KR0184027B1 - 재구성된 지방단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

재구성된 고밀도 지방단백질(rHDL)은 아포지방단백질 및 지질로 부터 제조되어지는데, 1-40g단백질/ℓ의 농도를 갖는 수용성 아포지방단백질 용액과 유기용매의 첨가없이 수용성 지질-디터전트 용액을 상기 지질대 디터전트의 몰비를 1 : 0.5 내지 1 : 4 및 상기 지질 대 디터전트의 중량비를 1 : 1.5 내지 1 : 5로 혼합시키며, ±10℃물에서 지질의 상전이 온도 범위에서 계속적으로 반응시켜 상기 아포지방단백질-지질-디터전트 혼합물을 얻고, 상기 디터전트는 적어도 부분적으로 제거된다.

상기 rHDL은 지질 및 지방성 물질과 연관된 질병의 예방법 및 치료법에 널리 유용하다. 상기 방법은 기술적 및 산업적 생산을 위해 특히 바람직하다.

Description

재구성된 지방단백질의 제조방법

제1도는 본 발명의 일실시예에 따라 apoA-I 대 포스파티딜 콜린의 다른 비를 사용하여 제조된 rHDL 입자의 겔여과법의 용출 다이아그램.

본 발명은 아포지방단백질(apolipoprotein) 및 지질로부터 재구성된 고 밀도 지방단백질 (rHDL)을 산업적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. rHDL 은 개체에서 지질 및 지방성 물질과 결합하고, 그들의 수송 및 활성에 영향을 미치는 특징을 갖는다. 따라서 rHDL 은 지질 및 지방성 물질과 관련된 다양한 질병의 예방 및 치료에 유용하다.

인간 혈액의 지방단백질은 일련의 다양한 기능을 수행할 수 있다. 지질은 수송하는 지방단백질의 기능은 잘 연구되어 알려져 있다. 지방단백질은 수용성 환경에서 지질을 수송하기 위해 불용성 지질과 결합하여 그들의 목적지로 운반하는 능력을 갖는다. 근래에는 지방단백질의 개별적인 분류 작업이 지질 대사의 방해와 관련하여 더욱 면밀히 연구되어져 왔다. 대다수의 서방 국가에 있어서, 심장 혈관 질환 및 고 혈장 콜레스테롤 또는 고 저밀도지방단백질 콜레스테롤(LDL cholesterol) 사이의 양성(positive)관계 및 고HDL 또는 고 HDL콜레스테롤에 대한 음성 관계를 유행병 연구에 의해 밝혀냈다. 전반적인 의학분야에서 저-지질 효과를 나타내는 상품이 사용되고 있을지라도, 어떤 경우에는 적절한 지방단백질로의 치환이 바람직하다고 생각할 수 있다. 결국, 이러한 경우에 적절하다는 것은 HDL 또는 불리된 아포지방단백질 및 안전한 지질로부터 재구성된 HDL(rHDL)과 같은 HDL과 유사한 입자와 같이 바람직한 지방단백질들이다. 음식물로부터 섭취된 지질 외에, 다른 지질 또는 지방성 물질로부터의 지방단백질은 수송 또는 결합될 수 있다. 예를 들면, 죽은 세포의 구성분은 지방단백질과 결합할 수 있고 새로운 기능이 부여될 수 있다. 지방성물질은 예를 들어, 지방다당류(LPS)와 같은 지방단백질에 결합될 수 있다. 지방다당류 또는 내독소는 그램-음성(-) 박테리아의 막의 구성분이다. 내독소의 양이 심장혈관 시스템에 침투할 수 있을 만큼 충분할 경우, 이것은 패혈증성 쇼크나 심지어 사망에 이를 수도 있다. 지방단백질 LPS가 결합하므로서 LPS의 기능 또는 활성은 조절될 수 있다. LPS의 활성은 지방단백질 또는 지방단백질과 유사한 입자의 첨가를 통해 생체 또는 실험실 조건에서 변화될 수 있다. 따라서 재구성된 HDL의 첨가는 패혈증의 중요 매개체인 종양 괴사인자(TNF)의 형성을 억제한다는 것을 생체 실험을 통해 입증할 수 있었다. 생체내에서, 상기 쇼크의 증상은 HDL 또는 rHDL 의 투여를 통해 점진적으로 감소시킬 수 있다.

지질 또는 지방성 물질과 지방단백질 또는 재구성된 지방단백질의 상호작용 외에 지방단백질과 단백질의 상호작용은 다음과 같이 논의 되어왔다: -지방 단백질은 상보 시스템의 각각의 성분들과 상호작용으로 침투할 수 있고 따라서 그들의 활성에 영향을 미칠 수 있다; -응고 시스템의 성분을 지방단백질 단편(fraction)에서 발견된 것으로 알려졌는데, 즉, 이것은 어떤 지방단백질과 결합되었다는 것이다; -혈청 아밀로이드A(SAA)와 같은 어큐트(acute)상 단백질 HDL단편에서 발견된다; -그리고 표면에 어떤 단백질의 흡착은 지방단백질로 예비처리하므로서 영향을 미칠 수 있다.

세포에 대한 특이 또는 비-특이결합을 통해, 지방단백질은 세포내 활성에 영향을 미칠 수 있다 : -활성화될 수 있는 혈소판의 능력은 HDL의 결합을 통해 감소시킬 수 있고 또는 LDL의 첨가로 인해 자극시킬 수 있다; -단핵세포 및 마이크로파아지는 지방단백질에 대한 수용체를 가지는데; 지방단백질과 결합 또는 흡착은 상기 세포들의 활성의 변화를 초래할 수 있다; -뉴트로필(neutrophils)과 같은 숙주 방어시스템에 관련된 다른 세포의 활성은 지방단백질의 결합을 통해 변경 또는 조절될 수 있다; -더군다나, 예를 들어 글리오블라스토마(glyoblastoma) 세포를 이용하여 나타난 종양 세포의 성장은 또한 지방단백질을 통해 영향을 받을 수 있다.

과학 잡지에서 병원균과 지방단백질의 상호작용, 예를 들어, 지방단백질에 기인하는 항균 활성을 기술하는 보고서가 나타나고 있다. 바이러스는 지방단백질에 의해 비활성화될 수 있는데, 예를 들어 트리파노좀(trypanosome)을 이용하여 기생균을 개별적으로 억제시키거나 영향 미칠 수 있다.

이러한 예들은 예방 및 치료의 적용에 지방단백질 또는 rHDL의 사용에 대한 다양한 가능성을 나타내고 있다.

지방단백질은 4개의 주요 군으로 구분된다.

유미입자(chylomicron)는 주로 트리글리세라이드(triglyceride)로 구성된 입자이고, 지방, VLDL(초저밀도 지방단백질), LDL(저밀도 지방단백질), 및 HDL(고밀도 지방단백질)섭취 우 오직 혈장에 많은 양이 통상적으로 나타난다. 상기 명명법은 초원심분리기에 의해 지방단백질을 분리시키므로써 명명된 것이다. 분류학적으로 상기 지방단백질은 밀도구배에 의해 분리된 것이다. 이러한 방법은 특별한 기구 및 많은 시간을 소비하므로 실험실에서만 적용될 수 있다. 기껏해야 지방단백질 또는 아포지방 단백질의 몇백 밀리그램을 몇일을 걸쳐 상기 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 아포지방단백질 또는 지방단백질을 분리시키는 다른 방법이 근래에 알려졌는데; 이 방법은 예를 들어, 2가 양이온 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란에 의해 침전시키는 것을 기초로 한다. 아포지방단백질을 분리시키는 다른 방법은 유럽 특허 제 0 329 605 B1호에 기술된 바와 같이 알코올 분류법에 의해 침전시키는 것이다. 상술한 방법을 사용하여 아포지방단백질 A-I(apoA-I) 또는 apoA-I에 농축된 단편의 많은 양을 분리시킬 수 있고, 치료법 응용에 이용할 수 있게 제조할 수 있다. 따라서 분리된 apoA-I 또는 apoA-I에 농축된 단백질 단편을 사용하여, 일련의 실험을 동물 및 인간을 대상으로 수행해 왔다. 상기 실험을 기본으로 바이러스에 관한 상기 생성물의 안전성은 두 경우 모두 증명할 수 있었고, 또한 사용된 상기 형태의 apoA-I은 인간 또는 동물에서 주목할만한 부반응(side reation)이 없다는 결과에 이르게 되었다. 그럼에도 불구하고, 시험관 내에서는 예를 들어, 콜레스테롤 수송 중성백혈구(neutrophil) 마이크로파아지(macrophage), 단핵세포 또는 혈소판과 같은 세포에서 apoA-I의 효과와 같은 원하는 활성이 발견되지 않는다. 동물 및 인간을 대상으로 한 생체 실험에서는 두 경우 모두 혈장내의 apoA-I이 매우 짧은 반감기를 나타내는 것이 관찰되었다. 자유(free)apoA-I(28000 달톤)의 분자량때문에, apoA-I은 신장에 의해 제거될 간능성이 있다. apoA-I은 실제로 토끼의 뇨에서 검출할 수 있다. 이러한 결과는 많은 양으로 주입된 apoA-I는 원하는 지방단백질 단편에 공급되지 않는다는 것을 입증한 것이다. 짧은 반감기 때문에, apoA-I는 매우 짧은 시간 동안 생체내에서 효과를 갖는다. 결과적으로 투약을 위한 더욱 적절한 형태는 지방단백질 또는 지방단백질과 같은 입자에 apoA-I를 주입하므로써 달성된다.

재구성된 지방단백질을 제조하는 방법은 과학 잡지(A.Jonas, Methods in Enzymology 128, 553-582(1986))에서, 특히 아포지방단백질인 A-I, A-II, A-IV, apoC 및 apoE에 대해 기술된 바 있다. 재구성에 사용된 가장 빈도 높은 지질은 달걀 또는 콩으로부터 추출된 포스파티딜콜린(phosphatidyl choline)이다. 다른 포스포리피드(phospholiid)도 사용되고, 트리글리세라이드 또는 콜레스테롤과 같은 지질도 사용된다. 지질의 재구성은 먼저 유기용매에 용해시킨 후, 질소하에서 증발시킨다. 이러한 방법에서 지질은 유리벽에 얇은 필름(film)으로 결합된다. 그후 아포지방단백질 및 염소산나트륨과 같은 디터전트(detergent)를 첨가하여 혼합한다. 상기 첨가된 염소산나트륨은 지질의 분산을 일으킨다. 적절한 반응 기간 후에, 상기 혼합물은 오랜 시간동안 대량의 완충용액에서 투석되는데 : 상기 염소산나트륨은 투석에 의해 대부분이 제거되고, 동시에 지질 및 아포지방단백질은 자연스럽게 지방단백질 또는 소위 재구성 지방단백질을 형성한다. 투석에 대해 선택적으로 이용가능한, 소수성 흡착제가 디터전트(Bio-Beads SM=2, Bio Rad; Amberlite XAD-2, Rhm Haas) (E.A.Bonomo, J.B.Swaney, J.Lipid Res., 29, 380-384(1988))를 흡착하고, 상기 디터전트는 겔크로마토그래피(\Sephadex G-25, Pharmacia)에 의해 제거될 수 있다. 지방단백질은 예를들어, 아포지방단백질과 적절한 지질의 수용성 현탁액의 배양, 상기 혼합물의 가열 또는 apoA-I-지질 혼합물을 초음파로 처리하여 디터전트 없이 제조할 수 있다.

상기 방법들에서 예를 들어, apoA-I 및 포스파티딜 콜린으로 출발으로 출발하여 그들의 반응 초기에 지방단백질에 상응하는 판-형의 입자를 얻을 수 있다. 통상적으로, 배양 이후에 결합되지 않은 아포지방단백질 및 자유지질은 원심분리기 또는 겔크로마토그래피에 의해 균질하게 재구성된 지방단백질 입자로 분리된다.

미합중국 특허 제 5 128 318 호에서는 포스파티딜 콜린이 유기 용매하에서 용액에 용해되어 재구성된 HDL을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

상술한 재구성된 지방단백질을 제조하는 방법은 실험실 규모에서 몇 밀리그램에 대한 몇 그램 정도의 작은 양에 대해서만 적용된다: -중간 생성물에서 용액의 높은 희석은 불가능한 요구된 시간 내에 상기 혼합물의 반응 과정을 이룬다; -큰 부피에 대한 필요한 기반은 일반적으로 유용하지 않다; -사용된 유기용매는 환경적으로 받아들일 수 없다; -상기 최종 생성물은 저장할 수 없다; -상기 최종 생성물의 농도는 너무 낮고, 따라서 환자에게 투여하기 위한 부피는 너무 크다; -일반적으로 상기 생성물은 원하는 rHDL 입자로부터 잔류 자유지질 및/또는 자유단백질을 분리하기 위해 예를 들어, 겔크로마토그래피를 사용하여 더 정재되어야 한다.

더구나, A. Hubsch et al., Circulatory Shock 40, 14-23(1993)에서 비율이 1 : 200인 아포지방단백질대 지질을 사용하여 재구성된 지방단백질을 제조하는 방법을 기술하고 있다. 상기 공정의 결과는 상당부분의 자유지질을 갖는 획득된 생성물이 치료 적용력에 불리한 영향을 미치는 것이다.

인간에게 rHDL의 치료 또는 예방적 사용을 위해서는, rHDL을 그램정도의 양으로 투여하여 혈장내에서 apoA-I 또는 HDL 수준을 증가시키는 것이 필수적이다. 따라서, 킬로그램 또는 더 많은 양으로 임상적인 목적을 위한 rHDL의 경제적인 생산은 상술한 방법으로는 가능하지 않다.

따라서, 본 발명의 목적은 전술한 문제점 없이, 특히 이것의 생성물의 많은 부분이 자유 지질 또는 자유 apoA-I을 갖지 않도록 rHDL을 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 또다른 목적은 유기 용매의 첨가없이 수행될 수 없는 방법을 제공하는데 있다. 본 발명에서는 재구성된 지방단백질, 특히 재구성된 HDL(rHDL)을 간편하고, 빠르게, 산업적으로 이용가능한 수단을 사용하여 아포지방단백질 및 지질로부터 제조할 수 있는 방법을 발견했다.

본 발명의 특징은 아포지방단백질 및 지질로부터 재구성된 지방단백질 입자를 함유하고, 20℃±2℃에서 40NTU(nephelometric turbidityunit)이하의 혼탁도를 가지며, 여기서 20℃±2g/ℓ의 단백질 함량 및 1-40g단백질/ℓ의 농도를 갖는 수용성 아포지방단백질 용액을 유기용매의 첨가없이 수용성 지질-디터전트 용액과 지질 대 디터전트의 몰비를 1 : 0.5 내지 1 : 4.0 의 범위 및 아포지방단백질 대 지질의 중량비를 1 : 1.5 내지 1 : 5.0의 범위로 혼합시키고, 상기 획득된 아포지방단백질-지질-디터전트 혼합물을 물에서 지질의 상변화 온도 범위의 온도 ±10℃에서 계속적으로 반응시키면서, 사용된 단백질의 95% 이상 및 전체 지질의 90% 이상이 결합되어 5-50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 단백질-지질 입자가 형성되었을 때 크기에 의한 축출수단 또는 흡착제에 의한 흡착에 의해 더 이상의 정제 단계없이 상기 디터전트를 제거시킨 제조액을 산업적으로 제조하는 방법에 있다.

본 발명의 특징은 아포지방단백질 및 지질로부터 재구성된 지방단백질 입자를 함유하는 안정한 동결건조물(lyophilisate)을 산업적으로 제조하는 방법에 있는 것으로, 여기서 1-40g단백질/ℓ의 농도를 갖는 수용성 아포지방단백질 용액을 유기용매의 첨가없이 수용성 지질-디터전트 용액과 지질 대 디터전트의 몰비를 1 ; 0.5 내지 1 : 4.0 의 범위 및 아포지방단백질 대 지질의 중량비를 1 : 1.5 내지 1 : 5.0의 범위로 혼합시켜, 상기 얻은 아포지방단백질-지질-디터전트 혼합물을 물에서 지질의 상전이 온도 범위의 온도 ±10℃에서 계속적으로 반응시키면서, 사용된 단백질의 95% 이상 및 전체 지질의 90% 이상이 결합되어 5-50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 단백질-지질 입자가 형성되었을 때 크기에 의한 축출수단 또는 흡착제에 의한 흡착에 의해 더 이상의 정제 단계없이 상기 디터전트를 제거시켜 20±2g/ℓ량 및 20±2℃에서 40NTU이하의 혼탁도를 갖는 유동성 생성물을 얻고, 상기 획득된 생성물은 슈크로오스 또는 만니톨(mannitol)과 같은 탄수화물의 군으로부터 선택된 안정제를 사용하는 동결건조법을 통해 안정화된다.

본 발명에 사용된 아포지방단백질은 예를들어. 재조합 아포지방단백질, 인간 혈장에서 농축된 아포지방단백질 A-I단편으로부터의 아포지방단백질, 아포지방단백질의 단편, 또는 양극성의 성질을 갖는 천연, 합성 또는 재조합된 폴리펩타이드이다. 아포지방단백질의 단편은 천연 또는 합성된 아포지방단백질의 화학적 또는 효소적 절단에 의해 얻을 수 있다. 화학적 절단의 예로써 상술한 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)로의 처리가 언급된 바 있고, 또는 효소적 절단의 예로써 트립신(trypsin)과 같은 프로테아제(protease)가 있다.

본 발명에 따라 사용된 지질-디터전트 용액에는 예를 들어, 콩 또는 계란에서 추출한 포스포리피드(phospholipid), 콜레스테롤, 콜레스테롤-에스터, 지방산 또는 트리글리세라이드(triglyceride)와 같은 지질을 포함한다.

상기 디터전트는 담즙산 또는 그들의 염이 바람직한데, 예를 들어, 콜릭 엑시드-소듐 염 또는 소듐-디옥시콜로닉 엑시드이다.

본 발명에서 20±2℃의 온도는 18℃ 내지 22℃의 범위의 모든 값을 포함한다. 20±2g/ℓ의 단백질 함량은 18g/ℓ 내지 22g/ℓ의 범위의 모든 농도를 포함한다. 상기 용어 상태 전이 온도 ±10℃는 상대지질의 수용상에서의 상전이 온도보다 10℃ 낮은 온도와 지질의 상전이 온도보다 10℃높은 온도사이의 범위에서의 보든 온도를 포함한다. 상기 값은 용액의 어는점과 50℃사이의 범주를 포함하는데, 여기서 온도는 25℃이하가 바람직하다.

예를 들어 저온살균법과 같은 적절한 방법을 사용하여 비활성화된 바이러스를 갖는 인간의 혈장에서 정제한 지방단백질이 개시 물질로 바람직하다. 이러한 과정을 거쳐 변성된 단백질(응집)은 요소 또는 구아니딘-하이드로클로라이드와 같은 카오트로픽(chaotropic) 성분 존재하에서 온도를 서서히 올리고 약염기성 pH에서 반응 시키므로 연속적으로 활성을 되찾으므로 apoA-I은 10mM NaCl70%에서 상기 단백질의 완충용액 교환 후에는 단량체 형태로 존재한다. (분석 크기 축출 크로마토그래피에 의해 결정 : 40μg aopA-I은 10mM소듐 포스페이트 0.02% 소듐 아지드, pH 7.4 용액에서, 0.4ml/min의 유속으로 TSK G3000SW 울트로팩(Ultropac) 컬럼(LKB)에 적용; 280nm에서 상기 용출액 측정).

공정이 진행됨에 따라, 고농도의 지방단백질은 유기용매없이 담즙산 또는 그들의 염(예를들어, 콜레이트, 디옥시콜레이트, 우루소데옥시콜레이트)의 용액에서 지질(포스파티딜콜린과 같은 포스포리피드, 콜레스테롤, 트리스리세이드 등)의 용액과 혼합한다. Hubsch et al. (Circulatory S44hock 40, 14-23(1993)에 의해 기술된 것과 대조적으로, 지질에 대한 아포지방단백질의 비는 상기 최종 생성물에서 다량의 자유 지질 또는 다량의 자유 아포지방단백질이 발견되지 않는 방법에서 선택되어, rHDL의 더 이상의 정제는 생략될 수 있다. 특히 apoA-I : PC의 비는 1 : 200(M : M; 중량비 약 1 : 5.5)이하로 고려되어진, 즉 1 : 50 내지 1 : 180, 바람직하게는 1 ; 100 내지 1 ; 150(몰 비 : 콩으로부터 apoA-I 및 PC에 대해 1 : 2.8 내지 1 : 4.2의 중량비에 상응.)으로 감소된다. 디아휠터레이션(diafiltration)방법으로 결합된 이것은 자유 지질 (크기 축출 크로마토그래피에 의해 정량 : Superose^R6에 의한 겔 여과법 : 하기에 명시.)의 급속한 감소 및 동시에 최종 생성물에서 담즙산의 상당히 낮은 농도를 유도하는데 : 담즙산의 고농도 및 자유 PC이고 함량은 모두 생체 및 실험조건에서 세포의 손상을 초래할 수 있으므로 정확히 조절되어져야 한다. 콜레이트 농도는 한편으로는 apoA-I : PC의 비율로 최적화되고, 동시에 필요한 경우, 그 이상의 지질, 특히 콜레스테롤의 첨가로 조화된다. 여기서, 상기 최적의 농도는 apoA-I : PC의 비가 1 : 150이고 Na-콜레이트의 몰 비가 1 : 200인 것으로 rHDL 제조액 (즉, 기술된 상기 반응 동안 apoA-I : PC : Na-콜레이트=1 : 150 : 200(M : M : M))대한 최종 생성물에서 자유 지질 및 자유 apoA-I 부분이 되도록 작은 양에 의해 결정된다. 0℃-2℃(콩으로부터의 PC에대해)에서 4-16시간의 반응시키면 상기 담즙산의 농도는 1,000과 100,000달톤사이, 바람직하게는 30,000달톤 이하인 구형단백질에 대한 포어(pore)크기를 갖는 한외거르기(ultrafiltration)막을 사용한 디아휠터레이션에 의해 감소된다. 따라서, 필요한 상기 완충용액은 pH 6이상, 바람직하게는 7.5-9에서 100mmol/ℓ이하, 바람직하게는 10mmol/ℓ 이하인 낮은 이온 강도를 갖고, 탄수화물의 낮은 농도, 예로 1% 슈크로오스를 함유한다. 이러한 조건하에서, 사용된 단백질의 그램당 완충용액의 1ℓ 내지 최대 2ℓ는 필요한 낮은 디터전트 농도 및 원하는 입자 크기의 분포를 달성하기에 충분하며, 상기 완충용액 부피는 전술된 방법에서 보다 몇배(10-200배) 더작은 양이다. 필요한 경우, 상기 디터전트 농도는 엠버라이트(amberlite) XAD-Z를 사용한 부가적인 흡착 단계로 원하는 농도까지 더 낮출 수 있다. 디아휠터레이션을 사용하여 상기 생성물은 10-50g단백질/ℓ의 고농도에 맞추고, 안정하고 저장가능한 최종 생성물 (유동성 또는 동결건조된)에 슈크로오스와 같은 안정제의 존재하에서 연속적으로 진행시킨다. 상기 동결건조물은 사용전에 물에 용해시켜, 지질 함량에 따라 투명하고, 흐린 단백광을 내는 밝은 노르스름한 색을 띠는 용액을 제조하고, 상기 용액에서 반응 후에 측정된 rHDL 입자 (판(disks))는 사실상 원래 그대로의 형태로 다시 검출될 수 있다. 크기 축출 크로마토그래피에 의해 10% 미만인 응집체(자유 지질 대부분에 대한)의 비 및 5% 미만의 자유 아포지방단백질의 비율로 발견된다. 동결 건조 전후에 결정되는 유동성 최종 생성물의 혼탁도는 20g/ℓ의 단백질 농도에 대해 40NTU이하이다. 효소적 색소 시험에서 측정된 콜레이트 함량은 일반적으로 단백질 g당 0.5g콜릭 엑시드(cholocacld)-소듐염보다 적다(담즙산의 검출은 3-α-하이드록시스테로이드-탈수소효소의 도움으로 NAD+의 존재하에 NADH의 형성을 통해일어나는데, 상기 형성된 NADH는 푸른 포르마진 유도체를 형성하는 전이효소의 촉매작용에 의해 니트로테트라 졸리움 블루와 반응하는데, 이것은 광도 측정법에 의해 검출된다.

용매, 바람직하게는 물의 적당한 부피에 용해후 전자 현미경을 통해 관찰하여 보면, 상기 동결 건조된 rHDL은 직경이 5-50nm 일반적으로 8-20nm, 및 두께가 2-6nm인 초기 HDL과 구조유사성을 보이는 판-형입자로서 존재한다. 예를 들어 Superose^R6HR 10/30컬럼(Pharmacia Biotech)으로 생리학적 완충용액에서 겔 여과법(크기 축출 크로마토그래피)을 통해 입자 크기 및 그들의 상대 분포를 결정하기 위한 분석 방법에 의하면, 상기 입자의 80%이상이 분자량 100,000 내지 1,000,000달톤의 범주이다. 게다가 상기 입자의 80%이상이 구배-겔-전기영동법(A.V.Nichols et al.,Methods in Enzymology 128, 417-413(1986)에 따른 방법)에 기초하여 50,000 내지 1,000,000달톤의 범주에서 분자량 분포를 갖는다.

제1도는 본 발명에 따른 일실시예를 좀 더 구체적으로 설명하는 것이다. 이것은 apoA-I대 포스파티딜 콜린의 다른 비(아포지방단백질대지질비)를 사용하여 제조된 rHDL 입자의 겔여과법의 용출 다이아그램(시간에 대한 흡착-용출 다이아그램)을 나타낸다. [apoA-I 및 rHDL 입자의 고퍼포먼스(High Performance)크기 축출 크로마토그래피; 분당속도 0.5ml/min 로 PBS(10mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl, pH7.4)에서 Superose^R6HR 10/30컬럼(Pharmacia Biotch)에 100μl 0.9% NaCl에서 200μg rHDL의 분리]. 상기 컬럼의 용출액의 흡착은 280nm에서 측정되었다(L.L Rudel, C.A.Marzetta and F.L. Johnson, Methods in Enzymology 129, 45-57(1986)). 상기 크로마토그램에서 각각의 단편의 함량을 결정하기 위해 곡선 하부가 계산된다. 1 : 200 생성물의 용출 곡선에 의하면, 자유 지질의 용출시 유실될 수 있는데, 이것은 상기 1 : 100-1 : 150 생성물의 경우와는 다르다. 비교해보면 순수한 아포지방단백질(apoA-I)의 곡선은 나타난 바와 같다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보지만, 하기예에 본 발명의 범주가 한정되지 않는다.

[실시예1]

apoA-I 1Kg을 0.15 mol/ℓ NaCl 500ℓ에 용해시킨다. 상기 지질 용액은 다음과 같이 분리되어 제조되는데 : 콩기름으로부터의 포스파티딜 콜린(phospholipon 90, Nattermann, cologne, Germany)은 10mmol/ℓTRIS/HCL, 150mmol/ℓ EDTA, pH 8.0, 2.8Kg 포스타티딜 콜린으로 구성된 완충용액에 용해시키고, 2.325 Kg 콜릭 엑시드 소듐염을 100ℓ의 상기 완충액에 용해시킨다. 1-2시간동안 교반시키고, 필요한 경우, 상기 용액이 투명해질 때까지 약 40℃로 가열한다. 연속적으로 4℃로 냉각시키고, 상기 지질-콜레이트-용액 100ℓ를 500ℓ의 1Kg apoA-I과 혼합한다. 상기 혼합물을 2-4℃에서 밤새도록 천천히 교반한다. 상기 반응 후에 상기 용액을 노미날(nominal) 분자량 제한(NMWL)=10,000달톤인 PTGC 카세트(cassettes)를 갖는 펠리콘(Pellicon)으로 4℃에서 여과기멸균 및 디아휠터시키는데, 먼저 5mmol/ℓ탄산 나트륨의 4배 부피로, 그다음 10% 슈크로오스의 2배 부피로, 일정 수준에서 생성물의 부피를 유지하면서 행한다. 상기 농도는 그다음 단백질 농도가 20g/ℓ에 도달할때까지 천천히 상승시킨다. 상기 용액은 다시 여과기 멸균하고, 바이알(Vial)안에 충진되어 동결건조시킨다. 전체 공정동안, 주의할 점은 특히 지질 용액을 공기, 빛 및 매우 높은 온도로부터 보호해야한다. 상기 최종 생성물은 apo A-I 대 포스파티딜 콜린의 몰비가 1 : 100(몰 : 몰), 5% 자유지질이하 및 40NTU이하인 혼탁도를 나타내는 단백질 농도 20±1g/ℓ를 얻기 위해 적당한 양의 물에서 용해시킨다.

[실시예2]

apoA-I 10Kg을 10 mmol/ℓ NaCl 2000ℓ에 용해시킨다. 1.38Kg콜레스테롤 및 29.9Kg콜릭 엑시드 소듐염은 10mmol/ℓTRIS-HCL, 150mmol/ℓ NaCl, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0을 함유하는 완충액 200ℓ에서 교반시킨다.

온도는 65℃로 올리고, 상기 혼합물은 투명한 용액을 얻을 때까지 2시간동안 교반시킨다. 그 다음 20℃로 냉각하고 27.9Kg의 포스파티딜 콜린을 첨가한다. 상기 용액은 그 다음 4℃로 냉각시키고 2시간동안 교반시킨다.

상기 혼합물은 단백질 용액에 첨가되어 혼합되고 여과기 멸균된다. 상기 여과물은 4℃에서 밤새도록(적어도 16시간동안) 천천히 교반시킨다. 그 다음 상기 생성물의 일정 부피를 유지하면서, 2-4시간 동안 50mmol/ℓ NaCl, 1 mmol/ℓ EDTA, pH 7.5인 용액의 4배 부피를 사용한 후, 10% 슈크로오스의 2배 부피를 사용하여 디아휠터레이션한다. 상기 용액의 농도는 그다음 20g/ℓ단백질 농도까지 증가된다. 상기 용액은 그 다음 여과기 멸균하고, 유리 바이알에 충건시켜 동결건조시킨다. 상기바이알은 진공 밀봉하고 4℃에서 냉암보관한다. 상기 방법을 사용하면, rHDL은 aopA-I : 포스파티딜 콜린 : 콜레스테롤의 몰비가 1 : 100 : 10으로 얻어진다.

[실시예3]

aopA-I 대 포스파티딜 콜린의 비가 1 : 150인 rHDL을 제조하기 위해 : 3.08Kg의 소듐 콜레이트를 10mmol/ℓ TRIS-HC1, 10mmol/ℓ NaCl, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0인 완충용액을 25ℓ에 용해시킨다. 4.2Kg의 포스파티딜 콜린을 더 첨가하여, 상온에서 2시간동안 용해시킨다. 그 다음 10mmol/ℓ NaCl 200ℓ에 aopA-I 1Kg을 첨가하고, 상기 혼합물은 0-4℃에서 밤새도록 반응시킨다. 그다음 50mmol/ℓ NaCl, 1mmol/ℓ EDTA, pH 7.5인 용액의 4배 부피로 4시간동안, 그후 1%슈크로오스의 2배 부피로 일정 부피를 유지하면서 디아휠터레이션을 수행한다. 최종적으로 상기 노도는 20g/ℓ의 단백질까지 증가된다.상기 슈크로오스 농도는 고체 슈크로오스의 첨가에 의해 10%까지 상승된다. 상기 용액은 여과기 멸균하고 동결 건조시킨다.

[실시예4]

aopA-I 대 포스파티딜 콜린 대 콜레스테롤의 비가 1 : 100 : 10 인 rHDL을 제조하기 위해 : 소듐 콜레이트 4.61Kg을 10mmol/ℓ TRIS-HCL, 10mmol/ℓ NaCl, 1mmol/ℓ EDTA, pH 8.0으로 구성된 완충용액 25ℓ에 용해시킨다. 콜레스테롤 138g을 상기 완충용액-콜레이트 혼합물에 첨가하여 65℃에서 2시간동안 용해시킨다. 그 다음 상기 혼합물을 상온에서 냉각시키고, 포스파티딜 콜린 2.8Kg을 더 첨가하여 1시간동안 용해시킨다. 그 다음 10mmol/ℓ NaCl 200ℓ에 aopA-I 1Kg을 첨가한다. 상기 혼합물은 디아휠터되는 것과 같이, 상술한 실시예와 같이 반응시키고, 상기 농도는 상술한 바와 같이 증가된다.

[실시예5]

aopA-I 대 PC 대 콜레스테롤이 1 : 150 : 10로 제조 : 소듐 콜레이트 5.38Kg 을 실시예 3 및 4에서 기술된 완충용액에 용해시킨다. 콜레스테롤 180g을 첨가하여 65℃에서 2시간동안 용해시킨다.그 다음 PC 4.2Kg을 첨가하여 65℃에서 2시간동안 용해시킨다. 그 다음 PC 4.2Kg 을 첨가하고, 상온에서 1시간 동안 용해시킨다. 상기 혼합물은 10mmol/ℓ NaCl에서 리터당 5g인 apoA-I용액 200ℓ에 첨가하고, 4℃에서 밤새도록 반응시킨다. 디아휠터레이션 및 최종 생성물의 제조법은 상술한 바와 같다.

[실시예6]

저소듐 콜레이트 함량을 갖는 rHDL을 제조하는 방법이다. 상기 rHDL은 실시예 1-5에서와 같이 제조한다. 상기 디아휠터레이션 과정 및 농도의 증가에 따라, rHDL 용액의 1배 부피를 Amberlite XAD-2(2배 부피)와 혼합하고, 상기혼합물은 4℃에서 1시간 동안 혼합하면서 반응시킨다. 반응함에 따라, 상기 rHDL은 여과법에 의해 제거되고, 실시예 1-5와 같이 여과기 멸균하여 동결건조된다.

[실시예7]

10mmol/ℓ NaCl 80ml에 aopA-I 400Kg을 용해시킨 용액과 실시예 3-6에 기술된 완충용액에 포스파티딜 콜린 1.66Kg, 소듐 콜레이트 1.23Kg으로 구성되는 지질 용액을 혼합한다. 상기 혼합물은 0-2℃에서 16시간동안 반응시킨다. 그다음 EDTA(0.1mmol/ℓ)의 4배 부피로, 그 다음은 슈크로오스(1%)의 2-4배 부피를 사용하여 디아휠터레이션하고 최종적으로 상기 농도는 단백질 농도 21-25 g/ℓ까지 증가된다. 상기 rHDL 용액은 연속적으로 10% 슈크로오스 및 20g/ℓ단백질의 최종 농도로 조절된다. 상기 용액은 여과기 멸균하고 50g(50ml 바이알에 rHDL 1g)씩 채워 동결건조한다.

[실시예8]

침전물 IV(Kistler, P., Nitschmann, H.; Vox Sang, 7, 414-424(1962)) 980Kg으로부터 침전물 apoA-I 11.2Kg은 알코올에 의한 침전법을 통해 얻어진다. 이것은 3배 부피의 4-몰 구아니딘 하이드로클로라이드 용액에서 부유된다. 상기 pH는 5.2에 맞추고 상기 용액은 10시간 동안 60℃에서 저온 살균한다. 상기 단백질은 ph 7.5 및 45℃에서 용해된다. 여과 후, 세파덱트(Sephadex) G-25 (Pharmacia Biotech)의 겔여과법에 의해 10mM NaCl용액으로 완충용액 교환이 일어난다. 160Kg의 apoA-I 용액은 전체가 1040g의 apoA-I을 함유한다. 상기 단백질 용액은 0 내지 2℃에서 2내지 16시간동안 지질 용액과 반응시킨다. 상기 지질 용액은 상온에서 분리하여 제조되었고 : 콩기름으로부터 추출한 포스파티딜 콜린은 상기 실시예 3-7에서 언급된 완충용액에서 용해된다. 상기 완충용액 26Kg에 소듐 콜레이트 3203g 및 포스파티딜 콜린 4460g을 용해시킨다. 다음의 디아휠터레이션(NMWL=10,000달톤)에서, 단백질-지질 혼합물의 첫번째 농도는 7g 단백질/ℓ이다. 그 다음 4g/ℓ 이하의 콜레이트 함량이 달성될 때까지 1%슈크로오스 용액으로 디아휠터레이션한다. 상기 pH는 항상 적어도 7.5로 유지시켰다. 최종적으로 상기 용액의 농도는 단백질의 함량이 25g/ℓ까지 증가되었고, 슈크로오스로 안정화되었다. 상기 최종 생성물은 20g apoA-I/ℓ 및 100g 슈크로오스/ℓ의 단백질 농도에 맞추고 멸균, 여과되었다. 상기 크기 축출 크로마토그래피에서, 5% 자유지질 이하 및 1% 자유 apoA-I이하의 양이 발견되었다. 상기 단백질-지질 혼합물은 50ml씩 충건되고, 동결, 건조되었다. 적당한 양의 물에서 용해된 상기 최종 생성물은 apoA-I : 포스파티딜 콜린의 몰비가 1 : 140[몰 : 몰]을 나타낸다.

Claims (18)

1~40g/l의 단백질 농도를 갖는 수용성 아포지방단백질 A-I용액과, 포스파티딜 콜린 대 디터전트의 몰비가 1 : 0.5 내지 1 : 4.0의 범위이며 유기용매를 사용하지 않고 제조한 수용성 포스타티딜 콜린-디터전트 용액을 혼합하되 아포지방단백질 A-I용액 대 포스타티딜 콜린-디터전트 용액의 비율은 아포지방단백질 A-I 대 포스타티딜 콜린의 중량비가 1 : 1.5 내지 1 : 5.0의 범위가 되도록 혼합시키고, 획득된 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린-디터전트 혼합물을 물에서의 포스타티딜 콜린의 상변화온도 ±10℃에서 계속적으로 반응시키고, 사용된 아포지방단백질 A-I의 95% 이상의 및 전체 포스타티딜 콜린의 90% 이상이 결합되어 5~50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린 입자가 형성되었을 때 디아휠트레이션(diafiltration)에 의한 디터전트를 제거하고 더 이상의 정제 단계없이 20±2g/l의 단백질 함량 및 20±2℃에서 40NTU 이하의 혼탁도를 가지며, 재구성된 고밀도 지방단백질(rHDL) 입자를 함유하는 제조액을 아포지방단백질 A-I 및 포스타티딜 콜린으로 부터 산업적으로 제조하는 방법.

1~40g/l의 단백질 농도를 갖는 수용성 재조합 아포지방단백질 A-I용액과, 포스타티딜 콜린 대 디터전트의 몰비가 1 : 0.5 내지 1 : 4.0의 범위이며 유기용매를 사용하지 않고 제조한 수용성 포스타티딜 콜린-디터전트 용액을 혼합하되 아포지방단백질 A-I용액 대 포스타티딜 콜린-디터전트 용액의 비율은 아포지방단백질 A-I 대 포스타티딜 콜린의 중량비가 1 : 1.5 내지 1 : 5.0의 범위가 되도록 혼합시키고, 획득된 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린-디터전트 혼합물을 물에서의 포스타티딜 콜린의 상변화온도 ±10℃에서 계속적으로 반응시키면서, 사용된 재조합 아포지방단백질 A-I의 95% 이상 및 전체 포스타티딜 콜린의 90% 이상이 결합되어 5~50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린 입자가 형성되었을 때 디아휠트레이션(diafiltration)에 의한 디터전트를 제거하고 더 이상의 정제 단계없이 20±2g/l의 단백질 함량 및 20±2℃에서 40NTU 이하의 혼탁도를 가지며, 재구성된 고밀도 지방단백질(rHDL) 입자를 함유하는 제조액을 재조합 아포지방단백질 A-I 및 포스타티딜 콜린으로 부터 산업적으로 제조하는 방법.

1~40g/l의 단백질 농도를 갖는 수용성 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편 용액과, 포스타티딜 콜린 대 디터전트의 몰비가 1 : 0.5 내지 1 : 4.0의 범위이며 유기용매를 사용하지 않고 제조한 수용성 포스타티딜 콜린-디터전트 용액을 혼합하되 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편 용액 대 포스타티딜 콜린-디터전트 용액의 비율은 아포지방단백질 A-I 대 포스타티딜 콜린의 중량비가 1 : 1.5 내지 1 : 5.0의 범위가 되도록 혼합시키고, 획득된 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편과 포스타티딜 콜린-디터전트 혼합물을 물에서의 포스타티딜 콜린의 상변화온도 ±10℃에서 계속적으로 반응시키면서, 사용된 재조합 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편의 95% 이상 및 전체 포스타티딜 콜린의 90% 이상이 결합되어 5~50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편-포스타티딜 콜린 입자가 형성되었을 때 디아휠트레이션(diafiltration)에 의한 디터전트를 제거하고 더 이상의 정제 단계없이 20±2g/l의 단백질 함량 및 20±2℃에서 40NTU 이하의 혼탁도를 가지며, 재구성된 고밀도 지방단백질(rHDL) 입자를 함유하는 제조액을 재조합 아포지방단백질 A-I 또는 재조합 아포지방단백질 A-I의 단편 및 포스타티딜 콜린으로 부터 산업적으로 제조하는 방법.

1~40g/l의 단백질 농도를 갖는 수용성 재조합 아포지방단백질 A-I 용액과, 포스타티딜 콜린 대 디터전트의 몰비가 1 : 0.5 내지 1 :4.0의 범위이며 유기용매를 사용하지 않고 제조한 수용성 포스타티딜 콜린-디터전트 용액을 혼합하되 아포지방 단백질 A-I 용액 대 포스타티딜 콜린-디터전트 용액의 비율은 아포지방단백질 A-I 대 포스타티딜 콜린의 중량비가 1 :1.5 내지 1 : 5.0의 범위가 되도록 혼합시키고, 획득된 아포지방단백질 A-I-지질-디터전트 혼합물을 물에서의 포스타티딜 콜린의 상변화온도 ± 10℃에서 계속적으로 반응시키면서, 사용된 아포지방단백질 A-I의 95% 이상 및 전체 포스타티딜 콜린의 90% 이상이 결합되어 5~50nm의 직경 및 50,000 내지 1,000,000달톤의 질량을 가지는 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린 입자가 형성되었을 때 디아휠트레이션(diafiltration)에 의한 디터전트를 제거하고, 탄소화물 군으로 부터 선택된 안정제 존재하에서 동결건조를 통하여 상기에서 얻은 액상 생성물을 안전화시켜 20 ± 2g/l의 단백질 함량 및 20 ± 2℃에서 40NTU 이하의 혼탁도를 가지며, 재구성된 고밀도 지방단백질(rHDL) 입자를 함유하는 안정한 동결건조물을 아포지방단백질 A-I 및 포스타티딜 콜린으로부터 산업적으로 제조하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 디터전트의 제거시 단백질 g당 적어도 2리터의 완충제가 사용됨을 특징으로 하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 포스타티딜 콜린-디터전트 용액은 다른 포스포리피드, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 지방산 또는 트리글리세라이드를 함유함을 특징으로 하는 방법.

제1항에 있어서, 수용성 아포지방단백질 A-I 용액은 카오트로픽 성분을 함유하는 용액에서 반응되고, 지방단백질의 70% 이상이 단량체를 형성한 후 50mmol/l 미만의 이온강도를 갖는 용액에서 완충용액을 교환하는 방법에 의한 적어도 하나의 바이러스 비활성화 단계로 처리되어 아포지방단백질 A-I이 풍부하게된 인간 혈장으로 부터 분리된 분획인 것을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 포스타티딜 콜린은 합성 포스포티딜 콜린임을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 포스타티딜 콜린은 천연 포스포티딜 콜린임을 특징으로하는 방법.

제9항에 있어서, 천연 포스포티딜 콜린은 콩 또는 계란으로 부터 추출된 것임을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 포스타티딜 콜린은 콩 포스포티딜 콜린이고, 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린-디터전트 혼합물의 반응은 0~15℃에서 행하여짐을 특징으로하는방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 사용된 디터전트는 담즙산 또는 그들의 염으로 구성되는 군으로부터 선택된 것임을 특징으로하는 방법.

제12항에 있어서, 디터전트는 콜릭에시드-소듐염 또는 소듐-디옥시콜릭에시드임을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 아포지방단백질 A-I-포스타티딜 콜린-디터전트 혼합물의 반응 후 디터전트의 함량은 디아휠트레이션에 의하여 단백질 g당 0.5g 이하로 감소됨을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 디터전트의 분리 전 또는 분리후 단백질의 농도는 디아휠트레이션에 의하여 10~50g/l로 증가됨을 특징으로하는 방법.

제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 수용성 아포지방단백질 A-I용액 또는 포스타티딜 콜린-디터전트 용액은 pH 6 내지 pH 9의 범위내의 pH로 완충됨을 특징으로하는 방법.

제4항에 있어서, 생성물은 5~50g/l의 단백질 농도로 조절되고, 생성물을 안정화하기 위한 동결건조는 5~15%의 디사카라이드 또는 2~10%의 모노사카라이드 혹은 2∼10%의 만니톨 존재하에서 행하여 짐을 특징으로하는 방법.

제17항에 있어서, 디사카리이드는 슈크로오스임을 특징으로하는 방법.