は、被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを検出する検出工程を含み、前記細胞外小胞のＬＡＴ１レベルががんマーカであることを特徴とする。本発明の診断方法は、前記本発明のがんリスクの試験方法における記載を援用できる。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。
［実施例１］
ヒト前立腺がん細胞株について、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質の存在を確認した。
ヒト前立腺がん細胞株について、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質の存在を確認した。
前記ヒト前立腺がん細胞株として、Ｃ４－２、ＰＣ３、ＤＵ１４６を使用した。
ウェル内で前記前立腺がん細胞株を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有ＲＰＭＩを用いて培養を開始し（Ｄａｙ０）、６０－７０％コンフルエントになるまで３日間培養し（Ｄａｙ３）、培地を無血清のａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩに置換した。さらに、２日間培養を行い、細胞と上清とをそれぞれ回収した（Ｄａｙ５）。前記上清を、４℃。３５，０００ｒｐｍ（２１０，０００ｇ）、７０分の条件で超遠心分離し（スウィングローターＳＷ４１Ｔｉ）、細胞外小胞であるエクソソームを含む沈殿画分を回収した。前記沈殿画分を２００μＬのＰＢＳに懸濁し、エクソソーム検体とした。
前記エクソソーム検体について、抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＬＡＴ１タンパク質およびエクソソームのマーカであるＣＤ９タンパク質の検出を行った。また、参照例として、回収した細胞について、抗体を用いたウェスタンブロットにより、ＬＡＴ１タンパク質および細胞のマーカであるＧＡＰＤＨ９タンパク質の検出を行った。ＬＡＴ１タンパク質用の抗体は、市販抗体（ＣＳＴ＃５３４７、Cell Signaling Technology社）を使用し、ＣＤ９タンパク質用の抗体は、市販抗体（SHI-EXO-M01、コスモバイオ社）を使用し、ＧＡＰＤＨタンパク質用の抗体は、市販抗体（ＭＡＢ３７４、ｓｉｇｍａ社）を使用した。
これらの結果を図１に示す。図１（Ａ）は、エクソソームの結果であり、上が、ウェスタンブロットの画像であり、下が、ウェスタンブロットの結果（バンドインテンシティ）に基づき算出したタンパク質の相対値を示すグラフである。前記相対値は、エクソソームのマーカであるＣＤ９タンパク質に対するＬＡＴ１タンパク質の比率であり、全エクソソームあたりのＬＡＴ１タンパク質の割合、すなわち全エクソソームにおけるＬＡＴ１陽性エクソソームの割合に相当する（以下、同様）。また、図１（Ｂ）は、参照例である細胞の結果であり、上が、ウェスタンブロットの画像であり、下が、ウェスタンブロットの結果に基づき算出したタンパク質の相対値を示すグラフである。前記相対値は、細胞のマーカであるＧＡＰＤＨタンパク質に対するＬＡＴ１タンパク質の比率であり、全細胞あたりのＬＡＴ１タンパク質の割合、すなわち全細胞におけるＬＡＴ１陽性細胞の割合に相当する（以下、同様）。
図１（Ａ）に示すように、ＣＤ９陽性であることから、いずれの前立腺がん細胞株からもエクソソームが分泌され、且つ、ＬＡＴ１陽性であった。エクソソームは、破壊することなく分析に供したことから、エクソソーム上にＬＡＴ１タンパク質が存在しているといえる。また、図１（Ａ）に示すエクソソームのＬＡＴ１タンパク質量の結果は、図１（Ｂ）に示す参照例である細胞株のＬＡＴ１タンパク質量の結果と相関していた。前述のように、前立腺がん細胞におけるＬＡＴ１は、がんマーカとなることが知られているため、前立腺がん細胞から分泌されるエクソソーム上にＬＡＴ１タンパク質の存在が確認され、且つ、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質量が前立腺がん細胞のＬＡＴ１タンパク質量と相関していることにより、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質が新たながんマーカとなるといえる。
［実施例２］
前立腺がんの治療方法として、前述のように、男性ホルモンのアンドロゲンによる刺激をブロックするために、ブロッキング剤を用いて前立腺がん細胞の増殖を抑えるホルモン治療がある。そこで、ホルモン治療時における前立腺がん細胞から分泌されるエクソソームのＬＡＴ１タンパク質の挙動を確認した。
前立腺がんの治療方法として、前述のように、男性ホルモンのアンドロゲンによる刺激をブロックするために、ブロッキング剤を用いて前立腺がん細胞の増殖を抑えるホルモン治療がある。そこで、ホルモン治療時における前立腺がん細胞から分泌されるエクソソームのＬＡＴ１タンパク質の挙動を確認した。
前記ヒト前立腺がん細胞株として、Ｃ４－２を使用した。Ｃ４－２は、男性ホルモンのアンドロゲンに対する受容体を発現し、且つ去勢耐性（ホルモン抵抗性）を有する細胞株である。この細胞については、前記実施例１において、細胞およびそれから分泌される細胞外小胞がＬＡＴ１タンパク質を有することが確認されている。
ウェル内でＣ４－２を、５％ＣＳ－ＦＢＳ（ホルモンを完全に除去したウシ胎児血清）と１μｍｏｌ／Ｌ アンドロゲン（活性を有する男性ホルモンＤＨＴ：ジヒドロテストステロン）とを含むＲＰＭＩを用いて培養を開始し（Ｄａｙ０）、６０－７０％コンフルエントになるまで３日間培養し（Ｄａｙ３）、続いて、培地を３種類の培地（培地１、培地２、培地３）にそれぞれ置換した。培地１（Control）は、ＤＨＴ含有の同じ培地であり、未治療の系に該当する。培地２（Bicaltamide）は、１０μｍｏｌ／Ｌ非ステロイド アンドロゲン受容体拮抗薬（ビカルタミド）と５％ＣＳ－ＦＢＳとを含むＲＰＭＩであり、アンドロゲン受容体の遮断を目的とした治療の系に該当する。培地３（DHT(-)）は、ＤＨＴ未含有・ビカルタミド未含有で５％ＣＳ－ＦＢＳを含むＲＰＭＩであり、ＤＨＴおよびビカルタミドの除去により治療を模した系に該当する。培地置換後、さらに、１日間または２日間培養を行い、それぞれの培地（培地１、２、３）から、細胞と上清とをそれぞれ回収した（Ｄａｙ４、Ｄａｙ５）。Ｄａｙ５の前記上清を、４℃、３５，０００ｒｐｍ（２１０，０００ｇ）、７０分の条件で超遠心分離し（スウィングローターＳＷ４１Ｔｉ）、細胞外小胞であるエクソソームを含む沈殿画分を回収した。前記沈殿画分を２００μＬのＰＢＳに懸濁し、エクソソーム検体とした。
Ｄａｙ５の前記エクソソーム検体について、前記実施例１と同様にして、ＬＡＴ１タンパク質、エクソソームのマーカであるＣＤ９タンパク質の検出を行った。また、参照例であるＤａｙ４およびＤａｙ５の細胞について、前記実施例１と同様にして、ＬＡＴ１タンパク質、細胞のマーカであるＧＡＰＤＨ９タンパク質の検出を行った。
これらの結果を図２および図３に示す。図２は、エクソソームの結果であり、上が、ウェスタンブロットの画像であり、下が、ウェスタンブロットの結果に基づき算出したタンパク質の相対値を示すグラフである。図３は、参照例の細胞の結果であり、具体的には、左がＤａｙ４の細胞、右がＤａｙ５の細胞の結果であり、それぞれ上が、ウェスタンブロットの画像であり、下が、ウェスタンブロットの結果に基づき算出したタンパク質の相対値を示すグラフである。前記相対値は、細胞のマーカであるＧＡＰＤＨタンパク質に対するＬＡＴ１タンパク質の比率であり、全細胞あたりのＬＡＴ１タンパク質の割合、すなわち全細胞におけるＬＡＴ１陽性細胞の割合に相当する。
まず、図３の参照例について説明する。図３において、Controlは、培地１を使用した未治療の系、Bivcaltamideは、非ステロイドのアンドロゲン受容体拮抗薬（ビカルタミド）含有の培地２を使用した治療の系、ＤＨＴ（－）は、アンドロゲン（ＤＨＴ）未含有・ビカルタミド未含有の培地３を使用した治療を模した系である。そして、前述のように、Ｃ４－２は、去勢耐性（ホルモン抵抗性）を有する細胞株である。図３に示すように、細胞のＬＡＴ１タンパク質は、未治療の系（Control）と比較して、治療の系（Bicaltamide）および治療を模した系（DHT(-)）のいずれでもＬＡＴ１陽性細胞が増加した。
つぎに、エクソソームに関する図２について説明する。図２のエクソソームの結果においても、ＬＡＴ１タンパク質を有するエクソソーム（ＬＡＴ１陽性エクソソーム）は、未治療の系（Control）と比較して、治療の系（Bicaltamide）および治療を模した系（DHT(-)）のいずれでも増加した。この結果から、ホルモン療法においてＬＡＴ１陽性エクソソームが増加するか否かによって、患者がホルモン療法により抵抗性を獲得するに至ったか否かを判断できることがわかる。そして、抵抗性を獲得した患者に対して、ホルモン療法は有効ではなくなったとして、他の治療方法への切り替えの必要性を判断することができる。
［実施例３］
ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ－７について、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質の存在を確認した。
ヒト乳がん細胞株ＭＣＦ－７について、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質の存在を確認した。
ＭＣＦ－７については、前記実施例１の前記前立腺がん細胞と同様に細胞の回収、エクソソーム検体の調製、ＬＡＴ１の検出をおこなった。
これらの結果を前述の図２のウェスタンブロットの画像にあわせて示す。図２に示すように、ＣＤ９陽性であることから、乳がん細胞株からエクソソームが分泌され、且つ、ＬＡＴ１タンパク質陽性であった。このことから、乳がん細胞株からのエクソソームにおいて、ＬＡＴ１陽性エクソソームが増加していることが確認できた。
［実施例４］
前立腺腺がんの患者血清を用いて、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質を検出した。
前立腺腺がんの患者血清を用いて、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質を検出した。
ホルモン療法を行っていない患者４名（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４）および健常者４名（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４）から血清６００～１０００μＬを採取し、４℃、３５，０００ｒｐｍ（２１０，０００ｇ）、３２分の条件で超遠心分離し（スウィングローターＳＷ４１Ｔｉ）、細胞外小胞であるエクソソームを含む沈殿画分を回収した。前記沈殿画分を６０～１００μＬのＰＢＳに懸濁し、エクソソーム検体とした。前記患者４名の悪性度およびＰＳＡ（前立腺特異抗原、prostate specific antigen）は、表１の通りである。ＰＳＡは、前立腺がんの公知のマーカである。前記エクソソーム検体について、前記実施例１と同様にして、ＬＡＴ１タンパク質およびエクソソームのマーカであるＣＤ９タンパク質の検出を行った。
これらの結果を図４に示す。図４は、血清中エクソソームの結果であり、上が、ウェスタンブロットの画像であり、下が、ウェスタンブロットの結果に基づき算出したタンパク質の相対値を示すグラフである。前記相対値は、エクソソームのマーカであるＣＤ９タンパク質に対するＬＡＴ１タンパク質の比率であり、全エクソソームあたりのＬＡＴ１タンパク質の割合、すなわち全エクソソームにおけるＬＡＴ１陽性エクソソームの割合に相当する。図４の上図に示すように、患者および健常者のいずれにおいてもエクソソームが検出されたが、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質は、患者のみで検出された。健常者と比較して、患者は、エクソソームのバンドが薄いにもかかわらずＬＡＴ１のバンドが検出されていることから、健常者において、ＬＡＴ１のバンドが検出されていないことは、エクソソームの量が原因でないことは明らかと言える。また、最も低いＰＳＡ値を示す患者Ｐ１に関しても、エクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質を検出できた。これらの結果から、血清中のエクソソーム上のＬＡＴ１タンパク質が、がんマーカとして使用できることが確認できた。
以上、実施形態および実施例を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
本発明によれば、細胞そのものではなく、細胞から分泌された細胞外小胞についてＬＡＴ１タンパク質を検出することにより、被検者ががんに罹患している可能性を試験することが可能である。また、例えば、血液を検体とし、血液に放出された細胞外小胞のＬＡＴ１タンパク質を検出することも可能であるため、患者および医師等の医療従事者の負担となる生検も回避できる。したがって、本発明は、例えば、医療分野において非常に有用な技術といえる。
Claims (9)
- 被検者由来の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルを取得する取得工程を含み、
前記細胞外小胞のＬＡＴ１ががんマーカであることを特徴とする、がんリスクを試験する試験方法。 - 前記ＬＡＴ１が、ＬＡＴ１タンパク質である、請求項１に記載の試験方法。
- 前記検体が、被検者から採取した体液である、請求項１または２に記載の試験方法。
- 前記検体が、被検者から採取した血液または尿である、請求項１から３のいずれか一項に記載の試験方法。
- 前記検体が、細胞が除去された検体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の試験方法。
- さらに、前記被検者由来の検体のＬＡＴ１レベルと評価基準とを比較する比較工程を含み、
前記評価基準は、
がんに罹患していない陰性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルであり、
前記被検者のＬＡＴ１レベルが、前記評価基準と比較して高い場合、前記被検者はがんに罹患している可能性があることを意味する、請求項１から５のいずれか一項に記載の試験方法。 - さらに、前記被検者由来の検体のＬＡＴ１レベルと評価基準とを比較する比較工程を含み、
前記評価基準は、
がんに罹患している陽性比較対象者由来の同じ種類の検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルであり、
前記被検者のＬＡＴ１レベルが、前記評価基準と比較して同一または高い場合、前記被検者はがんに罹患している可能性があることを意味する、請求項１から５のいずれか一項に記載の試験方法。 - 前記被検者由来の経時的な複数の検体について、前記取得工程を行い、
前記検体中の細胞外小胞のＬＡＴ１レベルの経時変化情報を得る、請求項１から７のいずれか一項に記載の試験方法。 - 前記がんが、前立腺がんまたは乳がんである、請求項１から８のいずれか一項に記載の試験方法。
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