CN1474831A

CN1474831A - 膜支架蛋白

Info

Publication number: CN1474831A
Application number: CNA018192076A
Authority: CN
Inventors: Sg; S·G·斯莱加尔; T·H·贝伯特
Original assignee: University of Arkansas
Current assignee: University of Arkansas
Priority date: 2000-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2004-02-11
Also published as: US20060211093A1; CA2429473A1; US7048949B2; AU2567002A; EP1345959A2; US20060057662A1; DK1345959T3; JP4303468B2; US7662410B2; US7575763B2; ATE510847T1; WO2002040501A3; JP2004513653A; JP2008044958A; AU2002225670B2; US20050152984A1; BR0115475A; EP1345959B1; JP4467610B2; US20060211092A1

Abstract

膜蛋白很难以重组形式表达、纯化并作特性鉴定，这至少部分是由于它们的疏水或部分疏水特性。膜支架蛋白(MSP)与目标膜蛋白或其它疏水或部分疏水的蛋白质或膜片段装配，形成可溶的纳米级颗粒，保存了它们的天然结构和功能；它们改进成为脂质体和去污剂微团。当存在磷脂时，MSP形成纳米级的磷脂双层圆盘，MSP稳定了该双层结构域周围的粒子。这种颗粒性双层结构可以对液体或固体支持物中掺入的蛋白质进行处理，包括和这种表面敏感技术一起用作扫描探针显微术或表面胞质基因组共振术。此纳米级粒子可促进药物和生物研究、结构/功能相关性、结构确定、生物分离和药物开发。

Description

膜支架蛋白

相关申请的参考

本申请是提交于2000年11月20日、序列号为60/252,233的美国专利临时申请的后继部分。

联邦研究资助的认证

本发明，至少一部分，是在美国国立卫生研究院的资助下完成的(许可证号(R01GM31756、R01GM33775、GM63574和5F32GM19024)。因此，美国政府对本发明拥有一定的权利。

发明背景

本发明的领域包括分子生物学和膜技术。具体地讲，本发明涉及人造膜支架蛋白质(MSP)，编码它们的序列、载体和重组宿主细胞、重组产生它们的方法、以及使用这些膜支架蛋白以稳定、分散和溶解完全或部分疏水的蛋白质(如外周、包埋或整合膜蛋白)同时保持这些膜蛋白的生物学活性，或稳定、分散和溶解膜片段的方法。

若干年前，我们研制了一种新的系统通过扫描探针显微术研究膜蛋白，此系统以合成的高密度脂蛋白圆盘(rHDL，apo A-I)定向吸附在云母上为基础(Carlson等，1997；Bayburt等，1998；Bayburt等，2000；Carlson等，2000)。所观察到的圆盘状结构直径约10nm，高约5.5nm。拓扑学观察到5.5nm的高度与外延朝向平坦的云母原子表面上的单一双层膜是非常相容的(Carlson等，1997)。

可将纯化的膜蛋白重新构建到这种圆盘状结构的磷脂双层区域中并在溶液中研究，或者随后吸附到合适的表面作原子力显微镜检查或用定向的蛋白质-双层装配表面用光谱技术进行检查。此外，膜蛋白圆盘状结构可容易地识别并提供判断样品和图象质量的参考点。将外周膜蛋白，NADPH-细胞色素P450还原酶，掺入rHDL双层圆盘中并对此酶进行了生理研究(Bayburt等，1998；Bayburt等，2000)。将这种还原酶掺入直径10nm的rHDL圆盘，那些圆盘可吸附在云母上，且可以拍摄到该还原酶从双层结构顶部伸出的催化域，掺入的酶在此类表面上仍有活性，其转化的底物数与用颗粒膜制品所获得的酶活性相符。探针力曲线分析已用来估计这一结构的高度和它在AFM探针力下的压缩性(Bayburt等，2000)。双层表面上分子的高度与根据最近X射线晶体结构预计的高度相符(Wang等，1997)。细胞色素P450还原酶可以活性形式掺入本发明MSP支持的纳米级结构中。

高密度脂蛋白(HDL)是一种称为apo A-I的蛋白质成分和各种磷脂的聚集体。HDL颗粒作为胆固醇逆向转运的主要通道在哺乳动物胆固醇稳态中起着重要作用(Fielding和Fielding，1991)。HDL作为胆固醇转运者的功能依赖于与HDL结合的酶卵磷脂-胆固醇酰基转移酶或LCAT(Glomset，1968；Jonas，1991)的活性，LCAT介导胆固醇酯插入HDL脂蛋白颗粒。apo A-I蛋白的某些部分是这种酶的活性所必需的(Holvoet等，1995)。此外，据认为apo A-I蛋白的N-末端球状结构域中的一部分负责与细胞表面受体相互反应。根据染色标本的电镜观察，HDL颗粒的新生形式呈圆盘状(Forte等，1971)。我们的实验室在水环境中对rHDL的合成形式进行了AFM研究，证实了这一结果。然而，这种形式不是体内循环的优势形式。而且，apo A-I的结构显然与稳定球状形式有关。

已提出了HDL圆盘结构的两种常规模型。一种模型中，由弯曲的分段α螺旋棒构成的apo A-I蛋白围绕环状双层部分形成平行环带或“带”(Wlodawer等，1979)。另一种模型，蛋白质以一系列α螺旋区段垂直跨于双层两边缘间(Boguski等，1986)。这两种模型主要都以间接的实验证据为基础，且没有区分它们的明确方法。apo A-I基因的序列分析提示此蛋白质折叠成一系列约22个氨基酸长的螺旋，这与双层结构大致的高度相符。计算机模拟(Phillips等，1997)和削弱的总反射红外光谱测量术(Wald等，1990)已经预了这些螺旋在圆盘中的位置。这些研究提出，螺旋大致与酰基链平行排布且略短于双层的高度。蛋白质和脂类的这种排布与尖桩围栏模型相符。

环带模型和一些电镜和中子散射数据是一致的(Wlodawer等，1979)，此模型中，诸螺旋像一条带纵向排列围绕在双层圆盘边缘。与早期的研究相反，最近用新的样品定向法作圆二色性测量的红外光谱研究与环带模型更加相符(Wald等，1990；Koppaka等，1999)。迄今为止，还没有引人注目的直接证据可以证明这一模型是正确的，即使已经得到了不含脂质的apo A-I晶体的低分辨率X-射线晶体结构(Borhani等，1997)。N-末端载短的apo A-I的低分辨率晶体结构显示一个单元含有由四个螺旋棒构成的四聚物，四个螺旋棒弯曲成马蹄状并联合，产生一大约125×80×40的圆形聚集体。提示这种弯曲构象中的二聚物能够形成圆盘状颗粒。

迄今收集到的与胆固醇逆向转运循环和HDL颗粒成熟有关的信息，提示o A-I蛋白有独特的性质，使它能自发地与膜发生反应导致脂蛋白颗粒的形成。已有人提出了最初的apo A-I脂类结合反应(Rogers等，1998)，但双层结构形式如何转变成圆盘状颗粒仍不清楚。现有证据表明，稳定不含脂apo A-I的能量非常低，不能维持两种构象异构体之间的平衡(Atkinson和Small，1986；Rogers等，1998)。一种构象异构体可能是长螺旋棒，另一种可能是约一半长的螺旋性“发夹”结构。已知当apo A-I遇到脂类膜时，稳定能量低和构象可塑性可使其被结构性识别，促进了膜和蛋白质中发生的结构变化而产生精细的脂蛋白颗粒(Rogers等，1998)。一旦这些颗粒形成，apo A-I仍由可能经历特殊的构象变化，影响到脂蛋白颗粒的动力学官能度这些相互反应和变化都发生在蛋白-脂质介面。因此，几乎没有理由相信apo A-I自身可理想的产生稳定的、纳米级大小的磷脂双层结构。

在脂类的相转变温度时或高于此温度时，合成的rHDL自发的使apo A-I和磷脂酰胆碱脂质体以一定的蛋白-脂类比例和温度相互反应(Jonas，1986)。apo A-I和磷脂混合物的去污剂透析方法亦已用来形成颗粒结构并提供掺入纯化的膜蛋白的方法。所形成的圆盘状颗粒的大小取决于生成的混合物中蛋白质和脂类的比例，并反映了双层区域的直径(Brouillette等，1984；Wald等，1990)。因此提出了按照磷脂圆盘周围结合的apo A-I分子的数目进行大小分类。这些类别按照每种圆盘apo A-I蛋白分子的化学计量学称为LP1、LP2、LP3和LP4。由于apo A-I构象的不均一性LP同类中还有不同的大小。本发明的一个方面以鉴定造成这种不均一性结构的能力和将其消除以产生均匀分散的圆盘结构群体的能力为基础。目前，产生直径大于10nm的均匀颗粒需要将该颗粒与含有2-4个结合的apo A-I分子的混合物分离步骤，而直径10nm的颗粒是apo A-I：磷脂低比例时产生的主要形式。纯化得到一种大小的颗粒和获得高效膜蛋白或膜片段掺入的能力要求改变apo A-I的结构。

不同类型的脂类聚集体被用于重建和研究纯化的膜蛋白；这些脂类聚集体包括膜分散、去污剂微团和脂质体。参见图1。供生化和物理研究的纯化系统需要稳定性，但这不是一些系统所固有的。脂质体是内部含水的封闭的球形双层外壳。通过去污剂透析或其它方法重建成的脂质体通常会导致蛋白质朝外和朝腔内空间的随机取向。由于配体或蛋白质靶标通常是亲水或带电荷的，如图1所示，它们不能通过脂质体双层，尽管在一些情况下这样是有利的。由于脂质双层的两侧不与大部分溶剂接触，可能无法研究双层相对侧区域之间的耦合效果。脂质体亦倾向于聚集和融合，且在一周以上的时期或在某些物理操作下(如停止流动或剧烈混合时)通常不稳定。通过限定的圆柱形孔挤出而得到的脂质体的大小显示不均一的直径，在粒径分布上具有多分散性。

由于光散射和双层中膜蛋白的聚集，脂质体也可能难以制备。脂质体的表面积相对较大(10⁵-10⁸2)。为得到带有单一膜蛋白的脂质体，需要较大的脂类：蛋白质摩尔比。去污剂微团通过与蛋白质的膜-包埋部分相互反应使膜蛋白溶解并易于使用。去污剂微团是动态的并经历结构波动，这促进了亚单位的解离并经常在处理稀释液中蛋白质的能力上发生困难。然而，过量的去污剂微团对于维持蛋白质处于非聚集的和溶解状态是必需的。去污剂还可能受到温和的变性并常常不能保持磷脂双层系统的特性。为支持并调节蛋白质结构和功能常常需要特殊的磷脂(Tocanne等，1994)。因此，去污剂溶解的膜蛋白质的结构、功能和稳定性可能产生问题。由于需要过量的去污剂微团，蛋白质复合物可能解离，这取决于蛋白质浓度和去污剂和蛋白质的比例。相反，本发明的MSP纳米结构在结构上更加坚固，与单室脂质体相比，它含有大小和组分不连续的磷脂双层模拟结构域以及较高的稳定性和较小的表面积。圆盘状结构象去污剂那样使得能够接触双层的两侧，并提供了像脂质体那样的双层结构。

此领域对能分散膜蛋白和其它疏水性或部分疏水性蛋白质，从而保存那些蛋白质的天然活性和性质的稳定而明确的组合物有长期的需要。

发明概要

本文所用的膜支架蛋白(MSP)是一种人造蛋白质，它能与磷脂以及磷脂混合物自身组装，或在没有磷脂时自身组装成纳米级的膜双层。这些纳米级装配体的一个亚类是圆盘状的，称为纳米圆盘(nanodisc)或纳米圆盘状结构(nanodiskstructure)。这些“纳米级”颗粒的直径可以是约5-500nm，约5-100nm或约5-50nm。这些包含磷脂和MSP的结构保存了正常膜的整个双层结构，而且提供了磷脂和MSP溶于溶液中并可被安装到或粘附到各种表面的一种系统。具体的示范性MSP的氨基酸序列给出在SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ IDNO：45。

本发明还提供了用本发明的MSP形成的纳米级磷脂双层结构或纳米圆盘的应用，它们可用于加入其它的疏水或部分疏水的蛋白质分子。例如，可用去污剂溶解这些其它的蛋白质可以并将溶解的蛋白质加到有或没有磷脂的MSP溶液中，纳米级颗粒自身组装，这样MSP和其它的蛋白就掺入在稳定而可溶的颗粒中。随后，可以通过透析除去去污剂。这些见于活生物体各种膜结构中的蛋白质可溶于MSP支持的纳米级双层或纳米圆盘中，且在这些MSP支持的结构中保存了目标蛋白的天然结构和活性。除了疏水性或部分疏水性蛋白质，膜片段或破碎的膜也可以用本发明的MSP装配。

MSP支持的双层或纳米圆盘可用于溶液中或许多表面，这样就可以保留掺入在MSP支持结构中的天然蛋白的天然结构和配体结合(能力)。像具体列举的那样，MSP支持的结构粘附到金表面，例如，可以用于表面胞质基因组共振技术。

本发明涉及将整合膜蛋白掺入至少含有一种本发明的MSP的纳米级脂质双层或纳米圆盘的方法。在本发明的方法中可使用三类(外周、包埋和整合)膜蛋白。第一种膜蛋白是外周膜蛋白；这一类的例子是NADPH-细胞色素P450还原酶和人组织因子。包埋膜蛋白的例子包括但不限于兔肝脏微粒体的细胞色素P450 2B4、人肝脏微粒体的细胞色素P450 3A4以及昆虫微粒体的细胞色素P450 6B1。整合膜蛋白的例子是7-螺旋跨膜蛋白，包括但不限于盐生盐杆菌的视紫红质、人类的5-羟基色胺1A G-蛋白偶联受体和其它的G-蛋白偶联受体。使用本发明的MSP和方法，各类膜蛋白的成员都可以成功掺入纳米级结构中。特别是，可将细胞表面受体，尤其是G-蛋白偶联受体，掺入由一类膜交架蛋白(MSP)形成的纳米级双层双层结构中。

通过基因工程制备的支架蛋白(MSP)，我们开发了用于结构、生化和制药技术在所得纳米级脂蛋白颗粒中具有较好的稳定性、尺寸均一性和有用功能基因的纳米圆盘。为了纯化和物理处理这些圆盘状物，这些颗粒可以在比如水凝胶或金生物传感器表面形成标记，，同时它们可以作为实体以进行快速可重现性试验和结晶。这种纳米颗粒和膜蛋白支架可用于生物技术、制药工业以及基础研究。此外，我们发现的结构和功能原理，以及相关技术促进了在分子水平上对蛋白质和脂质双层相互反应理解。

本发明的另一方面涉及一类膜支架蛋白(MSP)，它可以用来溶解以功能稳定均匀分散磷脂双层结合形式存在的膜蛋白和复合物。此外，这种MSP提供了物理操纵单一膜蛋白的方法。这种MSP模仿人载脂蛋白A-I，在某些条件下，Apo AI可以与磷脂自动组装形成直径100-200的圆盘状结构(Brouillette等，1984)。其它的两性蛋白质也可以作为起点。尽管脱辅基蛋白质A-I是已知的，但它在常规方法未用于溶解和研究完全无关来源的外周、嵌入或整合膜蛋白。本发明一个具体实施方案是采用与脂类结合的MSP进行膜蛋白的溶解、操纵和研究。

本发明还提供了使用遗传基因工程构建的MSP来尽可能减少膜颗粒形成所需的MSP的尺寸，并通过改变亲代分子的序列提高自身组装纳米颗粒的稳定性和均分散性的材料和方法。特别是我们开发了用于研究G-蛋白偶联受体的MSP。G-蛋白偶联受体(GPCR)是哺乳动物细胞膜中一类重要和多样的药物靶子，它们作为信号转导元件起作用，能结合几类生物活性配体并将信息传递给胞内机制。本发明的人造MSP能稳定并溶解与膜结合的GPCR使得人们可认纯化和在溶液中或在高产量筛选应用所用的固体支持物上操作以及在表面胞质基因生物传感器和扫描探针技术的表面上操作。本发明的人造MSP可用于促进可溶形式重组膜蛋白的表达和纯化。

编码MSP的重组DNA分子以及含有那些用来制造MSP的重组DNA分子的宿主细胞也在本发明的范围之内。这些重组DNA分子编码的MSP包括含有以下氨基酸序列的那些分子，这些氨基酸序列包括但不限于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQID NO：44和SEQ ID NO：45。

附图简述

图1显示了掺入膜蛋白的不同类型的脂类聚集物。小圈和三角分别代表受体蛋白质胞内域和胞外域的配体。

图2显示了α螺旋的轮状结构，疏水和亲水的氨基酸侧链的位置使得此螺旋具有两性性质。

图3A是MSP稳定双层的“尖桩围栏”模型的示意图。圆圈代表一个α螺旋，其直径约为1.5nm、螺距约为0.54nm(每圈有3.6个氨基酸残基)。图3B是MSP支持双层的“环带”模型的示意图。矩形表示一个α螺旋，其直径约为1.5nm、螺距约为3.9nm。

图4是亲代apo A-I分子的序列及其二级结构的预测。星号表示螺旋重复边界。黑体下划线序列代表α-螺旋结构，斜体表示b结构，素色粗体表示可能的转折。

图5A-5G显示了各种基因工程构建的MSP结构，显示以序列分析为基础的尖桩围栏拓扑学形态和螺旋性排布。图5A：MSP1显示半重复所在位置。半重复1根据分子动态模拟技术是无序的(Phillips，1997)。图5B：绞链区的移动。图5C：除去半重复。图5D：绞链区替代螺旋3和4。图5E：MSP1序列串联加倍的MSP2。图5F：除去半重复1制得MSP1Δ1。图5G：MSP1Δ1串联加倍形成MSP2Δ1。

图6A-6B图示了用于扩增人造MSP的PCR方法。

图7A-7B显示了有(图7A)和没有长接头序列(图7B)的MSP2的图。

图8A-8B说明了构建并表达编码缺失螺旋4和5的MSP1衍生物的人工序列的方法。

图9A-9B说明了构建并表达编码缺失螺旋5和6的MSP1衍生物的人工序列的方法。

图10提供了重建进入MSP1结构的细菌视紫红质的凝胶过滤洗脱图。

图11显示了不加入磷脂时MSP1溶解的细菌视紫红质的凝胶过滤层析图。以550nm吸光值检测细菌视紫红质，而以280nm吸光值检测MSP1和细菌视紫红质蛋白。

图12显示了不加入磷脂时MSP2溶解的细菌视紫红质的凝胶过滤层析图。以550nm吸收值检测细菌视紫红质，而以280nm吸收值检测MSP2和细菌视紫红质蛋白。

图13说明了用不同的脂类：MSP比例形成的纳米级颗粒。以所标出的脂类：MSP摩尔比形成颗粒，并用天然梯度凝胶电泳分离，如右图所示，MSP1形成了直径为8.2、9.6和10.6nm的颗粒。MSP2形成了优势的9.6nm的颗粒。

图14显示了化学变性含二棕榈酰磷脂酰胆碱的复合物中MSP1和MSP2颗粒(直径9nm)的结果，采用色氨酸荧光监测。在280nm激发光，缓冲液是10mM HepespH7.5和0.15M NaCl。

图15A-15B显示了掺入到圆盘并粘附于固体支持物的膜蛋白。图15A：金粒上与圆盘结合的受体和受体-靶复合物的配体诱导装配。图15B：凝胶基质中与圆盘结合的受体。

图16A显示了层析柱上纳米圆盘颗粒的HPLC结果，显示了8和10nm大小颗粒的保留时间和25-28分时的组织因子活性。图16B显示了使用8-25％梯度凝胶的SDS-PAGE结果；分离自HPLC并含有TF的MSP1支持的纳米圆盘双层具有预期的分子量。

图17A-17b说明细胞色素b5，如采用8-25％梯度凝胶作天然PAGE所测定的那在分离到圆盘中。泳道1，分子量标志；泳道2，细胞色素b5；泳道3，圆盘；泳道4，圆盘/细胞色素b5；泳道5和6，圆盘(代表洗脱自阴离子交换柱的两个合并物)中的阴离子交换纯化的细胞色素b5。图17A显示了用考马斯兰染色的蛋白质，图17B显示了血红素特异的染色结果。注意，232kDa的标志蛋白质(过氧化氢酶)也如血红素染色。

图18是掺入由85％DPPC、15％POPC组成的10nm双层圆盘中的细胞色素P450 3A4的层析谱。

图19是掺入由85％DPPC、15％POPS组成的10nm双层圆盘中的细胞色素P450 3A4的层析谱。

图20是掺入由100％DPPC构成的10nm双层圆盘中的细胞色素P450 3A4的层析谱。

图20显示了在8-25％梯度凝胶上与纳米圆盘颗粒的大小有关的三种圆盘样品的PAGE结果。

图22说明了Superdex 200分级柱上MSP-溶解的细胞色素P450 6B1的HPLC层析结果。保留时间指出含有6B1的纳米圆盘颗粒(420nm痕量)约为1。流速为0.25ml/min。

图24说明了样品1(用共同表达细胞色素P450 6B1和NADPH P450还原酶的细胞的微粒体膜制备的纳米圆盘)的PAGE结果。样品2含有对照微粒体。

图24说明[Co-Fe²⁺-Co-Fe³⁺]的视差光谱。掺入纳米圆盘中的活性细胞色素P450 6B1在450nm处的吸光值。

图25描述了用Superdex分级柱分离的样品的层析谱。保留时间指出了大小为10nm的rHDL颗粒。

图26说明细胞色素P450还原酶和细胞色素P450 6B1的共同掺入MSP纳米圆盘中。456nm(主要是还原酶)吸收与420nm(主要是P450)吸收的比值是保留时间的函数。约26min处的峰表示同时含有还原酶和细胞色素的纳米圆盘群。

图27说明了含有羧基未端硫醇的DPPC纳米圆盘与金表面的结合，这是用表面胞质基因组共振监测的。

发明详述

此说明书中使用的缩写包括A，Ala，丙氨酸；M，Met，甲硫氨酸；C，Cys，半胱氨酸；N，Asn，天冬酰胺；D，Asp，天冬氨酸；P，Pro，脯氨酸；E，Glu，谷氨酸；Q，Gln，谷氨酰胺；F，Phe，苯丙氨酸；R，Arg，精氨酸；G，Gly，甘氨酸；S，Ser，丝氨酸；H，His，组氨酸；T，Thr，苏氨酸；I，Ile，异亮氨酸；V，Val，缬氨酸；K，Lys，赖氨酸；W，Try，色氨酸；L，Leu，亮氨酸；Y，Tyr，酪氨酸；MSP，膜支架蛋白；DPPC，二棕榈酰磷脂酰胆碱；PC，磷脂酰胆碱；PS，磷脂酰丝氨酸；BR，细菌视紫红质。

最简单的单细胞生物是由充满含水性物质的中心区域和各种可溶性小分子和大分子构成的。包围这一区域的是以双层结构排列的磷脂构成的膜。在较为复杂的活细胞中，内部区室和结构也被膜包裹。有许多蛋白质分子包埋在这些膜结构中或与其结合，这些被称为膜蛋白的蛋白质通常对决定细胞功能是最重要的，这些功能包括信息和能量的通讯和加工。研究膜蛋白遇到的最大问题是，磷脂双层的内侧是疏水的，膜蛋白的包埋或锚定部分本身也是疏水的。在将这些膜蛋白从它们的天然膜环境分离时，很难防止它们形成失活的聚集体。本发明提供了产生可溶性纳米颗粒的方法，这种纳米颗粒自身是天然样的磷脂双层，其中可以掺入感兴趣的疏水性蛋白(靶蛋白)以维持靶蛋白呈可溶和均匀分散的实体状态。这可以通过在纳米级结构中掺入疏水性蛋白(如膜蛋白)而实现。

本文所用的膜支架蛋白(MSP)是人造蛋白质，它可将磷脂和磷脂混合物自身组装进纳米大小的膜双层中。这些纳米大小装配体的一个亚类是圆盘状的，称为纳米圆盘或纳米圆盘状结构。这些结构保存了正常膜的整个双层结构，而且提供了溶于溶液中并可被装配或粘附到各种表面的一种系统。

本发明的MSP必需是两性的，其结构的一部分或多或少是亲水的并朝向含水溶液，另一部分或多或少是疏水的并朝向将被稳定的疏水双层的中心。查阅一些基础性生化文献发现两种具有这种所需两性特征的候选蛋白质结构：α-螺旋和β-片层。尽管文献中有β-片层可以靠自身折叠产生“内部”疏水性而“外部”亲水性的结构的例子，但这些最简单的结构中所形成的中央空隙很小。如此小的内部区域也许能稳定磷脂双层，但这种尺寸实在太小而无法掺入任何所需的膜蛋白靶子。因此，我们设计了本发明的MSP，它具有α螺旋作为基础性两性建筑模块。每种MSP都具有可形成两性α-螺旋的氨基酸序列，螺旋的一个面上有多个占优势的疏水残基(如A、C、F、G、I、L、M、V、W或Y)，螺旋的另一个面上有多个极性或带电荷的残基(如D、E、N、Q、S、T、H、K或R)。参见图2以了解结构。此外，此螺旋结构大约每隔20-25个氨基酸就插有一个脯氨酸残基(P)形成“纽结”或引起转向以利于MSP“缠绕”在圆盘状磷脂双层边缘周围。参见图2，它描述了通用的线性氨基酸序列和螺旋形轮状图，显示了此螺旋一个面上占优势的疏水性氨基酸的位置。精确的氨基酸序列中，疏水氨基酸的位置和数目在设计的线性序列中可以不同。可以产生螺旋轴与正常纳米圆盘双层平行或垂直的简单模型；参见图3A和3B。为产生直径约为10nm的圆盘一个，MSP含有约12-20个或更多个具有这种通用两性序列的重复单元。优选地，蛋白质由长度14-25个氨基酸之间的两性α螺旋构成，线性序列中插有不利于形成螺旋的残基，如脯氨酸，这就形成了能稳定磷脂双层疏水核心的小的螺旋状建筑模块。这些小的螺旋状节段通过约1-5个氨基酸残基相互连接。为覆盖的“环带”或“尖桩围栏”模型中的10nm圆盘状颗粒的边缘，需要10-20个这种螺旋，根据图3A和3B简单的图解分析16是最理想的数目。我们就这样建立了一种合成基因以表达含有所需两性螺旋的蛋白质。

本发明的MSP可用来将外周、包埋或整合膜蛋白溶解于在纳米级结构中。外周膜蛋白主要是由双层外部的相对可溶的球形结构域和将这一结构域锚定到膜双层的相对简单的区域(例如，一个穿膜螺旋)构成的。天然情况下此球形结构域可能朝向胞外或胞质。本文所述的包埋膜蛋白包含有多肽的膜锚定区段，但该蛋白质表面也有疏水氨基酸集群，这种疏水性结构域埋在膜双层中。整合膜蛋白主要位于膜双层内部；这种蛋白质的较小部分暴露于细胞内的水环境或暴露于胞外水环境。

外周膜蛋白质类的例子是NADPH-细胞色素P450还原酶(例如，来自大鼠肝脏内质网)、细胞色素b5和人组织因子。NADPH-细胞色素P450还原酶是内质网中发现的膜蛋白，它催化嘧啶核苷酸脱水和电子向膜结合细胞色素P450转移。在人类、植物、其它哺乳动物、昆虫等中发现了类似结构的同工酶。组织因子(TF)或促凝血酶原激酶是一种30,000 Da的I-型外周膜蛋白，是引发血液凝固级联反应的关键性因子。这种膜结合蛋白作为因子VII的活化辅因子起作用，可溶性丝氨酸蛋白酶执行血液凝固的第一个催化步骤。组织因子的表达局限于不与血浆直接接触在脉管系统和整个器官周围形成“止血性外壳”的细胞中，。在皮肤、大脑和血管周围的外膜层中发现了高水平的TF。TF：VII复合物必需在膜表面装配才显示高活性，仅当膜含有带有负电荷头部基的磷脂时才有最佳活性。细胞色素b5是一种膜锚定(外周)的血红素蛋白，它有一个穿入膜双层的膜锚定结构域。在没有去污剂时，溶解自其天然膜的细胞色素b5以大型聚集物存在，在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上看起来像污点而不是分离的条带(图17泳道2)。纳米圆盘的形成(采用我们的发明所说的MSP通过自身组装过程)，其中细胞色素b5被加到MSP和磷脂的制品中，导致细胞色素b5被掺入到圆盘状结构中(图17泳道4)。通过对右图中与纳米圆盘相对应的条带进行血红素强染色验证了这一点。图17的泳道5和6中显示了用阴离子交换层析法分离的含有细胞色素b5的纳米圆盘。从阴离子交换柱上洗脱的两个峰接近310mM NaCl和接近370mM NaCl。310mM NaCl附近的洗脱物只观察到圆盘，而450和700mM NaCl之间的洗脱物只有细胞色素b5。这些数据证明，采用MSP技术细胞色素b5被溶解了，并说明化含有细胞色素b5的圆盘复合物可以经层析方法分离和纯化除去不需要的聚集物质。纯化物质的血红素生色团的光吸收特性显示，血红素活性位点在天然构象中。

包埋膜蛋白的例子包括但不限于兔肝脏微粒体的细胞色素P450 2B4、人肝脏微粒体的细胞色素P450 3A4以及昆虫微粒体的细胞色素P450 6B1。细胞色素P450是见于所有形式生命体中的一种酶超家族。许多哺乳动物P450的一个作用是脱毒生物异源物质；例如，人肝脏P450可解毒大多数内源和外源化合物，这些酶决定了所有摄取药物的平均血浆寿命。另一种研究得最广泛的人肝脏细胞色素P450是细胞色素P450 3A4(CYP 3A4)。这种膜结合P450是人肝脏中表达最高的P450，它负责代谢几乎50％的所有药物(Guengerich，F.P.，Cytochrome P450.CytochromeP450，P.R.Ortiz de Montellano编，1995，New York：Plenum Press.473-535)。为证明纳米圆盘技术在研究细胞色素P450中的应用，我们将CYP 3A4掺入MSP支持的纳米级双层圆盘。图18-21显示，CYP 3A4(通过417nm处光吸收观察)和纳米圆盘(监测MSP和P450的280nm处吸光值)同时从柱子上洗脱，保留时间大约为24分钟。这种洗脱时间与计算出的圆盘蛋白复合物的保留时间也是紧密相关的。支持此结果的其它证据是天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，PAGE直接测量了洗脱的纳米圆盘颗粒的大小(图21)。

细胞色素P450 6B1(CYP 6B1)是大分子细胞色素P450单加氧酶蛋白超家族的成员，它是包埋膜蛋白的另一个例子。已经从Papilio polyxenes[专门用能产生对大多数生物都有光毒性的植物代谢物furanocoumarin的植株喂养的黑色燕尾(black swallowtail)]中分离了CYP 6B1。CYP 6B1据认为是通过环氧化反应催化furanocoumarin的脱毒作用(Ma，R.等，(1994)Arch.Biochem.Biophys.310(2)，332-40)。为展示本发明MSP技术的新应用，我们证明，含有膜蛋白所有组成成分的分离的膜，可以被掺入含有MSP的纳米圆盘中。一个特别重要的实施方案是已广泛用作异源性表达系统的普通昆虫细胞培养物-杆状病毒表达系统的应用。因此，我们使用了市售的共转染的Sf9昆虫细胞系，这样产生了含有过度表达的昆虫CYP 6B1和过度表达的昆虫NADPH细胞色素P450还原酶的微粒体制品。因此，我们不仅证明了MSP纳米圆盘可用于将另一种细胞色素P450系统掺入可溶性均匀分散的颗粒，还证明了这种P450的来源可能只不过是用克隆的CYP 6B1基因转染的Sf9细胞系的完整的膜。因此，可以制造MSP支持的纳米圆盘用于高产量筛选，如膜结合蛋白配体的鉴定和新型药物的鉴定。这种应用可扩大到其它来源的含有感兴趣的靶蛋白的膜片段，如任何哺乳动物细胞培养系统或哺乳动物表达系统。

本发明纳米圆盘技术的一个重要应用在于高产量筛选酶或受体的结合活性。在许多此类系统中，将一个以上的膜蛋白靶子掺入纳米圆盘是有利的，例如，将P450单加氧酶催化所需的电子转移伙伴或G-蛋白偶联受体和相应的G-蛋白掺入纳米圆盘。为证明MSP纳米圆盘技术在这些情况下的用途，我们成功的掺入了NADPH细胞色素P450还原酶和细胞色素P450 6B1。如本文所证明的那样，每个目标膜蛋白都可以用MSP个别掺入纳米圆盘，或者它们混合掺入内活性。细胞色素P450与还原酶的相对量是每分子还原酶约有10-20个P450分子(Feyereisen，R.(1999).Annual Review of Entomology 44，501-533)。为在重建入圆盘后得到CYP 6B1的活性，最好在重建混合物中加入过量的还原酶，如在一个圆盘中二者分开加入一个P450分子和一个还原酶分子。添加外源性加入的还原酶的微粒体制品已经实现。用Superdex分级柱分离样品，280nm处吸光值表明了MSP1的存在，420mm和456nm处的吸光值表明三价铁物质的存在456nm、处吸光值地表明还原酶的存在(图25)。制作456nm与420nm的比例图，显示了层析谱上的位置，其中456nm处吸光值超过与CYP 6B1有关的吸光值，因此可归因于还原酶的吸光(图26)。保留时间与含有CYP6B1和还原酶的10nm颗粒的存在相关。也可以参见图22-24。

整合膜蛋白的例子是7-螺旋跨膜蛋白，包括但不限于盐生盐杆菌的细菌视紫红质、人类的5-羟基色胺1A G-蛋白偶联受体和其它的G-蛋白偶联蛋白受体。已经用本发明的MSP和方法成功地将各类膜蛋白的成员掺入纳米级结构中。具体有，细胞表面受体，尤其是G-蛋白偶联受体，可以被掺入由一类膜支架蛋白(MSP)形成的纳米双层结构中。已将BR掺入本文以下所述的MSP纳米圆盘中，我们还使用了市售的昆虫细胞表达系统，它提供了带有人受体的5-HT-1A(血清素)G-蛋白偶联膜片段。5-HT-1A掺入纳米圆盘显示的配体结合活性证明这种蛋白质在本发明的纳米圆盘中处于活性构象。

图10，显示了MSP/BR/二肉豆寇酰磷脂酰胆碱合成混合物的凝胶过滤洗脱图，证明细菌视紫红质已经被溶解。在没有MSP时，细菌视紫红质在空组分中定量洗脱。细菌视紫红质洗脱主峰位置略早于部分MSP圆盘(直径约100的小复合物，根据校准用标准品的Stoke’s半径)。还形成了含有BR的较大复合物。复合物中的BR可以通过含有6个组氨酸尾巴的基因工程构建的MSP特异性地结合于镍亲和柱并从中洗脱。此外，BR凝胶过滤洗脱曲线和没有BR时MSP圆盘的洗脱曲线非常相似。复合物中BR的光谱和去污剂溶解的单体BR的光谱类似，且在4℃贮藏数周看来没有变化。令人惊奇的是，在没有外源添加的磷脂时MSP定量地溶解了BR。这些缺少脂类的复合物也有小MSP/磷脂圆盘的大小。

我们通过设计依靠短接头连接的串联重复的MSP1制得了人造MSP(MSP2)，产生了一种新的分子。参见图5G和SEQ ID NO：17。在细菌表达系统中生产了较大量(每升细胞培养物有几十毫克)的本发明人造MSP。我们的构建物减少了可以形成的大小等级的数目(与三种MSP1分子相对应)。初步证据表明MSP2形成的主要物质的尺寸相当于2-4个MSP1分子。此外，由于发现以低磷脂：MSP比例制备MSP1时膜支架蛋白的构象改变，MSP2不存在最小的圆盘尺寸。不希望受到理论的束缚，我们认为较小的颗粒含有一个MSP2分子，而较大的圆盘含有两个分子。

已经用基因工程方法构建了支架蛋白(MSP)以使圆盘状磷脂双层的结构可变性减至最小。这提供了较大的结构稳定性并提高了圆盘结构的尺寸均一性，以及为圆盘的纯化和物理操作掺入有用的功能基团(如尾)。圆盘均一性是将单一的膜蛋白或单一的膜蛋白复合物掺入单一大小等级的圆盘所必需的。亲代分子，apoA-I，具有稳定圆盘结构的功能；这包括细胞受体的结合、LCAT的活化和各种脂蛋白之间的结构转化(Forte等，1971；Holvoet等，1995；Fidge，1999)。这些功能域不是必需的且在本发明的人造双层系统中通常是有害的。人造支架蛋白可用于研究两性螺旋膜蛋白结构。

二级结构的预测提供了估计支架蛋白结构特征的方法。重复序列中主要由插有脯氨酸的α-螺旋构成的结构如图4所示。据认为8-9个α螺旋与圆盘状形式中的脂类结合。预计apo A-I的N-末端区域更具球状特征。除去该分子的这一部分以产生能够形成圆盘的结构。可产生具有高度均匀分散性的圆盘状装配体的MSP是需要的。中心螺旋(99-186)可用相关蛋白质(载脂蛋白A-II)的无脂形式替代，将其加到圆盘状结构的溶液中(Durbin和Jonas，1999)，这些螺旋可能是从圆盘边缘分离的“绞链”区(图5A-5B)的一部分，在LP2、LP3和LP4类中产生各种直径的颗粒(Jonas等，1989)。由相关绞链区形成的圆盘也更易受到蛋白酶水解(Dalton和Swaney，1993)，这是不希望的。删除三对中心螺旋(100-143，122-165和144-186)导致了重组，形成了尺寸小于全长apo A-I的较小圆盘，此外，两个突变(122-165和144-186)增加了对化学变性的稳定性(Frank等，1997)。进一步的工作用另一组螺旋替代了螺旋5和6(143-186)(图5D)。螺旋3和4含有认为能赋予圆盘稳定性的区域(Frank等，1997)。螺旋3具有高亲脂性，且被认为可通过盐桥稳定与脂类结合的形式。螺旋1也有高亲脂性且是完整的螺旋状(Rogers等，1998)。掺入螺旋对1-2以替代螺旋对5-6的构建物是理想的。人们对半重复的作用很感兴趣。预计这些11-mer的重复是α-螺旋状的，但长度不足以跨越尖桩围栏模型的双层。在尖桩围栏模型圆盘的分子动力学模型中，与半重复相对应的区域实际上是“松弛的”不与脂类反应，而发现半重复2在头部基团区域附近与双层平行(图5A和5C)。这种结构可使圆盘产生紊乱。为确定半重复的作用以及进一步优化MSP的结构和功能，采用诱变和直接进化来产生以下所述的变体。

掺入MSP圆盘的受体可用于结构、生化和药物研究。膜蛋白研究目前局限在不可溶膜的分散、去污剂微团和脂质体。生化和物理研究的纯化系统需要稳定性，这在许多情况下可以或不可以用去污剂获得。去污剂微团是动态的并经历结构波动，这促进了亚单位的解离并给处理稀释液中的蛋白质带来了困难。MSP纳米双层(纳米圆盘)在结构上更加坚固，与单室脂质体相比，它具有大小和成分不连续的磷脂双层模拟区域以及较高的稳定性和较小的表面积。4℃时，本发明的颗粒的大小和结构至少可稳定一个月。

当载体使膜的一侧与亲水试剂和效应蛋白接触时信号转导元件跨膜发生。本发明的一个具体实施方案采用圆盘以稳定载体颗粒上膜结合形式的药物靶子(如GPCR)、离子通道、受体激酶和磷脂酶。就GPCR而言，我们已经将具有多个跨膜螺旋的蛋白掺入本发明的圆盘中。我们已经成功地掺入了一种模型血清素受体、细菌视紫红质。细菌视紫红质是GPCR的一个模型，它是现今药物开发的靶标。目前，已经克隆了1000多种不同生物的可能的G-蛋白受体，并有许多被称为“孤儿”的受体等待鉴定其天然配体。配体类型包括肽激素、类二十烷酸、脂类、钙、核苷和生物胺。GPCR据认为占目前市售药物的一半以上。无需过多的试验，此领域的一般技术人员能够优化将膜蛋白掺入这类结构的方法。可采用如下所述的化学分析、光谱法和原子力显微法进行这些重建受体的结构特征分析。

采用本发明圆盘中的MSP以溶解、稳定、处理膜蛋白。当本发明的MSP配制在圆盘上时，可用于表面技术(如供高产量筛选的生物传感器芯片)或固相测足技术。我们关于圆盘支架的工作还涉及相关表面的装配。例如，SPR生物传感器在光学元件上采用了大约50nm厚的金箔以使表面胞质基因组与金箔表面的电介质元件(样品)连接。通过基因工程将半胱氨酸构建入MSP中，可以使MSP稳定的双层粘附到表面，用作含蛋白质或其它有关靶标的仿生层(图15A)。采用硫醇以使分子附到金表面的方法是熟知的。半胱氨酸的安置取决于用于半胱氨酸残基安置的模型。以环带模型为基础，半胱氨酸可以沿着两性螺旋轴线的极性侧安置，只要半胱氨酸残基不放在螺旋-螺旋界面上。据信，环带的螺旋-螺旋界面和apo A-IMilano(R173C)的位置对齐，后者形成了二硫键连接的二聚体(Segrest等，1999)。或者在可弯曲或C-封端接头中引入半胱氨酸。理论上，这种结构能够使圆盘的环带形式或尖桩围栏形式与金表面结合。或者，可以在双层区域中掺入硫醇酯。除了SPR，金表面结合的圆盘可用于STM和电化学研究，例如，和膜结合的氧还蛋白(如细胞色素P450及其黄素蛋白)以及离子通道的研究。

用电介质薄膜(如用于通常用作SPR基质的金属膜的二氧化硅)进行测量也可以获得SPR数据。此技术的这一变化称为偶联的胞质基因组波导管谐振(CPWR)(Salamon等，1997a)。因为硅在这些胞质基因组谐振实验中可用作活性表面，制造自身组装双层的步骤可简化为相同于在云母或其它氧化硅表面产生活性表面的步骤。这有着额外的优点，能使SPR实验所用的条件直接与AFM实验所用的条件相比。简单地在用于SPR光谱的金属膜载片上加入硅涂层就可以在我们的SPR装置上容易的进行CPWR技术。

也可以用化学反应基团或亲和性6个组氨酸的尾巴特异性标记带有可利用半胱氨酸基团的MSP，以固定在凝胶矩阵中。带有反应性偶合基团的水凝胶可用于固定蛋白质以供SPR测定。在水凝胶构型中(图15B)，该圆盘可以作为以均匀分散形式包埋在双层膜中蛋白质的载体，其胞内域和胞外域都可供配体结合。我们已经证明，含有组氨酸尾巴的圆盘可结合到用于固定BR的金属螯合物矩阵。这指出了这种圆盘结构的另一种用途，即制造亲和矩阵以供生物分离加工和测定配体的亲和性。本发明的颗粒和技术可用于药物开发、膜蛋白结构/功能相关性以及结构测定。

目前限制膜蛋白结构测定的是制造大量膜蛋白的能力和结晶这些蛋白质的能力。MSP可用作为膜蛋白稳定和表达的运载体。MSP可以替代去污剂溶解膜蛋白以供结晶。实际上，当MSP的脂类结合形式在结构上是稳定和刚性时，通过MSP引入结晶点可以增强结晶。我们已经证明在有和没有外源脂类时都可用MSP1或MSP2来溶解BR。可以用任何一个此领域已知的众多载体在大肠杆菌中表达其它没举例的膜蛋白与MSP区域的融合构建物。用这种方法，可以大量制得含有膜锚定的稳定可溶形式的膜蛋白。在不加磷脂时MSP可溶解BR这一令人振奋的发现使得我们可以在没有去污剂或脂类添加剂时使用人造MSP来稳定膜蛋白。本发明的人造MSP可用于溶解BR和其它的膜蛋白，这包括但不限于细胞色素P450、细胞色素P450还原酶和5-HT-1A受体。

使用膜支架蛋白(MSP)以便为一般的膜蛋白，尤其是G-蛋白偶联受体(GPCR)，提供供进行均一生化测定或结晶的合适环境，一个重要目的是为了得到颗粒均一的制品。我们已描述的膜支架蛋白范围包括全长的人Apo AI及其衍生物至改变的膜支架蛋白，后者包括但不限于氨基末端可溶性区域去除的截短的人Apo AI(t-MSP)、一个或多个蛋白质区段被除去的缺失突变以及掺入组氨酸尾巴的任何上述物质-当在溶液中与磷脂自身组装时主要形成8-10nm的颗粒。然而，对于最初的重建物存在其它尺寸的颗粒。虽然可以用标准排阻分离层析来纯化单一大小等级的颗粒，但宜使靶蛋白、MSP和磷脂的最初重建混合物的粒径分布最小化。8-10nm的颗粒一般由两个MSP、Apo-AI或Apo-AI衍生的蛋白质组成。因此，我们构建了一种膜支架蛋白，其中两个截短的Apo-AI蛋白(称为MSP1)经遗传方法连接形成一种由一条多肽链构成的支架蛋白。图示说明见图5G。

可溶于纳米级磷脂双层的GPCR可以包括A类(视紫质样)GPCR，它结合胺、肽、激素蛋白、视紫质、嗅前列腺素类、核苷样化合物、大麻的化学成分、血小板活化因子、促性腺激素释放激素、促甲状腺激素释放激素和促分泌素、褪黑素和lysosphingolipid和LPA。带有胺配体的GPCR包括但不限于乙酰胆碱或毒蕈碱性受体、肾上腺素受体、多巴胺、组胺、血清素或对羟苯β羟乙胺受体；肽配体包括但不限于血管紧张素、铃蟾肽、缓激肽、过敏毒素、Fmet-leu-phe、白细胞介素-8、趋化因子、胆囊收缩素、内皮缩血管肽、黑皮质激素、神经肽Y、神经加压素、阿片样物质、促生长素抑制素、速激肽、后叶加压素样凝血酶、galanin、活化的蛋白酶、orexin和神经肽FF、adrenomedullin(G10D)、GPR37/B-样肾脏髓质素、趋化因子受体样和神经调节肽U。

其它特异性GPCR的配体包括激素蛋白、视紫质、嗅的、前列腺素类、核苷样物质(腺苷、purinoceptor)、大麻的化学成分、血小板活化因子、促性腺激素释放激素、促甲状腺激素释放激素和促分泌素、褪黑素和溶血鞘脂和LPA。B类血清素样GPCR其中包括但不限于那些结合降钙素、促肾上腺皮质激素释放因子、胃抑制肽、胰高血糖素、生长激素释放激素、甲状旁腺激素、PACAP、血清素、肠血管活性多肽、利尿激素、EMR1和latrophilin的物质。C类metabotropic谷氨酸受体其中包括那些结合metabotropic谷氨酸、胞外钙传感知或GABA-B的物质。配体仍然未知的“孤儿”受体也是本发明试验的潜在靶标。

在本发明的试验中(这种测定证明了特定配体的结合或用于鉴定配体与MSP支持的GPCR结合的抑制剂或竞争剂)，可以在配体分子中掺入各种标记(比如放射性同位素，如³H、¹⁴C、³⁵S、³²P)或者可将可检测化合物结合于配体分子，只要与同类受体的结合没有因标记而明显下降。标记可以包括但不限于¹²⁵I、¹³¹I、荧光化合物、发光化合物等。

融合的MSP之间的接头序列必须的特性是弹性和溶解性，这样融合蛋白就能以类似于两种分离的MSP的方式装配进颗粒。由重复的Gly-Gly-Gly-Ser/thr-(SEQ ID NO：46)组成的接头序列具有这些特性。还需要使接头的长度最小化。我们用最小的接头-GT-构建了一融合物，如下所示，此接头相当于Kpn I的共有DNA限制性位点。Kpn I位点提供了一种简便的插入任何所需接头序列的方法，即用Kpn I限制性酶切并插入编码所需接头的双链合成DNA(Robinson等，1998)。我们还构建了带接头序列-GTGGGSGGGT-(SEQ ID NO：15)的一种融合结构。然而，带有最小接头的MSP2装配进颗粒非常类似于含有两个MSP1蛋白的颗粒。

MSP2支架蛋白的整个的氨基酸和核酸序列显示在表7和8中；也可以参见SEQID NO：16和SEQ ID NO：17。使MSP2融合蛋白在大肠杆菌中表达并用与单个MSP基本一样的方法纯化至均一。MSP2蛋白作为有效的支架蛋白，在去除增溶去污剂时可与磷脂自身组装。寻找样品不均一性的点，图13显示了天然梯度聚丙烯酰胺凝胶的光密度分析轨迹，其各个峰都标上了以埃表示的平均粒径。明确的证据是，尤其是与名义上10nm颗粒相符的脂类/二聚体比率为200时，MSP2蛋白提供了好得多的均匀分散性。

重要的是，圆盘的整体稳定性，如通过化学诱导的去折叠和色氨酸残基暴露于溶剂所监测的那样，没有因均匀的膜支架蛋白质的融合而改变，如图14所示。

在特性分析圆盘结构和结合的蛋白质中所用的一项重要技术是扫描探针显微术(SPM)。SPM是在扫描隧道显微镜(STM)中首先采用的扫描原理的任何显微镜总括性术语，但这些显微镜术可能有非常大的不同，故而最好按照它们的指导性中心原理进行讨论。这种技术被用于分析生物膜和它们的结合蛋白、双层结构和掺入了膜蛋白的表面。SPM将所有三个空间方向上的独立活动(扫描)与能够检测该表面某些特征的检测系统(探测)相联合。可以探测的各种表面特性(电导率、表面张力、压缩性、电容、磁性、荧光发射)证明了可以获得丰富的信息。原子力显微术出色的z-轴灵敏度使得对结合于rHDL均一层的蛋白质的存在更加容易检测，正如我们展示那样已充分鉴定了固定在MSP-支持的纳米圆盘中的整合和锚定膜蛋白质(Bayburt等，1998)。可能与AFM有关的精确高度测量法的用处的其它例子，是我们的rHDL颗粒高度的直接定量测定(Carlson等，1997)，以及通过调节AFM探针施加在各种纳米圆盘聚集体上的力而获得的膜蛋白高度测量法(Bayburt等，2000)。MSP形成的圆盘的表面结合使得可以利用人apo A-I蛋白和其改进的变体直接检测通过SPM掺入表面上的磷脂双层的单个膜蛋白质的生物物理学特性。将圆盘附着于利用原子能的导电平面(如金)的能力，是扫描隧道显微术(STM)所必需的。理论上，可利用通过氧化还原一活性系统的隧道探测酶的功能状态(Friis等，1999；Mukhopadhyay等，2000)。这两种技术提供了互相补充的数据并可一齐用来创造一幅双层/溶液界面发生的活动的尽可能完整的图画。将圆盘放置到金表面的能力还使表面胞质基因组共振(SPR)术得到应用。通过SPR可以检测并定量分析膜蛋插入如人造脂双层中的情况，或它们与表面结合蛋白的相互反应。

圆盘稳定性的测量和各类圆盘中大小分布的测定是评价所产生结构所必需的。凝胶过滤和天然凝胶电泳可用来分离和定量分析不同大小的圆盘类别。光谱法可用来定量分析基因工程构建的MSP的二级结构(CD)和脂结合(荧光)特性，包括基于热和化学变性的稳定性。用传统方法定量分析圆盘中成分的组成和化学计量(Jonas，1986)。

AFM可用来对所制造的该系统的脂类和蛋白质成分的结构组织提供分子分辨率数据。这一技术可以在空气、真空和水溶液下以及非水溶液下使用。后一能力使其成为生物科学中最重要的扫描探针技术。AFM是用途很广的装置，它能够获得几种不同模式中力数据(如接触力、敲击力、相力和侧力)的图象和其它数据(Sarid，1994)。所有这些扫描模式在Digital Instruments Multimode ScanningProbe Microscope(Digital Instruments，Plainview，N.Y.)上都可得到，且它们已经成功的用于描绘生物缓冲液下的rHDL层和rHDL层相关蛋白质。这种装置还可用于STM和电化学模式以研究金相关结构和掺入的氧还蛋白的特性。

用如本文所用，膜支架蛋白是可以将磷脂和磷脂混合物自身组装进纳米级膜双层的蛋白质或多肽。这些结构的一个亚类是圆盘状的并被称为纳米圆盘(nanodiscs)或纳米圆盘(nanodisks)。疏水蛋白质(如膜蛋白)或膜片段可以与这些颗粒结合，这样疏水蛋白质或膜片段就可被有效溶解在稳定的结构中，这种结构保持了该蛋白质的酶活性或配体结合功能。这些颗粒在溶液中是稳定的，或者它们可固定到表面，优点是以相同取向固定到该表面。如本文所用，含有MSP的纳米颗粒(有或没有其它的疏水或部分疏水的蛋白质)的直径可以大约为5-500nm，较好约5-100nm，或约5-50nm。直径约5-15nm的纳米颗粒(圆盘)特别有用。

我们经显示MSP1和MSP2可与细菌视紫红质装配。从最初的重建混合物开始，在不加入磷脂时，当与MSP1(图11)或MSP2(图12)形成颗粒时观察到两种含有细菌视紫红质物质。我们发现，MSP是细菌视紫红质溶解形成这些物质所绝对必需的，因为形成的混合物中没有MSP会导致大的非特异性的细菌视紫红质聚集体，它在凝胶过滤柱的空体积处洗脱出来。图11中15分钟的小峰代表BR聚集体。在这些实验中，显示，当MSP存在时绝大多数细菌视紫红质呈溶解状。所观察到两种大小的颗粒与此结构中假定的采用替换构象的“绞链区”完全相符。通过这些工作，据及这种可屈曲的绞链区是由与人Apo-AI的螺旋5和6相对应的螺旋构成的，参见MSP1。因此，在直径为9.8nm的含细菌视紫红质颗粒中，蛋白质结构的这些可屈曲性部分看来与该结构的疏水核心结合的，而在直径为7.6nm的颗粒中，这种绞链区不和疏水核心结合，因此形成了一种直径较小的颗粒。

对亲代Apo-AI蛋白作进一步修饰可产生更有效和稳定的膜支架蛋白。例如，为增加BR/MSP结构的均一性以及为说明该蛋白质结构上述可屈曲“绞链”区的作用，我们删除了此绞链区产生两种新的膜支架蛋白。第一种情况下，假定从带组氨酸尾巴的MSP1结构中删除绞链区4和5而产生称为MSP1D5-6的构建物。在第二个实验中，假定删除螺旋5和6产生了称为MSP1D4-5的物质。我们在大肠杆菌中过度表达这些蛋白质，在lac-调节的构建物中用异丙基-硫代-b-D-吡喃半乳糖苷诱导表达后这些蛋白质即以高水平表达。

另一种避免形成多种大小种类颗粒的方法是基因工程法构建MSP构建物，其绞链区螺旋用对颗粒疏水核心亲和力更高的螺旋取代。这种情况下，更高亲和力的相互反应不利于形成其中绞链区已解离的较小物质。在这一实验流程中，我们选择用对应于天然序列(对应于螺旋1和2)的蛋白质序列替代绞链区(螺旋5和6)。在另一表现中，我们选择了编码膜支架蛋白的DNA构建物，其中采用与假定的螺旋区域3和4相对应的蛋白质序列来替代此绞链区，其目的是为了通过与细菌视紫红质和脂类装配形成单一尺寸的颗粒。

存在于亲代人Apo-AI蛋白中的所谓“半重复”单元也可以在MSP装配体中引起构象不均一性。例如，在尖桩围栏模型中，已经预见到这些螺旋采取了与双层平面相平行的构象，在与颗粒疏水核心以及蛋白质序列的其它区域的相互反应中不发挥主要作用。在“环带模型”中，这些短的螺旋状重复可能引起区段的移动，这使得MSP采取不同的构象。换句话说，MSP中结构元件的类型数目最小化可能是最需要的膜支架蛋白概念的例子。因此，为进一步优化膜支架蛋白的结构改进它们溶解膜整合蛋白靶标的能力，我们可以构建将删除两个半重复单位的衍生序列以产生简化的MSP结构。

可用此领域已知的方法制造多克隆或单克隆抗体，较好的是单克隆抗体，尤其是和本发明的MSP反应的单克隆抗体。参见，例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，冷泉港实验室；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，第二版，学术出版社，纽约；以及Ausubel等(1993)Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，纽约，纽约州。

克隆，DNA分离、扩增和纯化，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶促反应等的标准技术，以及各种分离技术是技术人员已知的，通常为此领域的技术人员使用。许多标准技术描述见Sambrook等(1989)Molecular Cloning，第二版，冷泉港实验室，Plainview，纽约；Maniatis等(1982)Molecular Cloning，Plainview，纽约；Wu(编)(1993)Meth.Enzymol.218，第I部分；Wu(编)(1979)Meth.Enzymol.68；Wu等(编)(1993)Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编)Meth.Enzymol.65；Miller(编)(1972)Experiments in MolecularGenetics，冷泉港实验室，冷泉港，纽约；Old和Primrose(1981)Principles ofGene Manipulation，加州大学出版社，Berkeley；Schleif和Wensink(1982)Practical Methods in Molecular Biology；Glover(编)(1985)DNA Cloning第I和II卷，IRL出版社，Oxford，UK；Hames和Higgins(编)(1985)Nucleic AcidHybridization，IRL出版社，Oxford，UK；Setlow和Hollaender(1979)GeneticEngineering：Principles and Methods，第1-4卷，Plenum出版社，纽约；以及Ausubel等(1992)Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，纽约，纽约州。这里所用的缩写和术语在此领域是标准的且通常用于如上所述的专业期刊中。

在此并入本申请中提到的所有参考资料以供参考，其引用程度与本发明的公开一致。

本文提供的描述并不是要限制本申请权利要求的本发明的范围。本领域熟练技术人员可想到的本发明所例举的物品和方法的变化应被认为在本发明的范围之内。

实施例

实施例1.构建表达MSP的重组DNA分子

将下面给出的人proapoAI编码序列插入pET-28的Nco I和Hind III位点之间(Novagen，Madison，WI)。起始和终止密码子以黑体表示。克隆所用的限制性内切酶位点用下划线表示。

表1.ProApoAI编码序列(SEQ ID NO：1)。克隆所用的限制性位点用下划线表示，转录起始和终止密码子为黑体。

CCATGGCCCATTTCTGGCAGCAAGATGAACCCCCCCAGAGCCCCTGGGATCGAGT

GAAGGACCTGGCCACTGTGTACGTGGATGTGCTCAAAGACAGCGGCAGAGACTAT

GTGTCCCAGTTTGAAGGCTCCGCCTTGGGAAAACAGCTAAACCTAAAGCTCCTTGA

CAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCT

GTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAA

GAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGAC

GACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAG

CCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAA

GAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTG

GACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTG

GCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTAC

CACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCG

CTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCT

TCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTT-3′

表2.ProapoaI氨基酸序列(SEQ ID NO：2)

MAHFWQQDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLD

NWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDF

QKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDAL

RTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQ

GLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

构建MSP1编码序列如下进行。设计引物通过聚合酶链式反应(PCR)诱变产生编码MSP1的DNA，该截短的蛋白质缺少proApoAI的N-末端区域(Higuchi等，1988)。引物1(SEQ ID NO：3)(5’-TATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACT-3’)为MSP1的纯化和处理引入了N-末端6个组氨酸的尾巴，并为除去该组氨酸尾巴引入了Xa因子切切割点。Xa因子在将R引入蛋白质序列IEGR后切割。引物2(SEQ IDNO：4)(5’-GCAAGCTTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTT-3’)用作反向引物。

表3.带有组氨酸尾巴的MSP1编码序列(SEQ ID NO：5)。克隆所用的限制性位点用下划线表示，转录起始和终止密码子为黑体。

TATA CCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGAC

AACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGT

GACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGA

GATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGAC

TTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCG

CTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAG

AAGTTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCCCATGTGGAC

GCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCC

GCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCAC

GCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAACCCGCGCTC

GAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCC

TGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表4.带组氨酸尾巴的MSP1氨基酸序列(SEQ ID NO：6)

MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMS

KDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSP

LGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATE

HLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKLNTQ

为产生没有N-末端组氨酸尾巴的MSP1，用引物1a：5’-TACCATGGCAAAGCTCCTTGACAACTG-3’(SEQ ID NO：7)替代引物1产生SEQ ID NO：8中提供的序列。

表5.无组氨酸尾巴的MSP1 DNA序列(SEQ ID NO：8)。克隆所用的限制性位点用下划线表示，转录起始和终止密码子为黑体。TA CCATGGCAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGTTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAACCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表6.无组氨酸尾巴的MSP1氨基酸序列(SEQ ID NO：9)

MAKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKV

QPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRA

RAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAK

PALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

产生带有串联重复的MSP(MSP2)的方法如下所述进行。用以下引物来产生MSP2(参见图6A-6B)：引物3(SEQ ID NO：10)：5’-TACCATGGCAAAGCTCCTTGACAACTG-3’

引物3a(SEQ ID NO：11)：

5′-TATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACT-3′

引物4(SEQ ID NO：12)：

5′-TAAGAAGCTCAACACCCAGGGTACCGGTGGAGGTAGTGGAGGTGGTACCCTA-3′

引物5(SEQ ID NO：13)：

5′-CAGGGTACCGGTGGAGGTAGTGGAGGTGGTACCCTAAAGCTCCTTGACAA-3′

引物6(SEQ ID NO：14)：

5′-GCAAGCTTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTT-3′

在第一次PCR中，用引物2(或N-末端组氨酸尾巴的引物2a)和引物4在MSP基因的3’末端加入接头(编码氨基酸序列GTGGGSGGGT；SEQ ID NO：15)产生MSP-A。在第二次PCR中，在MSP基因的5’末端加入该接头产生了MSP-B。用KpnI处理MSP-A和MSP-B随后连接产生了以下构建物，一个有接头而一个没有接头。KpnI位点提供了通过KpnI限制性切开和用编码所需接头的双链合成性DNA连接而插入任何所需的接头序列的简便方法。参见图7A-7B。

表7.MSP2(有组氨酸尾巴，没有长接头)的DNA序列(SEQ ID NO：16).转录起始和终止密码子为黑体，克隆所用的限制性内切酶识别位点用下划线表示。TATA CCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGGGTACCCTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表8.MSP2(有组氨酸尾巴，没有长接头)的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTWEFWDNLEKETEGLRQEMS/KDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQGTLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

表9.MSP2(有组氨酸尾巴，有长接头)的DNA序列(SEQ ID NO：18).转录起始和终止密码子为黑体，克隆所用的限制性内切酶位点用下划线表示。TA CCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGGGTACCGGTGGAGGTAGTGGAGGTGGTACCCTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGCTGAGCCCACTGGGCGAGGAGATGCGCGACCGCGCGCGCGCCCATGTGGACGCGCTGCGCACGCATCTGGCCCCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAGCCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表10.MSP2(有组氨酸尾巴，有长接头黑体)的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQGTGGGSGGGTLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

为删除绞链区，采用以下PCR引物和MSP1编码序列的Sac I和Hind III片段作为模板，通过构建MSP1的C-末端部分以使螺旋4和5缺失。

引物A(SEQ ID N0：20)：

5’-TGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCCTACAGCGACGAGCT-3’/

引物B(SEQ ID NO：21)：

5′-GCAAGCTTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTT-3′.

用SacI和HindIII消化扩增产物并连接入pLitmus 28以便测序。然后将pET28载体中SacI+HindIII处理的带组氨酸尾巴MSP1构建物与上述片段连接产生了MSP1D4-5。

表11.MSP1D4-5(螺旋4和5被删除)的DNA序列(SEQ ID NO：22)。转录起始和终止密码子为黑体；克隆所用的限制性内切酶识别位点用下划线表示。TATA CCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTctaccgccagaaggtggagcCCTACAGCGACGAGCTGCGCCAGCGCTTGGCCGCGCGCCTTGAGGCTCTCAAGGAGAACGGCGGCGCCAGACTGGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAACCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表12.MSP1D4-5(螺旋4和5被删除)的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

以类似的方法进行螺旋5和6的删除，但两个独立的PCR步骤在第一个反应中采用了以下引物(反应1，引物C：5’-CAGAATTCGCTAGCCGAGTACCACGCCAA-3’，SEQID NO：24；和引物D：5’-GCAAGCTTATTACTGGGTGTTGAGCTTCTT-3’，SEQ ID NO：25)，在第二个反应中采用以下引物(反应2，引物E：5’-ATACCATGGGCCATCATCATCATCATCATA-3’，SEQ ID NO：26；以及引物F：5’-CAGAATTCGCTAGCCTGGCGCTCAACTTCTCTT-3’，SEQ ID NO：27)。

PCR产物编码都缺少螺旋5和6的MSP的N-和C-末端部分，且各含有一个NheI限制性位点。用NheI、NcoI和HindIII消化PCR产物后，将片段连接入NcoI+HindIII处理的pET28以产生缺失螺旋5和6的MSP1D5-6的DNA序列。参见图9A-9B。

表13.MSP1D5-6(螺旋5和6被删除)的DNA序列(SEQ ID NO：28)。转录起始和终止密码子为黑体；克隆所用的限制性内切酶识别位点用下划线表示。TATA CCATGGGCCATCATCATCATCATCATATAGAAGGAAGACTAAAGCTCCTTGACAACTGGGACAGCGTGACCTCCACCTTCAGCAAGCTGCGCGAACAGCTCGGCCCTGTGACCCAGGAGTTCTGGGATAACCTGGAAAAGGAGACAGAGGGCCTGAGGCAGGAGATGAGCAAGGATCTGGAGGAGGTGAAGGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAGTGGCAGGAGGAGATGGAGCTCTACCGCCAGAAGGTGGAGCCGCTGCGCGCAGAGCTCCAAGAGGGCGCGCGCCAGAAGCTGCACGAGCTGCAAGAGAAGTTGAGCGCCAGGCTAGCCGAGTACCACGCCAAGGCCACCGAGCATCTGAGCACGCTCAGCGAGAAGGCCAAACCCGCGCTCGAGGACCTCCGCCAAGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAGAGCTTCAAGGTCAGCTTCCTGAGCGCTCTCGAGGAGTACACTAAGAAGCTCAACACCCAGTAAT AAGCTTGC

表14.MSP1D5-6(螺旋5和6被删除)的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

实施例2.构建合成的MSP基团

用下列重叠性合成寡核苷酸(用PCR填满)制备了MSP1的合成基因。该密码子的用法已被优化以在大肠杆菌中表达，并已经引入限制性位点以进一步基因操作该基因。

合成的核苷taps 1a(SEQ ID NO：30)

TACCATGGGTCATCATCATCATCATCACATTGAGGGACGTCTGAAGCTGTT

GGACAATTGGGACTCTGTTACGTCTA

合成的核苷taps 2a(SEQ ID NO：31)

AGGAATTCTGGGACAACCTGGAAAAAGAAACCGAGGGACTGCGTCAGGA

AATGTCCAAAGAT

合成的核苷taps 3a(SEQ ID NO：32)

TATCTAGATGACTTTCAGAAAAAATGGCAGGAAGAGATGGAATTATATCG

TCAA

合成的核苷taps 4a(SEQ ID NO：33)

ATGAGCTCCAAGAGAAGCTCAGCCCATTAGGCGAAGAAATGCGCGATCGC

GCCCGTGCACATGTTGATGCACT

合成的核苷taps 5a(SEQ ID NO：34)

GTCTCGAGGCGCTGAAAGAAAACGGGGGTGCCCGCTTGGCTGAGTACCAC

GCGAAAGCGACAGAA

合成的核苷taps 6a(SEQ ID NO：35)

GAAGATCTACGCCAGGGCTTATTGCCTGTTCTTGAGAGCTTTAAAGTCAGT

TTTCT

合成的核苷taps 1b(SEQ ID NO：36)

CAGAATTCCTGCGTCACGGGGCCCAGTTGTTCGCGAAGTTTACTGAAGGT

AGACGTAACAG

合成的核苷taps 2b(SEQ ID NO：37)

TCATCTAGATATGGCTGAACCTTGGCCTTCACCTCTTCTAAATCTTTGGAC

ATTT

合成的核苷taps 3b(SEQ ID NO：38)

TGGAGCTCATGGAGTTTTTGGCGTGCCCCCTCTTGCAGTTCCGCACGCAGC

GGTTCCACCTTTTGACGATATAATTCCAT

合成的核苷taps 4b(SEQ ID NO：39)

GCCTCGAGACGTGCGGCCAAACGCTGGCGAAGTTCATCCGAATACGGCGC

CAAATGAGTCCGGAGTGCATCAACAT

合成的核苷taps 5b(SEQ ID NO：40)

GTAGATCTTCCAGCGCCGGTTTCGCTTTTTCGCTCAAGGTGCTCAGGTGTT

CTGTCGCTTT

合成的核苷taps 6b(SEQ ID NO：41)

CCAAGCTTATTACTGGGTATTCAGCTTTTTAGTATATTCTTCCAGAGCTGA

CAGAAAACTGACTTT

表15.MSP1的完整的合成基因序列(SEQ ID NO：42)。克隆所用的限制性位点用下划线表示，转录起始和终止密码子为黑体。A CCATGGGTCATCATCATCATCATCACATTGAGGGACGTCTGAAGCTGTTGGACAATTGGGACTCTGTTACGTCTACCTTCAGTAAACTTCGCGAACAACTGGGCCCCGTGACGCAGGAATTCTGGGACAACCTGGAAAAAGAAACCGAGGGACTGCGTCAGGAAATGTCCAAAGATTTAGAAGAGGTGAAGGCCAAGGTTCAGCCATATCTAGATGACTTTCAGAAAAAATGGCAGGAAGAGATGGAATTATATCGTCAAAAGGTGGAACCGCTGCGTGCGGAACTGCAAGAGGGGGCACGCCAAAAACTCCATGAGCTCCAAGAGAAGCTCAGCCCATTAGGCGAAGAAATGCGCGATCGCGCCCGTGCACATGTTGATGCACTCCGGACTCATTTGGCGCCGTATTCGGATGAACTTCGCCAGCGTTTGGCCGCACGTCTCGAGGCGCTGAAAGAAAACGGGGGTGCCCGCTTGGCTGAGTACCACGCGAAAGCGACAGAACACCTGAGCACCTTGAGCGAAAAAGCGAAACCGGCGCTGGAAGATCTACGCCAGGGCTTATTGCCTGTTCTTGAGAGCTTTAAAGTCAGTTTTCTGTCAGCTCTGGAAGAATATACTAAAAAGCTGAATACCCAGTAAT AAGCTTGG

下面是MSPp多肽的氨基酸序列，其中半重复已删除：

表16.第一个半重复已删除的MSP(MSP1delta1)(SEQ ID NO：43)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

表17.第二个半重复已删除的MSP(MSP1delta2)(SEQ ID NO：44)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

表18.第一个半重复已删除的MSP串联重复(MSP2delta1)(SEQ ID NO：44)MGHHHHHHIEGRLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQGTLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ

其它容易制造的构建物包括上述改变，即与以下任一联合的MSP1或MSP2：绞链缺失、绞链替代、半重复缺失、组氨酸尾巴、MSP2的不同接头。

实施例3.重组MSP的表达

为表达MSP蛋白，在pET28表达载体的NcoI和HindIII位点之间插入其核酸构建物并转化入大肠杆菌BL21(DE3)。在卡那霉素选择性LB平板上培养转化体。菌落用来接种5ml起始培养物，培养在含有30μg/ml卡那霉素的LB肉汤中。为了过度表达，在100倍体积含有30μg/ml卡那霉素的LB肉汤中加入1体积过夜培养物以接种培养物，并使其生长在37℃的摇瓶中。当600nm的光密度达到0.6-0.8时，加入异丙基b-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至浓度1mM以诱导表达，使细胞再生长3-4小时然后离心收集。将细胞沉淀速冻并保藏于-80℃。

实施例4.重组MSP的纯化

如下进行带组氨酸尾巴MSP的纯化。将从l升表达培养物获得的冷冻细胞沉淀重悬浮在25ml含1mM苯基甲基磺酰基氟化物、pH 7.5、20mM的Tris HCl中。加入Triton X-100(叔-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，加入的Triton X-100是用10％(w/v)的原液稀释在蒸馏水中至最终浓度1％。在冰上用Branson探头超声波仪以50％能率循环超声破碎重悬浮细胞，功率设定为5，每分钟4个循环，超声5分钟。将所得裂解物在超速离心机中用Bechman Ti 45转头30,000rpm离心30分钟。通过0.22mm尼龙注射器滤器过滤所得上清液。用水配制的4M NaCl原液将盐浓度调至0.5M，加到5ml Hi-Trap镍负载柱上(Pharmacia，Piscataway，NJ)。

对于6H-MSP1，用20ml含有1％ Triton X-100的缓冲液(10mM Tris pH8，0.5MNaCl)，然后用20ml缓冲液+50mM胆酸钠，接着用20ml缓冲液和20ml含100mM咪唑的缓冲液洗涤此柱。用15ml含0.5M咪唑的缓冲液洗脱带His-尾的多肽。

对于6H-MSP2，用20ml含有1％ Triton X-100的缓冲液(10mM Tris pH8，0.5MNaCl)；20ml缓冲液+50mM胆酸钠；20ml缓冲液；20ml含35mM的咪唑的缓冲液洗涤。然后用15ml含0.5M咪唑的缓冲液洗脱带His-尾的多肽，并用10,000MW的截留值的纤维素透析膜以10mM Tris pH8，0.15M NaCl透析纯化的蛋白质。

实施例6.含有MSP的纳米级颗粒的制造

为用脂类重建本发明的MSP蛋白，在使用10,000MW截留值膜的加压超滤装置(Amicon)中浓缩纯化的MSP至约2-6mg蛋白质/ml。用bicinchonic acid试验(Pierce Chemical，Rockford，IL)或是采用理论吸收系数作A280测定确定蛋白质浓度。在氮气气流下干燥溶于氯仿储备液的磷脂(本例中是二棕榈酰磷脂酰胆碱，然而也可以使用不同的磷脂酰胆碱和磷脂酰胆碱与其它脂类的混合物)然后真空过夜。进行磷酸分析以确定氯仿储备溶液的浓度。将干燥的脂类薄膜重悬浮于含0.15M NaCl和50mM胆酸钠的10mM Tris HCl pH8.0或pH7.5缓冲液中以使最终脂类浓度为25mM。将悬浮液涡旋搅拌并加热至50℃得到澄清溶液。在MSP溶液(2-6mg/ml蛋白质)中加入磷脂溶液以使MSP1∶脂类的摩尔比为2∶200，MSP2∶脂类的摩尔比为1∶200。37℃温育混合物过夜，然后用1000体积没有胆酸盐的缓冲液透析2-3天，需要更换4次缓冲液。

实施例7.外周膜蛋白的掺入

组织因子(TF)是外周膜蛋白的代表。为证明MSP技术对外周膜蛋白的价值，将重组人TF掺入MSP支持的纳米圆盘。此重组蛋白质具有胞外域、膜锚定结构域和截短的胞质域。这种截断通过除去易受细菌酶蛋白水解的此蛋白质的C-末端部分提高了此蛋白质的均一性。这种修饰不会影响TF活性。对此蛋白质的其它修饰包括N-末端运输肽和HPC4表位标记。运输肽可将表达的蛋白质导向重组体大肠杆菌宿主细胞的膜间腔隙，肽序列在此腔隙中被剪切。HPC4表位使得可用Ca²⁺依赖性抗体作亲和纯化(Rezaie等，1992)且不会影响TF活性。

用溶于10mM Tris Cl、150mM NaCl pH 8.0的50mM胆酸盐溶解含有80％磷脂酰胆碱和20％磷脂酰丝氨酸的25mM脂类混合物。将TF、MSP1和脂类(比例为1∶10∶1000)混合37℃温育过夜。然后用含10mM Tris Cl、150mM NaCl pH 8.0的缓冲液(没有胆酸盐)37℃透析此样品2小时(10,000道尔顿分子量的截留膜)。4℃再继续透折6小时每隔2小时更换透析液，然后用YM-10离心浓缩机将大约1ml样品浓缩至＜250μl，并将其注射到Pharmacia 10/30 Superdex 200HR凝胶过滤柱中。用上述一样的缓冲液(没有胆酸盐)以每分钟0.5ml流速洗脱样品。将层析所得诸组分在8-25％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶上跑电泳以确定表观分子量大小，然后检测凝血活性。展示被掺入MSP1纳米圆盘过量群体的TF的洗脱结果的层析图见图16A-16B。

通过与人血清的凝固试验测定了几个圆盘组分中TF的活性。活性见于组分25-28中以凝固时间的倒数检测。组分25的活性最高，为40hr^-1，然后降至组分28的30hr^-1。这可以由大小层析图预测，因为由于MSP支持的双层中TF的掺入，纳米圆盘峰的前沿有较大的有效质量。因此这一试验证明了TF是以活性构象掺入纳米圆盘的，且纳米圆盘的膜环境精确模拟了天然膜系统。

细胞色素b5是一种膜锚定的血红素蛋白，它具有一个穿过膜双层的膜锚定结构域。从其天然膜溶解的细胞色素b5在没有去污剂时以大聚集体的形式存在，在天然聚丙烯酰胺凝胶电泳上看起来更像是污斑而不是分离的条带。通过自身组装过程形成纳米圆盘，其中将细胞色素b5加到MSP和磷脂的制剂中，导致细胞色素b5掺入圆盘状结构中。参见图17B泳道4，通过对右栏中与纳米圆盘相对应的条带进行强烈血红素染色验证了这一点。图17的泳道5和6显示了用阴离子交换层析法分离的含有细胞色素b5的纳米圆盘。从阴离子交换柱上洗脱的两个峰接近310mM NaCl和接近370mM NaCl。在310mM NaCl附近洗提得到了单独的圆盘，在450和700mM NaCl之间洗提得到了单独的细胞色素b5。这些数据证明，采用MSP技术细胞色素b5成功地溶解了，并说明可以通过层析将不需要的聚集物质去除而分离并纯化含有细胞色素b5的圆盘复合物。纯化物质的血红素生色团的光吸收特性显示血红素活性位点在天然构象中。

将20μl apo A-I(10mg/ml)、6.6μl细胞色素b5(0.5mM)和50μl鸡蛋磷脂酰胆碱/胆酸钠(11.2mg/ml蛋PC、6.2mg/ml胆酸钠)混合，4℃培育过夜，然后透析除去胆酸盐，这样也可以形成纳米圆盘。纯化是用经25mM Tris Cl，pH 8.0平衡的Pharmacia MonoQ FPLC阴离子交换柱完成的。以0.5ml/min流速从0-1M NaCl进行20分钟线性梯度。

实施例8.包埋膜蛋白的掺入

兔肝脏微粒体的细胞色素P450 2B4、人肝脏微粒体的细胞色素P450 3A4以及昆虫微粒体的细胞色素P450 6B1是包埋膜蛋白的代表。

细胞色素P450 2B4系用苯巴比妥诱导后由兔肝脏微粒体分离获得。2B4纳米圆盘的形成如下。用去污剂透析法将细胞色素P450 2B4重建入圆盘中。缓冲剂由10mM Tris-HCl pH8.0、0.1M NaCl、10％(v/v)甘油组成。将apo A-I、胆酸盐和磷脂(摩尔比例为1∶220∶110)的混合物37。℃温育8小时，然后加入P450(apo A-I：P450的摩尔比为1∶0.5)室温培育过夜。在室温下用10,000 MW截留值slide-a-lyzer(Pierce Chemical公司，Rockford，IL)将混合物透析两小时，然后更换缓冲液并在4℃继续透析。发现在这些条件下可以回收82％的P450成分。透析后，在室温下将混合物注射入经重建缓冲液平衡的Superdex 200 HR10/30凝胶过滤柱中(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，流速为0.25ml/min，收集到0.5ml组分。在8-25％梯度的天然凝胶上用天然聚丙烯酰胺凝胶电泳测定诸组分，并用Phastgel系统(Pharmacia，Uppsala，Sweden)进行考马斯染色。

人细胞色素P450 3A4(通常来自肝脏微粒体)已经被克隆、在大肠杆菌中表达并纯化、掺入MSP支持的双层纳米圆盘中。将10纳摩MSP2、1毫摩脂类、5纳摩细胞色素P450 3A4蛋白和2毫摩胆汁酸一起37℃温育2小时。然后在10KSlide-a-lyzer透析盒(Pierce Chemical公司，Rockford，IL)中透析温育的混合物。透析是用10mM磷酸钾(pH7.4)、150mM NaCl缓冲液进行的。将样品在37℃透析6小时，然后更换缓冲液并继续在4℃透析，期间更换两次缓冲液，每12小时一次。然后在经透析缓冲液平衡的Superdex 200 HR10/30柱(Pharmacia，Uppsala，SE)上在室温下以0.5ml/min流速分离样品。

四幅图(图18-20)显示了细胞色素P450 3A4的保留时间(以417nm的吸收观察)和同一时间内(约24分钟)纳米圆盘(在280nm处检测，此处MSP和3A4蛋白都有吸收)从柱上的洗脱。洗脱时间与计算出的圆盘蛋白质复合物的保留时间也是密切关联的。支持这一结论的进一步的证据是天然聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，它直接测量了被洗脱颗粒的大小(图21)。

细胞色素P450 6B1是另一种模型包埋膜蛋白。已经从Papilio polyxenes这种黑色燕尾中分离得到这种细胞色素。专门用能产生对大多数生物都有光毒性的植物代谢物furanocoumarin的植物喂养这些蝴蝶。细胞色素6B1可催化furanocoumarin脱毒。

为显示本发明的MSP法的新用途，我们证明含有膜蛋白所有组成成分的分离的膜可用作原料以将膜蛋白掺入纳米圆盘。一个重要的说明性实施方案采用已广泛用作异源表达系统的普通昆虫细胞(Sf9)-杆状病毒表达系统。因此，我们使用了以含有过度表达的昆虫CYP 6B1的微粒体制品和过度表达的昆虫NADPH细胞色素P450还原酶共转染的昆虫细胞系，。在这些实验中，我们不仅证明了MSP纳米圆盘可用来将另一种细胞色素P450细胞掺入可溶性均匀分散的颗粒中，还证明这种P450的来源可以简化为含该蛋白质的整个膜。

采用标准杆状病毒表达系统获得了含有过度表达的昆虫细胞色素6B1和昆虫NADPH P450还原酶的微粒体制品。根据该微粒体制品中所含的脂类含量，用MSP技术以110∶1∶220的脂类∶MSP1∶胆酸盐比例将微粒体蛋白质装配进入纳米颗粒圆盘。用胆酸盐去污剂溶解微粒体样品并与MSP1混合。将样品4℃培育2小时。通过透析或疏水珠除去去污剂。在这一实验中，加入过量(每1ml圆盘混合物加0.25g)BIOBEADS(疏水珠，BioRad，Hercules，CA)并4℃培育2小时以除去去污剂。从珠子上取下样品并采用使用Ni²⁺树脂的分批纯化法分离获得带His₆-尾的MSP。然后用Superdex分级柱层析分离MSP圆盘(图22)。在带His₆-尾的圆盘中掺入P450，然后用CO示差光谱分析用镍亲和柱纯化并用分级柱纯化的组分(图24)。进行SDS-PAGE以验证细胞色素P450 6B1掺入了圆盘(图23)。

细胞色素P450和还原酶的内源(天然)比例约为10-20。为在重建入圆盘后得到细胞色素P450 6B1的活性，宜在重建的混合物中加入过量的还原酶，这样P450分子和还原酶分子都分散进入单个圆盘中。已经成功证明了外源加入的还原酶补充了此微粒体制剂的不足。

采用了用微粒体制剂制造圆盘的方法，其中有一处修改。用胆酸盐溶解微粒体制剂后加入外源兔还原酶，然后加入MSP1。然后进行同样的圆盘装配和纯化过程。用Superdex分级柱分离样品，280nm处的吸收表明了MSP1的存在，420nm和456nm处的吸收表明存在三价铁物质，456nm处的吸收还表明存在还原酶。制作了456对420nm的比例图；显示层析谱上的位置，其中456nm处的吸收超过与CYP 6B1有关的吸收，因此可归因子还原酶的吸收。保留时间反映存在含细胞色素P450 6B1和还原酶的10nm颗粒(图26)。

含有纯化的蛋白质、膜片段或破裂膜的MSP支持的纳米圆盘可用于高产量筛选来例如，鉴定新的药物和其它生物活性分子。

实施例9.整合膜蛋白的掺入

细菌视紫红质是一种模型整合膜蛋白。细菌视紫红质采用以下方法掺入纳米级结构的，这是一种对其它蛋白质同样有用的方法。细菌视紫红质以冻干的紫色膜获自Sigma(St.Louis.MO)。将1mgBR悬浮在1ml 25mM pH6.9的磷酸钾中。加入溶于同一缓冲液的1ml 90mM的正-辛基B-D-吡喃葡萄糖苷并将样品在24℃于黑暗中放置过夜。这种处理产生了去污剂溶解的均一形式(Dencher等，1982)。估计BR在550nm的摩尔消光系数为63,000来定量测定BR。将BR(7.8μM)与MSP1(97mM)或MSP2(110mM)以及胆酸盐(50mM)混合以使最终MSP1∶BR的摩尔比为10∶1或MSP2∶BR的摩尔比为5∶1且胆酸盐浓度约为8mM。为了与磷脂重建，将磷脂溶于含50mM胆酸盐的上述溶液中，并按1∶110∶0.1的MSP1∶脂类∶BR的摩尔比与MSP1混合。混合物室温培育约3小时，然后用10,000MW截留透析装置(Slide-a-lyzer，Pierce Chemical)以1000倍体积的缓冲液透析过夜。4℃继续透析2天，更换缓冲液数次。可以使用10mM HEPES，pH7.5，0.15M NaCl缓冲液。也可以成功使用pH7.5或pH8的Tris缓冲液。

已经将人的5-羟色胺1AG蛋白偶联受体掺入含有MSP的纳米颗粒中。用MSP组合物支持可提供含有人5-羟色胺1AGPCR的膜片段的市售的昆虫细胞表达系统。简而言之，将含有5-HT受体的膜制品按磷脂：MSP1∶胆酸盐比例45∶45∶10与磷脂(磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸)、MSP1和胆酸盐混合。

用以下方法溶解市售的Sf9昆虫细胞膜制品(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)中过度表达的5-HT 1A受体。以45∶10∶45的摩尔比例在氯仿中混合POPC、POPS和POPE(Avanti Phospholipids)，氮气气流中干燥，然后在真空下放置数小时以除去残留的溶剂。以25mM的磷脂浓度将磷脂分散在50mM Tris pH7.4、0.2M NaCl、50mM胆酸钠缓冲液中。将5微升sf9膜制品(0.2mg/ml蛋白)、1.62微升溶于缓冲液的磷脂、2.4微升MSP1(4.2mg/ml)和0.28微升4M NaCl混合，冰中放置1小时。用50mM Tris pH7.4将混合物的总体积稀释至100微升，并于4℃在迷你slide-a-lyzer(Pierce Chemical)中用50mM Tris pH7.4透析(更换两次缓冲液，每次一升)。为测定与纳米圆盘结合的5HT1A受体的量，使放射性标记的配体结合于该受体，并按照以下方法利用MSP1中存在的6-组氨酸尾巴分离圆盘-受体-配体复合物。透析后，用50mM Tris pH7.4将混合物的总体积稀释至200微升。在两个试管中分别加入95微升稀释的混合物。加入105微升试剂母液以使最终体积为200微升最终浓度为50mM Tris pH7.4、10mM MgSO₄、0.5mM EDTA、0.1％抗坏血酸。在各个试管中加入氚标记的8-羟基-DPAT(比活135000Ci/摩尔)直至浓度达到1.5nM。作为对照，在其中一个试管中加入未标记的麦角苄酯(最终浓度为100微摩尔)作为竞争性配体。在冰上放置1小时后，将混合物加到200微升Ni-螯合的树脂上以特异性结合带有6组氨酸尾巴的MSP1圆盘的受体。用0.5ml冷的50mM Tris pH7.4将树脂洗涤三次以除去未特异性结合的配体。用0.5ml溶于10mMTris pH7.4和0.5M NaCl的0.5摩尔的咪唑洗脱与受体/圆盘复合物结合的特异性结合放射性标记的8-羟基-DPAT。将闪烁混合液与洗脱液混合并用闪烁计数仪测定特异性结合的放射性配体。发现有5-15％最初存在于sf9膜中的受体与MSP1纳米圆盘结合。

透析掺入了5-HT GPCR的颗粒。用含有氚化的8-OH-DPAT(此受体的拮抗剂)的缓冲液透析以检测功能性(根据配体结合)。然后将颗粒置于Ni-NTA柱以通过MSP1上的组氨酸尾巴结合于柱中并将颗粒与未结合颗粒的8-OH-DPAT分离，洗脱与柱结合的物质。证明了氚标记拮抗剂的结合，显示掺入的GPCR保留了其与拮抗剂结合的能力。

实施例10.分析MSP支持的纳米圆盘磷脂装配体

下面分析了由膜支架蛋白和磷脂(无论有或没有加入的靶蛋白)自身组装所得的颗粒。

透析含有细菌视紫红质的颗粒，将所得混合物注射入Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱(Pharmacia)并在室温下以0.5ml/min的流速用缓冲液洗脱。在280nm处监测蛋白质的吸收，在550nm监测BR的吸收。收集0.5ml组分。用甲状腺球蛋白(669kDa，Stoke’s直径为170A)、铁蛋白(440kDa，Stoke’s直径为122A)、过氧化氢酶(232kDa，Stoke’s直径为92A)、乳酸脱氢酶(140kDa，Stoke’s直径为82A)、牛血清白蛋白(66kDa，Stoke’s直径为71A)和马心脏细胞色素c(12.4kDa，Stoke’s直径为35.6A)的混合物校准此柱。

和数字式毫微秒示波器IIIa一起，在缓冲液中用削尖的氮化硅探针以接触模式进行原子力显微术(AFM)。在10mM Tris pH8.8、0.15M NaCl、2mM CaCl₂中，用质量比为1∶50的Xa因子：MSP蛋白处理MSP1和MSP2二棕榈酰磷脂酰胆碱颗粒8小时。将2-10ml样品和20ml成像缓冲液(10mM Tris pH8、0.15mM NaCl、10mM MgCl₂)一起放置在新鲜切割的云母表面并培育30分钟或更长时间，然后将样品放在流动小室中。用几毫升缓冲液冲洗流动小室以除去未吸收的物质。

如下进行纳米级颗粒的磷酸盐分析。磷酸盐试验法根据Chen等(1956)Anal.Chem.28：1756-1758以及Fiske和Subbarow(1925)改编。将约含40纳摩脂类磷酸盐的样品在玻璃试管中干燥。在各个试管中加入75ml 8.9N H₂SO₄然后加热至210℃，保持30分钟。在各个试管中加入一滴30％的H₂O₂并加热30分钟。冷却试管，加入0.65ml水，然后加入83.3ml 2.5％w/v的四水合钼酸铵，然后涡旋搅拌，最后加入83.3ml 10％w/v的抗坏血酸。混合后，将试管在沸水浴中放置7分钟。在820nm处读取吸收值。用磷酸钾标准品(0-100nmol磷酸)校准吸收值。MSP蛋白测定时包括了柱层析的缓冲液空白。

实施例12.表面上的MSP支持结构

含有MSP和有关蛋白质的纳米圆盘可装配到金表面。其用处涉及所得的掺入纳米圆盘装配体的靶蛋白质朝向溶液的外延部分。这为定量测定其它用电介质对比试剂标记的大分子或小分子与靶蛋白质的结合，提供了理想的系统。实现这种测定的一般方法采用了表面胞质基因组共振(SPR)技术。SPR是用于监测表面生物分子相互反应的常规技术。SPR迅速检测并定量金表面未标记的蛋白质相互反应的能力，对于产生用于圆盘上多种膜蛋白(包埋的和可溶的)的高产量芯片试验是有用的。

用下述方法制备了由含或不含其它硫醇化脂类的磷脂DPPC与MSP1蛋白组成的圆盘。将含有溶于10mM Tris Cl和150mM NaCl pH 8.0的50mM胆酸盐溶解的磷脂酰胆碱的25mM脂类混合物混合37℃培育过夜。对于硫醇化的圆盘，将90％的磷脂酰胆碱和10％硫醇化脂类(ATA-TEG-DSPA，Northern Lipids)溶于pH 9.0、3.3mMTris Cl、66.7mM硼酸盐和150mM NaCl中以除去硫醇化脂类中的硫醇屏蔽。将MSP1和脂类(1∶100)混合37℃培育过夜。然后在37℃(10,000MW截留膜)以pH 8.0的含10mM Tris Cl和150mM NaCl而没有胆酸盐的缓冲液透析样品2小时。4℃继续透析6小时，每2小时更换一次缓冲液。用YM-10离心浓缩机将约1ml样品浓缩至＜250μl，并将其注射到Pharmacia 10/30 Superdex 200HR凝胶过滤柱中。用没有胆酸盐的所述缓冲液以0.5ml/min流速从柱中洗脱得到样品。用8-25％的梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶作聚丙烯酰胺凝胶电泳分析层析所得的诸组分以测定表观分子量大小。

将如上制备的纳米圆盘样品(3-20μM)注射到SPR装置中以测定圆盘是否会结合到金表面。DPPC和10％硫醇化脂类圆盘都吸附到金表面，修饰的金表面上覆盖了一单层的甲基未端硫醇(壬烷硫醇)或羧基未端硫醇(11-巯基十一醇酸)。用含3.3mM Tris、66.7mM硼酸盐、150mM NaCl的pH为9.0缓冲液注射硫醇化圆盘。用含10mM Tris、150mM NaCl的pH 7.5或8.0缓冲液注射DPPC圆盘。两种情况下，即便在严紧条件(0.5M HCl)下也无法除去圆盘。表面覆盖度显示随着所注射圆盘浓度的增加而增加(3μM比19μM)。圆盘没有形成包装极好的单层；因此，表面覆盖度受限于0.547的干扰界限(根据以相同的非重叠硬球体在表面建模圆盘上随机连续吸收的理论最大覆盖度)限制。根据假定的5.5nm圆盘高度和1.45-1.5之间的折射指数计算了全部单层圆盘的覆盖度将全部单层数值乘以干扰界限以确定最大覆盖度，然后将其用于测定基于实验值的覆盖度百分率。当圆盘浓度至少为10μM时，估计覆盖度约在62-103％之间。结果得到的SPR痕量证明了纳米圆盘已与金表面结合的，见图27。

引用文献Atkinson，D.和Small，D.M.(1986)Ann.Rev.Biophys.Chem.15：403-456.Bayburt，T.H.等(1998)J.Struct.Biol.123：37-44.Bayburt，T.H.等(2000)Langmuir 16：5993-5997.Boguski，M.S.等(1986)J.of Lipid Research 27：1011-1034.Borhani，D.W.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci USA 94：12291-12296.Brouillette，C.G.等(1984)Biochemistry 23：359-367.Carlson，J.W.等(2000)Langmuir 16：3927-3931.Carlson，J.W.等(1997)Biophys.J.73：1184-1189.Chen等(1956)Anal.Chem.28：1756-1758.Dalton，M.B.和Swaney，J.B.(1993)J.Biol.Chem.268：19274-19283.Dencher，N.A.和Heyn，M.P.(1982)Methods Enz.88：，5-10.Drake等(1989)Am.J.Pathol.134：1087-1097.Durbin，D.M.和Jonas，A.(1999)J.Lipid Research 40：2293-2302.Fidge，N.H.(1999)J.Lipid Research 40：187-201.Fielding，P.E.和Fielding，C.J.(1991).Biochemistry of Lipias，Lipoproteins，and Membranes.Fiske和Subbarow(1925)J.Biol.Chem.66：374-389Forte，T.M.等(1971)Biochim.Biophys.Acta 248：381-386.Frank，P.G.等(1997)Biochemistry 36：1798-1806.Friis，E.P.等(1999)ProG.Natl Acad.Sci.USA 96：1379-84.Glomset，J.A.(1968)J.Lipid Research 9：155-167.Higuchi，R.等(1988)Nucl.Acids Res.16：7351.Holvoet，P.等(1995)Biochemistry 34：13334-13342.Jonas，A.(1986)Methods Enzymol.128：553-582.Jonas，A.(1991)Biochim.Biophys.Acta 1084：205-220.Jonas，A.等(1989)J.Biol.Chem.264：4818-4824.Koppaka，V.等(1999)J.Biol.Chem.274：14541-14544.Miller，J.P.等(1996)Biochemistry 35：1466-1474.Mukhopadhyay，R.等(2000)J.Inorg.Biochem.78：251-254.Nemerson，Y.和Repke，D.(1985)Thromb.Res.40：350-358.Phillips，J.C.等(1997)Biophysics Journal 73：2337-2346.Rezaie 等(1992)Protein Expression and Purification 3：453-460.Robinson，C.R.和Sauer，R T.(1998)Proc.Natl Acad.Sci.USA 95(11)：5929-34].Rogers，D.P.等(1998)Biochemistry 37：945-955.Rogers，D.P.等(1998)Biochemistry 37：l1714-11725.Segrest，J.P.等(1999)J.Biol.Chem.274：31755-31758.Tocanne，J.-F.等(1994)Chemistry and Physics of Lipids 73：139-158..Wald，J.H.等(1990)J.Biol.Chem.265：20044-20050.Wald，J.H.等(1990)J.Biol.Chem.265：20037-20043..Wang，M.等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：8411-8416.Wlodawer，A.等(1979)FEBS Lett.104：231-2 Segr35.序列表<110>伊利诺斯州立大学托管会<120>膜支架蛋白<130>87-00 WO<140>PCT/US01/43451<141>2001-11-20<150>US 60/252,233<151>2000-11-20<160>46<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>762<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220><221>misc feature<222>(1)..(762)<223>限制性位点Nco I和Hind III位于5’和3’末端<400>1ccatggccca tttctggcag caagatgaac ccccccagag cccctgggat cgagtgaagg 60acctggccac tgtgtacgtg gatgtgctca aagacagcgg cagagactat gtgtcccagt 120ttgaaggctc cgccttggga aaacagctaa acctaaagct ccttgacaac tgggacagcg 180tgacctccac cttcagcaag ctgcgcgaac agctcggccc tgtgacccag gagttctggg 240ataacctgga aaaggagaca gagggcctga ggcaagagat gagcaaggat ctggaggagg 300tgaaggccaa ggtgcagccc tacctggacg acttccagaa gaagtggcag gaggagatgg 360agctctaccg ccagaaggtg gagccgctgc gcgcagagct ccaagagggc gcgcgccaga 420agctgcacga gctgcaagag aagctgagcc cactgggcga ggagatgcgc gaccgcgcgc 480gcgcccatgt ggacgcgctg cgcacgcatc tggcccccta cagcgacgag ctgcgccagc 540gcttggccgc gcgccttgag gctctcaagg agaacggcgg cgccagactg gccgagtacc 600acgccaaggc caccgagcat ctgagcacgc tcagcgagaa ggccaagccc gcgctcgagg 660acctccgcca aggcctgctg cccgtgctgg agagcttcaa ggtcagcttc ctgagcgctc 720tcgaggagta cactaagaag ctcaacaccc agtaataagc tt 762<210>2<211>250<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Ala His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp1 5 10 15Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser

20 25 30Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys Gln

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210<210>7<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>7taccatggca aagctccttg acaactg 27<210>8<211>619<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>8taccatggca aagctccttg acaactggga cagcgtgacc tccaccttca gcaagctgcg 60cgaacagctc ggccctgtga cccaggagtt ctgggataac ctggaaaagg agacagaggg 120cctgaggcag gagatgagca aggatctgga ggaggtgaag gccaaggtgc agccctacct 180ggacgacttc cagaagaagt ggcaggagga gatggagctc taccgccaga aggtggagcc 240gctgcgcgca gagctccaag agggcgcgcg ccagaagctg cacgagctgc aagagaagtt 300gagcccactg ggcgaggaga tgcgcgaccg cgcgcgcgcc catgtggacg cgctgcgcac 360gcatctggcc ccctacagcg acgagctgcg ccagcgcttg gccgcgcgcc ttgaggctct 420caaggagaac ggcggcgcca gactggccga gtaccacgcc aaggccaccg agcatctgag 480cacgctcagc gagaaggcca aacccgcgct cgaggacctc cgccaaggcc tgctgcccgt 540gctggagagc ttcaaggtca gcttcctgag cgctctcgag gagtacacta agaagctcaa 600cacccagtaa taagcttgc 619<210>9<211>201<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>9Met Ala Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser1 5 10 15Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn

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275 280 285Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu

290 295 300Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu305 310 315 320Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp

325 330 335Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg

340 345 350Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu

355 360 365Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser G1u

370 375 380Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val385 390 395 400Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr

405 410 415Lys Lys Leu Asn Thr Gln

420<210>20<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>20tggagctcta ccgccagaag gtggagccct acagcgacga gct 43<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>21gcaagcttat tactgggtgt tgagcttctt 30<210>22<211>522<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：编码人工肽的合成核苷序列<400>22tataccatgg gccatcatca tcatcatcat atagaaggaa gactaaagct ccttgacaac 60tgggacagcg tgacctccac cttcagcaag ctgcgcgaac agctcggccc tgtgacccag 120gagttctggg ataacctgga aaaggagaca gagggcctga ggcaggagat gagcaaggat 180ctggaggagg tgaaggccaa ggtgcagccc tacctggacg acttccagaa gaagtggcag 240gaggagatgg agctctaccg ccagaaggtg gagccctaca gcgacgagct gcgccagcgc 300ttggccgcgc gccttgaggc tctcaaggag aacggcggcg ccagactggc cgagtaccac 360gccaaggcca ccgagcatct gagcacgctc agcgagaagg ccaaacccgc gctcgaggac 420ctccgccaag gcctgctgcc cgtgctggag agcttcaagg tcagcttcct gagcgctctc 480gaggagtaca ctaagaagct caacacccag taataagctt gc 522<210>23<211>168<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>23Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu1 5 10 15Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln

20 25 30Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr

35 40 45Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala

50 55 60Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu65 70 75 80Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg

85 90 95Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala

100 105 110Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu

115 120 125Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu

130 135 140Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu145 150 155 160Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln

165<210>24<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>24cagaattcgc tagccgagta ccacgccaa 29<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>25gcaagcttat tactgggtgt tgagcttctt 30<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>26ataccatggg ccatcatcat catcatcata 30<210>27<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸引物<400>27cagaattcgc tagcctggcg ctcaacttct ctt 33<210>28<211>522<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：编码人工肽的合成核苷序列<400>28tataccatgg gccatcatca tcatcatcat atagaaggaa gactaaagct ccttgacaac 60tgggacagcg tgacctccac cttcagcaag ctgcgcgaac agctcggccc tgtgacccag 120gagttctggg ataacctgga aaaggagaca gagggcctga ggcaggagat gagcaaggat 180ctggaggagg tgaaggccaa ggtgcagccc tacctggacg acttccagaa gaagtggcag 240gaggagatgg agctctaccg ccagaaggtg gagccgctgc gcgcagagct ccaagagggc 300gcgcgccaga agctgcacga gctgcaagag aagttgagcg ccaggctagc cgagtaccac 360gccaaggcca ccgagcatct gagcacgctc agcgagaagg ccaaacccgc gctcgaggac 420ctccgccaag gcctgctgcc cgtgctggag agcttcaagg tcagcttcct gagcgctctc 480gaggagtaca ctaagaagct caacacccag taataagctt gc 522<210>29<211>168<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>29Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu1 5 10 15Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln

20 25 30Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr

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100 105 110Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu

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165<210>30<211>77<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>30taccatgggt catcatcatc atcatcacat tgagggacgt ctgaagctgt tggacaattg 60ggactctgtt acgtcta 77<210>31<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>31aggaattctg ggacaacctg gaaaaagaaa ccgagggact gcgtcaggaa atgtccaaag 60at 62<210>32<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>32tatctagatg actttcagaa aaaatggcag gaagagatgg aattatatcg tcaa 54<210>33<211>73<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>33atgagctcca agagaagctc agcccattag gcgaagaaat gcgcgatcgc gcccgtgcac 60atgttgatgc act 73<210>34<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>34gtctcgaggc gctgaaagaa aacgggggtg cccgcttggc tgagtaccac gcgaaagcga 60cagaa 65<210>35<211>56<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>35gaagatctac gccagggctt attgcctgtt cttgagagct ttaaagtcag ttttct 56<210>36<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>36cagaattcct gcgtcacggg gcccagttgt tcgcgaagtt tactgaaggt agacgtaaca 60g 61<210>37<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>37tcatctagat atggctgaac cttggccttc acctcttcta aatctttgga cattt 55<210>38<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>38tggagctcat ggagtttttg gcgtgccccc tcttgcagtt ccgcacgcag cggttccacc 60ttttgacgat ataattccat 80<210>39<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>39gcctcgagac gtgcggccaa acgctggcga agttcatccg aatacggcgc caaatgagtc 60cggagtgcat caacat 76<210>40<211>61<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>40gtagatcttc cagcgccggt ttcgcttttt cgctcaaggt gctcaggtgt tctgtcgctt 60t 61<210>41<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>41ccaagcttat tactgggtat tcagcttttt agtatattct tccagagctg acagaaaact 60gacttt 66<210>42<211>651<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成核苷<400>42accatgggtc atcatcatca tcatcacatt gagggacgtc tgaagctgtt ggacaattgg 60gactctgtta cgtctacctt cagtaaactt cgcgaacaac tgggccccgt gacgcaggaa 120ttctgggaca acctggaaaa agaaaccgag ggactgcgtc aggaaatgtc caaagattta 180gaagaggtga aggccaaggt tcagccatat ctagatgact ttcagaaaaa atggcaggaa 240gagatggaat tatatcgtca aaaggtggaa ccgctgcgtg cggaactgca agagggggca 300cgccaaaaac tccatgagct ccaagagaag ctcagcccat taggcgaaga aatgcgcgat 360cgcgcccgtg cacatgttga tgcactccgg actcatttgg cgccgtattc ggatgaactt 420cgccagcgtt tggccgcacg tctcgaggcg ctgaaagaaa acgggggtgc ccgcttggct 480gagtaccacg cgaaagcgac agaacacctg agcaccttga gcgaaaaagc gaaaccggcg 540ctggaagatc tacgccaggg cttattgcct gttcttgaga gctttaaagt cagttttctg 600tcagctctgg aagaatatac taaaaagctg aatacccagt aataagcttg g 651<210>43<211>201<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>43Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu1 5 10 15Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln

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195 200<210>45<211>392<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成肽<400>45Met Gly His His His His His His Ile Glu Gly Arg Leu Lys Leu Leu1 5 10 15Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln

20 25 30Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr

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Claims

1.一种膜支架蛋白，其特征在于，此蛋白质在含水环境中，当没有磷脂或有磷脂或磷脂混合物时，它能自组装形成直径约5-500nm的纳米级颗粒，所述的膜支架蛋白是两性的，且可形成至少一个α螺旋。

2.如权利要求1所述的膜支架蛋白，其中，所述膜支架蛋白与磷脂或磷脂混合物装配形成直径约5-500nm的纳米级颗粒，并形成磷脂双层。

3.如权利要求2所述的膜支架蛋白，其中，磷脂双层是圆盘状的。

4.如权利要求1所述的膜支架蛋白，其中，所述膜支架蛋白与至少一种疏水或部分疏水的蛋白质一起自组装形成直径约5-500nm的纳米级颗粒，所述纳米级颗粒包含该膜支架蛋白和至少一种疏水或部分疏水的蛋白质。

5.如权利要求1-4中任一项所述的膜支架蛋白，其中，所述膜支架蛋白在无磷脂条件下自组装形成直径约5-500nm的纳米级颗粒。

6.如权利要求5所述的膜支架蛋白，其中，所述纳米级颗粒的直径约为5-100nm。

7.如权利要求6所述的膜支架蛋白，其中，所述纳米级颗粒的直径约为5-50nm。

8.如权利要求1-7中任一项所述的膜支架蛋白，其中，所述膜支架蛋白含有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列。

9.一种纳米级颗粒，它含有如权利要求1-8中任一项所述的膜支架蛋白和至少一种疏水或部分疏水蛋白质，并任选地还含有磷脂或磷脂混合物，其中所述纳米级颗粒的直径约为5-500nm。

10.如权利要求9所述的纳米级颗粒，其中所述疏水或部分疏水的蛋白质是膜蛋白。

11.如权利要求10所述的纳米级颗粒，其中，所述膜蛋白是外周膜蛋白。

12.如权利要求10所述的纳米级颗粒，其中，膜蛋白是包埋膜蛋白。

13.如权利要求10所述的纳米级颗粒，其中，膜蛋白是整合膜蛋白。

14.如权利要求13所述的纳米级颗粒，其中，膜蛋白具有七次跨膜区段。

15.如权利要求10所述的纳米级颗粒，其中，所述膜蛋白是受体蛋白。

16.如权利要求10所述的纳米级颗粒，其中，所述膜蛋白是G-蛋白偶联受体。

17.如权利要求16所述的纳米级颗粒，其中，所述G-蛋白偶联受体是5-羟色胺受体。

18.如权利要求8所述的纳米级颗粒，其中，所述膜支架蛋白与疏水蛋白通过遗传融合。

19.如权利要求9-18中任一项所述的纳米级颗粒，其中，所述膜支架蛋白含有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列。

20.将至少一种疏水或部分疏水蛋白质掺入在水溶液中稳定且可溶的纳米级颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括使膜支架蛋白和至少一种疏水或部分疏水蛋白在含有或没有至少一种磷脂的水溶液中自组装形成纳米级颗粒。

21.如权利要求20所述的方法，其中，所述至少一种疏水或部分疏水蛋白质是膜蛋白。

22.如权利要求21所述的方法，其中，所述膜蛋白是外周膜蛋白、包埋膜蛋白或整合膜蛋白。

23.如权利要求22所述的方法，其中，所述膜蛋白是组织因子。

24.如权利要求21所述的方法，其中，所述膜蛋白是受体蛋白。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述受体蛋白是G-蛋白偶联受体。

26.如权利要求25所述的方法，其中，所述G-蛋白偶联受体是5-羟色胺受体。

27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述膜支架蛋白含有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列。

28.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中，所述至少一种疏水或部分疏水的蛋白质与膜或膜片段结合。

30.一种鉴定配体与受体蛋白结合的竞争者的方法，其特征在于，其中所述的受体蛋白与膜支架蛋白一起包含在纳米级颗粒中，所述方法包括以下步骤：

(a)使含有膜支架蛋白和受体蛋白的纳米级颗粒与可测配体接触形成结合于纳米级颗粒的可测配体；

(b)使结合于纳米级颗粒的配体与待测化合物接触；

(c)检测从纳米级颗粒上释放的可测配体；

由此，当与结合于纳米级颗粒的配体接触导致可测配体释放时，可以鉴定配体结合的竞争者。

31.如权利要求30所述的方法，其中，所述受体蛋白是膜蛋白。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述受体蛋白是G-蛋白偶联受体。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述G-蛋白偶联受体是5-羟色胺受体。

34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜支架蛋白含有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列。

35.编码膜支架蛋白的DNA分子，其特征在于，所述膜支架蛋白含有选自SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45的氨基酸序列。

36.一种重组宿主细胞，它含有如权利要求35所述DNA分子。