TW434253B - Method of producing reconstituted lipoproteins - Google Patents

Description

43425 3 A7 A7 B7 五、發明説明（ί ) 本發明是關於一種以工業尺度來從脂蛋白元與脂質來 生產再組成高密度脂蛋白（rHDL)的方法。「HDL具有能结 合生物體内脂質與類脂物質，並且能蓮送它們及影響其 活性的性質。因此，rHJH對於和脂貲及類脂物質有關疾 病之不同預防與治療上十分有用。 人體血液中之脂蛋白可表現一系列的不同功能。其中 為人熟知的功能是運送脂質。脂蛋白具有結合不溶性脂 質，在水狀介質中運送他們，並將他們攏至目的的能力 。有時，各類脂蛋白與脂質代謝異常的關係被研究的更 仔细，在多數西方國家中，在心肺血管疾病與高量的血 漿膽固醇或高量的低密度脂蛋白膽固醇（LDL)膽固醇呈 正相關，而和髙量之HDL或高量的HDL膽固醇圼負相關 已在流行病學的研究顯示。雖然市面上有很多藥物具有 降低脂質的效果，但相信在某些情況下，K適當的脂蛋 白來替代是恰當的在此例中適當者首先是指”好”的脂蛋 白，像是HDL或者是HDL的粒子，像是來自分雛的脂蛋 白元與適當脂質的再組成HDL (rHDL)。. 經濟部中央標準局員工消費合作社印^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

除了脂質之外，其由食物中消化而來，來自其他脂質 或類脂物質的脂蛋白可以被運送或被结合。譬如說：死 細胞的成分可以被結合到脂蛋白上，而且被賦予新的功 能，類脂物質也可和脂蛋白結合像是例如脂多随（LPS)。 脂多豳或內毒素是革菌氏陰性細菌的细胞膜成分；如果 足夠大量的内毒素可以進入心血管，可能會導致敗血性 體克，甚至死亡。將LPS結合到脂蛋白的结果，使得LPS 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 434253 A7 B7 五、發明説明（> ) 的功能或活性可被加Μ調節，LPS的活性可Μ透過脂蛋 白或類似脂蛋白粒子的添加，在活體内或活體外被大幅 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 地改變。體内實驗顯示再組成HDL的添加可Μ抑制脯瘤

壞死因子（TNF)之生成。在體内，休克的症狀在透過HDL 或rHDL的投予後會大有改善。 除了脂蛋白或再組成脂蛋白和脂質與類脂物質的交互 作用之外，脂蛋白與蛋白質的交互作用也已被描述。 S. -脂蛋白會介人補體系統的各別成分的交互作用，且所 Μ能影響其活性。 -凝血糸統的成分已概略知道，其被發現在脂蛋白部分 內，亦即，它是與特定脂蛋白結合的。 -急性期蛋白如血清類澱粉A (SAA)被發琨在HDL部分。 -且進一步，則表面特定蛋白之吸附，會受到Μ脂蛋白 預處理的影響〇 -透過對於细胞專一性或非專一性的结合，脂蛋白也可 Μ影響細胞活性。 -血小板被活化的能力可由於HDL結合而減低或由於加 入L D L而被刺激。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -因為單核綑胞及巨噬细胞似乎具有脂蛋白的接受器； 脂蛋白的結合或攝取會導致該等細胞活性的改變。 -涉及寄主防禦系統的其化細胞，例如中性球的活性似 乎可透過脂蛋白的結合來被修正或調節。 _更甚者，腫瘤细胞的生長，Κ神經膠母细胞瘤 (glUblastoma)為例，可Μ透過脂質而被影響。 -4- 本紙乐尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4342S3 Λ7 Β7 五、發明説明（ϊ ) 此外茌科學性文獻報告可發琨其描述脂蛋白與致病菌 的交互作用；舉例來說，如一種抗菌活性係來自脂蛋白 。病毒可以藉著脂蛋白而被去活，或Μ錐形蟲（trypanosome) 為例時 ，寄生 蟲會被 影響或 個別地 被抑制 ，已被 顯示。 這些例子顯示了脂蛋白或「H DL在預防及治療上的應用 具有多種可能性。 脂蛋白分成四個主要類型： 乳糜微粒（chylomicrons),其為主要由三甘油酯所組 成的粒子且其通常在吃下含脂食物後會在胞漿中大量的 出規，VLDL(極低密度脂蛋白），LDL (低密度脂蛋白）， 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ及HDL (高密度脂蛋白）。其命名係基於K超離心方式 對於脂蛋白的分離而來。典型地，脂蛋白是以密度梯度 來分離，由於此方法須要特殊設備，而且十分耗時故只 在實驗室中進行。採用此法的話，經過數天的時間最多 也只能產生數百毫克的脂蛋白或脂蛋白元。分離脂蛋白 元或脂蛋白的其他方法已知有一段時問；在許多例子中 其係基於，用二價之陽離子和/或聚乙二醇或例如葡聚 糖來沈澱。另一種可能分離脂蛋白元的方法是透過酒精 化學分雛法來沈澱*如同在專利第Ε Ρ 0 3 2 9 6 0 5 Β 1號所述。 使用最後述及的方法分離出較大量的脂蛋白元A-I(apo A-I)或是apo A-I被富化的部分，且使其引Μ應用於洎療 是可能的。利用此種分離出的a ρ 〇 A- I被富化的部分的一 系列實驗已在動物Μ及人類身上進行。基於這些實驗這 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 434253 A7 B7 五、發明説明（4·) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 些產品關於套毒的安全性可被顯示Μ及此種形式之被採 用的aP〇A-I對人及動物沒有明顯的副作用。雖然如此， 於體外試驗中無所欲的活性可被發規，像是：膽固醇的 蓮送或是31>〇/\-1對於细胞，像是中性球、巨噬细睢、單 核球、或血小板的效應等。在體內試驗中，已被觀察到 在人體及動物體内，apo-A-I在血漿中有極短的半生期。 由於游離態apo-A-I之分子量（28000道耳 呑）的原故，有可能apoA-I是被腎臟所清除，apoA-I實 際上可在兔子之尿液中檢驗出。這些結果證明大量注射 的apoA-I並未分布在所欲的脂蛋白部分。由於其半生期 很短，apoA-I在體内的效應至多也是很短的時間。所Μ 給藥較佳的形式是藉著Μ —脂蛋白或類似脂蛋白粒子的 形式來注人ap〇A-I而被達成。 製造再組成脂蛋白的方法已在科學文獻上有記載，尤 其是對於脂蛋白元A-Ι, Α-ΙΓ, A-W, ap〇C,和apo-E (A. Jonas,酵素學的方法，Methods in Etizymology 128，553-582(1986))，最常用於再組成的脂質是由蛋 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 樣組其。混時 .， 同再使上相育析 ，。中壁且培透 用用當璃人段行 使使氣玻加 一進 被被氮於被了的 也也與合，過間 脂等後結納。.時 鱗酵然式酸散長 的固，型膽分液 他膽中膜為質衝 其者劑薄常脂緩 | 。.或溶一通得的-6 腊酯機 Μ ，使蠆 鱗油有是劑以大 卵甘於質滌可用 的三溶脂洗鹽物 取是先，和酸合 抽像是中元膽潖 所質質法白的該 中脂脂此蛋入 ， 豆他 ，。脂加後 大其時發後。之 或地成蒸然合間 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 434253 A7 B7 五、發明説明（f ) 而後大部分膽酸鈉得K除去，並且同時脂質和脂蛋白元 會自發性的結合成脂蛋白或稱再組成脂蛋白。透析法的 另一選擇，也坷以利用疏水性之吸附劑其可以吸附洗滌 劑 iBio-Beads S Μ- 2, Βίο Rad； Amberlite X A D-2, Rohm & Haas) (E . A. Bonomo， J . B. Swaney, J. Lipid Res., 29, 380 -384 ( 1 988))，或者洗滌劑可M藉膠體色層分析 法（Sephadex G-25, Pharmacia)來移除。脂蛋白也可以 不添加洗滌劑來產生，例如透過將適當的脂質水狀態浮 液與脂蛋白元來培育，將溶於有機溶劑内的腊質加到脂 蛋白元，將此混合物或加熱或不加熱；或是K超音波處 理此a p 〇 A - I -脂質的混合物》利用這些方法，Μ例如a p 〇 A- I和卵磷脂開始，盤狀的粒子可被得到，其相當於最 初狀態的脂蛋白。正常情形下在培育的過程後，可未結 合之脂蛋白元與游離的脂質可利用雛心或膠體色層分析 法分開，以分離均質的再組成脂蛋白粒子。 描述於US-A-5128318內的是一種製造再組成HDL的方 法，其中卵磷脂是透過有機溶劑的輔助而被溶解在溶液 中〇 K上所提及的製造再組成脂蛋白的方法僅適用於在實 驗室尺度數毫克，最多只能到數克的小量生產。 -中間產物溶液的高度稀釋使得在所需時間内來處理混 合物為不可能； -大體積所必要的硬體結構通常無法取得。 -使用的有機溶劑對環境有害。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X2?7公釐} (請先S讀背面之注意事項再填寫本頁) .1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 n^t 1Ί » 434253 五、發明説明（b -終產物無法貯存。 -终產物濃度太低，灌流於病人的體積將會太大。 -產品通常必須進一步再被純化之，例如：用膠體色層 分析去將殘留的游離脂質和/或游離脂蛋白與所欲的 rHDL粒子分開來0 進而，A. Hubsch等人；Circulatory Shock 40， 14- 23(1993)描述一種製造再組成脂蛋白的方法，其中1:200 的脂蛋白元對脂質的比例被採用。此過程的結果是所獲得 的產物具有相當程度的游離脂質，其不利地影響治療的 可應用性。 對於將rHDL於人體之預防與治療的應用，Μ克計量的 rHDL的劑量才可將血漿中的apoA-I或HDL的水準明顯的 提高。因臨床目的Μ公斤或較大尺度之rHDL的經濟性生 產以上述的方法是不可能做到的。 因此，本發明的目的在於提供一個生產r H D L的方法， 其不具有前述的缺點，且特別是其產物不具有大量的游 離的脂質或游離ap〇A-I。本發明進一步主旨是在提供一 種無需加入有機溶劑而可胞行的方法。我們已發琨再組 成脂蛋白，特別是再組成的H D L ( r H D L ),可Μ利用快速 、簡單，及工業化方法由脂蛋白元及脂質製造而來。 本發明的主體因此是一種從脂蛋白元和脂質來工業化 生產製劑的方法，其包含再組成脂蛋白粒子，且其在具 有蛋白質含畺20±2克/升且在溫度為攝氏20±2Ρ時， 具有小於40 HTU (溫度計混濁度單位）的混濁度。其中濃 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4342S3 A7 B7 五f侧脱明擎足 猶克 .此…··”一___ 度1〜40克蛋白質/升的脂蛋白元水溶液中係在未加人 有機溶劑下，與脂質一洗滌劑的水溶液混合，腊質與洗 滌劑的萁耳比在1 : 〇 . 5至1 : 4 . 0的範圍，且脂蛋白 元與脂質之重量比約在1 : 1.5至1 : 5.0的範園内。 獲得的脂蛋白元-脂質-洗滌劑混合物接著被置於脂質於 水中產生相變化的溫度土 10 tl的範圍内。洗滌劑利用分 子大小排除或利用吸附於吸附劑上來分離，直到彤成直徑5 〜50毫微米，質虽在50,000至1，00 0 , 000 ,道耳呑的蛋白質 脂質粒子，其中，無需更進一步的純化步驟，超過95¾ 以上的蛋白質被耗用及超過90¾ K上總脂質被结合。 此發明的另一主體是提供一種工業上生產包含由脂蛋 白元和脂質所生產的再組成脂蛋白分子的安定冷凍乾燥 物，其中濃度1〜40克蛋白質/升的脂蛋白元水溶液， 在無額外添加有機溶劑的情形下 > 和脂質-洗滌劑水溶 液混合，脂質與洗滌劑的莫耳比在1 : 0 . 5至1 : 4 . 0 的範圍且，脂蛋白元與脂質的重量比在1 :1.5至1 : 5 . 0的範圍，所生顷的脂蛋白元-脂質-洗滌劑混合物接 著培養在脂質於水中產生相變化的溫度士 ίου的範圍， 洗滌劑利用分子大小排除或是用吸附劑的吸附而被分離，直 到直涇為5〜50毫微米，質量在50,000至1,000,000道 耳吞的蛋白質-脂質分子彤成，其中不須要其他進一步 的純化步驟，超過95¾以上的蛋白質被耗用超過90¾的 脂質被結合，得到的液狀產物，其在蛋白質含量為20士 2克/升且溫度為20t： 土 2TC下，具有小於40NTU的濁度 —9 _ -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公嫠） (請先閱讀背面之注意事項再填，寫本頁)

,tT 經濟部十央標準局貝工消費合作社印製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 34253 A7 B7 五、發明説明（2 ) ,且產物利用選自碳水化合物群，像是蔗糖或甘露酵的 安定劑，可透過冷凍乾燥法加Μ安定。 所使用的脂蛋白元是，例如重組脂蛋白元，來自人體 血漿腊蛋臼元A-Ι之濃縮部分的脂蛋白元，脂蛋白元之 Η段，或是具有兩性性質的天然或合成的重組多胜肽。 脂蛋白元的Η段可Μ透過將天然或合成之脂蛋白元經化 學或酵素切斷而得。化學切斷的例子，用溴化氰加Κ處 理已被提及或Κ酵素切斷而言，蛋白酶如胰蛋白酶 (trypsin)可被使用。 根據本發明所使用的腊質-洗滌劑溶液中所含之脂質， 如磷脂可Μ由大豆或蛋而來、膽固醇、臑固醇酯、脂肪 酸或三酸甘油酯。洗滌劑最好是用膽酸 或其鹽類，例 如膽酸納鹽或去氧膽酸納。 在此說明書中給予的溫度20t： 士 21涵蓋了位於18D 至2210範圍内的所有值。而蛋白質含量20 土 2克/升涵 蓋了由18克/升至22克/升之範圍的所有濃度。而”相 變化溫度± 1 ο υ ”的標示涵蓋較脂質在水溶液中的相變 化溫度低1 ο υ的溫度與較脂質的相變化溫度高1 ο υ的溫 度範圍的所有溫度。此值包括了:從溶液的結凍點溫度到5 0 f之範圍，其中溫度低於2 5七是最好的。 較佳的初始原料是由人體血漿所純化的脂蛋白，其利 用適當方法，例如像是用巴斯德殺菌法，將病毒去活化 。經此過程所產生的變性蛋白（聚集物），在一促溶成份 (chaotropic component),像是例如尿素或鹽酸_的存 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

434253 五、發明説明（9 ) 在下，透過培養於弱鹼pH及略升的溫度中，而後來復性 ,所以在10毫莫耳氯化鈉內的蛋白質之媛衝交換後，大 於70¾的apoA-I是單一單元的形式（是用分析性的尺寸 排胆曆析法所決定：40微克aP〇A-I被裝到TSK G3000Sli UH20pac管柱中（LKB)，在10毫萁耳磷酸鈉，0.02¾叠氮 納，PH7.4,流最0.4毫升/分，流出物的測量在280毫 微米下進行）。 在更進一步的處理中，高濃度的脂蛋白，在無有機 溶劑的情況下，和脂質（磷脂質，如卵磷脂、膽固醇、 三甘油酯等）的溶液混合在膽酸或其鹽之（例如膽酸、 。去氧膽酸、ursode oxyeholate -去氧膽酸）的溶液內。相 對於 Hubsch等人（circulatory Shock 40， 14-23(1993)) 所揭示的，脂蛋白元的脂質之比例Μ能使沒有大畺之游 離脂質和大量之脫脂蛋白出琨於終產物中的比例來被選 擇，因此rHDL再進一步的純化步驟可Μ省略。特別是 apoA-I: PC之比例被減低，該比例非常低於1:200(Μ:Μ， 重量比大約1 : 5 , 5 )，名義上比例是在1 : 5 0至1 : 1 8 0 的範圍，較佳是1 : 100至1 : 150 (莫耳比；相當於 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫木頁) apoA-I與來自大豆的PC之重量比在1 : 2.8至1: 4,2， 此法，在與雙過滤法结合使用下，使得游離脂質的含量 大大的減少（利甩尺寸排姐層析法size exclusion chromatography方法所定量，膠體過濟採用Super* ose 6 ;見下文）；同時在終產物中形成相當低濃度的膽酸； 高濃度的膽酸及高含量之游雛PC兩者會造成體內和體外 -11- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4342S3 Λ7 Α7 Β7 五、發明説明（t。） 之细胞損害，故必須精確的控制。另一方面，將膽酸鹽 湄度，一方面被調成最適於ap〇A-I: PC的比例，且同時 ，如有必要，也可進一步藉脂質，特刖是膽固醇的加入 來被調和在此，同樣地，最適濃度是Μ能使終產物內游 離脂質及游離aPoA-I的部分儘量少而決定的；對於一具 有1:500的apoA-I: PC的比例之rHDL製劑，Ha-膽酸鹽的 莫耳比被發琨是1 : 2 0 0 (亦即，在琨在所描述之培育期間 ,apoA-I: PC: Na-膽酸鹽=1: 150: 200)。在於 0C 〜 21下4〜16小時的培育之後（對來自大豆之PC),膽酸濃 度是藉著具有孔洞大小適用於1 0 0 0至1 0 0 0 0 0 ·道耳吞， 最好是低於3000 0道耳吞，之球蛋白的超過濾膜的雙過 漶法來被降低，因此所需的鍰衝液在pH6 Μ上，最好是 7.5-9時，具有100毫奠耳/升，較佳的是10毫莫耳/升 Κ下的低雛子強度，並且含低濃度之碳水化物，例：1¾ 之蔗糖。在這樣情況之下，對每克蛋白質使用1升到多 為2升的緩衝液，便足以達到一方面所需的低洗滌劑濃 度，Μ及另一方面，顆粒尺寸所欲的分布；這呰緩衝液 的體積比先前描述的方法小了許多倍（ 1 0-20 0倍）。如果 須要，洗滌劑的濃度可以利用ambeolite XAD-2的額外 吸附步驟來被降低到所欲的濃度。利用前述之雙過滹法 的技術，產品被調整至具有10〜50克蛋白質/升的高濃 度|並且接著在安定劑如蔗糖的存在下，製成安定、可 貯蔵的終產品（液體或經真空冷凍乾燥），該冷凍乾燥 物在使用之前先Μ水溶解，產生澄清、略癸蛋白色光之 -1 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐} (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ .’ptVf 修正 I_^__ 溶液*其依據脂質含量•顔色是淡黃色。在此種溶液中 ，在處理後被測星過的rHDL顆粒（盤形）可以再次地以特 別未改變的形式被探知，利用分子大小排除層析:法，比例小 於1 0 S：之聚集物（大部分為游離脂質）及小於5 S；的脂蛋白 元可分出。在蛋白質濃度為20克/升之下，無論是在冷 凍乾燥前後，液體终產品的混濁度都在40NTU Μ下。而 利用酵素性的顔色試驗所測得的膽酸含量，通常低於每 克蛋白質中有0.5克膽酸納鹽。膽酸的測定是在NAD + 存在下，經3-α-氫氧類固醇-去氫酶的輔助，透過NAD Η 的生成而得到。產生的N A D Η和硝基四偶氮藍在心肌黃酶 之催化反應下產生藍色的甲_衍生物（formazun),其可 Μ用光度計測知）。 經濟部中央標準局貝工消f合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經過以適當體積的溶劑，最好是水的溶解後，透過電 子顙微鏡的觀察，真空乾燥之rHDL圼現圓盤形顆粒，與 初期之HDL類似，其具5〜50毫微米，通常在8到20毫 微米的直徑，及在2〜6毫微米的厚度。利用分析方法 來決定粒子大小及其相關分佈，例如，透過K —生理緩 衝液貫注的 Superose® 6HR 10/30 管柱（Phaoraacia Biotech)的，則80¾ Μ上的顆粒分子量範圍是在100000 至1000000道耳吞之間。同樣地，利用梯度膠體電泳（方 法係按 A. V. Nicohols等人；Methods in Enzymology 128, 417-431Π986)),大於80¾的顆粒分子量分布於 50 000至1000000道耳呑之間。 單一圖式可使本發明更易了解並旦支持前面的實例。 -13- 本紙張天度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公嫠） 434253 at Β7 五、發明説明（A ) 其顯示利用不同apo A-I對卵磷脂的比例（脂蛋白元對脂 質比例），所製成的rHDL粒子在膠體過濾時的洗脫画樣 (隨時間變化之吸附-洗脫狀況），[對ap〇A-I及rHDL顆粒 的高效尺寸排阻層析；將200微克，溶於100微升0.9SK 氯化鈉溶液的rHDL, M0.5毫升/分鐘的流速，用含PBS U0毫莫耳磷酸納，150毫莫耳氯化鈉，PH7.4)的Supe「ose® 6ΗΙΪ 10/30 管柱（Pharmacia. Biotech)來分離]，在 280 毫 微米下测管柱洗出液之吸光（L . L . R u d e 1 , C . A .

Marzetta and F. L. Johnson, Methods in Enzymology 129，45-57(1986)，利用曲線下的面積來定色曆分析中 個別區分的含量。在1:200產品之洗脫曲線中，可看出 在洗脫作用的初期，游離脂質已被洗出，然而茌1:100 至1:150的產物卻無此琨象。相較之下，純化的脂蛋白 元（apoA-I)的曲線可K大略地被指出。 K下舉例進一步解釋本發明，然而，它們卻不應被認 為是此發明定義的限制。 例1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1公斤之apoA-I溶於500升的0.15莫耳/升之氯化鈉 。脂質的溶液如下分別地製備：來自黃豆油的卵磷脂 (Ph〇sphο 1 iρο η 9 0® f Νa11erma η η , Coloyne, Germany) 溶於由10毫莫耳/升三羥甲基氨基甲烷緩衝劑/氯化氫 ，150毫莫耳/升氯化納，1毫莫耳/升乙二胺四乙酸 ，所組成的ρ Η 8 . 0的緩衝渡，2 . 8公斤卵磷B旨及2 . 3 2 5公 斤膽酸納鹽溶於此媛衝液中，直至100升。攪拌1至2 -14- 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 43425 3 A7 B7 五、發明説明（<;) 小時，如果需要，可加熱至大約401，直到溶液澄清。 接著冷卻至4Π,接著100公升的脂質-膽酸溶液與具有 1公斤之apoA-I的500公升溶液混合。此混合液在2〜 4¾下緩慢搜動隔夜。經培養之後採過濾滅菌，並Μ通 稱分子量極限（NMWL)=10000道耳呑之PTGC匣之pellicon ，在下做雙過濂：先M4體積之5毫奠耳/升的碳 酸氫納過據和接著Μ 2體積的10¾蔗糖過漶，且維持產 品體積於恒定。濃度會緩慢的上升達到蛋白質濃度為20 克/升。此溶液再一次Μ過漶滅菌並裝填至小管加以冷 凍乾燥。在整個過程當中必須注意的特別是防止脂質溶 液與空氣及光線的接觸，Μ及太高的溫度。終產物，其 被溶於適量水以得到蛋白質濃度為20 土 1克/升，顯示 1:100(奠耳：莫耳）之ap〇A-I對磷脂質的莫耳，少於5% 的游離脂質，小於4 0 N T U且混濁度。 例2 : 將10公斤apoA-I溶於2000升的10毫莫耳/升的氯化納 。：1.38公斤的膽固醇及29.9公斤膽酸納鹽在含有10毫莫 耳/升三羥甲基氨基甲烷媛衝劑-氯化納，150毫莫耳/ 升氯化鈉，1毫莫耳/升乙二胺囲乙酸，PH8.0的緩衝 液200升中攪拌。溫度被增至65C,將此溶液攪拌2小 時至澄清。冷卻至2 0 υ，加入2 7 . 9公斤卵磷脂，把此溶 液冷卻至410，再一次攪拌2小時。此混合液加至蛋白 質溶液中，相混合並且過漶滅菌。濾液在410下緩慢攪 拌隔夜（至少16個小時）。然後，維持此產物體積固定， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I I - I n In · ^E— ntf tk4— 434253 Α7 Β7 五、發明説明（α) 用4體積之50毫莫耳/升氛化納，1毫萁耳/升乙二胺 四乙酸，ΡΗ7.5處理2〜4小時；接著再Κ另外2體積 之10%蔗糖來處理Μ進行雙過濾此溶液的濃度而後被提 高到20克/升的蛋白質濃度。再將此液過濾滅菌，裝填 至玻璃小管瓶，並冷凍乾燥。小瓶真空密封並且在4C 下暗室保存。使用此法，可得a Ρ 〇 A - I :卵磷脂：膽固醇 的箅耳比為1 : 100:19的rHDL·。:. 例3 : 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 生產3?〇&-1對卵磷脂為1:150的比例的^01^將3.08 公斤的膽酸鈉溶於25升之鑀衝液，10毫莫耳/升三羥甲 基氨基甲烷緩衝劑-氯化氫，10毫莫耳/升氯化納，1 毫莫耳/升乙二胺四乙酸pH8.0。進而將4.2公斤之卵 磷脂在室溫下2小時來被溶解於其中。再加人溶解在 200升的10毫莫耳/升氯化納中的1公斤apoA-I,此混 合液於0〜下培養隔夜。雙過漶在恒定體積下以4體 積之50毫莫耳/升氯化鈉，1毫莫耳/升乙二胺四乙酸 ,pH?.5下進行4小時，再M2體積U蔗糖處理。最後 濃度提升至20克/升蛋白質。蔗糖的濃度藉著加入更多 之固體蔗糖使其提高至10% ，此溶液進行過漶滅菌且冷 凍乾燥。 例4 : 產生a p 〇 A - I對卵磷脂比例為1 : 1 0 0的r H D L時：將4 . 6 1 公斤之膽酸鈉溶於25升的緩衝液（10毫莫耳濃度之三羥 甲基氨基甲烷緩衝劑-氯化氫，10毫莫耳/升氯化鈉， 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 4 3 42 S3 a? B7 五、發明説明（^ ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1毫萁耳/升乙二胺四乙酸，PH8.0),把138克膽固醇 於651C下放2小時使溶於此鍰衝液-膽酸混合液中。接 著此混合液冷卻至室溫，將2 . 8公斤卵磷脂加入其中放 1小時使其溶解加入1公斤溶於2 0 0升之1 0毫莫耳濃度 之氛化鈉的apoA-I。此混合液如前例般培養，同樣地雙 過S,如上使濃度提升。 例5 : apoA-I: PC:膽固醇為1:150:10:將5.38公斤膽酸鈉 溶於例3 、例4敘述的緩衝液中。再加180克膽固醇置 於6 5 10 2小時使其溶解。加入4 . 2公斤P C在室溫下1小 時使其溶解。此混合液被加到200升的apoA-I溶液中， 每升5公克於10毫莫耳濃度之氯化納中，在4 t下培養 隔夜。雙過濾及終產物的產生如上所述。 例6 : 生產低膽酸鈉鹽含量之rHDL。rHDL如同例1〜例5來 生產。在雙過濾且使濃度上升後，將1體積rHDL溶液與 與/^1^「1丨“乂40-2(2體積）混合，此混合液在充分混 合下於4 C下1小時來培養，培養之後，r H D L利用過滤 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 例 前 如 燥 乾 .¾ 冷 及 菌 滅 0 過 出7: 移例 述 所 質 脂 中鈉 鈉酸 b 詹 TH— 氣斤 度公 濃23 升1. \ 、 耳脂 莫磷 毫卵 ο , 1 斤 升公 毫66 ο . 8 1 於含 溶包 克與 3 1 例養 前培 於下 液 P 溶-2 6 ~ 箕 ο 毫 於1 液(0 合酸 混乙 此四 。 胺 合二 混乙 液積 衝體 0 4 的用 述再 所。 時 小 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4祝格（210X297公釐） 4 3 42 §3 A7 B7 五、發明説明（A) 耳/升），及2〜4體積蔗糖（U)進行雙過瀘，且最後 將濃度提升至21〜25克/升蛋白質含量。此rHDL溶液接 著整至最終濃度為10%蔗糖，及20克/升蛋白質。進行 過滹滅菌，為單位來裝填（1克rHDL置於50毫升 小瓶中 > 並被冷凍乾燥。 例8 : 由 9 8 0 公斤.的沈锻物 W (K i s 11 e r，P . , H i t s c h m a η η , H.; Vox Sang. 7， 414-424(1962))，有 11.2公斤的 apoA-I沈澱物M乙醇沈澱而來。此被懸浮於3掊體積的 4莫耳鹽酸_溶液中◊調整pH至5.2，在60TC1 0/下小時_ 行殺菌。此蛋白質在PH7.5, 45¾下可溶解。在過逋後， 與10毫莫耳氯化納溶液的媛衝液交換係利用MSephadex G-25., (Pharmacia Biotech)的膠體過漶來進行。160 公 斤apoA-I被取得，包含總共為1040公克之ap〇A-I。此蛋 白質溶液置與脂質溶液在〜-2¾下培養2〜16小時。 該脂質溶液於室溫下分別製備：將來自大豆油的卵磷脂 溶於例3〜7敘述的鍰衝液中。再把3203克膽酸鈉及 4 46 0克卵磷脂溶於26公斤此緩衝液中。在後壤的雙過據 (UHWL = 10000道耳吞），首先此蛋白質-脂質混合物的濃 度先被提升至7克蛋白質/升，再用IX蔗糖溶液作雙過 癍直到膽酸鹽含量小於4克/升。將pH值維持在至少7 5 。最後溶液濃度提升到蛋白質含量為25克/升’並Μ賺 糖安定之。終產物被調整成蛋白質濃度在20克ap〇A-I/ 升，及100克蔗糖/升，且進行過濾滅菌。在尺寸排姐 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4规格（210X297公釐） « tn u Bn In (請先閲绩背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -----訂------{ }----- 4342ii B9」H.線 五 A7 B7 層析丨去中*有低於5 S；的游離脂質及少於丨％的游離.a ρ 0 Α _ I 被發現。此蛋白質-脂質混合物每-份以5〇〇1丨為單位來 被^填，並被冷凍乾燥。终產物溶於適量水中，顧示 a f/o A - I :卵磷脂之莫耳比為1 :丨4 〇 (莫耳：冥耳）。 / 圖式簡要說明： 圖式係顯示以不同比例之脂蛋白元A_I(ap0 A-I)/卵磷脂 時所製備的rHDL樣品之分子大小排除層析之洗脫曲其顯 示四種不同製劑之洗脫曲線：（1) apo A-I; (2) apo A-ϊ對 卵磷脂（PC)之鸟耳比爲1:1〇〇; (3) apo A-I:PC之莫耳比爲 1: 150 ; (4) ) apo A-I:PC 之莫耳比爲 1:2〇〇。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 線- 19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 六、申請專利範圍^- 第83 1 1 2032號「再組成脂蛋白之製法」專利案 (89年11月修正） 六申請專利範圍： 1. 一種工業生產再組成高密度脂蛋白粒子（rHDL)之製 劑之方法，該再組成脂蛋白粒子係由脂蛋白元A-Kapolipoprotein A-Ι)及卵磷脂所組成，且該製劑具20 ±2克/升之蛋白質含量和溫度20°C±2°C下時具有 低於40NTU混濁度，該方法包含將含1〜40克蛋 白質/升濃度的脂蛋白元A-Ι水溶液與卵磷脂-洗滌 劑水溶液於未使用有機溶劑下混合，該卵磷脂對洗 滌劑的莫耳比例在1 :0.5至1:4的範圍且脂蛋白 元A-Ι對卵磷脂的重量比在1 : 1.5至1 :5.0的範圍， 將所獲得的脂蛋白元A-Ι-卵磷脂-洗滌劑混合物接著 於使脂質在水中產生相變化的溫度±10 °C的溫度範圍 內培養，洗滌劑用分子大小排除法或用吸附劑吸附 而移除，直到形成直徑5〜50奈米，質量在50000 至1000000道耳吞的脂蛋白元A-Ι-卵磷脂粒子，其 中脂蛋白元A-1對卵磷脂之莫耳比是從1:40至 1:180，無須更進一步的純化步驟即可回收來自脂蛋 白元A-Ι與卵磷脂之重組高密度脂蛋白粒子，其中 用掉超過95%的脂蛋白元A-Ι並且有超過90%的 總卵磷脂被結合。 2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中洗滌劑的移除 是利用超過濾的分子大小排除法來進行，每克蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公蝥） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本ff) .aT 經濟部智慧时i局負工消費合作社印製 4342S3 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 質最多使用2公升之緩衝液。 3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在脂蛋白元-洗 滌劑混合物經培養後，洗滌劑利用批式吸附（batch adsorption)或管柱方法，藉著吸附於疏水性吸附劑上 的方式來被結合。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中疏水性吸附劑 爲不溶性的交聯聚苯乙烯共聚物。 5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中卵磷脂-洗滌劑 溶液還含有磷脂質、膽固醇 '膽固醇酯、脂肪酸及 /或三酸甘油酯。 6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中所使用的脂蛋 白元來源是富含脂蛋白元A-Ι之人類血漿餾份，其 至少經一次的病毒去活化步驟的處理，該步驟係將 此鶴份於包含促溶成份（chaotropic components)的溶 液中培養，而後更換緩衝液，換成離子強度低於50 毫莫耳/升的溶液，經過這些處理後，有70%以上 之脂蛋白元是處於單元體形式。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中卵磷脂-洗滌劑 溶液內還含有磷脂.質。 8. 如申請專利範圍第8項之方法，其中卵磷脂爲合成 卵磷脂。 — 9·如申請專利範圍第1項之方法，其中卵磷脂爲一種 天然的卵磷脂，較佳是萃取自大豆或蛋。 10.如申請專利範圍第9項之方法，其中卵磷脂爲大豆 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（21 Ox 297公釐） 請先閲馈龙而之注悫事項再嗔寫本頁) Λ. 訂 經濟部智慧时.4局si工消費合作社印製 4342SI A8 B8 C8 D8 經濟.部智慧时是工消費合作社印製 六、申請專利範圍 卵磷脂，且脂蛋白元A-Ι-卵磷脂-洗滌劑混合物的培 養係在0〜15°C的溫度下進行。 11.如申請專利範圍第1項之方法，其中所採用的洗滌 劑是選自於膽酸類或其鹽。 12*如申請專利範圍第11項之方法，其中洗滌劑爲膽酸 鈉鹽或去氧膽酸鈉。 览如申請專利範圍第1項之方法，其中脂蛋白元Α-Ι 水溶液含有重組脂蛋白元，或來自人類血漿富含脂 蛋白元A-Ι之餹份之脂蛋白元。 14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中卵磷脂-脂蛋白 元A-Ι-洗滌劑混合物經培養後，洗滌劑的含量係經 透析或雙過濾的方法，被減少到低於0.5克洗滌劑 /克蛋白質的濃度。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中在洗滌劑分離 前後，蛋白質的濃度可以藉雙過濾法被提高至10〜 50克/升。 1S.如申請專利範圍第1項之方法，其中脂蛋白元水溶 液或卵磷脂-洗滌劑溶液係緩衝於PH6至PH9的範 圍內。 17·如申請專利範圍第16項之方法，其中脂蛋白元A-I 水溶液或卵磷脂洗滌劑溶液係緩衝於pH7.5至pH8.5 的範圍內。 1S.如申請專利範圍第1項之方法，其中所獲得的產物 在糖類安定劑存在下，透過冷凍乾燥而被安定化。 永紙張尺度適用中國國家標準{ CNS > A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背西之注意事項再填寫本頁}

   43428$ A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 19.如申請專利範圍第18項之方法，其中產物之脂蛋白 元A-Ι濃度係被調整成5-50克/升，且使溶液安定 化之冷凍乾燥作用爲在5〜15%雙醣如蔗糖，或2-10%單糖如甘露醇之存在下進行。 .....I - ΐ— - I I— n^i |!1 I. Ά - -- - - -- - - - ^^^1 \ * » 7 1,冰-* {請先閱请背面之注意事項再填寫本買) 經濟部智慧財是局與工消費合作杜印製 本紙張X度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐）