JP3561218B2

JP3561218B2 - 動脈硬化性病変の診断用キット

Info

Publication number: JP3561218B2
Application number: JP2000242345A
Authority: JP
Inventors: 壱夫内田
Original assignee: 株式会社いかがく
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2004-09-02
Anticipated expiration: 2020-08-10
Also published as: JP2002055106A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、血液中に存在するアポ蛋白ａｐｏＢ１００を有するリポ蛋白とＨＤＬの構成蛋白との複合体に関するもので、具体的には、ＬＤＬ（Ｌｐ（ａ）を含む）もしくは変性（酸化による変性など）ＬＤＬ並びに、ＶＬＤＬ（レムナントＶＬＤＬやカイロミクロンレムナントなどを含む）もしくは変性ＶＬＤＬとＨＤＬの構成蛋白との複合体（動脈硬化惹起性リポ蛋白とＨＤＬの構成蛋白との複合体）を測定することにより、動脈硬化性病変を診断するキットに関するものである。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】
動脈硬化症は大動脈、冠状動脈、脳動脈および頚動脈に多く発生し、心筋梗塞、脳梗塞などの主因となる疾患である。また、最近ではアルツハイマー病も動脈硬化症と関連性の大きい疾患であることがわかってきた。従来、血液中で、これらの生体内での動脈硬化症の状態を直接反映する測定対象がなく、血清中あるいは血漿中のＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）、レムナントリポ蛋白、Ｓｍａｌｌ，ｄｅｎｓｅＬＤＬ、酸化ＬＤＬなど、ＬＤＬを主体とした血管壁脂質蓄積と関わりの深い、動脈硬化性病変に関わるリポ蛋白として測定されてきた。
【０００３】
なかんずく、酸化ＬＤＬと粥状動脈硬化病変の進展との関連がスタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｄ．ｅｔａｌ．Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．３２０：９１５，１９８９）により、一方、Ｒｏｓｓらが提唱した傷害反応仮説（Ｒｏｓｓ，Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ．３６２：８０１，１９９３）によって指摘されて以来、動脈硬化の進展における酸化ＬＤＬの関与が注目されてきた。
【０００４】
しかし、最近の研究では酸化ＬＤＬのみならず酸化ＨＤＬ（Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔｅｔａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＢｉｏｐｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．２１７：４０７，１９９５）が動脈硬化症患部に局在する事実、大村らは（大村寛敏，他．動脈硬化．２５：ＮＯ４，１２６，１９９７）冠動脈硬化症において、血清ＨＤＬ中の過酸化脂質量が増大しているのを認め、動脈硬化の形成にＨＤＬの酸化変性も関与していることを報告している。同様に楠美らは（楠美嘉晃，他．動脈硬化．２４：３２７，１９９６）動脈内膜に酸化等による変性Ｌｐ（ａ）が沈着しているのを認め、Ｌｐ（ａ）の動脈硬化進展機序に変性Ｌｐ（ａ）の関与の可能性を示している。
【０００５】
また最近の疫学調査では、アルツハイマー病の発症の背景には動脈硬化があることが指摘されており（Ｋａｌａｒｉａ，ＲＮ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ＆Ｔｈｅｒ．７２：１９３，１９９６）、リポ蛋白の酸化変性やａｐｏＥの表現型と動脈硬化症やアルツハイマー病の発症との関連が注目されている（ＰｒｅｍＫｕｍａｒ，ＤＲＤ．ｅｔａｌ．ＡＭＪＰａｔｈｏｌ．１４８：２０８３，１９９６）。即ち、活性酸素によりＶＬＤＬが酸化修飾されてヘパリン結合性を失い、難溶性の沈澱を形成することによって脂質過酸化物が血管や神経組織に蓄積し、細胞を傷害することが予想されている。（平村和行，他．ＪｐｎＪＥｌｅｃｔｒｏｐｈ．４２：２７，１９９８）。
【０００６】
最近までは、動脈硬化の発症進展に関して、ＬＤＬに関する生化学的、分子生物学的研究の進歩が大きく、酸化ＬＤＬがａｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙの主役であることが強調されすぎているきらいがある。しかし、近年の研究の成果として、上述のごとく動脈硬化症やアルツハイマー病の発症・進展への関与物質として、ＬＤＬのみでなく、ＨＤＬ、Ｌｐ（ａ）、ＶＬＤＬなど多種の酸化変性リポ蛋白が含まれることが明らかとなった。
【０００７】
この様な現状において、本発明者らは血液中に存在する変性ＬＤＬの検出が特願平８−３１７１６２号、特願平１１−１０９００１号、特願平１１−２０２７９１３号、特願２０００−０１２２１０号に開示した手法によって可能であること、さらに変性ＨＤＬやＶＬＤＬの検出が特願平１１−２４４４０号に開示した手法によって可能であることを発見した。
【０００８】
上述のごとく、動脈硬化性病変の発症・進展に関わる要因が多様であることが判明するにつれ、本発明者らは、これら諸要因を個々に検出する手法を発見してきたが、これらの手法を臨床応用する場合には論理性、技術面で十分に活用できる状況にあるとはいえない。
【０００９】
したがって本研究は、動脈硬化症やアルツハイマー病の発症・進展と深く関わる要因間の関連性を明らかにしたうえで、新規な検出方法を提供することを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ＬＤＬとならび、ＨＤＬは虚血性心疾患の主要な危険予知因子の一つであるとされている。欧米人と異なり、日本人の場合は冠動脈疾患患者のなかでＬＤＬの上昇を示すものの割合が比較的少ない場合、リポ蛋白質側の危険因子として低ＨＤＬ血症はむしろ高ＬＤＬ血症よりも重要であるかも知れないとの指摘もある（横山信治，ホルモンと臨床，４８：３９，２０００）。即ち、血中ＨＤＬレベルと虚血性心疾患の発症頻度との間には負の相関があり、臨床疫学的にＨＤＬの抗動脈硬化作用は明確であり、コレステロール逆転送系がＨＤＬの抗動脈硬化作用に関係していると考えられてきた。
【００１１】
しかし最近では、ＨＤＬ上に存在するパラオキソネースと動脈硬化との関連が注目され、パラオキソネース自身がＬＤＬの酸化を抑制することにより冠動脈硬化の進展を予防しているらしいことも分ってきた（Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｍ，Ｉ．，ｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ，２８６：１５２，１９９１）。
【００１２】
この様な状況下で、本発明者らは、ＨＤＬの抗動脈硬化作用はＨＤＬの方がＬＤＬより酸化変性を受けやすい特性を有すること、ＨＤＬ自身が酸化変性を受けると抗動脈硬化作用を失う事実を勘案すると、ＨＤＬ分子そのものが抗酸化的に作用するのではないかと考えた。より具体的には動脈硬化病巣局部において酸化ＬＤＬとＨＤＬが共存することは周知の事実であり（Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．ｅｔａｌ．ＡｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒＴｈｒｏｍｂＶａｓｃＢｉｏｌ１７：１２３３，１９９７）、この場合生体にとって不都合な物質である酸化ＬＤＬの生成を防止すべくＨＤＬがＨＤＬ／ＬＤＬ複合体を形成するかたちで作用することによって抗動脈硬化作用を発揮していると考えた。
【００１３】
そこで、ｉｎｖｉｔｒｏで正常なＬＤＬとＨＤＬを共存させて酸化したところ、ＨＤＬのアポ蛋白を構成するアポＡ１、アポＣ３、ＳＡＡ１などがＬＤＬに移行するかたちでＨＤＬ／ＬＤＬ複合体を形成することによって、ＨＤＬがＬＤＬの酸化変性を防止する仕組みを発見した。即ち、この現象は動脈硬化病巣部位における本質的なものと考えられるので、ＨＤＬ／ＬＤＬ複合体が血液中で検出できれば動脈硬化性病変を診断するうえで、優れたマーカーになると考えた。そしてその後、更なる研究と検討を繰り返した結果、循環血液中にアポＢ１００を有するＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬもしくは、これ等の変性したものがＨＤＬを構成する蛋白と複合体を形成して存在する事実を発見して本発明に至った。
【００１４】
なお、具体的には、本発明は、血液中のＶＬＤＬ、ＬＤＬを超遠心法や、デキストラン硫酸とカルシウムイオンなどの化学物質を用いた沈澱法で分画したＶＬＤＬ、ＬＤＬを試料として、抗ヒトアポＡ１、抗ヒトアポＣ３、抗ヒトアポＥ、抗ヒトＳＡＡ抗体、抗ヒトパラオキシネース抗体などのＨＤＬ中に含まれるアポ蛋白やその他の構成成分に対する抗体と抗ヒトアポＢ１００抗体を反応させて血液中のアポＢ１００を有するリポ蛋白もしくは変性したリポ蛋白とＨＤＬ構成蛋白との複合体を検出する方法である。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明について具体的に説明する。
［血清中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／ａｐｏＡ１複合体の測定］
Ａ．試料の調製
１．デキストラン硫酸液（０．０５ＭＣａＣｌ２）１．５ｍｌに対して血清５０μｌを添加し、混和した後室温で３０分間放置する。
２．３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントで捨てる。
３．１ｍｌの２．５％ＮａＣｌ溶液で沈澱を溶解し、この溶解液を試料とする。
【００１６】
Ｂ．ＥＬＩＳＡによる測定例
１．抗ヒトアポＡ１抗体を０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ８．０緩衝液に１０μｇ／ｍｌで溶解し、マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注する。
２．４℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で３回洗浄し、０．１％ショ糖と牛血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ、ｐＨ７．５で調製したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し室温で３０分以上静置した後、液を廃棄し４℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水２５０μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄する。
３．マイクロプレートに５５ｍｇ／ｍｌＭｏｕｓｅＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎとＲａｂｂｉｔＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎ含有１％ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、これに上述の試料あるいは標準液を５０μｌ添加する。
４．室温下一晩反応させる。
【００１７】
５．０．００５％Ｔｗｅｅ２０溶液２５０μ／ｗｅｌｌで５回洗浄する
６．ビオチン標識Ｆａｂ´化ＩｇＧ−アポＢ１００抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μｇ／ｍｌとし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
７．３７℃下１．５時間反応させる。
８．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
９．ＨＲＰ標識アビジンＤ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈とし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
【００１８】
１０．３７℃下３０分間反応させる。
１１．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
１２．発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温下３０分間反応させる。
１３．１Ｍリン酸水溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停止する。
１４．主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍで測光する。
１５．人工的に調製した変性ＬＤＬ／アポＡ１複合体により求めた検量線から試料中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／アポＡ１複合体濃度を算出する。
【００１９】
［血清中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／アポＣ３複合体の測定］
Ａ．試料の調製
１．デキストラン硫酸液（０．０５ＭＣａＣｌ２）１．５ｍｌに対して血清５０μｌを添加し、混和した後室温で３０分間放置する。
２．３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントで捨てる。
３．１ｍｌの２．５％ＮａＣｌ溶液で沈澱を溶解し、この溶解液を試料とする。
【００２０】
Ｂ．ＥＬＩＳＡによる測定例
１．抗ヒトアポＣ３抗体を０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ８．０緩衝液に１０μｇ／ｍｌで溶解し、マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注する。
２．４℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で３回洗浄し、０．１％ショ糖と牛血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ、ｐＨ７．５で調製したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し室温で３０分以上静置した後、液を廃棄し４℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水２５０μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄する。
３．マイクロプレートに５５ｍｇ／ｍｌＭｏｕｓｅＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎとＲａｂｂｉｔＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎ含有１％ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、これに上述の試料あるいは標準液を５０μｌ添加する。
４．室温下一晩反応させる。
【００２１】
５．０．００５％Ｔｗｅｅ２０溶液２５０μ／ｗｅｌｌで５回洗浄する
６．ビオチン標識Ｆａｂ´化ＩｇＧ−アポＢ１００抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μｇ／ｍｌとし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
７．３７℃下１．５時間反応させる。
８．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
９．ＨＲＰ標識アビジンＤ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈とし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
【００２２】
１０．３７℃下３０分間反応させる。
１１．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
１２．発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温下３０分間反応させる。
１３．１Ｍリン酸水溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停止する。
１４．主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍで測光する。
１５．人工的に調製した変性ＬＤＬ／アポＣ３複合体により求めた検量線から試料中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／アポＣ３複合体濃度を算出する。
【００２３】
［血清中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／ＳＡＡ１複合体の測定］
Ａ．試料の調製
１．デキストラン硫酸液（０．０５ＭＣａＣｌ２）１．５ｍｌに対して血清５０μｌを添加し、混和した後室温で３０分間放置する。
２．３０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清をデカントで捨てる。
３．１ｍｌの２．５％ＮａＣｌ溶液で沈澱を溶解し、この溶解液を試料とする。
【００２４】
Ｂ．ＥＬＩＳＡによる測定例
１．抗ヒトｓｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＡ１抗体を０．０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌｐＨ８．０緩衝液に１０μｇ／ｍｌで溶解し、マイクロプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌで分注する。
２．４℃下で一晩物理吸着後、蒸留水で３回洗浄し、０．１％ショ糖と牛血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む０．０５Ｍ、ｐＨ７．５で調製したＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を１００μｌ／ｗｅｌｌで分注し室温で３０分以上静置した後、液を廃棄し４℃で乾燥させる。乾燥したマイクロプレートを蒸留水２５０μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄する。
３．マイクロプレートに５５ｍｇ／ｍｌＭｏｕｓｅＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎとＲａｂｂｉｔＧａｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎ含有１％ＢＳＡ溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、これに上述の試料あるいは標準液を５０μｌ添加する。
【００２５】
４．室温下一晩反応させる。
５．０．００５％Ｔｗｅｅ２０溶液２５０μ／ｗｅｌｌで５回洗浄する
６．ビオチン標識Ｆａｂ´化ＩｇＧ−アポＢ１００抗体を１％ＢＳＡ溶液で１．６μｇ／ｍｌとし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
７．３７℃下１．５時間反応させる。
８．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
９．ＨＲＰ標識アビジンＤ（ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１％カゼイン溶液で１５０００倍希釈とし、１００μｌ／ｗｅｌｌ分注する。
１０．３７℃下３０分間反応させる。
【００２６】
１１．５．と同様、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液２５０μｌ／ｗｅｌｌで５回洗浄する。
１２．発色試薬を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温下３０分間反応させる。
１３．１Ｍリン酸水溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌ分注し、反応を停止する。
１４．主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍで測光する。
１５．人工的に調製した変性ＬＤＬ／ＳＡＡ１複合体により求めた検量線から試料中の変性ＬＤＬ（ＶＬＤＬ）／ＳＡＡ１複合体濃度を算出する。
【００２７】
［酸化によるＬＤＬとＨＤＬの複合体形成試験］
超遠心により調製したＬＤＬとＨＤＬを等量混和し、硫酸銅を終濃度１０μＭの割合で加え、３７℃で酸化反応を行った。その結果図１に示すごとく、ＨＤＬのアポ蛋白にのみ存在する
ＳｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＡ１が酸化反応を受けることによってＬＤＬ画分に移行した〈図１（Ｂ）〉。この時、ＥＬＩＳＡによってもＬＤＬ／ＳＡＡ１複合体が形成されていることが、確認された〈図１（Ｄ）〉。また、ＬＤＬ−コレステロール値〈図１（Ｃ）〉、ＦａｔＲｅｄによる脂質染色の結果からも酸化を受けることにより、ＨＤＬの量が減少する傾向が認められた〈図１（Ａ）〉。
【００２８】
［血清中のアポＡ１／アポＢ１００複合体、アポＣ３／アポＢ１００複合体、ＳＡＡ１／アポＢ１００複合体間の関係性］
健常者血清（ｎ＝４０）、高脂血症患者血清（ｎ＝４０）を用いて血清中のアポＡ１／アポＢ１００複合体、アポＣ３／アポＢ１００複合体、ＳＡＡ１／アポＢ１００複合体濃度間の関係性は図２に示すごとく良好な相関を示した。
【００２９】
［血清中酸化ＬＤＬと各複合体濃度間の関係性］
上述と同じ血清を用いて、酸化ＬＤＬを測定し、各複合体と比較したところ、図３に示すごとく良好な相関を示した。
【００３０】
［健常者群および高脂血症患者血清中の各種複合体濃度の比較］
上述と同じ血清を用いて測定した各種複合体濃度について健常者群、高脂血症患者群間の比較を行ったところ、いずれの複合体についても高脂血症患者群において高値であった（図４）。
【００３１】
［冠動脈硬化症患者血清中のアポＡ１／アポＢ１００複合体濃度］
健常者群と冠動脈硬化症患者血清中のアポＡ１／アポＢ１００複合体濃度を比較したところ図５に示すごとく冠動脈硬化症群において明らかな高値を示した。
【００３２】
［高脂血症患者のアポＢ１００含有リポ蛋白中に存在するアポＡ１の証明］
高脂血症患者の血清を試料として超遠心によって調製したアポＢ１００含有リポ蛋白であるＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ中のアポＡ１を抗ヒトアポＡ１抗体による免疫染色法によって調べた。
その結果、図６に示すごとくアポＢ１００含有リポ蛋白であるＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬのいずれの画分にもアポＡ１が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】酸化によるＬＤＬとＨＤＬの複合体形成試験の結果を示すものである。
【図２】血清中のａｐｏＡ１／ａｐｏＢ１００複合体、ａｐｏＣ３／ａｐｏＢ１００複合体、ＳＡＡ１／ａｐｏＢ１００複合体間の関係性を示したものである。
【図３】血清中の酸化ＬＤＬ濃度と各種ＨＬＤアポ蛋白と変性ＬＤＬとの複合体間の関係性を示したものである。
【図４】健常者及び高脂血者血清中の各種複合体濃度の比較を示すものである。
【図５】健常者及び冠動脈疾患患者血清中のアポＡ１／アポＢ１００複合体濃度を示すものである。
【図６】ａｐｏＢ１００含有リポ蛋白中におけるａｐｏＡ１の存在を示す図面である。

Claims

血液中のアポB100を有するリポ蛋白もしくはアポB100を有するリポ蛋白が変性されてなる変性リポ蛋白と、
高比重リポ蛋白（HDL）の構成蛋白との複合体を測定対象にすることを特徴とする動脈硬化性病変の診断用キット。
血液中のアポB100を有するリポ蛋白もしくはアポB100を有するリポ蛋白が変性されてなる変性リポ蛋白と、
アポA1との複合体、アポC3との複合体、又はserum amyloid A1（SAA-1）もしくはパラオキソネースとの複合体を測定対象にすることを特徴とする請求項１に記載の動脈硬化性病変の診断用キット。
免疫学的方法により、血液中のアポB100を有するリポ蛋白もしくはアポB100を有するリポ蛋白が変性されてなる変性リポ蛋白と高比重リポ蛋白（HDL）の構成蛋白との複合体を測定することを特徴とする請求項１又２に記載の動脈硬化性病変の診断用キット。
血清又は血漿を試料としてデキルトラン硫酸/カルシウムイオン沈澱法で得たVLDL、LDL画分中に存在する、アポB100を有するリポ蛋白もしくはアポB100を有する蛋白が変性されてなる変性リポ蛋白と高比重リポ蛋白の構成蛋白との複合体を測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の動脈硬化性病変の診断用キット。
抗ヒトアポA1抗体、抗ヒトアポC3抗体、抗ヒトSAA1抗体、又は抗ヒトパラオキソネース抗体と、
抗ヒトアポB100抗体とを用いることを特徴とする請求項３又は４に記載の動脈硬化性病変の診断用キット。