JPH07294532A - 低比重リポ蛋白分画法 - Google Patents
低比重リポ蛋白分画法Info
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- JPH07294532A JPH07294532A JP10749894A JP10749894A JPH07294532A JP H07294532 A JPH07294532 A JP H07294532A JP 10749894 A JP10749894 A JP 10749894A JP 10749894 A JP10749894 A JP 10749894A JP H07294532 A JPH07294532 A JP H07294532A
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- lipoprotein
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、生体由来でロット差を生じ
やすいヘパリンに代わる硫酸多糖類をデキストラン硫酸
に求め、その合成法を確立し、ロット間差がなく保存性
の優れた血清リポ蛋白分画試薬を調製するためのもので
ある。 【構成】 本発明は、低重合度のデキストランを硫酸化
し、このデキストラン硫酸と比較的弱い沈殿増強能を有
する二価のカチオンを組み合わせた血清リポ蛋白測定の
測定法に係り、さらにイオン強度を適宜選択する事によ
りＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンの各分画を測定す
る方法および試薬に関る。 【効果】 本発明により、安価にロット差のない血清リ
ポ蛋白分画測定試薬の調製が可能となる。
やすいヘパリンに代わる硫酸多糖類をデキストラン硫酸
に求め、その合成法を確立し、ロット間差がなく保存性
の優れた血清リポ蛋白分画試薬を調製するためのもので
ある。 【構成】 本発明は、低重合度のデキストランを硫酸化
し、このデキストラン硫酸と比較的弱い沈殿増強能を有
する二価のカチオンを組み合わせた血清リポ蛋白測定の
測定法に係り、さらにイオン強度を適宜選択する事によ
りＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイロミクロンの各分画を測定す
る方法および試薬に関る。 【効果】 本発明により、安価にロット差のない血清リ
ポ蛋白分画測定試薬の調製が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清中の脂質成分を測
定する方法および試薬に関るものである。更に詳しくは
血清中の低比重リポ蛋白の分画成分を比濁法で測定する
技術に関るものである。
定する方法および試薬に関るものである。更に詳しくは
血清中の低比重リポ蛋白の分画成分を比濁法で測定する
技術に関るものである。
【０００２】
【従来の技術】血液中における脂質は、リポ蛋白の形で
存在し生体内組織間の輸送が行われている。リポ蛋白は
その比重から大きくカイロミクロン、超低比重リポ蛋白
（ＶＬＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ
蛋白（ＨＤＬ）に分けられ、それらは電気泳動法による
カイロミクロン、pre-βリポ蛋白、βリポ蛋白及びαリ
ポ蛋白に相当する。各リポ蛋白の機能としてはカイロミ
クロンは腸管から吸収した中性脂肪を肝に運搬し、肝で
生成されたＶＬＤＬは中性脂肪を末梢組織に運搬しなが
らＬＤＬへと変化し、コレステロールを多く含むＬＤＬ
は末梢において吸収される。一方、肝で生成されたＨＤ
Ｌは末梢のコレステロールを逆に肝へと運搬する役目を
果たし、末梢への脂質蓄積を促す低比重側のリポ蛋白群
とは明らかに異なった機能を有する。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ
は起源は一であるが、生体内の代謝機能の変化あるいは
疾病によりいずれかまたは両者の血中濃度の上昇が認め
られ、動脈硬化性疾患との関連が指摘されている。電気
泳動法によりカイロミクロン、pre-βリポ蛋白及びβリ
ポ蛋白の上昇をフェノタイピングし、５つの型にわけた
Fredricksonの分類はその後ＷＨＯにより１型が追加さ
れ、６型の分類として採用された。
存在し生体内組織間の輸送が行われている。リポ蛋白は
その比重から大きくカイロミクロン、超低比重リポ蛋白
（ＶＬＤＬ）、低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）、高比重リポ
蛋白（ＨＤＬ）に分けられ、それらは電気泳動法による
カイロミクロン、pre-βリポ蛋白、βリポ蛋白及びαリ
ポ蛋白に相当する。各リポ蛋白の機能としてはカイロミ
クロンは腸管から吸収した中性脂肪を肝に運搬し、肝で
生成されたＶＬＤＬは中性脂肪を末梢組織に運搬しなが
らＬＤＬへと変化し、コレステロールを多く含むＬＤＬ
は末梢において吸収される。一方、肝で生成されたＨＤ
Ｌは末梢のコレステロールを逆に肝へと運搬する役目を
果たし、末梢への脂質蓄積を促す低比重側のリポ蛋白群
とは明らかに異なった機能を有する。ＬＤＬ、ＶＬＤＬ
は起源は一であるが、生体内の代謝機能の変化あるいは
疾病によりいずれかまたは両者の血中濃度の上昇が認め
られ、動脈硬化性疾患との関連が指摘されている。電気
泳動法によりカイロミクロン、pre-βリポ蛋白及びβリ
ポ蛋白の上昇をフェノタイピングし、５つの型にわけた
Fredricksonの分類はその後ＷＨＯにより１型が追加さ
れ、６型の分類として採用された。
【０００３】従来、リポ蛋白の分画法としては超遠心法
と電気泳動法以外には有効な方法が無かったが、1972年
にScholnickらによりヘパリンと塩化カルシウム、塩化
マグネシウム及び塩化ナトリウムによりカイロミクロン
＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを濁らせる試薬と、カイロミクロン
＋ＶＬＤＬを濁らせる試薬及びカイロミクロンだけを濁
らせる試薬が調整可能であることが報告された(Fluids,
19 : 289,1972)。その後、小出らによりヘパリンと塩
化カルシウム及び塩化ナトリウムの適当な濃度を選択す
ることにより同様の試薬が調製できるだけではなく、そ
の濁りの差よりＬＤＬ、ＶＬＤＬが定量可能であること
が報告され（臨床病理、臨時増刊特集第21号：82,197
5）、これを原理とした試薬が製品化されている。
と電気泳動法以外には有効な方法が無かったが、1972年
にScholnickらによりヘパリンと塩化カルシウム、塩化
マグネシウム及び塩化ナトリウムによりカイロミクロン
＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを濁らせる試薬と、カイロミクロン
＋ＶＬＤＬを濁らせる試薬及びカイロミクロンだけを濁
らせる試薬が調整可能であることが報告された(Fluids,
19 : 289,1972)。その後、小出らによりヘパリンと塩
化カルシウム及び塩化ナトリウムの適当な濃度を選択す
ることにより同様の試薬が調製できるだけではなく、そ
の濁りの差よりＬＤＬ、ＶＬＤＬが定量可能であること
が報告され（臨床病理、臨時増刊特集第21号：82,197
5）、これを原理とした試薬が製品化されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】しかしながらヘパリ
ンはもともと動物由来の物質であり供給量に限界がある
うえ、動物種により反応性が異なる。また同じ動物種由
来でも精製法により出来上がったものが微妙に異なるた
め、同じ測定結果を得るためにはヘパリンのロット毎に
試薬処方を変える必要がある。さらにはヘパリンロット
によっては試薬調製後の安定性が悪く、使用に耐えない
ことがある。本発明は、長期間安定に供給可能なポリア
ニオンを合成し、このポリアニオンを用いることによ
り、常に安定した定量値を与える測定法および測定試薬
の供給を目的とするものである。
ンはもともと動物由来の物質であり供給量に限界がある
うえ、動物種により反応性が異なる。また同じ動物種由
来でも精製法により出来上がったものが微妙に異なるた
め、同じ測定結果を得るためにはヘパリンのロット毎に
試薬処方を変える必要がある。さらにはヘパリンロット
によっては試薬調製後の安定性が悪く、使用に耐えない
ことがある。本発明は、長期間安定に供給可能なポリア
ニオンを合成し、このポリアニオンを用いることによ
り、常に安定した定量値を与える測定法および測定試薬
の供給を目的とするものである。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】かかる目的を達成する
本発明は、硫酸デキストランと二価のカチオンおよび一
価のカチオンを用いて血清中のリポ蛋白を沈殿させる方
法において、硫酸デキストラン量および二価のカチオン
量および／または一価のカチオン量を変えることにより
リポ蛋白分画を段階的に沈殿させる血清リポ蛋白の分画
を測定する方法および試薬である。
本発明は、硫酸デキストランと二価のカチオンおよび一
価のカチオンを用いて血清中のリポ蛋白を沈殿させる方
法において、硫酸デキストラン量および二価のカチオン
量および／または一価のカチオン量を変えることにより
リポ蛋白分画を段階的に沈殿させる血清リポ蛋白の分画
を測定する方法および試薬である。
【０００６】ヘパリンに代わるリポ蛋白の沈殿剤とし
て、高分子デキストランを硫酸化した硫酸デキストラン
がよく知られている。ＨＤＬコレステロール測定用の沈
殿剤には分子量50、000の硫酸デキストランが用いられて
いる（Clin.Chem.28:1379,1982）。比濁定量を目的とし
たものはＳ含有量が15〜16％、比粘度0.988〜1.097の硫
酸デキストランを用いてβリポ蛋白の比濁測定を行った
例があった（臨床病理、臨時増刊特集号第21号:76、197
5）。しかしながら平均分子量500,000の硫酸デキストラ
ン（ファルマシア製）を用いて、ヘパリン使用と同様の
処方で試薬を調整したところ、リポ蛋白以外の血清蛋白
との沈殿が大量に認められた。また試薬組成をいかに変
えてもヘパリンの場合に見られるような選択的沈殿現象
は得られなかった。
て、高分子デキストランを硫酸化した硫酸デキストラン
がよく知られている。ＨＤＬコレステロール測定用の沈
殿剤には分子量50、000の硫酸デキストランが用いられて
いる（Clin.Chem.28:1379,1982）。比濁定量を目的とし
たものはＳ含有量が15〜16％、比粘度0.988〜1.097の硫
酸デキストランを用いてβリポ蛋白の比濁測定を行った
例があった（臨床病理、臨時増刊特集号第21号:76、197
5）。しかしながら平均分子量500,000の硫酸デキストラ
ン（ファルマシア製）を用いて、ヘパリン使用と同様の
処方で試薬を調整したところ、リポ蛋白以外の血清蛋白
との沈殿が大量に認められた。また試薬組成をいかに変
えてもヘパリンの場合に見られるような選択的沈殿現象
は得られなかった。
【０００７】この原因は、硫酸デキストランの分子量が
ヘパリンに比べ大きすぎるためと推測された。そこで、
より重合度の低いデキストランを硫酸化し、作製した硫
酸デキストランを使用して処方検討を行った。平均分子
量10,000のデキストランを硫酸化したものはヘパリンの
場合よりやや反応性が強く、リポ蛋白以外の蛋白との反
応も認められたが、塩化ナトリウムを適当量添加するこ
とにより、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロンとのみ
沈殿を生成する条件を見いだし、次いでＶＬＤＬとカイ
ロミクロンとのみ、さらにはカイロミクロンとのみ反応
する条件を見いだした。
ヘパリンに比べ大きすぎるためと推測された。そこで、
より重合度の低いデキストランを硫酸化し、作製した硫
酸デキストランを使用して処方検討を行った。平均分子
量10,000のデキストランを硫酸化したものはヘパリンの
場合よりやや反応性が強く、リポ蛋白以外の蛋白との反
応も認められたが、塩化ナトリウムを適当量添加するこ
とにより、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びカイロミクロンとのみ
沈殿を生成する条件を見いだし、次いでＶＬＤＬとカイ
ロミクロンとのみ、さらにはカイロミクロンとのみ反応
する条件を見いだした。
【０００８】ヘパリンあるいは硫酸デキストランに限ら
ず、ポリアニオンとリポ蛋白の反応はアポ蛋白を介して
いると思われるが、ポリアニオンの反応はリポ蛋白に限
らず血中のほとんどの蛋白との間に起こっており、疎水
性の強いリポ蛋白の場合は他の蛋白より容易に沈殿され
やすいために目に見える濁りとなって測定される。例え
ば反応液のｐＨを酸性にするとリポ蛋白のみならず他の
血中蛋白の沈殿も多く見られるようになる。また、ポリ
アニオンとリポ蛋白の反応により発生した濁りをイオン
強度を上げるかまたはｐＨをアルカリ側に上げることに
より可溶化したものを電気泳動にかけると、リポ蛋白の
泳動位置が陽極側へシフトする現象が見られ、ポリアニ
オンと結合した可溶性コンプレックスの存在が確認でき
る。
ず、ポリアニオンとリポ蛋白の反応はアポ蛋白を介して
いると思われるが、ポリアニオンの反応はリポ蛋白に限
らず血中のほとんどの蛋白との間に起こっており、疎水
性の強いリポ蛋白の場合は他の蛋白より容易に沈殿され
やすいために目に見える濁りとなって測定される。例え
ば反応液のｐＨを酸性にするとリポ蛋白のみならず他の
血中蛋白の沈殿も多く見られるようになる。また、ポリ
アニオンとリポ蛋白の反応により発生した濁りをイオン
強度を上げるかまたはｐＨをアルカリ側に上げることに
より可溶化したものを電気泳動にかけると、リポ蛋白の
泳動位置が陽極側へシフトする現象が見られ、ポリアニ
オンと結合した可溶性コンプレックスの存在が確認でき
る。
【０００９】またカルシウム、マグネシウム、マンガン
などの二価のカチオンはポリアニオンとの反応を増強す
る作用を持つ。前述の平均分子量2,000,000の硫酸デキ
ストランは二価のカチオンなしでもリポ蛋白による濁り
を生するが、より重合度の低い硫酸デキストランでは二
価のカチオンがなければ沈殿しない（Advance in Lipid
Research,2:67,1973）。さらに、マンガンは他の２種
よりも増強作用が強い。ヘパリンとの組み合わせを例に
とれば、マンガンは生理食塩水下（一価のカチオン濃度
＝0.9%）でもＬＤＬを含むリポ蛋白と強い濁りを生成す
るが、カルシウム、マグネシウムは一価のカチオン濃度
を0.36%以下とし、イオン強度を下げなければＬＤＬは
ほとんど沈殿しない（臨床病理、臨時増刊特集号第21
号:82、1975）。
などの二価のカチオンはポリアニオンとの反応を増強す
る作用を持つ。前述の平均分子量2,000,000の硫酸デキ
ストランは二価のカチオンなしでもリポ蛋白による濁り
を生するが、より重合度の低い硫酸デキストランでは二
価のカチオンがなければ沈殿しない（Advance in Lipid
Research,2:67,1973）。さらに、マンガンは他の２種
よりも増強作用が強い。ヘパリンとの組み合わせを例に
とれば、マンガンは生理食塩水下（一価のカチオン濃度
＝0.9%）でもＬＤＬを含むリポ蛋白と強い濁りを生成す
るが、カルシウム、マグネシウムは一価のカチオン濃度
を0.36%以下とし、イオン強度を下げなければＬＤＬは
ほとんど沈殿しない（臨床病理、臨時増刊特集号第21
号:82、1975）。
【００１０】従って反応性の比較的弱い、即ち重合度の
低いポリアニオンと増強度の弱めな二価のカチオンとの
組み合わせの時にＬＤＬを含む低比重側のリポ蛋白が選
択的に沈殿し、イオン強度を適当に選択すると、低比重
側のリポ蛋白のみと反応する試薬が調整され、しかもさ
らにイオン強度を上げていくと親水性の高い分画から溶
解する現象が見られる。すなわち、本現象はヘパリンあ
るいは硫酸デキストランに限らず適当なポリアニオンを
準備すれば同様な性能の試薬が調整が可能と思われる。
低いポリアニオンと増強度の弱めな二価のカチオンとの
組み合わせの時にＬＤＬを含む低比重側のリポ蛋白が選
択的に沈殿し、イオン強度を適当に選択すると、低比重
側のリポ蛋白のみと反応する試薬が調整され、しかもさ
らにイオン強度を上げていくと親水性の高い分画から溶
解する現象が見られる。すなわち、本現象はヘパリンあ
るいは硫酸デキストランに限らず適当なポリアニオンを
準備すれば同様な性能の試薬が調整が可能と思われる。
【００１１】しかしながら、ヘパリンに代わるポリアニ
オンを長期安定供給する目的には、原料入手の容易さお
よび価格の面から硫酸デキストランが最も好ましく、分
子量はヘパリンの挙動に類似する5,000〜50,000の範囲
内が好ましい。分子量50、000を超えるとイオン強度の僅
かな変化に沈殿発生量が影響されやすく、試薬調整に困
難をともなう。また分子量5,000未満では各分画の沈殿
量が少なくなり、そのため測定誤差が大きくなる傾向が
認められた。
オンを長期安定供給する目的には、原料入手の容易さお
よび価格の面から硫酸デキストランが最も好ましく、分
子量はヘパリンの挙動に類似する5,000〜50,000の範囲
内が好ましい。分子量50、000を超えるとイオン強度の僅
かな変化に沈殿発生量が影響されやすく、試薬調整に困
難をともなう。また分子量5,000未満では各分画の沈殿
量が少なくなり、そのため測定誤差が大きくなる傾向が
認められた。
【００１２】二価のカチオンはＣａ2+およびＭｇ2+が好
ましい。Ｍｎ2+およびＮｉ2+は、沈殿増強作用が強すぎ
て、一価のカチオン量をどのように変化させても、リポ
蛋白分画を選択的に沈殿させる処方は得られなかった。
イオン強度の調整に用いられる一価のカチオンはイオン
の活量係数の高い化合物から選ぶとよい。塩化ナトリウ
ムまたは塩化カリウムは広い濃度範囲で平均活量係数が
高く（0.6以上）、さらに原料入手が容易であるため、
とりわけ好ましいものである。
ましい。Ｍｎ2+およびＮｉ2+は、沈殿増強作用が強すぎ
て、一価のカチオン量をどのように変化させても、リポ
蛋白分画を選択的に沈殿させる処方は得られなかった。
イオン強度の調整に用いられる一価のカチオンはイオン
の活量係数の高い化合物から選ぶとよい。塩化ナトリウ
ムまたは塩化カリウムは広い濃度範囲で平均活量係数が
高く（0.6以上）、さらに原料入手が容易であるため、
とりわけ好ましいものである。
【００１３】カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬのリポ
蛋白分画を測定するためには、３種の試薬を必要とす
る。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋カイロミクロンを沈殿させる試
薬−１は、硫酸デキストラン０．０８〜１．２％、二価
のカチオン０．０１〜０．０３Ｍ、一価のカチオン０．
０５〜０．１０Ｍの組成とする。硫酸デキストラン量お
よび二価のカチオン量は、ヘパリン法の沈殿量との整合
性が保たれるよう決定した。一価のカチオン量はリポ蛋
白以外の蛋白を可溶化させるための必要最少量である。
蛋白分画を測定するためには、３種の試薬を必要とす
る。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋カイロミクロンを沈殿させる試
薬−１は、硫酸デキストラン０．０８〜１．２％、二価
のカチオン０．０１〜０．０３Ｍ、一価のカチオン０．
０５〜０．１０Ｍの組成とする。硫酸デキストラン量お
よび二価のカチオン量は、ヘパリン法の沈殿量との整合
性が保たれるよう決定した。一価のカチオン量はリポ蛋
白以外の蛋白を可溶化させるための必要最少量である。
【００１４】ＶＬＤＬ＋カイロミクロンを沈殿させる試
薬−２の組成は、ＬＤＬを可溶化する分だけ試薬−１の
イオン強度を高めればよい。しかし単にカチオンを増量
させただけでは、ＬＤＬのみ可溶化する条件を見出しに
くい。硫酸デキストラン量を倍増しリポ蛋白沈殿量を増
加させれば、二価および一価のカチオン量は比較的容易
に決定することができる。二価のカチオン量は試薬−１
の２〜４倍量、一価のカチオンは試薬−１の２〜３倍と
することが好ましい。試薬−２の組成の適当な濃度範囲
は、硫酸デキストラン０．１５〜２．５％、二価のカチ
オン０．０３〜０．１Ｍ、一価のカチオン０．１〜０．
２Ｍである。
薬−２の組成は、ＬＤＬを可溶化する分だけ試薬−１の
イオン強度を高めればよい。しかし単にカチオンを増量
させただけでは、ＬＤＬのみ可溶化する条件を見出しに
くい。硫酸デキストラン量を倍増しリポ蛋白沈殿量を増
加させれば、二価および一価のカチオン量は比較的容易
に決定することができる。二価のカチオン量は試薬−１
の２〜４倍量、一価のカチオンは試薬−１の２〜３倍と
することが好ましい。試薬−２の組成の適当な濃度範囲
は、硫酸デキストラン０．１５〜２．５％、二価のカチ
オン０．０３〜０．１Ｍ、一価のカチオン０．１〜０．
２Ｍである。
【００１５】カイロミクロンのみを沈殿させる試薬−３
は、試薬−２の一価のカチオンを３０〜５０％増量し、
イオン強度を高めることで得られる。試薬組成は、硫酸
デキストラン０．１５〜２．５％、二価のカチオン０．
０３〜０．１Ｍ、一価のカチオン０．１５〜０．２Ｍの
濃度範囲が好ましい。ＶＬＤＬは試薬−２の測定値（Ｖ
ＬＤＬ＋カイロミクロン）から試薬−３の測定値（カイ
ロミクロン）を差し引くことにより求められ、ＬＤＬ
は、試薬−１の測定値（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋カイロミク
ロン）から試薬−２の測定値（ＶＬＤＬ＋カイロミクロ
ン）を差し引くことにより求められる。
は、試薬−２の一価のカチオンを３０〜５０％増量し、
イオン強度を高めることで得られる。試薬組成は、硫酸
デキストラン０．１５〜２．５％、二価のカチオン０．
０３〜０．１Ｍ、一価のカチオン０．１５〜０．２Ｍの
濃度範囲が好ましい。ＶＬＤＬは試薬−２の測定値（Ｖ
ＬＤＬ＋カイロミクロン）から試薬−３の測定値（カイ
ロミクロン）を差し引くことにより求められ、ＬＤＬ
は、試薬−１の測定値（ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ＋カイロミク
ロン）から試薬−２の測定値（ＶＬＤＬ＋カイロミクロ
ン）を差し引くことにより求められる。
【００１６】また本発明はリポ蛋白分画を比濁法および
比ろう法にて測定する方法および試薬に関るものであ
る。沈殿量の測定には透過光による比濁法や散乱光によ
る比ろう法があり、どちらも広く普及している。本発明
によるデキストラン硫酸とリポ蛋白との沈殿は、均質な
混濁を形成するためどちらの測定法においても測定値の
乖離は認められない。
比ろう法にて測定する方法および試薬に関るものであ
る。沈殿量の測定には透過光による比濁法や散乱光によ
る比ろう法があり、どちらも広く普及している。本発明
によるデキストラン硫酸とリポ蛋白との沈殿は、均質な
混濁を形成するためどちらの測定法においても測定値の
乖離は認められない。
【００１７】本発明は発生した沈殿を濾過あるいは遠心
操作にて分離し、沈殿あるいは上清の脂質を測定するこ
とにも使用出来る。試薬−３または試薬−３よりもイオ
ン強度を低めた試薬を用いれば、ＨＤＬ以外の成分が沈
殿する。遠心分離、または自然放置によって得た上清を
試料としてコレステロールを測定することにより、ＨＤ
Ｌ−コレステロールの測定が可能となる。コレステロー
ルの測定をコレステローエステラーゼ、コレステロール
オキシダーゼを用いた酵素法で行う場合には、二価のカ
チオンは酵素阻害のないＣａ2+またはＭｇ2+を使用する
ことが望ましい。
操作にて分離し、沈殿あるいは上清の脂質を測定するこ
とにも使用出来る。試薬−３または試薬−３よりもイオ
ン強度を低めた試薬を用いれば、ＨＤＬ以外の成分が沈
殿する。遠心分離、または自然放置によって得た上清を
試料としてコレステロールを測定することにより、ＨＤ
Ｌ−コレステロールの測定が可能となる。コレステロー
ルの測定をコレステローエステラーゼ、コレステロール
オキシダーゼを用いた酵素法で行う場合には、二価のカ
チオンは酵素阻害のないＣａ2+またはＭｇ2+を使用する
ことが望ましい。
【００１８】つづいて実施例に基づき本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこの例によってなんら限定さ
れるものではない。
細に説明するが、本発明はこの例によってなんら限定さ
れるものではない。
【００１９】
【実施例】 実施例１ 三頸のフラスコにホルムアミド600mlを入れ、氷冷下に
クロルスルホン酸100mlを滴下した。平均分子量10,000
のデキストラン50ｇを加え50℃にて一昼夜攪拌した。室
温まで冷却し、発生した沈殿をろ別し、ろ液を3.5ｌの
冷メタノール中に注ぎ、生成する沈殿をろ別した。沈殿
を少量のメタノールで洗浄後、60℃にて一夜乾燥した。
デキストラン50ｇより74ｇの硫酸デキストランが得られ
た。
クロルスルホン酸100mlを滴下した。平均分子量10,000
のデキストラン50ｇを加え50℃にて一昼夜攪拌した。室
温まで冷却し、発生した沈殿をろ別し、ろ液を3.5ｌの
冷メタノール中に注ぎ、生成する沈殿をろ別した。沈殿
を少量のメタノールで洗浄後、60℃にて一夜乾燥した。
デキストラン50ｇより74ｇの硫酸デキストランが得られ
た。
【００２０】硫酸デキストラン、塩化カルシウムおよび
塩化ナトリウムを精製水に順次溶解し、表１に示す組成
の３種類の試薬を調製した。
塩化ナトリウムを精製水に順次溶解し、表１に示す組成
の３種類の試薬を調製した。
【００２１】
【表１】
【００２２】プール血清を準備し、超遠心法により血清
からカイロミクロン、カイロミクロン＋ＶＬＤＬおよび
カイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを除いた検体を作成
し、上記試薬にて測定した。0.1mlの検体と上記各試薬4
mlを試験管に取り混和後室温下に25分間放置し、反応液
を光学セルに移し日立３３０型分光光度計にて650nmの
吸光度を測定した。表２に結果を示す。
からカイロミクロン、カイロミクロン＋ＶＬＤＬおよび
カイロミクロン＋ＶＬＤＬ＋ＬＤＬを除いた検体を作成
し、上記試薬にて測定した。0.1mlの検体と上記各試薬4
mlを試験管に取り混和後室温下に25分間放置し、反応液
を光学セルに移し日立３３０型分光光度計にて650nmの
吸光度を測定した。表２に結果を示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】超遠心法によりカイロミクロンを除いたも
のは試薬-３との反応がほとんど失われたが、ＬＤＬと
ＶＬＤＬの吸光度に変化はなかった。ＶＬＤＬまで除く
と試薬-２、３の反応がほとんど見られなくなったが、
ＬＤＬの吸光度は残っていた。さらにＬＤＬまで除くと
いずれの試薬ともほとんど反応せず、わずかに残った試
薬-１との反応は超遠心分離の際のコンタミによるもの
と思われた。
のは試薬-３との反応がほとんど失われたが、ＬＤＬと
ＶＬＤＬの吸光度に変化はなかった。ＶＬＤＬまで除く
と試薬-２、３の反応がほとんど見られなくなったが、
ＬＤＬの吸光度は残っていた。さらにＬＤＬまで除くと
いずれの試薬ともほとんど反応せず、わずかに残った試
薬-１との反応は超遠心分離の際のコンタミによるもの
と思われた。
【００２５】実施例２ ヘパリンを用いた分画試薬を表３に示した処方にもとづ
き作製し、実施例１で作製した硫酸デキストランを用い
た試薬とともに冷所および37℃に保存した。３ヶ月経過
後、保存試薬各種を用いて実施例１と同様に数種の血清
を試料とした吸光度を測定した。結果を表４および表５
に示す。ヘパリンのものは有意に37℃保存品が低い吸光
度を示したが、硫酸デキストランのものは差が見られな
かった。
き作製し、実施例１で作製した硫酸デキストランを用い
た試薬とともに冷所および37℃に保存した。３ヶ月経過
後、保存試薬各種を用いて実施例１と同様に数種の血清
を試料とした吸光度を測定した。結果を表４および表５
に示す。ヘパリンのものは有意に37℃保存品が低い吸光
度を示したが、硫酸デキストランのものは差が見られな
かった。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【発明の効果】本発明により、硫酸デキストランをポリ
アニオンとする低比重リポ蛋白分画測定の手法が確立さ
れた。硫酸デキストランのロット毎に必要であった大幅
な処方変更なしに試薬の調製が可能となり、保存安定性
も向上した。また、デキストランそのものが合成品であ
るため、安価に大量の原料が入手可能となった。
アニオンとする低比重リポ蛋白分画測定の手法が確立さ
れた。硫酸デキストランのロット毎に必要であった大幅
な処方変更なしに試薬の調製が可能となり、保存安定性
も向上した。また、デキストランそのものが合成品であ
るため、安価に大量の原料が入手可能となった。
Claims (11)
- 【請求項１】 硫酸デキストランと二価のカチオンおよ
び一価のカチオンを用いて血清中のリポ蛋白を沈殿させ
る方法において、硫酸デキストランおよび二価のカチオ
ン量および／または一価のカチオン量を変えることによ
りリポ蛋白分画を段階的に沈殿させる血清リポ蛋白分画
測定法。 - 【請求項２】 リポ蛋白分画がＬＤＬ、ＶＬＤＬ、カイ
ロミクロンである請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項３】 測定法が比濁法あるいは比ろう法である
請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項４】 発生した沈殿を濾過あるいは遠心操作に
て分離し、沈殿あるいは上清の脂質を測定する請求項１
に記載の測定方法。 - 【請求項５】 硫酸デキストランとして平均分子量が
５，０００〜５０，０００のものを使用することを特徴
とする請求項１に記載の測定方法。 - 【請求項６】 二価のカチオンとしてＣａ2+、あるいは
Ｍｇ2+を使用することを特徴とする請求項１に記載の測
定方法。 - 【請求項７】 一価のカチオンとしてＮａ+、あるいはＫ
+を使用することを特徴とする請求項１に記載の測定方
法。 - 【請求項８】 硫酸デキストランと二価のカチオン、お
よび一価のカチオンを用いて血清中の低比重リポ蛋白の
沈殿を段階的に発生させるリポ蛋白分画測定試薬。 - 【請求項９】 硫酸デキストランとして平均分子量が
５，０００〜５０，０００のものを使用することを特徴
とする請求項８に記載の測定試薬。 - 【請求項１０】 二価のカチオンとしてＣａ2+、あるい
はＭｇ2+を使用することを特徴とする請求項８に記載の
測定試薬。 - 【請求項１１】 一価のカチオンとしてＮａ+、あるいは
Ｋ+を使用することを特徴とする請求項８に記載の測定
試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10749894A JPH07294532A (ja) | 1994-04-22 | 1994-04-22 | 低比重リポ蛋白分画法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10749894A JPH07294532A (ja) | 1994-04-22 | 1994-04-22 | 低比重リポ蛋白分画法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07294532A true JPH07294532A (ja) | 1995-11-10 |
Family
ID=14460738
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10749894A Pending JPH07294532A (ja) | 1994-04-22 | 1994-04-22 | 低比重リポ蛋白分画法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07294532A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002243745A (ja) * | 2001-02-15 | 2002-08-28 | Tosoh Corp | リポ蛋白質分析装置 |
| WO2004014942A1 (en) * | 2002-08-09 | 2004-02-19 | Selborne Biological Services (Australia) Pty Limited | A method for preparing lipoprotein from a blood source |
| WO2004053500A1 (ja) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Denka Seiken Co., Ltd. | 小粒子低比重リポ蛋白の定量法 |
| JP2013253980A (ja) * | 2007-06-08 | 2013-12-19 | Quest Diagnostics Investments Inc | 差異荷電粒子移動度によるリポ蛋白質の分析 |
| US9791464B2 (en) | 2007-06-08 | 2017-10-17 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Lipoprotein analysis by differential charged-particle mobility |
| US10119971B2 (en) | 2008-08-07 | 2018-11-06 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection apparatus for differential-charged particle mobility analyzer |
| US10308680B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-06-04 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Magnetic separation of lipoproteins using dextran sulfate |
-
1994
- 1994-04-22 JP JP10749894A patent/JPH07294532A/ja active Pending
Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| AU2003289224B2 (en) * | 2002-12-06 | 2009-02-19 | Denka Company Limited | Method of quantifying small-sized low density lipoprotein |
| US7544515B2 (en) | 2002-12-06 | 2009-06-09 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of quantifying small-sized low density lipoprotein |
| US7811826B2 (en) | 2002-12-06 | 2010-10-12 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method of quantitatively measuring small particle low density lipoproteins |
| JP2013253980A (ja) * | 2007-06-08 | 2013-12-19 | Quest Diagnostics Investments Inc | 差異荷電粒子移動度によるリポ蛋白質の分析 |
| JP2015180891A (ja) * | 2007-06-08 | 2015-10-15 | クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド | 差異荷電粒子移動度によるリポ蛋白質の分析 |
| US9791464B2 (en) | 2007-06-08 | 2017-10-17 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Lipoprotein analysis by differential charged-particle mobility |
| US10948503B2 (en) | 2007-06-08 | 2021-03-16 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Lipoprotein analysis by differential charged-particle mobility |
| US11680949B2 (en) | 2007-06-08 | 2023-06-20 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Lipoprotein analysis by differential charged-particle mobility |
| US12055554B2 (en) | 2007-06-08 | 2024-08-06 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Lipoprotein analysis by differential charged-particle mobility |
| US10119971B2 (en) | 2008-08-07 | 2018-11-06 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection apparatus for differential-charged particle mobility analyzer |
| US10488419B2 (en) | 2008-08-07 | 2019-11-26 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Detection apparatus for differential-charged particle mobility analyzer |
| US10308680B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-06-04 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Magnetic separation of lipoproteins using dextran sulfate |
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