CN1361822A

CN1361822A - Reg－结合蛋白

Info

Publication number: CN1361822A
Application number: CN00810465A
Authority: CN
Inventors: 冈本宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-06-10
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2002-07-31
Also published as: AU5107700A; EP1188828A1; CA2392514A1; EP1188828A4; WO2000077192A9; AU777139B2; KR20020033635A; WO2000077192A1

Abstract

本发明从大鼠胰岛－衍生的cDNA中成功克隆出与Reg蛋白结合的蛋白质。经证实,COS细胞表面表达的这种蛋白质特异性地与Reg蛋白结合。当在RINm5Fβ细胞中表达Reg－结合蛋白时,DNA合成和细胞增殖受到刺激,受刺激的程度依赖于培养基中所加入Reg蛋白的剂量,在较高浓度时,会诱导细胞凋亡。据认为该蛋白质作为细胞(如β细胞)表面表达的Reg受体起作用,并能调节这些细胞的增殖。该蛋白质及其基因可用于开发新的糖尿病治疗剂。

Description

Reg-结合蛋白

技术领域

本发明涉及一种与Reg蛋白结合的新蛋白质，其基因，以及该蛋白质和基因的生产和用途。

背景技术

胰岛β细胞能产生活体中唯一的血液降血糖因子—胰岛素。迄今为止，人们一直认为一旦胰β细胞的数目因一些损害而减少，这些细胞不能容易地再生和增殖。据认为这是引起糖尿病发作的重要因素，也是无法基于病因根治糖尿病的原因所在。

通常，通过施用胰岛素或口服磺酰脲型抗-糖尿病药物来治疗糖尿病。然而，施用胰岛素仅为症状疗法，仍难以维持血液胰岛素的生理浓度。此外，当考虑到治疗糖尿病并发症，如动脉硬化，神经病和进行性视网膜病时，该疗法具有其局限性。另外，长期使用口服抗-糖尿病药物可导致副作用，如冠状动脉硬化，或者，据认为胰腺负担过重会导致其分泌胰岛素的能力降低。

本发明人以前曾阐明胰β-细胞损害的机理及其预防(H.Yamamoto等，自然294，284(1981)；Y. Uchigata等，生物化学杂志，257，6084(1982)；Y.Uchigata等，糖尿病32，316(1983)；H. Okamoto，生物测定法2，15(1985)；H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999))。此外，本发明人已成功再生和培养出胰β-细胞(T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994)；Yonemura，Y等，(1984)糖尿病33，401-404)，并分离出再生期间特异性表达的基因，即Reg(再生基因)(H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313；KTerazono等，糖尿病学33，250(1990)；T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994))。另外，本发明人阐明Reg基因的基因产物Reg蛋白是胰β-细胞的再生增殖因子，并使用糖尿病模型动物证实了通过施用Reg蛋白，激活Reg基因或导入Reg基因来治疗糖尿病的可能性(Watanabe，T等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589-3592；Gross，D.J等(1998)内分泌学139，2369-2374；Okamoto，H.(1999)分子医学杂志，77，74-79)。从这些分析中发现：施用Reg蛋白可诱导β-细胞的再生和增殖，从而增加β-细胞的量，并改善90％切除胰腺的大鼠和非-肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病。然而，仍不知道何种蛋白质与Reg蛋白相互作用以发挥其功能。

希望能将Reg蛋白作为胰β-细胞的增殖因子用于治疗糖尿病，以补偿施用胰岛素的弱点。然而，当将其用于临床时，仍存在很多技术问题，例如由于Reg蛋白的分子量大，因此难以口服该蛋白，另外，也难以在体内靶向高-分子量的蛋白质。

发明的内容

本发明的目的是提供一种与Reg蛋白结合的新蛋白质，其基因，以及所述蛋白质和基因的生产方法和用途。特别地，本发明的蛋白质可用于开发新的糖尿病治疗药物。

为了分析Reg蛋白对胰β细胞-谱系细胞所起的作用，本发明人进行了实验，其中在大鼠胰岛瘤细胞-衍生的细胞系RINm5F中加入在酵母中产生的重组Reg蛋白。结果揭示出加入Reg蛋白能使RINm5F细胞中5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的掺入显著增加，Reg蛋白促进了这些细胞的增殖。接着，本发明人用¹²⁵I标记Reg蛋白，并将其加入RINm5F细胞中以分析结合活性。结果，观察到Reg蛋白与RINm5F细胞依赖于浓度的结合，据认为此结合是特异性的，因为过量的未经标记的Reg蛋白可抑制这种结合。这些结果表明胰β细胞表达Reg蛋白受体，此受体与Reg蛋白的结合促进细胞增殖。

为了分离具有Reg蛋白受体功能的Reg-结合蛋白，本发明人用噬菌体载体构建了大鼠胰岛polyA(+)RNA的表达cDNA文库，并使用经标记的Reg蛋白，通过West-Western印迹法筛选出编码Reg-结合蛋白的基因。结果，成功地分离出一种新的cDNA，其编码含有364个氨基酸的蛋白质。将该cDNA插入哺乳动物细胞-表达载体，并在COS-7细胞中表达。在这些细胞中加入重组Reg蛋白，证实Reg蛋白与COS-7细胞特异性结合。

本发明人使用该cDNA为探针筛选大鼠胰岛cDNA文库，成功分离出另一种编码Reg-结合蛋白的cDNA。该cDNA编码含有919个氨基酸的细胞表面蛋白。当在哺乳动物细胞中表达该cDNA时，蛋白质表达于细胞表面，细胞与Reg蛋白以高亲和力结合。加入Reg蛋白能诱导BrdU掺入至被该cDNA转染的RINm5Fβ细胞，使细胞数目增加。由这些结果可以证实：分离的cDNA编码的Reg-结合蛋白是Reg蛋白的受体，它能介导胰β细胞中的细胞增殖信号。另外，还揭示出通过加入高浓度的Reg蛋白，可在大量表达Reg-结合蛋白的RINm5F细胞中诱导细胞凋亡。

由这些事实可以设想Reg-结合蛋白转导Reg蛋白的信号，并通过调节例如胰β细胞的细胞增殖，来调节胰β细胞的量。本发明的Reg-结合蛋白及其基因可成为阐明糖尿病发病机理的有用工具，并且也可用于开发抗-糖尿病药物。

本发明涉及Reg蛋白-结合蛋白，其基因，生产该蛋白质和基因的方法，以及它们的用途，本发明更具体地涉及：

(1)根据(a)至(i)中任一项的DNA，

(a)编码含有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的蛋白质的DNA，

(b)含有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的编码区的DNA，

(c)编码含有将SEQ ID NO：2的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA，其中所述DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质，

(d)与含有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的DNA杂交的DNA，其中所述DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质，

(e)编码含有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的蛋白质的DNA，

(f)含有SEQ ID NO：3之核苷酸序列的编码区的DNA，

(g)编码含有将SEQ ID NO：4的氨基酸序列取代，缺失，插入和/或添加一个或多个氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质的DNA，其中所述DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质，

(h)与含有SEQ ID NO：3之核苷酸序列的DNA杂交的DNA，其中所述DNA编码具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质，

(i)编码含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之氨基酸序列的蛋白质的部分肽的DNA；

(2)由根据(1)的DNA编码的蛋白质或肽；

(3)插入根据(1)的DNA的载体；

(4)携有根据(3)的载体的宿主细胞；

(5)生产根据(2)的蛋白质或肽的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)培养根据(4)的细胞，和

(b)从经培养的细胞或培养物上清液中回收细胞所表达的重组蛋白质；

(6)抗根据(2)的蛋白质或肽的抗体；

(7)含有至少15个核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸与选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3的DNA或与其互补的DNA杂交；

(8)筛选能与根据(2)的蛋白质或肽结合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)使蛋白质或肽与受试样品接触，

(b)检测受试样品与蛋白质或肽的结合，和

(c)选择与蛋白质或肽结合的化合物；

(9)筛选能抑制Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽结合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽接触，

(b)检测Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽的结合，和

(c)选择能减弱结合的化合物；

(10)通过根据(9)的方法分离的化合物，其中所述化合物抑制Reg蛋白与根据(2)的蛋白质或肽的结合；

(11)筛选能对(2)的蛋白质的激活所致信号转导进行促进或抑制的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与在细胞表面表达根据(2)的蛋白质的细胞接触，

(b)检测细胞在应答Reg蛋白的刺激时的改变，

(c)选择与缺乏受试样品时所作的检测相比，能增强或抑制所述细胞改变的化合物；

(12)根据(11)的方法，其中所述细胞改变包括细胞-增殖活性或细胞DNA-合成活性的改变；

(13)通过根据(11)或(12)的方法分离的化合物，其中所述化合物能促进或抑制由激活根据(2)的蛋白质所致的信号转导；

(14)一种药剂，其含有根据(1)的DNA，根据(2)的蛋白质或肽，根据(3)的载体，根据(6)的抗体，或根据(10)或(13)的化合物；

(15)根据(14)的药剂，其中所述药剂选自Reg-结合剂，Reg蛋白应答细胞的胞内信号转导的调节剂，细胞增殖调节剂，DNA合成调节剂和细胞凋亡调节剂；和

(16)根据(14)或(15)的药剂，其中所述药剂是抗-糖尿病药物。

本发明涉及一种在胰腺中表达的，与Reg蛋白结合的新蛋白质(Reg-结合蛋白)。分离的大鼠“Reg-结合蛋白”的cDNA的核苷酸序列和由这些cDNA编码的氨基酸序列分别描述于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3，以及SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：4。

一种编码本发明的大鼠Reg-结合蛋白(SEQ ID NO：2)的cDNA含有开放阅读框，其编码含有364个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO：1)。通过使用该cDNA为探针进行筛选，可分离出编码大鼠Reg-结合蛋白的cDNA，所述cDNA含有开放阅读框(SEQ ID NO：3)，其编码含有919个氨基酸残基的蛋白质(SEQ ID NO：4)。本发明的大鼠“Reg-结合蛋白”在细胞表面表达，并具有Reg蛋白-结合活性。如上所述，Reg蛋白是胰腺β细胞再生时特异性表达的再生增殖因子，已有人提出应用该蛋白质及其基因治疗糖尿病的可能性。据认为本发明的Reg-结合蛋白涉及通过作为Reg蛋白的受体起作用来调节细胞的生理功能，包括对胰腺β细胞进行增殖调节。因此，本发明的Reg-结合蛋白可用作研究的靶，来阐明导致糖尿病的机理，或者可用作工具，用于开发针对涉及胰腺β细胞功能之疾病(如糖尿病)的治疗剂。

最近，已分离出几种Reg和Reg-相关基因，已揭示出这些基因构成一个多基因家族，Reg家族(H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝胆胰腺外科学杂志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化学杂志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；M.Abe等，基因246，111(2000))。Reg家族的所有成员都显示出6个外显子和5个内含子的保守基因排列，和家族成员之间40-85％的氨基酸序列同源性，保守的6个半胱氨酸残基形成3对分子内S-S键(H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝胆胰腺外科学杂志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化学杂志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；T.Itoh等，FEBS Lett，272，85(1990)；M.Abe等，基因246，111(2000))。根据Reg蛋白的一级结构，将该家族的成员分成3个亚类，I，II和III型(H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；H.Okamoto，肝胆胰腺外科学杂志，6，254(1999)；M.Unno等，生物化学杂志，268，15974(1993)；Y.Narushima等，基因185，159(1997)；T.Watanabe等，生物化学杂志，265，7432(1990)；M.Abe等，基因246，111(2000))。I型Reg蛋白包括本发明实施例中所用的大鼠和人Reg蛋白，它们在再生的胰岛中表达(H. Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病学33，250(1990)；H.Okamoto，肝胆胰腺外科学杂志，6，254(1999))。最近，已在人结肠癌(T.Watanabe等，生物化学杂志，265，7432(1990)；M.E.Zenilman等，胃肠道外科学杂志，1，194(1997)；F.R.Bernard-Perrone等，组织化学与细胞化学杂志，47，863(1999))，大鼠胃粘膜(H.Fukui等，胃肠病学115，1483(1998))和肠嗜铬样细胞(M.Asahara等，胃肠病学111，45(1996))中发现I型Reg在病理性条件下的表达，也有人提出III型Reg蛋白参与肠帕内特(Paneth)细胞(L.Christa等，美国生理学杂志，271，G993(1996))，肝细胞癌(L.Christa等，美国生理学杂志，271，G993(1996))，胰腺腺泡细胞(L.Christa等，美国生理学杂志，271，G993(1996)；E.M.Ortiz等，胃肠病学114，808(1998))和施旺(Schwann)细胞(J.F.Livesey等，自然390，614(1997))中的细胞增殖。因此，所鉴定的Reg受体可在生理和病理条件下，在多种组织和细胞中作为Reg家族基因产物的受体起作用。

上述发现表明：本发明的蛋白质可用于开发治疗剂，所述治疗剂不仅可以治疗和预防糖尿病，还可以治疗和预防诸如胃肠道肿瘤(Asahara，M等，胃肠病学111，45-55(1996)；Fukui，H等，胃肠病学115，1483-1493(1998))，神经变性病(Livesy，F.J等，自然390，614-618(1997))和胰腺炎(Christa，L等，美国生理学杂志，271，G993-G1002(1996)；Ortiz，E等，胃肠病学114，808-816(1998))等疾病。另外，据认为当肿瘤中出现Reg蛋白-Reg-结合蛋白紊乱，例如过度刺激时，Reg蛋白自身可用于治疗，因为施用可溶形式的Reg-结合蛋白可抑制过度刺激，从而抑制肿瘤增殖等。

本发明包括结构与大鼠“Reg-结合蛋白”类似的蛋白质，只要它们具有与Reg蛋白结合的活性即可。结构类似的蛋白质包括“Reg-结合蛋白”的突变体和得自其它生物体的“Reg-结合蛋白”。

本领域技术人员使用例如众所周知的诱变方法可以容易地制备这些蛋白质。改变蛋白质中的氨基酸的已知方法包括Kunkel的方法(Kunkel，T.A(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,488)，寡核苷酸-定向双琥珀(ODA)法(Hashimoto-Gotoh，T等(1995)基因152，271-275)，PCR-限制性酶法(Ito，W等(1991)基因102，67-70)，ODA-PCR法(Hashimoto-Gotoh，T等(1995)基因152，271-275；Ito，W等(1991)基因102，67-70)等。对蛋白质中所改变的氨基酸残基数目没有限制，但是，当进行人工改变时，所改变的氨基酸残基数目通常为50个或更少，优选为10个或更少，更优选为5个或更少。

蛋白质中的氨基酸突变可以自发发生。本发明也包括下述蛋白质，只要它们具有与Reg蛋白结合的活性即可，所述蛋白质具有因人工或自发地取代，缺失，添加和/或插入氨基酸而与天然大鼠“Reg-结合蛋白”有所不同的氨基酸序列。

优选使用与被取代的氨基酸特性类似的氨基酸进行取代。例如，由于Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Met，Phe和Trp被归类为非-极性氨基酸，可以认为它们具有类似的特性。另外，不带电的氨基酸包括Gly，Ser，Thr，Cys，Tyr，Asn和Gln。另外，酸性氨基酸包括Asp和Glu，而碱性氨基酸包括Lys，Arg和His。

在本发明中，大鼠“Reg-结合蛋白”的氨基酸有缺陷的蛋白质包括仅含有胞外结构域的蛋白质。另外，除含有大鼠“Reg-结合蛋白”之外，还含有其它氨基酸的蛋白质包括大鼠“Reg-结合蛋白”和另一种肽的融合蛋白。

使用已知的杂交技术(Sambrook，J等，(1989)分子克隆第2版，冷泉港实验室出版社)和聚合酶链反应(PCR)技术(Sambrook，J等，(1989)分子克隆第2版，冷泉港实验室出版社；Innis，M.A等，PCR方法，Academic出版社(1990))，即可制备与大鼠“Reg-结合蛋白”结构类似，且具有与Reg蛋白结合之活性的蛋白质。即，本领域技术人员可常规地将大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA(SEQ ID NO：1或3)或其部分用作探针，将与大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA特异性杂交的寡核苷酸用作引物，从多种其它生物体中分离出与大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA高度同源的DNA，再由分离的DNA获得与大鼠“Reg-结合蛋白”结构类似的蛋白质。

本发明中包括与大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA杂交的DNA所编码的蛋白质，只要它具有与大鼠“Reg-结合蛋白”结合的活性即可。其它可用于分离所述蛋白质的生物体包括例如人，猴，小鼠，兔，山羊，牛，猪，狗等，但并不局限于此。据认为这些生物体的胰岛β细胞是分离编码所述蛋白质的DNA的适当来源。

得自除大鼠外的生物体的，编码“Reg-结合蛋白”的DNA通常与大鼠“Reg-结合蛋白”的cDNA序列(SEQ ID NO：1或3)高度同源。“高度同源”指的是在核苷酸序列水平上具有至少60％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，甚至更优选95％或更高，最优选99％或更高的序列同一性。通过FASTA(用宽范围的序列相似性搜索某个序列)，BLAST(用局部的高相似性搜索某个序列)和SSEARCH(利用Smith-Waterman算法进行搜索)，即可测定序列同源性。进入众所周知的数据库和站点，例如日本DNA数据库(DDBJ)，即可使用这些程序。

本领域技术人员可以适当选择杂交条件，用以使用大鼠“Reg-结合蛋白”cDNA，从除大鼠外的生物体中分离出编码与“Reg-结合蛋白”功能等同的蛋白质的cDNA。例如，可在42℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和10％甲酰胺溶液进行杂交(低度-严紧条件)。优选在42℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和30％甲酰胺溶液进行杂交(中度-严紧条件)。更优选在50℃，使用6×SSC，5×FBP，0.5％SDS，0.2mg/ml鲑(鲱)精DNA和50％甲酰胺溶液进行杂交(高度-严紧条件)。在此情况下，尽管据认为包括温度，甲酰胺浓度，盐浓度等的几个因素影响杂交的严紧度，但本领域技术人员通过适当选择这些因素可以达到类似的严紧度。

本发明的蛋白质可被制备成天然蛋白质，或者可以利用基因重组技术将其制备成重组蛋白质。通过例如按下文所述，将据认为可表达“Reg-结合蛋白”的组织(例如胰岛β细胞)提取物上样至使用抗“Reg-结合蛋白”之抗体的亲和层析，即可制备出天然蛋白质。另一方面，通过按下文所述，培养用编码“Reg-结合蛋白”的DNA转化的细胞，使转化子表达该蛋白，并回收该蛋白即可制备出重组蛋白质。

本发明包括本发明蛋白质的部分肽。本发明蛋白质的部分肽的例子为相当于Reg蛋白-结合位点的肽。通过给活体施用本发明的部分肽，可将其用作本发明蛋白质的激动剂或拮抗剂，或Reg蛋白的拮抗剂等。这种部分肽可用作由本发明蛋白质介导的信号转导的激活剂或抑制剂。另外，本发明的部分肽包括本发明蛋白质N-末端区域或C-末端区域的部分肽，这些肽可用于制备抗体。含有特异于本发明蛋白质的氨基酸序列的部分多肽具有至少7个，优选为至少8个，更优选为至少9个氨基酸残基。通过例如基因工程技术，已知的肽合成方法，或者通过用适当的肽酶裂解本发明的蛋白质，即可制备本发明的部分肽。例如，可使用含有与Reg蛋白结合的结构域的部分肽来结合Reg蛋白。所述部分肽可用作Reg蛋白-结合剂。

本发明涉及编码本发明蛋白质的DNA。对编码本发明蛋白质的DNA没有特别的限制，只要它能编码本发明的蛋白质即可，所述DNA包括cDNA，基因组DNA和合成的DNA。本发明还包括具有基于遗传密码简并性的任何核苷酸序列的DNA，只要它能编码本发明的蛋白质即可。

通过例如用³²P等标记SEQ ID NO：1或3的cDNA或其片断，与它们互补的RNA，或含有部分cDNA序列的合成寡核苷酸，并使它们与得自表达本发明蛋白质的组织(如胰腺等)的cDNA文库杂交，可以筛选出编码本发明蛋白质的cDNA。另外，通过合成对应于cDNA核苷酸序列的寡核苷酸，并以得自适当组织(如胰腺等)的cDNA为模板，经聚合酶链反应对上述寡核苷酸进行扩增，也可克隆出所述cDNA。通过例如用³²P等标记SEQ ID NO：1或3的cDNA或其区断，与它们互补的RNA，或含有部分cDNA序列的合成寡核苷酸，并使它们与基因组DNA文库杂交，可以筛选出基因组DNA。或者，通过合成对应于这些cDNA的核苷酸序列的寡核苷酸，并以基因组DNA为模板，经聚合酶链反应对上述寡核苷酸进行扩增，也可克隆出基因组DNA。另一方面，通过例如化学合成含有SEQ ID NO：1或3的cDNA部分序列的寡核苷酸，使它们退火以形成双链，并用DNA连接酶使它们相互连接，即可制备合成DNA。

这些DNA可用于生产重组蛋白质。即通过将编码本发明蛋白质的DNA(例如SEQ ID NO：1或3)插入适当的表达载体，用该载体转化适当的细胞，培养转化子并回收表达的蛋白质，即可将本发明的蛋白质制备成重组蛋白质。在哺乳动物细胞中表达本发明的蛋白质之后，可将其制备成纯化的或粗的蛋白质，或者制备成与膜-结合的形式。

特定宿主-载体系统的例子是大肠杆菌-pGEX系统(Amer-sham PharmaciaBiotech；表达成GST-融合蛋白)，大肠杆菌-pHB6系统和pVB6系统(Rochediagnostics；表达成6×His-融合蛋白)，大肠杆菌-pMAL系统(New EnglandBiolabs；表达成与麦芽糖-结合蛋白的融合蛋白)，大肠杆菌-pTYB系统(NewEngland Biolabs；表达成与内蛋白子(Intein)的融合蛋白(在DTT的存在下可消化Intein部分，便于仅纯化目的蛋白质))，毕赤氏酵母-pPIC系统和pGAP系统(Invitrogen)，哺乳动物细胞(例如COS7)-pCI-neo系统(Promega)和pHook系统(Invitrogen)等。

可通过以下方法将载体导入宿主，如众所周知的转化感受态细胞或电穿孔大肠杆菌，转化用毕赤氏酵母Easy Comp试剂盒制备的感受态细胞(参见实施例1)或电穿孔毕赤氏酵母，电穿孔或众所周知的使用阳离子脂质对哺乳动物细胞进行脂质转染的方法等。

可通过已知方法纯化宿主细胞中表达的重组蛋白质。通过镍柱或谷胱甘肽Sepharose凝胶柱等可以纯化以融合蛋白的形式表达的本发明的蛋白质，例如具有组氨酸残基标记物或N-末端结合有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的蛋白质。

也可将编码本发明蛋白质的DNA用于基因治疗，以治疗由所述DNA的突变引起的疾病。例如，可使用病毒载体，例如痘苗病毒或逆转录病毒载体进行基因治疗。实际的治疗方法是：在培养条件下，使用这些重组病毒将“Reg-结合蛋白”导入例如用于移植的胰腺或胰岛，并进行移植。这将会通过增殖胰腺β细胞来改善移植的治疗效果，并能有效使用移植器官。

本发明还涉及含有至少15个核苷酸的多核苷酸，所述核苷酸能与含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所述核苷酸序列的DNA或其互补DNA杂交。所述多核苷酸优选与含有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所述核苷酸序列的DNA特异性杂交，并含有至少15个核苷酸。“特异性杂交”指的是在正常杂交条件下，优选在上述中度-严紧杂交条件下，更优选在上述高度-严紧杂交条件下，未观察到与编码其它蛋白质的DNA的显著交叉杂交。可在上述条件下进行杂交。这些多核苷酸包括探针和引物，核苷酸或核苷酸衍生物(例如反义寡核苷酸和核酶)，它们可与编码本发明蛋白质的DNA或与该DNA互补的DNA特异性杂交。

可使用含有编码本发明蛋白质的cDNA或其部分序列的寡核苷酸克隆编码本发明蛋白质的基因或cDNA，或使用所述寡核苷酸通过PCR进行扩增。另外，所述寡核苷酸还可用于检测和定量编码本发明蛋白质的RNA。另外，可使用所述寡核苷酸通过诸如限制性片断长度多态性(RFLP)，单链构象多态性(SSCP)的方法检测突变，多态性或疾病(如基因诊断)。

本发明的多核苷酸可用于胰腺检测，例如胰腺β细胞检测，因为本发明的蛋白质在形成，再生和/或维持胰腺，尤其是调节胰腺β细胞的量的方面具有重要功能。另外，本发明的多核苷酸可用于糖尿病检测。例如，从受试者体内分离胰腺组织样品，通过诸如Northern杂交，RT-PCR或DNA芯片(DNA微列阵)的方法检查这些组织中本发明蛋白质表达水平的异常。另外，通过序列分析，SSCP，RFLP等可检测编码本发明蛋白质的DNA或RNA中是否存在突变或多态性。当使用多核苷酸作为检测试剂时，可将其与无菌水，缓冲液，盐等适当混合。

另外，本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或肽的DNA，和其中已插入该DNA的载体可用于按下述方法来筛选能抑制本发明的蛋白质与Reg蛋白结合的化合物。它们也可用于筛选能促进或抑制通过激活本发明蛋白质而刺激的信号转导(例如细胞增殖活性或细胞的DNA-合成活性)的化合物。这些筛选可用于分析由胰腺β细胞的量或功能紊乱所导致疾病，包括糖尿病的治疗剂或预防药物。除糖尿病外，这些筛选也可用于分析或筛选胃肠肿瘤，神经变性疾病，胰腺炎和其它肿瘤的治疗剂或预防药物。

另外，本发明涉及与本发明蛋白质结合的抗体。本发明的抗体包括多克隆和单克隆抗体。通过使用众所周知的方法(Harlow，E和Lane，D，抗体，冷泉港实验室(1988)等)，将上述制备自生物材料(例如胰岛)的“Reg-结合蛋白”，通过宿主-载体系统产生的重组“Reg-结合蛋白”等，或通过常规肽合成方法合成的部分肽用作抗原，免疫兔，山羊，绵羊等，即可制备多克隆抗体。通过使用众所周知的方法(Harlow，E和Lane，D，抗体，冷泉港实验室(1988)等)，将上述制备自生物材料(例如胰岛)的“Reg-结合蛋白”，通过宿主-载体系统产生的重组“Reg-结合蛋白”等，或通过常规肽合成方法合成的部分肽用作抗原，免疫小鼠，大鼠等，并使用小鼠，大鼠等的脾细胞获得能产生单克隆抗体的杂交瘤，即可制备单克隆抗体。

通过常规的生物化学方法，例如硫酸铵分级分离，G蛋白Sepharose柱，或固相化抗原亲和柱，从血清中纯化多克隆抗体，从杂交瘤的培养物上清液或接种了杂交瘤的动物的腹水中纯化单克隆抗体。

将如此制备的抗体用于亲和纯化本发明的蛋白质，或者用于检测和诊断由本发明蛋白质的异常表达或结构异常导致的疾病，以及用于检测所述蛋白质的表达水平等。具体地说，例如，从组织或细胞中提取蛋白质，通过Western印迹，免疫沉淀，ELISA等检测本发明的蛋白质，籍此检测和/或诊断表达或结构的异常。本发明的抗体也可用于胰腺检测，例如胰腺β细胞检测。另外，本发明的抗体可用于检测糖尿病。例如，从受试者体内分离胰腺组织样品，通过Western印迹，免疫组化，ELISA，EIA等方法检测所述组织中本发明蛋白质表达水平或结构的异常。当使用抗体作为检测试剂时，可将其与无菌水，缓冲液，盐，稳定剂，防腐剂等适当混合。另外，本发明的抗体也可用于抗体治疗。当使用本发明的抗体进行抗体治疗时，优选使用人源化抗体或人抗体。此时，使人淋巴细胞与HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)-缺陷型小鼠骨髓瘤细胞融合，使用HAT培养基选择人-小鼠异源杂交瘤。通过众所周知的RIA或ELISA法(其中将“Reg-结合蛋白”用作抗原)选择骨髓瘤细胞，获得能产生Reg结合蛋白的人源化单克隆抗体的克隆。按上述进行抗体的纯化。

本发明还涉及筛选能与本发明蛋白质结合的化合物的方法。可通过包括下列步骤的方法进行筛选：(a)使本发明的蛋白质或其部分肽与受试样品接触，(b)检测受试样品与本发明的蛋白质或其部分肽的结合，和(c)选择能与本发明的蛋白质或其部分肽结合的化合物。

可根据筛选方法，将本发明的蛋白质以纯化的蛋白质，细胞表面-表达的形式，或细胞膜组分的形式用于筛选。

可使用的受试样品包括例如细胞提取物，基因文库的表达产物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。必要时，在使用前可标记筛选所用的受试样品。标记物包括例如放射性标记和荧光标记等，但并不局限于此。

通过例如将有望表达与本发明蛋白质结合的蛋白质的细胞培养物上清液，或细胞提取物上样于固定有本发明蛋白质的亲和柱，并通过纯化与该柱特异性结合的蛋白质，即可筛选出与本发明蛋白质结合的蛋白质。

另外，可根据“West-Western印迹法”等进行筛选，其中由有望表达与本发明蛋白质结合的蛋白质的组织或细胞(例如胰腺β细胞)通过噬菌载体构建cDNA文库，然后，在琼脂糖上表达所述文库，将表达的蛋白质固定于滤膜上，并与经标记的本发明蛋白质反应，以检测表达结合蛋白的噬斑。另一种方法是“双-杂种系统”，其中GAL4-DNA结合结构域和GAL4转录激活结构域被表达成本发明蛋白与受试蛋白的融合蛋白，通过表达报道基因即可检测本发明蛋白质与受试蛋白质的结合，所述报道基因与具有GAL4-DNA结合蛋白之结合序列的启动子的下游相连接。

另外，使固定化的本发明蛋白质与合成的化合物，天然产物库，或随机噬菌体肽展示文库反应从而筛选结合蛋白的方法，和通过使用高-物料流通量系统的组合化学技术进行筛选，分离出与本发明蛋白质结合的化合物的方法是本领域技术人员众所周知的技术。

另外，还例举了使用BIACORE(Biacore)的筛选方法，或通过使用微型生理计(Molecular Device)等监测被强制表达本发明Reg-结合蛋白的培养细胞的酸分泌速度变化的方法。

另外，本发明还涉及筛选能抑制本发明的蛋白质与Reg蛋白结合的化合物的方法，可通过包括下列步骤的方法进行筛选：(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与本发明的蛋白质接触，(b)检测Reg蛋白与本发明蛋白的结合，和(c)选择能减弱该结合的化合物。

本发明的蛋白质可以以纯化的蛋白质，细胞表面-表达的形式，或细胞膜组分的形式用于筛选。Reg蛋白通常以纯化蛋白质的形式用于筛选。例如，人REG Iα或大鼠Reg I等可用作Reg蛋白。可将这些蛋白质制备成重组蛋白质(参照实施例1)。必要时，可用放射性同位素，如[¹²⁵I]标记Reg蛋白。

关于受试样品，可使用细胞提取液，基因文库的表达产物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。

例如，可按下述进行筛选。在受试样品的存在下，使表达本发明蛋白质的细胞或使用所述细胞制备的膜组分与经标记的配体(Reg蛋白)接触，测定与本发明蛋白质结合的经标记配体的量。选择与缺乏受试样品时相比，能减少配体量的化合物。使用上述BIACORE或微型生理计可测定本发明蛋白质与Reg蛋白的结合。如此分离得到的化合物可以是本发明蛋白质的候选拮抗剂或激动剂。

另外，本发明还涉及筛选能对激活本发明的蛋白质所致信号转导进行促进或抑制的化合物的方法，可通过下列步骤进行筛选：(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与在表面表达本发明蛋白质的细胞接触，(b)检测细胞应答Reg蛋白的刺激时的改变，(c)选择与缺乏受试样品时所作的检测(对照)相比，能增强或抑制所述细胞改变的化合物。

通过将编码本发明蛋白质的DNA插入适当表达载体，并将所述载体导入适当宿主细胞，可以制备在其表面表达本发明蛋白质的细胞。例如，诸如RINm5F细胞，CHO细胞，COS-7细胞等细胞可用作宿主细胞。关于载体，可使用pCI-neo(Promega)，pHook(Invitrogen)等。

关于受试样品，可使用例如细胞提取液，基因文库的表达产物，合成的低分子量化合物，合成肽，天然化合物等，但并不局限于此。另外，关于受试样品，也可以使用按照与本发明蛋白质的结合为所指示，通过上述筛选分离得到的化合物。

Reg蛋白通常以纯化蛋白质的形式用于筛选。例如，人REG Iα或大鼠Reg I等可用作Reg蛋白。可将这些蛋白质制备成重组蛋白质(参照实施例1)。

在筛选中，检测上述细胞在受试样品的存在下，应答Reg蛋白的刺激作出的改变。关于细胞应答Reg蛋白刺激作出的改变包括例如：细胞增殖活性的改变，DNA-合成活性的改变，细胞凋亡水平的改变，本发明蛋白质或蛋白质转导信号的磷酸化，细胞中特定基因表达的改变等，但改变并不局限于此。

例如，如实施例中所述，可通过测定5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的掺入来检测细胞的DNA合成。另外，通过在细胞中添加³H-胸苷，然后测定掺入的放射性也可进行检测。通常使用细胞的³H-胸苷掺入试验分析对DNA合成的促进或抑制效果。该方法的优点是能处理相对大量的样品，且敏感性高等。筛选能促进或抑制DNA合成的化合物时，具体操作如下：将细胞接种于多孔板上，保温1-2天后，将培养基换成含有受试样品的培养基，保温一段时间，如24小时。随后，例如，加入1μCi/ml ³H胸苷。保温后，除去培养基，洗涤，加入10％TCA，再将细胞放在冰块上约20分钟，用冰冷的5％TCA洗涤，然后用0.5N NaOH裂解细胞，在冰上放置10分钟，加入1/2体积的1N HCl，小心混合，再加入40％TCA至终浓度为10％，并小心混合。在冰上放置20分钟后，该溶液通过Whatman GF/C滤膜等过滤以收集不溶的物质。用100％乙醇洗涤3次并干燥之后，使用液体闪烁计数器测定放射性。

另外，通过测定细胞数目或集落数目，或通过加入诸如MTT或Alamar蓝等染料测定依赖于细胞数目的颜色生成，可以测定细胞增殖。MTT法使用MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)所致的颜色生成来测定细胞增殖活性，由于与活细胞线粒体的呼吸链反应，形成了MTT甲瓒。所生成的量反映了细胞数目。具体地说，例如，细胞在96孔板中保温，与受试样品反应，然后加入10μl 5mg/ml MTT溶液，保温4小时。再加入100μl 0.04NHCl/异丙醇，充分混合，静置几分钟。然后，在参照波长为630nm，检测波长为570nm时，使用微滴板读数仪测定颜色生成。另外，如实施例11所述，四唑盐4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并]-1，3-苯二磺酸盐(WST-1)可用于该分析。

例如，以核的形态学改变(核的凝聚或区段化)，染色体的片段化(序列梯的形成)等为指标，可测定细胞凋亡。具体地说，通过例如TUNEL法(Y.Gavrieli等，细胞生物学杂志，119，493(1992))等可以检测细胞凋亡(参照实施例11)。

据认为蛋白质磷酸化出现在丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸残基中。通过用Western印迹法或使用抗-磷酸丝氨酸，抗-磷酸苏氨酸或抗-磷酸酪氨酸抗体的免疫沉淀法测定胞内蛋白质的磷酸化状态，可以测定这些磷酸化变化。与细胞增殖-相关的蛋白质，如MAP激酶家族，STAT家族或Fos-Jun家族蛋白质有望被磷酸化，但并不局限于此。

已知上述蛋白质磷酸化等可诱导或抑制多种基因的转录。使用报道基因可检测依赖于本发明蛋白质与其配体的结合的特定基因表达的变化。也即，通过检测报道基因的表达可测定表达的变化，其中报道基因与所述基因启动子的下游相连接。另外，通过检测mRNA的Northern印迹或RT-PCR法，使用抗体检测身为基因翻译产物的蛋白质的方法，或检测身为基因翻译产物的蛋白质活性的方法，也可以测定特定基因表达的变化。

通过这些筛选方法分离的化合物包括例如：(1)与本发明的蛋白质结合并促进或抑制其活性的化合物，(2)与本发明的蛋白质，或本发明蛋白质的配体，如Reg蛋白等结合，并促进或抑制本发明的蛋白质与配体结合的化合物，(3)与本发明蛋白质的配体结合，并促进或抑制其激活的化合物，和(4)促进或抑制本发明蛋白质所致信号转导从而表达出细胞变化的化合物。

所述化合物可用作本发明蛋白质介导的信号转导系统紊乱所致疾病(例如由胰腺β细胞功能紊乱引起的疾病)的预防或治疗剂。例如，这些化合物可用作糖尿病的治疗剂。

当用作治疗剂时，本发明的DNA，本发明的蛋白质或其部分肽，含有本发明DNA的载体，抗本发明蛋白质或其部分肽的抗体，和通过上述筛选分离的化合物可以单独使用，或者与其它化合物联合使用。本发明的治疗剂中包括试剂和药物。

例如，由于本发明的蛋白质具有与Reg蛋白结合的活性，因此可使用本发明的蛋白质或其部分肽结合Reg蛋白。所述蛋白质或肽可用于检测Reg蛋白，或用于亲和纯化。通过使本发明的蛋白质或其部分肽与Reg蛋白接触，本发明的蛋白质或其部分肽可与Reg蛋白结合。本发明的蛋白质或其部分肽可被纯化或表达于细胞膜表面。它们也可与载体结合。对所结合的Reg蛋白的来源没有限制，可以使用小鼠，大鼠或人Reg蛋白。另外，通过在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽，可使编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的载体用于相同的目的。因此，本发明的蛋白质或其部分肽，编码它们的DNA，或含有携所述DNA之载体的治疗剂可以是Reg蛋白-结合剂。

另外，本发明的蛋白质可作为Reg蛋白的受体起作用。因此，本发明的蛋白质可用于调节(促进或抑制)应答Reg蛋白的胞内信号转导。通过激活本发明的蛋白质，可促进该信号转导，反过来，通过抑制激活，可阻断该信号转导。例如，通过使表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO：4)的细胞与本发明蛋白质的配体，如Reg蛋白或激动剂接触，可使本发明的蛋白质被激活并将信号转导至细胞内部。优选细胞是胰腺β细胞谱系，上皮细胞等。另外，可使用与Reg蛋白结合，但不能将信号转导至细胞内部的蛋白质来阻断Reg蛋白的信号转导。例如，可使用含有与Reg蛋白结合的区域，但不含将信号向下游转导的区域的蛋白质。通过在细胞中表达这种蛋白质，或将它们添加至胞外，可以阻断Reg蛋白的信号转导。通过在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽，也可将编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的载体用于相同的目的。另外，与本发明蛋白质或其部分肽结合的抗体，或通过本发明的筛选分离出的化合物也可用于相同的目的。因此，可以认为本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或肽的DNA，插入了所述DNA的载体，本发明的抗体，通过本发明的筛选分离出的化合物是应答Reg蛋白的胞内信号转导的调节剂(促进剂，抑制剂等)。

应答Reg蛋白的胞内信号转导的例子包括：促进细胞的DNA合成和调节细胞增殖(促进或抑制)。即这表明可使用本发明的蛋白质抑制细胞的DNA合成，促进或抑制细胞增殖。优选靶细胞为胰腺β细胞谱系的细胞，上皮细胞等。通过使表达本发明蛋白质的细胞与本发明蛋白质的配体(例如Reg蛋白)或激动剂接触以促进DNA合成，即可促进细胞增殖(或细胞分裂)。当在细胞中外源表达本发明的蛋白质时，可将表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO：4)的载体导入细胞。另外，可使用与Reg蛋白结合，但不能将信号转导至细胞内部的蛋白质来抑制DNA合成或细胞增殖。例如，可使用含有与Reg蛋白结合的区域，但不含将信号转导至下游的区域的蛋白质。通过在细胞内表达这种蛋白质，或将它们添加至胞外，可以抑制DNA合成或细胞增殖。通过在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽，也可将编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA，或插入了所述DNA的载体用于相同的目的。另外，与本发明蛋白质或其部分肽结合的抗体，和通过本发明的筛选分离出的化合物也可用于调节DNA合成或细胞增殖。例如，通过给活体施用作为本发明蛋白质的配体或激动剂起作用的抗体或化合物，可促进细胞(如胰腺β细胞)的增殖。给药可以在体外和体内进行。因此，本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或肽的DNA，插入了所述DNA的载体，本发明的抗体，通过本发明的筛选分离出的化合物可以是细胞的DNA合成或细胞增殖的调节剂(促进剂或抑制剂)。

另外，通过激活本发明的蛋白质而引发的信号转导的例子还包括细胞凋亡。即本发明的蛋白质可用于调节细胞凋亡(诱导细胞凋亡或抑制该诱导作用)。通过在细胞中表达本发明的蛋白质或其部分肽，也可将编码本发明蛋白质或其部分肽的DNA，或插入了所述DNA的载体用于相同的目的。另外，与本发明蛋白质或其部分肽结合的抗体，和通过本发明的筛选分离出的化合物也可用于调节细胞凋亡。优选靶细胞为胰腺β细胞谱系的细胞，上皮细胞等。通过使表达高浓度的本发明蛋白质的细胞与本发明蛋白质的配体(例如Reg蛋白)接触，可以导致细胞凋亡。与细胞接触的Reg蛋白的浓度高于100nM，优选500nM或更高，更优选1000nM或更高。当在细胞中外源表达本发明的蛋白质时，可将表达本发明蛋白质(例如SEQ ID NO：4)的载体导入细胞。另外，可使用与Reg蛋白结合，但不能将信号转导至细胞内部的蛋白质来抑制由Reg蛋白导致的细胞凋亡。通过在细胞内表达这种蛋白质，或将它们加至胞外，可以抑制细胞凋亡。因此，本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或其部分肽的DNA，插入了所述DNA的载体，本发明的抗体，通过本发明的筛选分离出的化合物可以是细胞凋亡的调节剂(诱导剂或抑制剂等)。

可通过众所周知的药学方法，将本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或肽的DNA，插入了所述DNA的载体，本发明的抗体，通过本发明的筛选分离出的化合物与蒸馏水，缓冲剂，盐，BSA，甘油，稳定剂，防腐剂或去污剂混合，可以制备成组合物。另外，本发明的药剂可用作上述胰腺检查所用的试剂。另外，它也可用作药物组合物，用于治疗或预防糖尿病，消化道肿瘤，神经变性疾病，胰腺炎和其它肿瘤。

当将本发明的药剂用作药物时，本发明的蛋白质或其部分肽，编码所述蛋白质或肽的DNA，插入了所述DNA的载体，本发明的抗体，通过本发明的筛选分离出的化合物可以直接施用于患者，或者可通过众所周知的药学方法对它们进行配制。例如，为了进行配制，可以适当混合药物可接受的载体或介质，具体地为无菌水，生理盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，植物油，乳化剂，悬浮剂，去污剂，稳定剂等，然后再施用。本发明的药物组合物可以是溶液，片剂，胶囊，锭剂，含片，酏剂，悬浮液或糖浆形式。可以适当决定活性化合物的含量。除了动脉内，静脉内或皮下注射外，还可通过本领域技术人员众所周知的方法进行给药，例如鼻内，经支气管，肌内或口服给药。可以全身性或局部给药。剂量可根据患者的体重，年龄，给药方法，症状等而改变，本领域技术人员可适当选择适当的剂量。可分一次或几次给药。另外，只要化合物是由DNA编码的物质，可通过将DNA整合至基因治疗载体来进行基因治疗。给药可在体外或体内进行。可根据患者的体重，年龄，症状等改变给药剂量，给药方法，但本领域技术人员可以适当选择给药方法。

附图简述

图1显示了在大鼠胰岛瘤衍生的细胞系RINm5F细胞中加入人REG蛋白(REG Iα)之后，测定BrdU掺入的结果(实施例3)。

图2显示了在RINm5F细胞中加入经[¹²⁵I]标记的大鼠Reg蛋白(Reg I)时，测定所述Reg蛋白与细胞的结合的结果(实施例4)。“Hot”表示仅加入经标记的大鼠Reg蛋白时的结果，“Hot+100×Cold”表示加入经标记的大鼠Reg蛋白和100倍量的未经标记的大鼠Reg蛋白的结果。

图3显示了在表达了分离型Reg-结合蛋白的COS-7细胞中加入经[¹²⁵I]标记的大鼠Reg蛋白(Reg I)时，测定经[¹²⁵I]标记的大鼠Reg蛋白(Reg I)与所述细胞的结合的结果(实施例6)。“pCI-neo”和“pCI-167.1”分别表示导入空白载体和Reg-结合蛋白表达载体的细胞的结果。另外，(-)和(+)分别表示仅加入经标记的大鼠Reg蛋白，和加入经标记的大鼠Reg蛋白并加入100倍量的未经标记的大鼠Reg蛋白的结果。

图4显示了大鼠Reg结合蛋白，即Reg受体(rEXTL3)(SEQ ID NO：4)，人EXTL3/EXTR1(hEXTL3)(GenBank登录号为AF001690和AB 007042)(SEQID NO：5)，人EXT2(hEXT2)(GenBank登录号为U64511)(SEQ ID NO：6)，人EXT1(hEXT1)(GenBank登录号为S79639)(SEQ ID NO：7)，人EXTL1(hEXTL1)(GenBank登录号为U67191)(SEQ ID NO：8)和人EXTL2(hEXTL2)(GenBank登录号为AF000416)(SEQ ID NO：9)的推测蛋白质氨基酸序列的比对(实施例7)。下划线部分为跨膜结构域。右边的数字对应于氨基酸残基。点表示与大鼠Reg-结合蛋白(rEXTL3)相同的残基。连字号表示在大鼠Reg-结合蛋白(rEXTL3)中缺乏相应的残基。

图5显示出Reg-结合蛋白的细胞分布。泳道1，导入对照载体的COS-7细胞的匀浆液；泳道2-6，导入Reg受体表达载体的COS-7细胞的匀浆液，膜组分，线粒体组分，微粒体组分和胞质组分(实施例8)。在每个泳道中电泳10微克蛋白质，通过使用针对与Reg-结合蛋白结合的HA标记物的抗体进行Western印迹分析其显示Reg蛋白质在细胞表面表达。

图6显示了人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物是细胞表面型Reg-结合蛋白(实施例9)。该图显示了存在(+；过量100倍)或缺乏(-)未经标记的大鼠Reg蛋白时，[¹²⁵I]Reg蛋白与表达Reg受体的细胞的结合。“pCIneo”是导入空白载体的对照，而“pCI.rEXTL3”是在细胞中导入Reg-结合蛋白表达载体的结果。结果被表示为4次独立实验的平均值±S.E.M.。

图7显示了Reg受体的功能鉴定。(A)通过大鼠Reg蛋白使BrdU掺入至稳定表达Reg受体的CHO细胞中(实施例10)。检测了两个表达Reg受体的独立细胞系(RegR-#3和RegR-#22)。结果被表示为8次独立实验的平均值±S.E.M.。(B)大鼠Reg(圆形)和人REG(方形)与大鼠Reg受体的竞争结合曲线。结果被表示为4次独立实验的平均值±S.E.M.。

图8显示了表达Reg受体的β-细胞的增殖和细胞凋亡(实施例11)。检测了三个表达Reg受体的独立细胞系(#1，#6和#24)。RIN是RINm5F对照。结果被表示为4-8次独立实验的平均值±S.E.M.。(A)通过大鼠Reg蛋白使BrdU掺入稳定表达Reg受体的RINm5F细胞。(B)Reg蛋白增加了活细胞对WST-1的裂解。(C)通过TUNEL法定量测定Reg蛋白-诱导的RINm5F细胞凋亡。

图9显示了Reg受体mRNA的表达(实施例12)。进行RNA酶保护试验以测定Reg受体mRNA的表达。309个核苷酸的带对应于Reg受体mRNA受保护的大小。(A)在β-细胞中表达Reg受体mRNA。再生胰岛分离自接受腹膜内注射0.5mg/kg/天烟酰胺达1至3个月，90％的胰腺被切除的大鼠(K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yoneyama，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病学33，250(1990)；Y. Yonemura等，糖尿病33，401(1984))：泳道1，正常胰岛；泳道2，部分胰腺切除术后1个月的再生胰岛；泳道3，部分胰腺切除术后2个月的再生胰岛；泳道4，部分胰腺切除术后3个月的再生胰岛；泳道5，RINm5F细胞；泳道6，ARIP细胞。泳道P中仅使用探针。(B)在大鼠组织中表达Reg受体mRNA：泳道1，正常胰岛；泳道2，整个胰腺；泳道3，肝脏；泳道4，肾脏；泳道5，心脏；泳道6，脾脏；泳道7，胸腺；泳道8，睾丸；泳道9，肾上腺；泳道10，胃；泳道11，空肠；泳道12，回肠；泳道13，结肠；泳道14，脑垂体；泳道15，脑。

图10显示了在稳定表达Reg受体的CHO细胞中，Reg蛋白增加了活细胞对WST-1的裂解(实施例12)。使用了两个如图7A所述的独立细胞系。结果被表示为8次独立实验的平均值±S.E.M.。

实施本发明的最佳模式

下文将使用实施例具体解释本发明，但本发明并不局限于此。实施例1构建人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I)的表达载体

使用接头将人REG IαcDNA的全长蛋白质编码区(Terazono，K等，生物化学杂志，263，2111-2114(1998))插入毕赤氏酵母表达载体pPIC3.5(Invitrogen)的酵母醇氧化酶启动子下游的SnaBI/AvrII位点以构建表达载体。类似地，使用接头将大鼠Reg I cDNA的全长蛋白质编码区(Terazono，K等，文献同上)插入pPIC3.5的SnaBI/NotI位点。使用CsCl法纯化这两种表达载体的DNA，并将所述DNA导入使用毕赤氏酵母Easy Comp试剂盒(Invitrogen)制备的感受态细胞(毕赤氏酵母GS115菌株)。通过已导入表达载体的细胞获得了在不含组氨酸的培养基中增殖的能力这一事实，即可选择出这些细胞。在这些细胞中，选择当加入甲醇时，产生并分泌至培养基中的人REG蛋白或大鼠Reg蛋白的量达到最大值的克隆。实施例2制备人REG蛋白(REG Iα)和大鼠Reg蛋白(Reg I)

于28至30℃，在BMGY培养基(1％酵母提取物，2％聚胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％Yeast Nitrogen Base，0.00004％生物素，1％甘油)中将能生产上述人REG蛋白或大鼠Reg蛋白的毕赤氏酵母(巴斯德毕赤氏酵母)预培养16至18小时。然后，在BMGY培养基中进行大规模培养直至OD600为2至5。离心收集酵母，将其重新悬浮于BMMY培养基(1％酵母提取物，2％聚胨，100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34％ Yeast Nitrogen Base，0.00004％生物素，0.5％甲醇)中，于28至30℃培养3至4天使OD₆₀₀达到1为止。在培养过程中，以24小时为间隔加入甲醇至终浓度为0.5％。收集培养物上清液，加入乙酸而将pH调节为3.5。将已调节pH的培养基上样于用50mM醋酸钠(pH3.5)平衡过的STREAMLINE SP(Pharmacia)，用50mM醋酸钠(pH3.5)洗涤之后，再用50mM醋酸钠(pH3.5)/0.5M NaCl洗脱。使用质谱法证实所产生的蛋白质是人REG蛋白或大鼠Reg蛋白。实施例3加入REG蛋白对大鼠胰岛瘤衍生的培养细胞RINm5F细胞的影响

在大鼠胰岛瘤衍生的培养细胞RINm5F细胞(Zenilman，M.E等，胃肠病学110，1208-1214(1996))中加入REG蛋白，测定5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的掺入(细胞增殖活性)。首先，将5×10⁵个细胞/ml的RINm5F细胞以100μl/孔的量接种于96孔培养板，于37℃培养2天。然后，将培养基换成100μl/孔下述培养基。关于人REG Iα，使用的是实施例2中所述的人REG Iα。

培养基+1％FCS

培养基+1％FCS+人REG Iα(1nM；0.016μg/ml)

培养基+1％FCS+人REG Iα(10nM；0.16μg/ml)

培养基+1％FCS+人REG Iα(100nM；1.6μg/ml)

培养基+1％FCS+人REG Iα(1000nM；16μg/ml)

于37℃将细胞保温24小时，然后加入10μl/孔BrdU标记溶液(用培养基将10mM BrdU原液稀释至100μM)(终浓度为10μM)。37℃保温12小时，然后除去培养基，加入200μl/孔FixDenat(Roche Diagnostics)。室温下保温15分钟，除去FixDenat溶液，然后加入100μl/孔抗-BrdU-POD抗体(原液的1/100稀释溶液，Roche Diagnostics)。室温下保温60分钟之后，除去抗-BrdU-POD抗体溶液，然后用200μl/孔洗涤溶液(10x洗涤溶液，Roche Diagnostics)冲洗3次。加入100μl/孔底物溶液(Roche Diagnostics)，室温下保温直至充分显色。使用ELISA读数仪测定每个样品在370nm的光吸收值(参照波长：约492nm)。

结果，观察到依赖于REG蛋白浓度的细胞增殖(图1)。实施例4检测Reg蛋白对RINm5F细胞的结合活性

首先，按下述制备经稀释的[¹²⁵I]Reg I溶液。用DMEM将[¹²⁵I]大鼠Reg I原液(50ng/μl≈3.33μM，8.6×10⁵cpm/μl)稀释至1nM，333pM，100pM，33pM和10pM。另外，按类似方法制备含100倍浓度未经标记的Reg I原液(460ng/μl≈30.6μM)的稀释溶液。将3ml 4×10⁵个细胞/ml RINm5F细胞接种于6孔培养板上，37℃培养2天。用冰冷的DMEM洗涤，然后加入3ml含有上述[¹²⁵I]大鼠Reg I(终浓度：10pM，33pM，100pM，333pM和1nM)的DMEM。在竞争抑制实验中，使用了含100倍量未经标记的Reg I的DMEM。在冰上放置2小时，然后用DMEM将细胞洗涤3次，通过加入0.5至1ml/孔[100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，1％Triton X-100]进行裂解，用γ-计数器计数[¹²⁵I]放射性。

结果看出过量的未经标记的Reg蛋白抑制结合，这表明RINm5F细胞的细胞膜上存在一种特异性结合所必需的分子(图2)。实施例5鉴定和分离Reg-结合蛋白

使用大鼠胰岛的poly(A)+RNA为模板，用λZAP II载体构建大鼠胰岛表达cDNA文库。使用Bolton-Hunter试剂，用[¹²⁵I]标记实施例2中制备的大鼠Reg蛋白，通过West-Western法，从表达的cDNA文库中选择并分离与Reg蛋白结合的噬菌体克隆。

使用得自阳性噬菌体克隆的辅助噬菌体，通过体内切除法将cDNA重组至质粒载体(pBluescript SK(-)，Stratagene)。通过双脱氧法测定cDNA的核苷酸序列。核苷酸序列和预期的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2。据认为由核苷酸序列估计的蛋白质是细胞膜蛋白质，其跨膜结构域含有疏水氨基酸簇。实施例6在COS-7细胞中表达Reg-结合蛋白

将实施例5中分离的cDNA整合至含有巨细胞病毒启动子的哺乳动物细胞表达载体(pCI-neo)(Promega)，以构建Reg-结合蛋白表达载体(pCl-167.1)。通过电穿孔法将载体导入COS-7细胞并瞬时表达。导入载体48小时之后，通过类似于实施例4中所述的方法检测Reg结合活性。

具体地说，首先，使用DMEM将[¹²⁵I]大鼠Reg I原液(50ng/μl≈3.33μM，2.7×10⁵cpm/μl)稀释至10nM。另外，还制备一种稀释液，使该稀释液中加入的未经标记的Reg I原液(2250ng/μl＝150μM)浓度为[¹²⁵I]Reg I浓度(1μM)的100倍。

将3ml 2.5×10⁵个细胞/ml经转染的COS细胞接种于6孔培养板上，37℃培养2天。用冰冷的DMEM洗涤，然后加入3ml含有[¹²⁵I]大鼠Reg I(终浓度为10nM)的DMEM。在竞争抑制实验中，同时存在100倍量的未经标记的Reg I。在冰上放置2小时，然后用DMEM将细胞洗涤3次，加入1ml/孔[100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA，1％Triton X-100]以裂解细胞，用γ-计数器计数[¹²⁵I]放射性。

结果，与仅导入载体的细胞相比，在导入cDNA的细胞中，与经[¹²⁵I]标记的Reg蛋白的结合显著增加。另外，通过加入过量未经标记的Reg蛋白使所述结合消失(图3)。因此，可以认为由分离的cDNA编码的蛋白质是哺乳动物细胞膜上与Reg蛋白结合的分子，所述分子可以是对β细胞再生和Reg蛋白的增殖活性起着重要作用的受体分子。实施例7筛选大鼠胰岛cDNA文库

为了进一步分离编码Reg-结合蛋白的cDNA，可使用实施例5中所得的cDNA片段为探针，通过噬斑杂交来筛选大鼠胰岛cDNA文库(5×10⁶个克隆)，得到8个阳性克隆。这8个克隆彼此高度重叠，并且在重叠区域具有完全的核苷酸同一性。所得的编码大鼠Reg-结合蛋白的cDNA序列和由该cDNA编码的Reg-结合蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4。

如图4所示，该cDNA具有2760bp的开放阅读框，其编码919个氨基酸的蛋白质，由该cDNA推定的氨基酸序列推测：该蛋白质是II型跨膜结构域，所述结构域具有长的胞外结构域(868个氨基酸残基)，跨膜结构域(残基29-51)，和位于N-末端的短的胞内区域。实施例8表达大鼠Reg-结合蛋白

构建实施例7中分离的大鼠Reg蛋白cDNA的表达载体，并在COS-7细胞中瞬时表达。将大鼠Reg结合蛋白cDNA与能在N末端编码血凝素(HA)九肽-标记物(YPYDVPDYA)的寡核苷酸连接，然后插入pCl-neo哺乳动物表达载体(Promega)。通过电穿孔将该载体导入COS-7细胞并表达。保温48小时之后，收集细胞，匀浆，并按文献所述进行分级分离(S.Takasawa等，生物化学杂志，268，26052(1983)；H.Okamoto等，酶学方法，280，306(1997))。蛋白质样品在12.5％(w/v)SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移至Immobilon-P(Millipore)。按S.Takasawa等，生物化学杂志，270，30257(1995)；H.Okamoto等，酶学方法，280，306(1997)所述进行Western印迹分析。抗HA的单克隆抗体是抗-HA 3F10(Boehringer)。

免疫印迹分析表明：由所述cDNA编码的蛋白质在细胞膜组分中优势表达，其表观分子量为105kD(图5A)，这与由推定的氨基酸序列计算出的分子量(104,682)一致。实施例9大鼠Reg-结合蛋白与Reg蛋白的结合

通过电穿孔将实施例8中构建的大鼠Reg-结合蛋白(也称为EXTL3/EXTR1)表达载体或对照载体导入COS-7细胞，并瞬时表达。按上文所述分离稳定表达Reg受体的CHO细胞。用RPMI 1640(Roswell ParkMemorial institute 1640培养基)洗涤细胞(7.5×10⁵个细胞)，在经¹²⁵I标记的大鼠Reg蛋白(50ng/ml，1.5×10⁵cpm/ml)的存在下，在冰上将上述细胞与含有多种浓度未经标记的大鼠Reg或人REG蛋白和1％胎牛血清的RPMI 1640一起保温2小时。用RPMI 1640洗涤3次之后，用1ml 100mM Tris-HCl(pH7.6)，1mM EDTA和1％ Triton X-100溶解细胞。通过γ-计数器(Cobra，Packard)测定裂解物的放射性。结果，导入大鼠Reg结合蛋白表达载体的COS-7细胞与经¹²⁵I标记的大鼠Reg蛋白结合，通过加入未经标记的Reg蛋白可以减少该结合(图6)。

在DNA和蛋白质数据库中进行同源性检索，结果表明：大鼠Reg结合蛋白的cDNA(SEQ ID NO：3)及其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与多发性外生骨疣(EXT)家族基因，尤其是人EXT-样基因3(EXTL3)/EXT-相关基因1(EXTR1)(W.Van Hui等，基因组学47，230(1998)；T.Saito等，生物化学与生物物理研究通讯，243，61(1998))的相应序列显示出显著的同源性(氨基酸同一性超过97％)，这表明所述cDNA编码人EXTL3/EXTR1的大鼠同系物。通过同源性筛选已分离出身为EXT家族基因成员的EXTL3/EXTR1基因，但尚未阐明其生理功能和病理学意义。据认为EXTL3/EXTR1属于EXT家族(W.Van Hui等，基因组学47，230(1998)；T.Saito等，生物化学与生物物理研究通讯，243，61(1998))，因为它与EXT2和EXT1在C-末端区域显示出同源性(C末端的262个氨基酸与EXT2有52％同源，C末端的247个氨基酸与EXT1有40％同源)(见图4)。然而，EXTL3/EXTR1的N-末端区域(残基1-656)与EXT家族基因的任何其它成员都没有同源性。另外，EXTL3/EXTR1的N-末端区域含有跨膜结构域，但该家族的其它成员缺乏该结构域，因此，不认为它们是细胞表面蛋白质。另外，起初在筛选大鼠胰岛cDNA表达文库时作为Reg-结合蛋白被分离的1.6kbp cDNA仅含有N-末端区域(氨基酸残基1-332)。因此，可以合理地假定N-末端区域含有Reg结合结构域，且除EXTL3/EXTR1外的EXT家族成员不能结合Reg蛋白。实施例10 Reg蛋白对大鼠Reg-结合蛋白(大鼠Reg受体)表达细胞的刺激作用

将实施例8中构建的表达载体导入CHO细胞，建立几个过量表达受体蛋白质的细胞系，测定细胞对大鼠Reg蛋白刺激作出反应而掺入的5’-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)。

将具有HA-标记的大鼠受体表达载体导入CHO细胞和RINm5F细胞。在含有10％胎牛血清(Bio Whittaker，Walersville，Maryland)和250μg/ml新霉素(Gibco)的Roswell Park Memorial institute 1640培养基(RPMI1640)中将细胞培养2周[S.Takasawa等，生物化学杂志，273，2497(1998)]。通过对HA进行免疫印迹分析，筛选出表达高水平重组蛋白质的稳定转化子，并分离这些转化子。在浓度渐增的大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培养基中将表达Reg受体的稳定转化子培养24小时。在最后的2小时，在培养基中加入BrdU(10μM)，使用比色细胞增殖ELISA试剂盒(Boehringer)测定BrdU掺入。

当与1-300nM大鼠Reg蛋白保温时，表达EXTL3/EXTR1的细胞系(#3和#22)中的BrdU掺入显著增加(细胞系#3的EC₅₀＝4.01nM，细胞系#22中为1.11nM，图7A)。对CHO-细胞系表现出增殖-刺激作用的Reg蛋白浓度与对大鼠胰岛原代培养物的(T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994))一致，这表明Reg蛋白刺激胰腺β-细胞增殖的作用是由EXTL3/EXTR1的大鼠同系物介导的。

经¹²⁵I-标记的大鼠Reg蛋白与表达大鼠Reg受体的CHO细胞结合(K_d＝4.41nM)，通过增加未经标记的大鼠Reg蛋白的浓度可以置换该结合(K_i＝1.61 nM；图7B)(参照实施例9)。经估计，大鼠Reg蛋白的Hill系数为n_H＝1.18，表明与单个匀质结合位点群的相互作用。另外，显示出与大鼠Reg蛋白70％氨基酸同一性的人REG蛋白(K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yonemura，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313)也能与表达上述大鼠Reg受体的CHO细胞结合(Kα＝14.0nM)。经放射性标记的大鼠Reg蛋白和CHO细胞的结合虽然也能通过人REG蛋白置换，但置换需要较高的浓度(K_i＝7.41 nM；图7B)。这些结果强烈地暗示EXTL3/EXTR1是细胞表面Reg受体，它能与Reg蛋白结合，并能转导Reg蛋白的增殖刺激信号。实施例11大鼠Reg受体的功能分析

Reg被认为是β-细胞增殖因子(H.Okamoto，分子医学杂志，77，74(1999)；T.Watanabe等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，3589(1994)；D.J.Gross等，内分泌学139，2369(1998))。当在大鼠胰岛瘤衍生的β细胞系RINm5F中加入Reg蛋白时，细胞的BrdU掺入增加(1.5至2倍)，这表明它可以以依赖于Reg蛋白浓度的方式刺激细胞数目的增加。由于刺激RINm5F细胞增殖的Reg蛋白浓度与大鼠胰岛原代培养物中的一致，可以认为在这两种细胞中Reg蛋白通过相同的受体反应。接着，将实施例8中构建的表达载体导入RINm5F细胞以建立几个过量表达Reg受体的细胞系，使用这些细胞系检测Reg蛋白的功能。

当与0.3至300nM的大鼠Reg蛋白保温时，表达受体的细胞系(细胞系#1，#6和#24)的BrdU掺入(参照实施例10的检测方法)显著增加(图8A)。

在多种浓度大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培养基中将表达Reg受体的稳定转化子保温24小时之后，在培养基中加入含有WST-1的溶液，再培养30分钟，使用细胞增殖试剂WST-1(Boehringer)，测定活细胞中由线粒体脱氢酶所致的四唑盐4[-3-(4-碘苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-5-四唑并]-1，3-苯二磺酸盐(WST-1)的裂解。RINm5F细胞对加入Reg蛋白(0.3-100nM)作出反应使细胞数目增加，但当将细胞与高浓度的Reg蛋白保温时，细胞数目减少(图8B)。

为了评价高浓度的Reg蛋白诱导这些细胞凋亡的可能性，在浓度渐增的大鼠Reg蛋白的存在下，在含有1％胎牛血清的RPMI1640培养基中将表达Reg受体的稳定转化子保温24小时。保温之后，使用细胞凋亡筛选试剂盒(Wako，Osaka，日本)，通过TUNEL法(Y.Gavrieli，Y.Sherman，S.A.Ben-Sasson，细胞生物学杂志，119，493(1992))检测细胞凋亡。

通过对这些细胞进行细胞凋亡检测，揭示出高浓度的Reg蛋白可诱导表达Reg受体的RINm5F细胞凋亡(图8C)。这些结果表明Reg受体对Reg蛋白作出反应，介导胰腺β-细胞的增殖和细胞凋亡，从而维持稳定的β-细胞量。实施例12 Reg受体mRNA的表达分析

通过RNA酶保护试验在各种大鼠组织和细胞中检测Reg受体mRNA的表达。

按文献所述制备大鼠再生胰岛(K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y. Yoneyama，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313；Y.Yonemura等，糖尿病33，401(1984))。按文献所述从各种大鼠组织和细胞系中分离RNA(T.Koguma等，Biochem.Biophys.Acta 1223，180(1994)；N.Noguchi等，生物化学杂志，272，3133(1997)；H.Okamoto等，酶学方法，280，306(1997))。将大鼠Reg受体cDNA的PstI/BglII片断亚克隆至pBluescript SK(-)的PstI/BglII位点，用HindIII使其线性化，并使用[α-³²P]CTP，通过T3 RNA聚合酶进行体外转录。将所得的0.45kb cRNA用作探针。根据厂商说明，使用RPA III试剂盒(Ambion)进行RNA酶保护试验。

如图9A所示，正常的胰岛，再生的胰岛和RINm5F β-细胞中表达Reg受体mRNA。与正常的胰岛相比，再生胰岛中的Reg受体表达未增加，这表明使β-细胞量增加的胰腺β-细胞再生和增殖主要由Reg蛋白的表达调节，而不是由受体的表达调节。这一假说与以下观察结果一致：Reg基因最初被鉴定为在再生的胰岛中特异性表达的基因(K.Terazono等，生物化学杂志，263，2111(1988)；K.Terazono，T.Watanabe，Y.Yoneyama，胰岛分子生物学，H.Okamoto编(剑桥大学出版社，剑桥，1990)，p301-313；K.Terazono等，糖尿病学33，250(1990))，而且，在瞬时β-细胞增殖期，例如在处于糖尿病缓解期的BB/Wor/Tky大鼠的胰岛(C.Ishii等，内分泌学杂志，40，269(1993))，处于糖尿病活跃期的NOD小鼠的胰岛(N.J.Baeza等，糖尿病45，67(1996))和自身免疫性糖尿病小鼠模型的处于分化和增殖中的胰腺导管细胞(被认为是β-细胞的祖细胞)(E.Anastasi等，欧洲内分泌学杂志，141，644-52(1999))中，也能观察到Reg基因表达。据报道，表达Reg受体的胰腺导管细胞系ARIP细胞(见图9A，泳道6)也能以依赖于Reg蛋白的方式增殖(M.E.Zenilman等，胃肠病学110，1208(1996)；M.E.Zenilman等，胰腺17，256(1998))。在肝脏，肾脏，胃，小肠，结肠，肾上腺，脑垂体和脑中也可检测到Reg受体mRNA的表达，而在心脏中却检测不到这种表达(图9B)，这表明在除胰腺β-细胞以外的多种细胞类型中，Reg-Reg受体信号系统可能涉及细胞增殖和细胞凋亡的控制机制。实际上，表达Reg受体的CHO细胞系对Reg蛋白作出反应而增殖(图7A)。另外，CHO细胞数目的增加和减少(参照实施例11的检测方法)依赖于Reg蛋白的浓度(图10)。

工业实用性

本发明提供了Reg-结合蛋白(Reg受体)。Reg蛋白是胰腺β细胞的细胞增殖因子，已知它也可在上皮细胞等中发挥细胞增殖活性。据认为在胰腺β细胞中，Reg-结合蛋白具有通过与Reg蛋白结合而转导细胞增殖所需信号的功能，胰腺β细胞通过Reg蛋白与Reg-结合蛋白的结合而再生。因此，通过分析Reg-结合蛋白胞外结构域的结构，并寻找与该结构域结合的配体的类似物，可以开发能诱导胰腺β细胞生理增殖的“抗-糖尿病治疗剂”。另外，由于Reg蛋白不会导致胰腺β细胞的过量增殖，据认为不存在由胰岛素过量而导致低血糖的可能性。

序列表<110>冈本宏(OKAMOTO，Hiroshi)<120>Reg-结合蛋白<130>OKT-101PCT<140><141><150>JP 1999-164488<151>1999-06-10<160>9<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>1599<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(168)..(1259)<400>1tcagcgagga aaatgaaatt cccattttat ttggtgcctt gtgcagggag cacactgatc60cctctagaac cttgtgtgtg aaaaagaggt cgagttttgt caaacagact catggttatg120gcaagtgatc cgacgtgacc agagtgggca agagccacag tgaactc atg aca ggc176

Met Thr Gly

1tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt ggt cag acc tgt 224Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly Gln Thr Cys

5 10 15atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg ctg agt ttc acg 272Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu Ser Phe Thr20 25 30 35ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc cac tat tac ctc 320Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His Tyr Tyr Leu

40 45 50acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc atc ttt ggc ccc 368Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile Phe Gly Pro

55 60 65cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc cta gat ctt tgt 416Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu Asp Leu Cys

70 75 80cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag cta gaa gcc aag 464Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu Glu Ala Lys

85 90 95cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac ctc aag att gaa 512Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu Lys Ile Glu100 105 110 115gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac ctg ctg cag ctc 560Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu Leu Gln Leu

120 125 130aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag gag ctg atg gcc 608Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu Leu Met Ala

135 140 145cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg ctc cct gag aag 656Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu Pro Glu Lys

150 155 160gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg ggt tgc cgg cta 704Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly Cys Arg Leu

165 170 175cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg tct ggc ttt cct 752His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser Gly Phe Pro180 185 190 195gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt gcc ttt ggg agc tac ctg gac 800Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser Tyr Leu Asp

200 205 210cct ttg gtc aag cag gct ttt cag gct aca gtg aga gcc aac gtt tat 848Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala Asn Val Tyr

215 220 225gtt aca gaa aat gca gcc atc gcc tgc ctg tat gtg gtg tta gtg gga 896Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val Leu Val Gly

230 235 240gag ata caa gag ccc gct gtg ctg cag cct gcc gac ctt gag aag cag 944Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu Glu Lys Gln

245 250 255ctg cat tct ctg cca cac tgg agg aca gac gga cac aac cat gtc atc 992Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn His Val Ile260 265 270 275atc aat ctg tcc cgg aag tca gac aca caa aat tta ctg tac aat gtc 1040Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu Tyr Asn Val

280 285 290agt aca ggt cgg gcc atg gtg gcc cag tct acc ttc tat gct gcc cag 1088Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr Ala Ala Gln

295 300 305tac aga gct ggc ttt gac ttg gtt gtg tca cca ctt gtc cat gcc atg 1136Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val His Ala Met

310 315 320tct gaa ccc aac ttc atg gaa atc cca cgt gta act att ttt tca ctt 1184Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile Phe Ser Leu

325 330 335ggg aga ggt gag gaa gaa caa gag aag ctg ggg gtg tgg aga ggc aga 1232Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp Arg Gly Arg340 345 350 355ccc ccc cca ggc tgg ggt gct ggc ccc tagactaggg tgctgacccc1279Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro

360tgggctgggg tgctgcgtgc tacctcccac tgtgaaatcg atggtgctca caattgtctc1339ttgtaatgta tgtgattttt ttttaaggag aaaaagaaac tatttaagat tctgaaggtg1399ctactatttt tgttgccaca ggctttaaag aaactttctg agtgggtggg gccttgccca1459cttatctttc tctcctccaa atgaggagtt aaaaatgtta ctaaattgcc cgcacgtgta1519atccgctgaa aagaaaaaaa aaaaagaaaa aaaaaaggaa ggaaagaagg aaagaaggaa1579ggaaggaagg aaggaaagga1599<210>2<211>364<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>2Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly1 5 10 15Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu

20 25 30Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His

35 40 45Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile

50 55 60Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu65 70 75 80Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu

85 90 95Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu

100 105 110Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu

115 120 125Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu

130 135 140Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu145 150 155 160Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg Gly

165 170 175Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser

180 185 190Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser

195 200 205Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala

210 215 220Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val Val225 230 235 240Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp Leu

245 250 255Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn

260 265 270His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu

275 280 285Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr

290 295 300Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val305 310 315 320His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Arg Val Thr Ile

325 330 335Phe Ser Leu Gly Arg Gly Glu Glu Glu Gln Glu Lys Leu Gly Val Trp

340 345 350Arg Gly Arg Pro Pro Pro Gly Trp Gly Ala Gly Pro

355 360<210>3<211>3198<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220><221>CDS<222>(5)..(2761)<400>3actc atg aca ggc tat acc atg ttg cgg aat ggg gga gtg ggg aac ggt 49

Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly

1 5 10 15ggt cag acc tgt atg ctg cgc tgg tcc aac cgc atc cgg ctg acc tgg 97Gly Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp

20 25 30ctg agt ttc acg ctg ttc atc atc ctg gtc ttc ttc ccc ctc att gcc 145Leu Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala

35 40 45cac tat tac ctc acc act ctg gat gag gca gat gag gcc ggc aag cgc 193His Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg

50 55 60atc ttt ggc ccc cgg gct ggc aac gag ctc tgt gag gta aag cac gtc 241Ile Phe Gly Pro Arg Ala Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val

65 70 75cta gat ctt tgt cgg atc cgc gag tct gtg agc gaa gag ctt cta cag 289Leu Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln80 85 90 95cta gaa gcc aag cgg cag gag ctg aac agc gag att gcc aag cta aac 337Leu Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn

100 105 110ctc aag att gaa gcc tgt aag aag agt ata gag aac gcc aag cag gac 385Leu Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp

115 120 125ctg ctg cag ctc aag aat gtc att agc cag aca gag cac tcc tac aag 433Leu Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys

130 135 140gag ctg atg gcc cag aac cag ccc aaa ctg tca ctg ccc atc cgg ctg 481Glu Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu

145 150 155ctc cct gag aag gat gac gct ggc ctt cca ccc ccc aag gtc act cgg 529Leu Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Val Thr Arg160 165 170 175ggt tgc cgg cta cac aac tgc ttc gat tac tct cgt tgc cct ctg acg 577Gly Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr

180 185 190tct ggc ttt cct gtc ttc gtc tat gac agt gac cag ttt gcc ttt ggg 625Ser Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly

195 200 205agc tac ctg gac cct ttg gtc aag cag gct ttt cag gct aca gtg aga 673Ser Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg

210 215 220gcc aac gtt tat gtt aca gaa aat gca gcc atc gcc tgc ctg tat gtg 721Ala Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Ala Ile Ala Cys Leu Tyr Val

225 230 235gtg tta gtg gga gag ata caa gag ccc gct gtg ctg cag cct gcc gac 769Val Leu Val Gly Glu Ile Gln Glu Pro Ala Val Leu Gln Pro Ala Asp240 245 250 255ctt gag aag cag ctg cat tct ctg cca cac tgg agg aca gac gga cac 817Leu Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His

260 265 270aac cat gtc atc atc aat ctg tcc cgg aag tca gac aca caa aat tta 865Asn His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu

275 280 285ctg tac aat gtc agt aca ggt cgg gcc atg gtg gcc cag tct acc ttc 913Leu Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe

290 295 300tat gct gcc cag tac aga gct ggc ttt gac ttg gtt gtg tca cca ctt 961Tyr Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu

305 310 315gtc cat gcc atg tct gaa ccc aac ttc atg gaa atc cca ccg cag gtg 1009Val His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val320 325 330 335cca gtt aag cgg aaa tat ctc ttc act ttc cag ggt gag aag att gag 1057Pro Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu

340 345 350tct cta aga tct agc ctt cag gag gcc cgt tcc ttt gag gaa gaa atg 1105Ser Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met

355 360 365gag ggt gac cct ccg gcc gac tat gat gat cga atc att gcc acc ctc 1153Glu Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu

370 375 380aag gcc gta cag gac agc aag cta gat cag gtg ctg gta gaa ttt act 1201Lys Ala Val Gln Asp Ser Lys Leu Asp Gln Val Leu Val Glu Phe Thr

385 390 395tgc aaa aac cag cca aag ccc agt ctg cct act gag tgg gca ctg tgt 1249Cys Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Leu Pro Thr Glu Trp Ala Leu Cys400 405 410 415ggg gag cgg gag gac cgg cta gag tta ctg aag ctc tcc acc ttc gcc 1297Gly Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala

420 425 430ctc atc atc act ccc ggg gac ccg agc ctg ctt atc tca tct ggc tgt 1345Leu Ile Ile Thr Pro Gly Asp Pro Ser Leu Leu Ile Ser Ser Gly Cys

435 440 445gca aca cgg ctc ttt gaa gcc ttg gag gtg gga gct gtg cct gtt gtc 1393Ala Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val

450 455 460ctt ggg gag cag gtg cag ctt ccg tac cac gac atg cta caa tgg aat 1441Leu Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr His Asp Met Leu Gln Trp Asn

465 470 475gag gcc gcc cta gtg gtg ccc aag cct cgt gtt aca gag gtt cac ttc 1489Glu Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe480 485 490 495ctg tta cga agt ctg tca gac agt gat ctg ttg gct atg agg cgg caa 1537Leu Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln

500 505 510ggc cgc ttt ctc tgg gag acc tac ttc tcc acc gct gac agt att ttt 1585Gly Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe

515 520 525aat acc gtg ctg gcc atg att agg act cga att cag atc cca gct gct 1633Asn Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala

530 535 540ccc atc cgg gaa gag gta gca gct gag atc ccc cat cgt tca ggc aag 1681Pro Ile Arg Glu Glu Val Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys

545 550 555gca gct ggt act gac ccc aac atg gct gac aat ggg gac ctg gac ctg 1729Ala Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu560 565 570 575ggg ccg gta gag aca gag ccg ccc tat gcc tca cct aaa tac ctc cgt 1777Gly Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Lys Tyr Leu Arg

580 585 590aat ttc act ctg act gtc act gac tgt tac cgc agc tgg aac tcc gca 1825Asn Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Cys Tyr Arg Ser Trp Asn Ser Ala

595 600 605ccc gga cct ttc cat ctt ttt cca cac aca ccc ttt gac cct gtg ctg 1873Pro Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu

610 615 620ccc tct gag gcc aaa ttc ctg ggc tca ggg act gga ttt cgg ccc atc 1921Pro Ser Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ser Gly Thr Gly Phe Arg Pro Ile

625 630 635ggt ggt ggg gct ggg ggc tct ggc aag gag ttc cag gca gcg ctt gga 1969Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Lys Glu Phe Gln Ala Ala Leu Gly640 645 650 655ggc aat gtc cag cgg gag cag ttc aca gtt gtg atg ctg acc tac gag 2017Gly Asn Val Gln Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu

660 665 670cgg gag gaa gtg ctc atg aac tcc ctg gag agg ctc aat ggc ctc ccc 2065Arg Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro

675 680 685tac ctg aac aag gta gtg gtg gtg tgg aac tct ccc aag ctg ccc tcg 2113Tyr Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser

690 695 700gag gac ctt ttg tgg cca gac att ggt gtc ccc atc atg gtt gtc cgt 2161Glu Asp Leu Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile Met Val Val Arg

705 710 715act gag aag aac agt ttg aac aat cgg ttc ttg ccc tgg aat gag ata 2209Thr Glu Lys Asn Ser Leu Asn Asn Arg Phe Leu Pro Trp Asn Glu Ile720 725 730 735gag aca gag gca ata ttg tcc atc gat gac gat gcc cac ctc cgc cat 2257Glu Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His

740 745 750gat gaa atc atg ttc ggg ttt cgg gtg tgg aga gag gcg cgt gat cgc 2305Asp Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg

755 760 765att gtg ggg ttc cct ggc cgg tac cat gcg tgg gac atc cct cac cag 2353Ile Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln

770 775 780tcc tgg ctc tac aac tcc aac tac tcc tgt gag ctg tcc atg gtg ctg 2401Ser Trp Leu Tyr Asn Ser Asn Tyr Ser Cys Glu Leu Ser Met Val Leu

785 790 795acg ggt gct gcc ttc ttt cac aag tat tac gcc tac ctg tat tct tat 2449Thr Gly Ala Ala Phe Phe His Lys Tyr Tyr Ala Tyr Leu Tyr Ser Tyr800 805 810 815gtg atg ccc cag gcc atc cga gac atg gtg gat gag tat atc aac tgt 2497Val Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys

820 825 830gag gat atc gcc atg aac ttc ctt gtc tcc cac atc aca cgg aag ccc 2545Glu Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro

835 840 845ccc atc aag gtg aca tcg agg tgg act ttt cga tgc ccg ggg tgc cct 2593Pro Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro

850 855 860cag gcc ctg tcc cac gat gac tct cac ttt cat gag cgg cac aag tgt 2641Gln Ala Leu Ser His Asp Asp Ser His Phe His Glu Arg His Lys Cys

865 870 875atc aac ttt ttt gtc aag gtg tac ggc tat atg cct ctc ctg tac aca 2689Ile Asn Phe Phe Val Lys Val Tyr Gly Tyr Met Pro Leu Leu Tyr Thr880 885 890 895cag ttt agg gtg gac tct gtg ctc ttc aag acc cgc ctg ccc cat gac 2737Gln Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp

900 905 910aag acc aag tgc ttc aag ttc atc tagggccttg ccagttctga ggagaagaca2791Lys Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile

915gtgagcagag tgaggggagt cacccccaag gttcccaagg tgttgaaggt ccttggggac2851atcgtgggca gggcccaggc cctttgcttg gagaagagca gggagagtag aaagggatgg2911ctgtctttat tttgaagtca gccgcactgg gcctggaatc ctggtcagca gactcagggc2971accgactaat ggcgaacact gaggactgtt catgagcccg ggacagctgg ttcccggttt3031ttaaattcag aacagcattt actatttaaa gagagagttt cacatctgcc atccaaggct3091tatttatatg tgcgtatatg tacacacata tgtgtatata catgtatatg cacgcacaca3151cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacagc ggccgcg3198<210>4<211>919<212>PRT<213>大鼠(Rattus norvegicus)<400>4Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Val Gly Asn Gly Gly1 5 10 15Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu

20 25 30Ser Phe Thr Leu Phe Ile Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His

35 40 45Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile

85 90 95Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu

100 105 110Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu

115 120 125Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu

165 170 175Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser

180 185 190Gly Phe Pro Val Phe Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Ala Phe Gly Ser

195 200 205Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Val Arg Ala

245 250 255Glu Lys Gln Leu His Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn

260 265 270His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu

275 280 285Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr

290 295 300Ala Ala Gln Tyr Arg Ala Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val305 310 315 320His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val Pro

325 330 335Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu Ser

340 345 350Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met Glu

355 360 365Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu Lys

370 375 380Ala Val Gln Asp Ser Lys Leu Asp Gln Val Leu Val Glu Phe Thr Cys385 390 395 400Lys Asn Gln Pro Lys Pro Ser Leu Pro Thr Glu Trp Ala Leu Cys Gly

405 410 415Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala Leu

420 425 430Ile Ile Thr Pro Gly Asp Pro Ser Leu Leu Ile Ser Ser Gly Cys Ala

435 440 445Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val Leu

450 455 460Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr His Asp Met Leu Gln Trp Asn Glu465 470 475 480Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe Leu

485 490 495Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln Gly

500 505 510Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe Asn

515 520 525Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala Pro

530 535 540Ile Arg Glu Glu Val Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys Ala545 550 555 560Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu Gly

565 570 575Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Lys Tyr Leu Arg Asn

580 585 590Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Cys Tyr Arg Ser Trp Asn Ser Ala Pro

595 600 605Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu Pro

610 615 620Ser Glu Ala Lys Phe Leu Gly Ser Gly Thr Gly Phe Arg Pro Ile Gly625 630 635 640Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Lys Glu Phe Gln Ala Ala Leu Gly Gly

645 650 655Asn Val Gln Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu Arg

660 665 670Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro Tyr

675 680 685Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser Glu

690 695 700Asp Leu Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile Met Val Val Arg Thr705 710 715 720Glu Lys Asn Ser Leu Asn Asn Arg Phe Leu Pro Trp Asn Glu Ile Glu

725 730 735Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His Asp

740 745 750Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg Ile

755 760 765Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln Ser

770 775 780Trp Leu Tyr Asn Ser Asn Tyr Ser Cys Glu Leu Ser Met Val Leu Thr785 790 795 800Gly Ala Ala Phe Phe His Lys Tyr Tyr Ala Tyr Leu Tyr Ser Tyr Val

805 810 815Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys Glu

820 825 830Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro Pro

835 840 845Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro Gln

850 855 860Ala Leu Ser His Asp Asp Ser His Phe His Glu Arg His Lys Cys Ile865 870 875 880Asn Phe Phe Val Lys Val Tyr Gly Tyr Met Pro Leu Leu Tyr Thr Gln

885 890 895Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp Lys

900 905 910Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile

915<210>5<211>919<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>5Met Thr Gly Tyr Thr Met Leu Arg Asn Gly Gly Ala Gly Asn Gly Gly1 5 10 15Gln Thr Cys Met Leu Arg Trp Ser Asn Arg Ile Arg Leu Thr Trp Leu

20 25 30Ser Phe Thr Leu Phe Val Ile Leu Val Phe Phe Pro Leu Ile Ala His

35 40 45Tyr Tyr Leu Thr Thr Leu Asp Glu Ala Asp Glu Ala Gly Lys Arg Ile

50 55 60Phe Gly Pro Arg Val Gly Asn Glu Leu Cys Glu Val Lys His Val Leu65 70 75 80Asp Leu Cys Arg Ile Arg Glu Ser Val Ser Glu Glu Leu Leu Gln Leu

85 90 95Glu Ala Lys Arg Gln Glu Leu Asn Ser Glu Ile Ala Lys Leu Asn Leu

100 105 110Lys Ile Glu Ala Cys Lys Lys Ser Ile Glu Asn Ala Lys Gln Asp Leu

115 120 125Leu Gln Leu Lys Asn Val Ile Ser Gln Thr Glu His Ser Tyr Lys Glu

130 135 140Leu Met Ala Gln Asn Gln Pro Lys Leu Ser Leu Pro Ile Arg Leu Leu145 150 155 160Pro Glu Lys Asp Asp Ala Gly Leu Pro Pro Pro Lys Ala Thr Arg Gly

165 170 175Cys Arg Leu His Asn Cys Phe Asp Tyr Ser Arg Cys Pro Leu Thr Ser

180 185 190Gly Phe Pro Val Tyr Val Tyr Asp Ser Asp Gln Phe Val Phe Gly Ser

195 200 205Tyr Leu Asp Pro Leu Val Lys Gln Ala Phe Gln Ala Thr Ala Arg Ala

210 215 220Asn Val Tyr Val Thr Glu Asn Ala Asp Ile Ala Cys Leu Tyr Val Ile225 230 235 240Leu Val Gly Glu Met Gln Glu Pro Val Val Leu Arg Pro Ala Glu Leu

245 250 255Glu Lys Gln Leu Tyr Ser Leu Pro His Trp Arg Thr Asp Gly His Asn

260 265 270His Val Ile Ile Asn Leu Ser Arg Lys Ser Asp Thr Gln Asn Leu Leu

275 280 285Tyr Asn Val Ser Thr Gly Arg Ala Met Val Ala Gln Ser Thr Phe Tyr

290 295 300Thr Val Gln Tyr Arg Pro Gly Phe Asp Leu Val Val Ser Pro Leu Val305 310 315 320His Ala Met Ser Glu Pro Asn Phe Met Glu Ile Pro Pro Gln Val Pro

325 330 335Val Lys Arg Lys Tyr Leu Phe Thr Phe Gln Gly Glu Lys Ile Glu Ser

340 345 350Leu Arg Ser Ser Leu Gln Glu Ala Arg Ser Phe Glu Glu Glu Met Glu

355 360 365Gly Asp Pro Pro Ala Asp Tyr Asp Asp Arg Ile Ile Ala Thr Leu Lys

405 410 415Glu Arg Glu Asp Arg Leu Glu Leu Leu Lys Leu Ser Thr Phe Ala Leu

420 425 430I1e Ile Thr Pro Gly Asp Pro Arg Leu Val Ile Ser Ser Gly Cys Ala

435 440 445Thr Arg Leu Phe Glu Ala Leu Glu Val Gly Ala Val Pro Val Val Leu

450 455 460Gly Glu Gln Val Gln Leu Pro Tyr Gln Asp Met Leu Gln Trp Asn Glu465 470 475 480Ala Ala Leu Val Val Pro Lys Pro Arg Val Thr Glu Val His Phe Leu

485 490 495Leu Arg Ser Leu Ser Asp Ser Asp Leu Leu Ala Met Arg Arg Gln Gly

500 505 510Arg Phe Leu Trp Glu Thr Tyr Phe Ser Thr Ala Asp Ser Ile Phe Asn

515 520 525Thr Val Leu Ala Met Ile Arg Thr Arg Ile Gln Ile Pro Ala Ala Pro

530 535 540Ile Arg Glu Glu Ala Ala Ala Glu Ile Pro His Arg Ser Gly Lys Ala545 550 555 560Ala Gly Thr Asp Pro Asn Met Ala Asp Asn Gly Asp Leu Asp Leu Gly

565 570 575Pro Val Glu Thr Glu Pro Pro Tyr Ala Ser Pro Arg Tyr Leu Arg Asn

580 585 590Phe Thr Leu Thr Val Thr Asp Phe Tyr Arg Ser Trp Asn Cys Ala Pro

595 600 605Gly Pro Phe His Leu Phe Pro His Thr Pro Phe Asp Pro Val Leu Pro

645 650 655Asn Val Pro Arg Glu Gln Phe Thr Val Val Met Leu Thr Tyr Glu Arg

660 665 670Glu Glu Val Leu Met Asn Ser Leu Glu Arg Leu Asn Gly Leu Pro Tyr

675 680 685Leu Asn Lys Val Val Val Val Trp Asn Ser Pro Lys Leu Pro Ser Glu

725 730 735Thr Glu Ala Ile Leu Ser Ile Asp Asp Asp Ala His Leu Arg His Asp

740 745 750Glu Ile Met Phe Gly Phe Arg Val Trp Arg Glu Ala Arg Asp Arg Ile

755 760 765Val Gly Phe Pro Gly Arg Tyr His Ala Trp Asp Ile Pro His Gln Ser

805 810 815Met Pro Gln Ala Ile Arg Asp Met Val Asp Glu Tyr Ile Asn Cys Glu

820 825 830Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ser His Ile Thr Arg Lys Pro Pro

835 840 845Ile Lys Val Thr Ser Arg Trp Thr Phe Arg Cys Pro Gly Cys Pro Gln

885 890 895Phe Arg Val Asp Ser Val Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro His Asp Lys

900 905 910Thr Lys Cys Phe Lys Phe Ile

915<210>6<211>718<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Met Cys Ala Ser Val Lys Tyr Asn Ile Arg Gly Pro Ala Leu Ile Pro1 5 10 15Arg Met Lys Thr Lys His Arg Ile Tyr Tyr Ile Thr Leu Phe Ser Ile

20 25 30Val Leu Leu Gly Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe Gln Phe Trp Pro His

35 40 45Ser Ile Glu Ser Ser Asn Asp Trp Asn Val Glu Lys Arg Ser Ile Arg

50 55 60Asp Val Pro Val Val Arg Leu Pro Ala Asp Ser Pro Ile Pro Glu Arg65 70 75 80Gly Asp Leu Ser Cys Arg Met His Thr Cys Phe Asp Val Tyr Arg Cys

85 90 95Gly Phe Asn Pro Lys Asn Lys Ile Lys Val Tyr Ile Tyr Ala Leu Lys

100 105 110Lys Tyr Val Asp Asp Phe Gly Val Ser Val Ser Asn Thr Ile Ser Arg

115 120 125Glu Tyr Asn Glu Leu Leu Met Ala Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Tyr Thr

130 135 140Asp Asp Ile Asn Arg Ala Cys Leu Phe Val Pro Ser Ile Asp Val Leu145 150 155 160Asn Gln Asn Thr Leu Arg Ile Lys Glu Thr Ala Gln Ala Met Ala Gln

165 170 175Leu Ser Arg Trp Asp Arg Gly Thr Asn His Leu Leu Phe Asn Met Leu

180 185 190Pro Gly Gly Pro Pro Asp Tyr Asn Thr Ala Leu Asp Val Pro Arg Asp

195 200 205Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Thr Trp Thr Tyr Arg Gln

210 215 220Gly Tyr Asp Val Ser Ile Pro Val Tyr Ser Pro Leu Ser Ala Glu Val225 230 235 240Asp Leu Pro Glu Lys Gly Pro Gly Pro Arg Gln Tyr Phe Leu Leu Ser

245 250 255Ser Gln Val Gly Leu His Pro Glu Tyr Arg Glu Asp Leu Glu Ala Leu

260 265 270Gln Val Lys His Gly Glu Ser Val Leu Val Leu Asp Lys Cys Thr Asn

275 280 285Leu Ser Glu Gly Val Leu Ser Val Arg Lys Arg Cys His Lys His Gln

290 295 300Val Phe Asp Tyr Pro Gln Val Leu Gln Glu Ala Thr Phe Cys Val Val305 310 315 320Leu Arg Gly Ala Arg Leu Gly Gln Ala Val Leu Ser Asp Val Leu Gln

325 330 335Ala Gly Cys Val Pro Val Val Ile Ala Asp Ser Tyr Ile Leu Pro Phe

340 345 350Ser Glu Val Leu Asp Trp Lys Arg Ala Ser Val Val Val Pro Glu Glu

355 360 365Lys Met Ser Asp Val Tyr Ser Ile Leu Gln Ser Ile Pro Gln Arg Gln

370 375 380Ile Glu Glu Met Gln Arg Gln Ala Arg Trp Phe Trp Glu Ala Tyr Phe385 390 395 400Gln Ser Ile Lys Ala Ile Ala Leu Ala Thr Leu Gln Ile Ile Asn Asp

405 410 415Arg Ile Tyr Pro Tyr Ala Ala Ile Ser Tyr Glu Glu Trp Asn Asp Pro

420 425 430Pro Ala Val Lys Trp Gly Ser Val Ser Asn Pro Leu Phe Leu Pro Leu

435 440 445Ile Pro Pro Gln Ser Gln Gly Phe Thr Ala Ile Val Leu Thr Tyr Asp

450 455 460Arg Val Glu Ser Leu Phe Arg Val Ile Thr Glu Val Ser Lys Val Pro465 470 475 480Ser Leu Ser Lys Leu Leu Val Val Trp Asn Asn Gln Asn Lys Asn Pro

485 490 495Pro Glu Asp Ser Leu Trp Pro Lys Ile Arg Val Pro Leu Lys Val Val

500 505 510Arg Thr Ala Glu Asn Lys Leu Ser Asn Arg Phe Phe Pro Tyr Asp Glu

515 520 525Ile Glu Thr Glu Ala Val Leu Ala Ile Asp Asp Asp Ile Ile Met Leu

530 535 540Thr Ser Asp Glu Leu Gln Phe Gly Tyr Glu Val Trp Arg Glu Phe Pro545 550 555 560Asp Arg Leu Val Gly Tyr Pro Gly Arg Leu His Leu Trp Asp His Glu

565 570 575Met Asn Lys Trp Lys Tyr Glu Ser Glu Trp Thr Asn Glu Val Ser Met

580 585 590Val Leu Thr Gly Ala Ala Phe Tyr His Lys Tyr Phe Asn Tyr Leu Tyr

595 600 605Thr Tyr Lys Met Pro Gly Asp Ile Lys Asn Trp Val Asp Ala His Met

610 615 620Asn Cys Glu Asp Ile Ala Met Asn Phe Leu Val Ala Asn Val Thr Gly625 630 635 640Lys Ala Val Ile Lys Val Thr Pro Arg Lys Lys Phe Lys Cys Pro Glu

645 650 655Cys Thr Ala Ile Asp Gly Leu Ser Leu Asp Gln Thr His Met Val Glu

660 665 670Arg Ser Glu Cys Ile Asn Lys Phe Ala Ser Val Phe Gly Thr Met Pro

675 680 685Leu Lys Val Val Glu His Arg Ala Asp Pro Val Leu Tyr Lys Asp Asp

690 695 700Phe Pro Glu Lys Leu Lys Ser Phe Pro Asn Ile Gly Ser Leu705 710 715<210>7<211>746<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Met Gln Ala Lys Lys Arg Tyr Phe Ile Leu Leu Ser Ala Gly Ser Cys1 5 10 15Leu Ala Leu Leu Phe Tyr Phe Gly Gly Leu Gln Phe Arg Ala Ser Arg

20 25 30Ser His Ser Arg Arg Glu Glu His Ser Gly Arg Asn Gly Leu His His

35 40 45Pro Ser Pro Asp His Phe Trp Pro Arg Phe Pro Glu Pro Leu Arg Pro

50 55 60Phe Val Pro Trp Asp Gln Leu Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val His Ile65 70 75 80Ser Pro Arg Gln Lys Arg Asp Ala Asn Ser Ser Ile Tyr Lys Gly Lys

85 90 95Lys Cys Arg Met Glu Ser Cys Phe Asp Phe Thr Leu Cys Lys Lys Asn

100 105 110Gly Phe Lys Val Tyr Val Tyr Pro Gln Gln Lys Gly Glu Lys Ile Ala

115 120 125Glu Ser Tyr Gln Asn Ile Leu Ala Ala Ile Glu Gly Ser Arg Phe Tyr

130 135 140Thr Ser Asp Pro Ser Gln Ala Cys Leu Phe Val Leu Ser Leu Asp Thr145 150 155 160Leu Asp Arg Asp Gln Leu Ser Pro Gln Tyr Val His Asn Leu Arg Ser

165 170 175Lys Val Gln Ser Leu His Leu Trp Asn Asn Gly Arg Asn His Leu Ile

180 185 190Phe Asn Leu Tyr Ser Gly Thr Trp Pro Asp Tyr Thr Glu Asp Val Gly

195 200 205Phe Asp Ile Gly Gln Ala Met Leu Ala Lys Ala Ser Ile Ser Thr Glu

210 215 220Asn Phe Arg Pro Asn Phe Asp Val Ser Ile Pro Leu Phe Ser Lys Asp225 230 235 240His Pro Arg Thr Gly Gly Glu Arg Gly Phe Leu Lys Phe Asn Thr Ile

245 250 255Pro Pro Leu Arg Lys Tyr Met Leu Val Phe Lys Gly Lys Arg Tyr Leu

260 265 270Thr Gly Ile Gly Ser Asp Thr Arg Asn Ala Leu Tyr His Val His Asn

275 280 285Gly Glu Asp Val Val Leu Leu Thr Thr Cys Lys His Gly Lys Asp Trp

290 295 300Gln Lys His Lys Asp Ser Arg Cys Asp Arg Asp Asn Thr Glu Tyr Glu305 310 315 320Lys Tyr Asp Tyr Arg Glu Met Leu His Asn Ala Thr Phe Cys Leu Val

325 330 335Pro Arg Gly Arg Arg Leu Gly Ser Phe Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gln

340 345 350Ala Ala Cys Val Pro Val Met Leu Ser Asn Gly Trp Glu Leu Pro Phe

355 360 365Ser Glu Val Ile Asn Trp Asn Gln Ala Ala Val Ile Gly Asp Glu Arg

370 375 380Leu Leu Leu Gln Ile Pro Ser Thr Ile Arg Ser Ile His Gln Asp Lys385 390 395 400Ile Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Glu Ala Tyr Phe

405 410 415Ser Ser Val Glu Lys Ile Val Leu Thr Thr Leu Glu Ile Ile Gln Asp

420 425 430Arg Ile Phe Lys His Ile Ser Arg Asn Ser Leu Ile Trp Asn Lys His

435 440 445Pro Gly Gly Leu Phe Val Leu Pro Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Gly Asp

450 455 460Phe Pro Tyr Tyr Tyr Ala Asn Leu Gly Leu Lys Pro Pro Ser Lys Phe465 470 475 480Thr Ala Val Ile His Ala Val Thr Pro Leu Val Ser Gln Ser Gln Pro

485 490 495Val Leu Lys Leu Leu Val Ala Ala Ala Lys Ser Gln Tyr Cys Ala Gln

500 505 510Ile Ile Val Leu Trp Asn Cys Asp Lys Pro Leu Pro Ala Lys His Arg

515 520 525Trp Pro Ala Thr Ala Val Pro Val Val Val Ile Glu Gly Glu Ser Lys

530 535 540Val Met Ser Ser Arg Phe Leu Pro Tyr Asp Asn Ile Ile Thr Asp Ala545 550 555 560Val Leu Ser Leu Asp Glu Asp Thr Val Leu Ser Thr Thr Glu Val Asp

565 570 575Phe Ala Phe Thr Val Trp Gln Ser Phe Pro Glu Arg Ile Val Gly Tyr

580 585 590Pro Ala Arg Ser His Phe Trp Asp Asn Ser Lys Glu Arg Trp Gly Tyr

595 600 605Thr Ser Lys Trp Thr Asn Asp Tyr Ser Met Val Leu Thr Gly Ala Ala

610 615 620Ile Tyr His Lys Tyr Tyr His Tyr Leu Tyr Ser His Tyr Leu Pro Ala625 630 635 640Ser Leu Lys Asn Met Val Asp Gln Leu Ala Asn Cys Glu Asp Ile Leu

645 650 655Met Asn Phe Leu Val Ser Ala Val Thr Lys Leu Pro Pro Ile Lys Val

660 665 670Thr Gln Lys Lys Gln Tyr Lys Glu Thr Met Met Gly Gln Thr Ser Arg

675 680 685Ala Ser Arg Trp Ala Asp Pro Asp His Phe Ala Gln Arg Gln Ser Cys

690 695 700Met Asn Thr Phe Ala Ser Trp Phe Gly Tyr Met Pro Leu Ile His Ser705 710 715 720Gln Met Arg Leu Asp Pro Val Leu Phe Lys Asp Gln Val Ser Ile Leu

725 730 735Arg Lys Lys Tyr Arg Asp Ile Glu Arg Leu

740 745<210>8<211>676<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Gln Ser Trp Arg Arg Arg Lys Ser Leu Trp Leu Ala Leu Ser Ala1 5 10 15Ser Trp Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Gly Phe Ser Leu Leu Arg Leu

20 25 30Ala Leu Pro Pro Arg Pro Arg Pro Gly Ala Ser Gln Gly Trp Pro Arg

35 40 45Trp Leu Asp Ala Glu Leu Leu Gln Ser Phe Ser Gln Pro Gly Glu Leu

50 55 60Pro Glu Asp Ala Val Ser Pro Pro Gln Ala Pro His Gly Gly Ser Cys65 70 75 80Asn Trp Glu Ser Cys Phe Asp Thr Ser Lys Cys Arg Gly Asp Gly Leu

85 90 95Lys Val Phe Val Tyr Pro Ala Val Gly Thr Ile Ser Glu Thr His Arg

100 105 110Arg Ile Leu Ala Ser Ile Glu Gly Ser Arg Phe Tyr Thr Phe Ser Pro

115 120 125Ala Gly Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Asp Ala Gln Thr Gly

130 135 140Glu Cys Ser Ser Met Pro Leu Gln Trp Asn Arg Gly Arg Asn His Leu145 150 155 160Val Leu Arg Leu His Pro Ala Pro Cys Pro Arg Thr Phe Gln Leu Gly

165 170 175Gln Ala Met Val Ala Glu Ala Ser Pro Thr Val Asp Ser Phe Arg Pro

180 185 190Gly Phe Asp Val Ala Leu Pro Phe Leu Pro Glu Ala His Pro Leu Arg

195 200 205Gly Gly Ala Pro Gly Gln Leu Arg Gln His Ser Pro Gln Pro Gly Val

210 215 220Ala Leu Leu Ala Leu Glu Glu Glu Arg Gly Gly Trp Arg Thr Ala Asp225 230 235 240Thr Gly Ser Ser Ala Cys Pro Trp Asp Gly Arg Cys Glu Gln Asp Pro

245 250 255Gly Pro Gly Gln Thr Gln Arg Gln Glu Thr Leu Pro Asn Ala Thr Phe

260 265 270Cys Leu Ile Ser Gly His Arg Pro Glu Ala Ala Ser Arg Phe Leu Gln

275 280 285Ala Leu Gln Ala Gly Cys Ile Pro Val Leu Leu Ser Pro Arg Trp Glu

290 295 300Leu Pro Phe Ser Glu Val Ile Asp Trp Thr Lys Ala Ala Ile Val Ala305 310 315 320Asp Glu Arg Leu Pro Leu Gln Val Leu Ala Ala Leu Gln Glu Met Ser

325 330 335Pro Ala Arg Val Leu Ala Leu Arg Gln Gln Thr Gln Phe Leu Trp Asp

340 345 350Ala Tyr Phe Ser Ser Val Glu Lys Val Ile His Thr Thr Leu Glu Val

355 360 365Ile Gln Asp Arg Ile Phe Gly Thr Ser Ala Asn Pro Ser Leu Leu Trp

370 375 380Asn Ser Pro Pro Gly Ala Leu Leu Ala Leu Ser Thr Phe Ser Thr Ser385 390 395 400Pro Gln Asp Phe Pro Phe Tyr Tyr Leu Gln Gln Gly Ser Arg Pro Glu

405 410 415Gly Arg Phe Ser Ala Leu Ile Trp Val Gly Pro Pro Gly Gln Pro Pro

420 425 430Leu Lys Leu Ile Gln Ala Val Ala Gly Ser Gln His Cys Ala Gln Ile

435 440 445Leu Val Leu Trp Ser Asn Glu Arg Pro Leu Pro Ser Arg Trp Pro Glu

450 455 460Thr Ala Val Pro Leu Thr Val Ile Asp Gly His Arg Lys Val Ser Asp465 470 475 480Arg Phe Tyr Pro Tyr Ser Thr Ile Arg Thr Asp Ala Ile Leu Ser Leu

485 490 495Asp Ala Arg Ser Ser Leu Ser Thr Ser Glu Val Asp Phe Ala Phe Leu

500 505 510Val Trp Gln Ser Phe Pro Glu Arg Met Val Gly Phe Leu Thr Ser Ser

515 520 525His Phe Trp Asp Glu Ala His Gly Gly Trp Gly Tyr Thr Ala Glu Arg

530 535 540Thr Asn Glu Phe Ser Met Val Leu Thr Thr Ala Ala Phe Tyr His Arg545 550 555 560Tyr Tyr His Thr Leu Phe Thr His Ser Leu Pro Lys Ala Leu Arg Thr

565 570 575Leu Ala Asp Glu Ala Pro Thr Cys Val Asp Val Leu Met Asn Phe Ile

580 585 590Val Ala Ala Val Thr Lys Leu Pro Pro Ile Lys Val Pro Tyr Gly Lys

595 600 605Gln Arg Gln Glu Ala Ala Pro Leu Ala Pro Gly Gly Pro Gly Pro Arg

610 615 620Pro Lys Pro Pro Ala Pro Ala Pro Asp Cys Ile Asn Gln Ile Ala Ala625 630 635 640Ala Phe Gly His Met Pro Leu Leu Ser Ser Arg Leu Arg Leu Asp Pro

645 650 655Val Leu Phe Lys Asp Pro Val Ser Val Gln Arg Lys Lys Tyr Arg Ser

660 665 670Leu Glu Lys Pro

675<210>9<211>330<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Met Arg Cys Cys His Ile Cys Lys Leu Pro Gly Arg Val Met Gly Ile1 5 10 15Arg Val Leu Arg Leu Ser Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Leu Val

20 25 30Ala Gly Ala Leu Thr Ala Leu Leu Pro Ser Val Lys Glu Asp Lys Met

35 40 45Leu Met Leu Arg Arg Glu Ile Lys Ser Gln Gly Lys Ser Thr Met Asp

50 55 60Ser Phe Thr Leu Ile Met Gln Thr Tyr Asn Arg Thr Asp Leu Leu Leu65 70 75 80Lys Leu Leu Asn His Tyr Gln Ala Val Pro Asn Leu His Lys Val Ile

85 90 95Val Val Trp Asn Asn Ile Gly Glu Lys Ala Pro Asp Glu Leu Trp Asn

100 105 110Ser Leu Gly Pro His Pro Ile Pro Val Ile Phe Lys Gln Gln Thr Ala

115 120 125Asn Arg Met Arg Asn Arg Leu Gln Val Phe Pro Glu Leu Glu Thr Asn

130 135 140Ala Val Leu Met Val Asp Asp Asp Thr Leu Ile Ser Thr Pro Asp Leu145 150 155 160Val Phe Ala Phe Ser Val Trp Gln Gln Phe Pro Asp Gln Ile Val GIy

165 170 175Phe Val Pro Arg Lys His Val Ser Thr Ser Ser Gly Ile Tyr Ser Tyr

180 185 190Gly Ser Phe Glu Met Gln Ala Pro Gly Ser Gly Asn Gly Asp Gln Tyr

195 200 205Ser Met Val Leu Ile Gly Ala Ser Phe Phe Asn Ser Lys Tyr Leu Glu

210 215 220Leu Phe Gln Arg Gln Pro Ala Ala Val His Ala Leu Ile Asp Asp Thr225 230 235 240Gln Asn Cys Asp Asp Ile Ala Met Asn Phe Ile Ile Ala Lys His Ile

245 250 255Gly Lys Thr Ser Gly Ile Phe Val Lys Pro Val Asn Met Asp Asn Leu

260 265 270Glu Lys Glu Thr Asn Ser Gly Tyr Ser Gly Met Trp His Arg Ala Glu

275 280 285His Ala Leu Gln Arg Ser Tyr Cys Ile Asn Lys Leu Val Asn Ile Tyr

290 295 300Asp Ser Met Pro Leu Arg Tyr Ser Asn Ile Met Ile Ser Gln Phe Gly305 310 315 320Phe Pro Tyr Ala Asn Tyr Lys Arg Lys Ile

325 330

Claims

1.根据(a)至(i)中任一项的DNA，

(a)编码含有SEQ ID NO：2之氨基酸序列的蛋白质的DNA，

(b)含有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的编码区的DNA，

(e)编码含有SEQ ID NO：4之氨基酸序列的蛋白质的DNA，

(f)含有SEQ ID NO：3之核苷酸序列的编码区的DNA，

(i)编码含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之氨基酸序列的蛋白质的部分肽的DNA。

2.由根据权利要求1的DNA编码的蛋白质或肽。

3.插入了根据权利要求1的DNA的载体。

4.携有根据权利要求3的载体的宿主细胞。

5.生产根据权利要求2的蛋白质或肽的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)培养根据权利要求4的细胞，和

(b)从经培养的细胞或培养物上清液中回收细胞所表达的重组蛋白质。

6.抗根据权利要求2的蛋白质或肽的抗体。

7.含有至少15个核苷酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸与选自SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：3的DNA或与其互补DNA的DNA杂交。

8.筛选能与根据权利要求2的蛋白质或肽结合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)使蛋白质或肽与受试样品接触，

(b)检测受试样品与所述蛋白质或肽的结合，和

(c)选择与所述蛋白质或肽结合的化合物。

9.筛选能抑制Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽结合的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽接触，

(b)检测Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽的结合，和

(c)选择能减弱该结合的化合物。

10.通过根据权利要求9的方法分离的化合物，其中所述化合物抑制Reg蛋白与根据权利要求2的蛋白质或肽的结合。

11.筛选能对权利要求2的蛋白质的激活所致信号转导进行促进或抑制的化合物的方法，其中所述方法包括下列步骤：

(a)在受试样品的存在下，使Reg蛋白与在细胞表面表达根据权利要求2的蛋白质的细胞接触，

(b)检测细胞在应答Reg蛋白的刺激中的改变，

(c)选择与缺乏受试样品时所作的检测相比，能增强或抑制所述细胞改变的化合物。

12.根据权利要求11的方法，其中所述细胞改变包括细胞-增殖活性或细胞的DNA-合成活性的改变。

13.通过根据权利要求11或12的方法分离的化合物，其中所述化合物能促进或抑制由激活根据权利要求2的蛋白质所致的信号转导。

14.一种药剂，其含有根据权利要求1的DNA，根据权利要求2的蛋白质或肽，根据权利要求3的载体，根据权利要求6的抗体，或根据权利要求10或权利要求13的化合物。

15.根据权利要求14的药剂，其中所述药剂选自Reg-结合剂，Reg蛋白应答细胞的胞内信号转导的调节剂，细胞增殖调节剂，DNA合成调节剂和细胞凋亡调节剂。

16.根据权利要求14或权利要求15的药剂，其中所述药剂是抗-糖尿病药物。