KR20020033635A - Ｒｅｇ 결합단백질 - Google Patents

Abstract

래트 췌장 랑게르한스섬 유래 cDNA로부터 Reg 단백질에 결합하는 단백질을 클로닝하는 것에 성공했다. COS 세포의 세포표면에 발현시킨 상기 단백질은, Reg 단백질과 특이적으로 결합하는 것이 판명되었다. Reg 결합단백질을 RINm5F β세포에서 발현시킨 바, 배지에 첨가한 Reg 단백질의 용량 의존적으로 DNA 합성 및 세포의 증식이 자극되고, 보다 고농도에 있어서는 아포토시스를 유도했다. 상기 단백질은 β세포 등의 세포표면에 발현하는 Reg 수용체로서 기능하고 있어, 이들 세포의 세포증식을 제어하고 있는 것으로 생각된다. 상기 단백질이나 그 유전자는, 당뇨병의 새로운 치료약개발을 위해 유용하다.

Description

Ｒｅｇ 결합단백질{Reg-binding protein}

기술분야

본 발명은, Reg 단백질에 결합하는 신규한 단백질 및 그 유전자, 또한 이들의 제조 및 용도에 관한 것이다.

배경기술

췌장 랑게르한스섬 β세포는 생체에 있어서의 유일한 혈당 강하인자 인슐린을 생산한다. 종래, 췌장 β세포는 일단 상해되어 세포수가 감소하면 용이하게 재생증식하지 않는 것으로 생각되고, 이것이 당뇨병 발증의 중요한 요인이자, 동시에 원인에 기인하는 근본적인 당뇨병치료를 할 수 없는 이유로 되어 왔다.

종래, 당뇨병치료로서는 인슐린의 투여, 또는 설포닐우레아계의 경구 당뇨병약이 투여된다. 그러나 인슐린투여는 대증요법으로, 동시에 생리적 혈중 인슐린농도를 유지하는 것이 어렵고, 더욱이, 동맥경화증, 신경장해, 안병변(progression of retinopathy)을 진행시키는 등, 당뇨병의 합병증치료를 생각한 경우에는 그 치료에는 한계가 있었다. 또한 경구 당뇨병약은 장기투여에 있어서의 관동맥경화증이나 췌장으로의 지나친 부하에 의한 것으로 생각되는 인슐린분비능 저하 등의 부작용이 있었다.

본 발명자 등은 지금까지 β세포장해 및 그 예방 메커니즘을 해석해 왔다(H. Yamamoto, et al., Nature 294, 284 (1981); Y. Uchigata, et al., J. Biol Chem. 257, 6084 (1982); Y. Uchigata, et al., Diabetes 32, 316 (1983); H. Okamoto, Bioessays 2, 15 (1985); H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999)). 더욱이 본 발명자 등은, 실험적으로 췌장 β세포를 재생증식시키는 것에 성공하고(T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 (1994); Yonemura, Y. et al. (1984) Diabetes 33, 401-404), 재생시에 특이적으로 발현하는 유전자를 단리하여 Reg(Regenerating gene)라 명명했다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990); T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 (1994)). 또한, Reg 유전자산물인 Reg 단백질이 췌장 β세포의 재생증식인자인 것을 명백하게 하고, 당뇨병 모델동물을 사용한 실험으로부터, Reg 단백질투여나 Reg 유전자의 활성화, 더 나아가서는 Reg 유전자도입에 의한 당뇨병치료의 가능성을 나타냈다(Watanabe, T. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589-3592; Gross, D.J. et al. (1998) Endocrinology 139, 2369-2374; Okamoto, H. (1999) J. Mol. Med. 77, 74-79). 이들 해석으로부터, Reg 단백질을 투여하면 β세포의 재생 및 증식이 유도되어, 그것에 의해 β세포의 양이 증가하여, 90% 췌장 절제 래트(pancreatectomized rats) 및 비비만 당뇨병 마우스의 당뇨병이 호전되는 것이 알려져 있다. 그러나, Reg 단백질이 어떠한 단백질과 상호작용함으로써 기능을 발휘하고 있는지에 대해서는 불명확했었다.

Reg 단백질은 인슐린투여의 약점을 보완하는 췌장 β세포의 증식인자로서 당뇨병치료로의 응용이 기대되지만, 분자량이 크고, 경구투여가 어려운 점이나, 더욱이 고분자 단백질의 생체내에서의 타겟팅이 곤란하다는 등, 임상응용에는 수 많은 기술적 과제가 존재한다.

발명의 개시

본 발명은, Reg 단백질에 결합하는 신규한 단백질 및 그 유전자, 또한 그들의 제조방법 및 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 특히 본 발명의 단백질은, 당뇨병에 대한 새로운 치료약의 개발에 유용하다.

본 발명자는, 췌장 β세포계 세포에 대한 Reg 단백질의 작용을 조사하기 위해, 효모를 사용하여 제조한 재조합 Reg 단백질을, 래트 인슐리노마세포(rat insulinoma cell) 유래 세포주 RINm5F에 첨가하는 실험을 행했다. 그 결과, Reg 단백질 첨가에 의해 RINm5F 세포의 5'-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 함입이 유의하게 증가하여, 상기 세포는 Reg 단백질에 의해 증식이 촉진되는 것이 판명되었다. 이어서 본 발명자는, Reg 단백질을¹²⁵I로 표지하고, RINm5F 세포에 첨가하여 그 결합활성을 조사했다. 그 결과, Reg 단백질이 농도 의존적으로 RINm5F 세포로 결합함이 관찰되었고, 그 결합은 과잉량의 비표지 Reg 단백질에 의해 저해되는 것으로부터 보아 특이적인 것으로 생각되었다. 이들 결과는, 췌장 β세포에는 Reg 단백질 수용체가 발현하고 있어, Reg 단백질의 결합에 의해 세포증식이 촉진되는 것을 시사하고 있다.

본 발명자는, Reg 단백질 수용체로서 기능하는 Reg 결합단백질을 단리하기 위해, 래트 췌장 랑게르한스섬 polyA(+)RNA로부터 파지 벡터에 의한 발현 cDNA 라이브러리를 구축하여, 표지한 Reg 단백질을 사용한 웨스트웨스턴법에 의해 Reg 결합단백질을 코드하는 유전자의 스크리닝을 행했다. 그 결과, 364 아미노산로 된 단백질을 코드하는 신규한 cDNA를 단리하는 것에 성공했다. 이 cDNA를 포유동물세포 발현벡터에 삽입하고, COS-7 세포에서 발현시켜, 재조합 Reg 단백질을 이 세포에 첨가한 바, Reg 단백질은 이 COS-7 세포에 특이적으로 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명자는, 이 cDNA를 프로브로 래트 췌장 랑게르한스섬 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, Reg 결합단백질을 코드하는 cDNA를 더욱 단리하는 것에 성공했다. 해당 cDNA는 919 아미노산로 된 세포 표면단백질을 코드하고 있었다. 이 cDNA를 포유동물세포에서 발현시키면, 단백질은 세포표면에 발현하고, 세포는 Reg 단백질과 높은 친화성으로 결합했다. 이 cDNA에 의한 트랜스펙션을 받은 RINm5F β세포는, Reg 단백질의 첨가에 의해 BrdU의 함입이 유도되어, 세포수가 증가했다. 이들 결과로부터, 단리된 cDNA가 코드하는 Reg 결합단백질은 Reg 단백질의 수용체로서, 췌장 β세포에서 Reg 단백질에 의한 세포증식 시그날을 매개하고 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 이 Reg 결합단백질을 높게 발현하는 RINm5F 세포는, 고농도Reg 단백질을 첨가하면 아포토시스(apoptosis)가 유도되는 것이 판명되었다.

이들 사실로부터, 이 Reg 결합단백질은 Reg 단백질의 시그날을 전달하여, 췌장 β세포 등에 있어서 세포증식 등을 제어함으로써 췌장 β세포 등의 양(mass)을 조절하고 있는 것으로 생각할 수 있다. 본 발명의 Reg 결합단백질이나 그 유전자는, 당뇨병의 병인 메커니즘(the etiological mechanism)을 해명하기 위한 유용한 수단이 되고, 또한, 당뇨병치료약 개발로의 응용도 가능하다고 생각된다.

본 발명은, Reg 단백질 결합단백질 및 그 유전자, 또한 그들의 제조방법 및 용도에 관한 것이고, 보다 구체적으로는,

(1) 하기 (a)에서 (i) 중 어느 하나의 DNA,

(a) 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA,

(b) 서열번호: 1의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,

(c) 서열번호: 2의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환,결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열로 되고, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,

(d) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA로서, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,

(e) 서열번호: 4의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA,

(f) 서열번호: 3의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA,

(g) 서열번호: 4의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열로 되고, Reg 단백질과 결합하는 활성을갖는 단백질을 코드하는 DNA,

(h) 서열번호: 3의 염기서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA로서, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA,

(i) 서열번호: 2 또는 4의 아미노산서열로 된 단백질의 부분펩티드를 코드하는 DNA,

(2) (1)의 DNA에 의해 코드되는 단백질 또는 펩티드,

(3) (1)의 DNA가 삽입된 벡터,

(4) (3)의 벡터를 보유하는 숙주세포,

(5) (4)의 숙주세포를 배양하여, 상기 세포에서 발현한 재조합 단백질을, 상기 배양세포 또는 그 배양상청으로부터 회수하는 공정을 포함하는 (2)의 단백질 또는 펩티드의 제조방법,

(6) (2)의 단백질 또는 펩티드에 대한 항체,

(7) 서열번호: 1 또는 3의 염기서열로 된 DNA 또는 그 상보 DNA와 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드,

(8) (2)의 단백질 또는 펩티드에 결합하는 화합물의 스크리닝방법으로서,

(a) 상기 단백질 또는 펩티드에 피검시료를 접촉시키는 공정,

(b) 상기 단백질 또는 펩티드와 피검시료와의 결합을 검출하는 공정, 및

(c) 상기 단백질 또는 펩티드에 결합하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(9) (2)의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝방법으로서,

(a) 피검시료 존재하에서 (2)의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질을 접촉시키는 공정,

(b) (2)의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 검출하는 공정, 및

(c) 상기 결합을 저하시키는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(10) (9)의 방법에 의해 단리될 수 있는 (2)의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물,

(11) (2)의 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,

(a) 피검시료의 존재하에서 (2)의 단백질을 그 표면에 발현하는 세포에 Reg 단백질을 접촉시키는 공정,

(b) Reg 단백질에 의한 자극에 응답한 상기 세포의 변화를 검출하는 공정, 및

(c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우(대조)와 비교하여, 상기 세포의 변화를 증강 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법,

(12) (11)에 있어서, 상기 세포의 변화가, 세포증식활성 또는 세포의 DNA 합성활성의 변화인 방법,

(13) (11) 또는 (12)의 방법에 의해 단리될 수 있는, (2)의 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물,

(14) (1)의 DNA, (2)의 단백질 또는 펩티드, (3)의 벡터, (6)의 항체, (10)의 화합물, 또는 (13)의 화합물을 포함하는 약제,

(15) (14)에 있어서, Reg 결합제, Reg 단백질에 응답한 세포내 시그날전달의 조절제, 세포증식조절제, DNA 합성조절제 및 아포토시스 조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제,

(16) (14) 또는 (15)에 있어서, 당뇨병치료약인 약제에 관한 것이다.

본 발명은, 췌장에서 발현하여 Reg 단백질에 결합하는 신규한 단백질(Reg 결합단백질)에 관한 것이다. 본 발명에 포함되는, 단리된 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA의 염기서열을 서열번호: 1 및 3에, 이들 cDNA에 의해 코드되는 「Reg 결합단백질」의 아미노산서열을 각각 서열번호: 2 및 4에 나타낸다.

본 발명의 래트 Reg 결합단백질을 코드하는 cDNA 중 하나는, 364 아미노산잔기의 단백질(서열번호: 2)을 코드하는 오픈 리딩 프레임(Open reading frame)을 함유한다(서열번호: 1). 이 cDNA를 프로브로 한 스크리닝에 의해, 919 아미노산잔기의 단백질(서열번호: 4)을 코드하는 오픈 리딩 프레임을 함유하는 래트 Reg 결합단백질을 코드하는 cDNA(서열번호: 3)도 단리할 수 있었다. 본 발명의 래트 「Reg 결합단백질」은, 세포표면에 발현하여 Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는다. 상술한 바와 같이, Reg 단백질은 췌장 β세포의 재생시에 특이적으로 발현하는 재생증식인자로서, 그 단백질이나 유전자는 당뇨병으로의 치료 가능성이 나타내어져 있다. 본 발명의 Reg 결합단백질은, 이 Reg 단백질의 수용체로서 기능하여, 췌장 β세포의 증식제어를 포함하는 세포 생리기능의 조절에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 Reg 결합단백질은 당뇨병 병원의 메커니즘을 해명하기 위한 연구대상으로서, 또한 췌장 β세포의 기능이 관여하는 질환(당뇨병 등)에 대한 치료제 개발을 위한 수단으로서의 이용을 생각할 수 있다.

최근, Reg 및 Reg 관련유전자가 몇개 단리되고, 이들은 다중유전자군 Reg 패밀리를 구성하고 있는 것이 명백해졌다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999); M. Unno et al., J. Biol. Chem. 268, 15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185, 159 (1997); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000)). Reg 패밀리의 멤버는 전부 엑손 6개 및 인트론 5개로 된 보존된 유전자구성을 나타내고, 패밀리내의 아미노산서열의 상동성은 40~85%이며, 3쌍의 분자내 S-S 결합을 형성하는 6개의 보존된 시스테인잔기를 갖는다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999); M. Unno et al., J. Biol. Chem. 268, 15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185, 159 (1997); T. Itoh et al., FEBS Lett. 272, 85 (1990); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000)). 이 패밀리의 멤버는, Reg 단백질의 1차구조에 기인하여 I형, II형 및 III형의 3개의 서브클래스로 나뉜다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999); M. Unno et al., J. Biol. Chem. 268,15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185, 159 (1997); T. Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265, 7432 (1990); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000)). 본 실시예에서 사용한 래트 및 인간의 Reg 단백질을 포함하는 I형 Reg 단백질은 재생 췌장섬에서 발현된다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); K. Terazono, et al., J. Biol.Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999)). 최근, 병적 조건하에서의 I형 Reg의 발현이, 인간대장암(T. Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265, 7432 (1990); M. E. Zenilman et al., J. Gastrointest. Surg. 1, 194 (1997); F. R. Bernard-Perrone et al., J. Histochem. Cytochem. 47, 863 (1999)), 래트 위점막(H. Fukui et al., Gastroenterology 115, 1483 (1998)) 및 장크롬 친화성 세포(enterochromaffin-like cell)(M. Asahara et al., Gastroenterology 111, 45 (1996))에 있어서 보고되어 있고, 장 파네트세포(intestinal Paneth cell)(L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996)), 간세포암(L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996)), 췌장외분비세포(pancreatic acinar cells)(L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996); E. M. Ortiz et al., Gastroenterology 114, 808 (1998)) 및 슈반세포(Schwann cell)(J. F. Livesey et al., Nature 390, 614 (1997))의 세포증식에 있어서의 III형 Reg 단백질의 관여도 지적되어 있다. 따라서, 동정된 Reg 수용체는, Reg 패밀리유전자의 산물에 대한 수용체로서 생리적 조건하 및 병적 조건하에서의 여러 조직 및 세포에서 기능하고 있는 것으로 생각할 수 있다.

이상의 사실로부터도 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 단백질은, 당뇨병은 물론, 소화관종양(Asahara, M. et al., Gastroenterology 111, 45-55 (1996);Fukui, H. et al., Gastroenterology 115, 1483-1493 (1998)), 신경변성증(Livesy, F.J. et al., Nature 390, 614-618 (1997)), 췌장염(Christa, L. et al., Am. J. Phsiol. 271, G993-G1002 (1996); Ortiz, E. et al., Gastroenterology 114, 808-816 (1998)) 등의 치료나 예방을 위한 의약품개발에도 유용하다. 또한, 종양 등에 있어서 Reg 단백질-Reg 결합단백질의 이상(예를 들면 과잉자극)이 일어나는 경우에는, 가용형 Reg 결합단백질의 투여에 의해 과잉자극을 억제하여, 종양의 증식 등을 억제하는 것이 가능하여, Reg 결합단백질 자체를 치료에 응용하는 것도 생각할 수 있다.

본 발명에 있어서는, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 한, 래트 「Reg 결합단백질」과 구조적으로 유사한 단백질도 포함된다. 이러한 구조적으로 유사한 단백질에는, 「Reg 결합단백질」의 변이체나 다른 생물 유래의 「Reg 결합단백질」이 포함된다.

이러한 단백질은, 당업자라면 예를 들면, 공지의 변이도입법을 사용하여 조제할 수 있다. 당업자에게 공지의 단백질 중 아미노산을 개변하는 방법으로서는, 예를 들면, Kunkel법(Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488), Oligonucleotide-directed Dual Amber(ODA)법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275), PCR-제한효소법(Ito, W. et al. (1991) Gene 102, 67-70), ODA-PCR법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Ito, W. et al. (1991) Gene 102, 67-70) 등을 들 수 있다. 단백질에 있어서의 아미노산의 개변은 그 수에 제한은 없지만, 인위적으로 행하는 것이라면, 통상 50아미노산 이내, 바람직하게는 10아미노산 이내, 더욱 바람직하게는 5아미노산 이내이다.

또한, 단백질의 아미노산의 변이는 천연에서도 생길 수 있다. 이와 같이 Reg 단백질에 결합하는 활성을 갖는 한, 인위적인 또는 자연계에서의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해 천연형 래트 「Reg 결합단백질」에 대해 아미노산서열이 다른 단백질도 본 발명에 포함된다.

치환되는 아미노산은, 치환전의 아미노산과 닮은 성질을 갖는 아미노산인 것이 바람직하다고 생각된다. 예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp는, 모두 비극성 아미노산으로 분류되기 때문에, 서로 닮은 성질을 갖는 것으로 생각된다. 또한, 비하전성으로서는, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln을 들 수 있다. 또한, 산성 아미노산으로서는, Asp 및 Glu를 들 수 있다. 또한, 염기성 아미노산으로서는, Lys, Arg, His를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 래트 「Reg 결합단백질」의 아미노산이 결실된 단백질에는, 세포외영역 만을 갖는 단백질이 포함된다. 또한, 래트 「Reg 결합단백질」에 대해 아미노산이 부가된 단백질에는, 래트 「Reg 결합단백질」과 다른 펩티드와의 융합단백질이 포함된다.

또한, Reg 단백질에 결합하는 활성을 갖는, 래트 「Reg 결합단백질」과 구조적으로 유사한 단백질의 조제는, 공지의 하이브리다이제이션기술(Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press)이나 폴리머라아제 연쇄반응기술(Sambrook, J. et al.(1989) Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Innis, M.A. et al., PCR protocols,Academic Press (1990)를 이용하여 행할 수 있다. 즉, 당업자에게 있어서는 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA 서열(서열번호: 1 또는 3) 또는 그 일부를 프로브로 하고, 또한, 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA에 특이적으로 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여, 여러 다른 생물로부터 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA와 상동성이 높은 DNA를 단리하고, 더욱이 단리한 DNA로부터 래트 「Reg 결합단백질」과 구조적으로 유사한 단백질을 얻는 것이 상투적인 수단으로 되어 있다.

본 발명에 있어서는, Reg 단백질에 결합하는 활성을 갖는 한, 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA와 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 단백질을 포함한다. 이러한 단백질을 단리하는 다른 생물로서는, 예를 들면, 인간, 원숭이, 마우스, 토끼, 염소, 소, 돼지, 개 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 이러한 단백질을 코드하는 DNA를 단리하기에는, 예를 들면, 이들 생물의 췌장 랑게르한스섬 β세포가 재료로서 적합하다고 생각된다.

래트 이외의 생물에 유래하는 「Reg 결합단백질」을 코드하는 DNA는, 통상, 래트 「Reg 결합단백질」 cDNA의 염기서열(서열번호: 1 또는 3)과 높은 상동성을 갖는다. 높은 상동성이란, 염기서열 레벨에서 적어도 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열의 동일성을 가리킨다. 서열의 상동성은, FASTA(넓은 범위에서 서열의 유사성을 유지하고 있는 것을 검색), BLAST(국소적으로 높은 유사성을 갖는 서열을 검색), SSEARCH(Smith-Waterman algorithm을 채용한 검색)에 의해 결정할 수 있다. 이들은 일본 DNA 데이터 베이스 등의 공지의 유전자 데이터 베이스, 홈페이지에서 사용하는 것이 가능하다.

래트 「Reg 결합단백질」 cDNA를 이용하여 래트 「Reg 결합단백질」과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 cDNA를 다른 생물로부터 단리하기 위한 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 당업자에 의해 적절히 선택할 수 있다. 일례를 나타내면, 6×SSC/5×FBP/0.5% SDS/0.2 mg/ml 연어(청어)정자 DNA/10% 포름아미드용액으로 42℃(저스트린젠트한 조건)에서 하이브리다이제이션을 행할 수 있다. 바람직하게는, 6×SSC/5×FBP/0.5% SDS/0.2 mg/ml 연어(청어)정자 DNA/30% 포름아미드용액으로 42℃(중간적인 스트린젠트의 조건)에서 하이브리다이제이션을 행한다. 더욱 바람직하게는, 6×SSC/5×FBP/0.5% SDS/0.2 mg/ml 연어(청어)정자 DNA/50% 포름아미드용액으로 50℃(고스트린젠트한 조건)에서 하이브리다이제이션을 행한다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 주는 요소로서는 온도나 포름아미드의 농도, 염농도 등 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

본 발명의 단백질은, 천연 단백질 외에, 유전자 재조합기술을 이용한 재조합 단백질로서 조제할 수 있다. 천연 단백질은, 예를 들면, 「Reg 결합단백질」이 발현하고 있는 것으로 생각되는 조직(예를 들면, 췌장 랑게르한스섬 β세포)의 추출액에 대해, 후술하는 「Reg 결합단백질」에 대한 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)를 행하는 방법에 의해 조제하는 것이 가능하다. 한편, 재조합 단백질은, 후술하는 바와 같이 「Reg 결합단백질」을 코드하는 DNA로 형질전환한 세포를 배양하고, 이 단백질을 발현시켜 회수함으로써 조제하는 것이가능하다.

본 발명은, 본 발명 단백질의 부분펩티드를 포함한다. 본 발명 단백질의 부분펩티드로서는, 예를 들면, 본 발명의 단백질 중, Reg 단백질과의 결합부위에 상당하는 펩티드를 들 수 있다. 본 발명 단백질의 부분펩티드는, 생체투여하함으로써, 본 발명 단백질의 아고니스트(agonist)나 안타고니스트(antagonist), Reg 단백질의 길항제 등으로서의 이용을 생각할 수 있다. 이들 부분펩티드는, 본 발명의 단백질을 매개로 한 시그날전달의 활성화제나 저해제로서 유용하다. 또한, 본 발명의 부분펩티드로서는, 예를 들면, 본 발명 단백질의 N 말단영역의 부분펩티드나, C 말단영역의 부분펩티드를 들 수 있고, 이들 펩티드는 항체의 조제에 이용할 수 있다. 본 발명의 단백질에 특이적인 아미노산서열을 갖는 부분 폴리펩티드는, 적어도 7아미노산, 바람직하게는 적어도 8아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 9아미노산의 사슬길이를 갖는다. 본 발명의 부분펩티드는, 예를 들면, 유전자공학적 수법, 공지의 펩티드합성법, 또는 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면 Reg 단백질과 결합하는 영역을 포함하는 부분펩티드는, Reg 단백질을 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 부분펩티드는, Reg 단백질 결합제로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA로서는, 이들 단백질을 코드할 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없고, cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 포함된다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드할 수 있는 한, 유전암호의 축중에 기인하는 임의의 염기서열을 갖는 DNA가 포함된다.

본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA는, 예를 들면, 서열번호: 1 또는 3의 cDNA 또는 그 단편, 그들에 상보적인 RNA, 또는 상기 cDNA 서열의 일부를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를³²P 등으로 표지하고, 본 발명의 단백질이 발현하고 있는 조직(예를 들면 췌장 등)유래의 cDNA 라이브러리에 하이브리다이즈시킴으로써 스크리닝할 수 있다. 또는, 이들 cDNA의 염기서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 적당한 조직(예를 들면 췌장 등)유래의 cDNA를 주형으로 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭하여 클로닝하는 것도 가능하다. 게놈 DNA는, 예를 들면, 서열번호: 1 또는 3의 cDNA 또는 그 단편, 그들에 상보적인 RNA, 또는 상기 cDNA 서열의 일부를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를³²P 등으로 표지하고, 게놈 DNA 라이브러리에 하이브리다이즈시킴으로써 스크리닝할 수 있다. 또는, 이들 cDNA의 염기서열에 대응하는 올리고뉴클레오티드를 합성하여, 게놈 DNA를 주형으로 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 증폭하고, 클로닝하는 것도 가능하다. 한편, 합성 DNA는 예를 들면, 서열번호: 1 또는 3의 cDNA의 부분서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 어닐링시켜 이중가닥으로 하고, DNA 리가아제로 결합시킴으로써 조제할 수 있다.

이들 DNA는, 재조합 단백질의 생산에 유용하다. 즉, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열번호: 1 또는 3의 DNA)를 적당한 발현벡터에 삽입하여, 상기 벡터를 적당한 세포에 도입하여 얻은 형질전환체를 배양하고, 발현시킨 단백질을 회수함으로써 본 발명의 단백질을 재조합 단백질로서 조제하는 것이 가능하다. 본 발명의 단백질은 정제 또는 정제되지 않은 단백질로서, 또한, 포유동물세포에 발현시켜, 막에 결합한 형태로서 조제하는 것 등이 가능하다.

구체적인 숙주-벡터계로서는, 예를 들면 E. coli-pGEX계(Amersham Pharmacia Biotech; GST와의 융합단백질로서 발현), E. coli-pHB6계 및 pVB6계(Roche Diagnostics; 6개의 히스티딘과의 융합단백질로서 발현), E. coli-pMAL계(New England Biolabs; 말토오스 결합단백질과의 융합단백질로서 발현), E. coli-pTYB계(New England Biolabs; Intein과의 융합단백질로서 발현, 그 후 DTT 존재하 Interin 부분이 절단되어, 목적단백질 만의 정제가 용이), Pichia-pPIC계 및 pGAP계(Invitorogen), 포유동물세포(예를 들면 COS-7)-pCI-neo계(Promega) 및 pHook계(Invitorogen) 등을 들 수 있다.

숙주로의 벡터의 도입법은, E. coli로는 공지의 캄피턴트 세포(competent cell)로의 형질전환(transformation) 또는 전기천공법, Pichia로는, 예를 들면 Pichia Easy Comp Kit(실시예1 참조)에 의해 조제한 캄피턴트 세포로의 형질전환, 또는 전기천공법, 포유동물세포로는 전기천공법 또는 공지의 양이온성 지질(cationic lipds)를 사용한 리포펙션법 등에 의해 행할 수 있다.

숙주세포에 있어서 발현시킨 재조합 단백질은, 공지의 방법에 의해 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을, 예를 들면, N 말단에 히스티딘잔기의 태그, 또는 글루타티온 S-트랜스페라아제(GST) 등을 결합한 융합단백질의 형태로 발현시킨 경우에는, 각각 니켈컬럼 또는 글루타티온세파로오스컬럼(glutathionesepharose column)에 의해 정제할 수 있다.

본 발명의 단백질을 코드하는 DNA는, 또한, 그 변이에 기인하는 질환의 유전자치료에 응용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 백시니아바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스벡터 등을 사용한 유전자치료를 생각할 수 있다. 치료의 실제방법으로서는, 예를 들면 이식용 췌장, 또는 췌장 랑게르한스섬에 배양조건하에서 이들 재조합 바이러스를 사용하여 「Reg 결합단백질」을 도입하여, 이식을 행함으로써 췌장 β세포의 증식에 의해 이식치료효과의 향상과, 이식용 장기를 유효하게 이용하는 것을 꾀할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호: 1 또는 3의 염기서열로 된 DNA 또는 그 상보 DNA와 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 상기 폴리뉴클레오티드는, 바람직하게는 서열번호: 1 또는 3의 염기서열로 된 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드이다. 「특이적으로 하이브리다이즈한다」라는 것은, 통상의 하이브리다이제이션 조건하, 바람직하게는 상기한 중간적인 스트린젠트한 하이브리다이제이션의 조건하, 보다 바람직하게는 상기한 고스트린젠트한 하이브리다이제이션의 조건하에서, 다른 단백질을 코드하는 DNA와의 크로스 하이브리다이제이션이 유의하게 생기지 않는 것을 의미한다. 하이브리다이제이션은, 상기의 조건으로 행하면 좋다. 이들 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 또는 상기 DNA와 상보적인 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브나 프라이머, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드유도체(예를 들면 안티센스올리고뉴클레오티드나 리보자임 등)이 포함된다.

본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA 또는 그 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드는, 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자나 cDNA의 클로닝, 또는 PCR에 의한 증폭에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드하는 RNA의 검출 및 정량에 유용하다. 더욱이, 제한단편길이다형성(restriction fragment length polymorphism)(RFLP), 단일가닥 DNA 고차구조다형성(single-strand conformation polymorphism)(SSCP) 등의 방법에 의해, 유전자 또는 cDNA의 변이, 다형성, 또는 이상의 검출(유전자진단 등)에 이용할 수 있다.

본 발명의 단백질은, 췌장의 형성, 재생 및/또는 유지, 특히 췌장 β세포의 양조절에 중요한 기능을 갖기 때문에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 췌장의 검사, 예를 들면 췌장 β세포의 검사에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당뇨병의 검사에 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 피검자로부터 췌장조직 샘플을 단리하여, 이 조직에 있어서의 본 발명의 단백질 발현량의 이상을 노던 하이브리다이제이션, RT-PCR, 또는 DNA 칩(DNA Microarray) 등으로 검사할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 또는 RNA의 변이 또는 다형성의 유무를, 서열을 결정하거나, SSCP 또는 RFLP 등에 의해 검사할 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 검사시약으로서 사용하는 경우에는, 적절히 멸균수나 완충액, 염과 함께 혼합할 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA 및 상기 DNA가 삽입된 벡터는, 후술하는 본 발명의 단백질과 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝 및 본 발명 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달(예를 들면 세포증식활성 또는 세포의 DNA 합성활성 등)을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 이들 스크리닝은, 당뇨병 등을 포함하는 췌장 β세포의 양 또는 기능의 이상에 기인하는 질환의 치료약 또는 예방약의 어세이에도 적용할 수 있다. 당뇨병 이외에도, 소화관종양, 신경변성증, 췌장염, 종양 등의 치료약 또는 예방약의 어세이 또는 스크리닝을 위해서도 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질에 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체에는, 다중클론항체 및 단일클론항체가 포함된다. 다중클론항체는, 예를 들면 생체재료(예를 들면 췌장 랑게르한스섬)로부터 조제한 「Reg 결합단백질」이나, 앞서 기술한 숙주-벡터계 등으로 제조한 재조합 「Reg 결합단백질」, 또는 일반적인 펩티드합성법에 의해 합성한 부분펩티드를 항원에 공지의 방법(Harlow, E. and Lane, D. Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 등)으로 토끼, 염소, 양 등을 면역하여 다중클론항체를 제작한다. 단일클론항체는, 생체재료(예를 들면 췌장 랑게르한스섬)로부터 조제한 「Reg 결합단백질」이나, 앞서 기술한 숙주-벡터계 등으로 제작한 재조합 「Reg 결합단백질」, 또는 일반적인 펩티드합성법에 의해 합성한 부분펩티드를 항원에 공지의 방법(Harlow, E. and Lane, D. Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 등)으로 면역한 마우스나 래트의 비장세포를 사용하여, 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 얻는다.

다중클론항체에서는 혈청으로부터, 단일클론항체에서는 하이브리도마 배양상청 또는 하이브리도마를 접종한 동물의 복수로부터 황산암모늄획분(ammonium sulfate fractionation), 프로틴G 세파로오스컬럼, 항원을 고정한 친화성 컬럼 등의 일반적인 생화학적 수법으로 항체를 정제한다.

이것에 의해 조제된 항체는, 본 발명 단백질의 친화성 정제를 위해 사용되는 것 외에, 예를 들면, 본 발명 단백질의 발현이상이나 구조이상에 기인하는 질환의 검사나 진단, 본 발명의 단백질 발현량의 검출 등에 이용하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 예를 들면 조직 또는 세포 등으로부터 단백질을 추출하여, 웨스턴 블로팅, 면역침강, ELISA 등의 방법에 의한 본 발명 단백질의 검출을 통해, 발현이나 구조의 이상의 유무를 검사 ·진단할 수 있다. 본 발명의 항체는, 췌장의 검사, 예를 들면 췌장 β세포의 검사에 이용하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 당뇨병의 검사에 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면, 피검자로부터 췌장조직 샘플을 단리하여, 이 조직에 있어서의 본 발명 단백질의 발현량 또는 구조의 이상을 웨스턴 블롯, 면역조직화학, ELISA, EIA 등에 의해 검사할 수 있다. 항체를 검사시약으로서 사용하는 경우는, 적절히 멸균수나 완충액, 염, 안정제, 보존제 등을 조합할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 항체치료에 사용하는 것도 생각할 수 있다. 본 발명의 항체를 항체치료에 사용하는 경우, 인간형 항체 또는 인간항체인 것이 바람직하다. 이 경우는, 인간 림프구와 HGPRT(hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손 마우스 골수종세포(myeloma cell)를 융합하여 HAT 배지에서 인간-마우스 헤테로 하이브리도마를 선택한다. 이 골수종세포를, 「Reg 결합단백질」을 항원으로 한 공지의 RIA, ELISA법으로 선택하여, 「Reg 결합단백질」에 대한 인간형 단일클론항체를 생산하는 클론을 얻는다. 항체의 정제는 상기와 같이 행할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝은, (a) 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 피검시료를 접촉시키는 공정, (b) 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드와 피검시료와의 결합을 검출하는 공정, 및 (c) 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 결합하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다.

본 발명의 단백질은, 스크리닝의 수법에 따라, 정제단백질로서 세포표면에 발현된 형태로서, 세포막획분으로서 스크리닝에 사용할 수 있다.

피검시료로서는, 이들에 제한되지 않지만, 예를 들면, 세포추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 저분자화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등을 사용할 수 있다. 피검시료는, 필요에 따라 적절히 표지하여 사용된다. 표지로서는, 예를 들면, 방사표지, 형광표지 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.

본 발명의 단백질과 결합하는 단백질의 스크리닝은, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 고정한 친화성 컬럼에 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질을 발현하고 있는 것이 예상되는 세포의 배양상청 또는 세포추출물을 올려 놓고, 컬럼에 특이적으로 결합하는 단백질을 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 결합하는 단백질의 스크리닝을 실시하는 것이 가능하다.

더욱이, 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질을 발현하고 있는 것이 예상되는 조직 또는 세포(예를 들면, 췌장 β세포 등)로부터 파지 벡터를 사용한 cDNA 라이브러리를 제작하고, 이것을 아가로우즈상에서 발현시켜 필터에 단백질을 고정 후, 표지한 본 발명의 단백질을 반응시켜, 결합하는 단백질을 발현하고 있는 플라크를 검출하는 「웨스트 웨스턴 블로팅법」이나, GAL4 DNA 결합영역 및 GAL4 전사활성화 영역을, 본 발명의 단백질 및 피검 단백질과의 융합단백질로서 발현시켜, GAL4 DNA 결합단백질의 결합서열을 갖는 프로모터의 하류에 연결시킨 리포터 유전자의 발현을 통해 본 발명의 단백질과 피검 단백질과의 결합을 검출하는 「2-하이브리드 시스템」 등에 따라 실시하는 것도 가능하다.

또한, 고정화한 본 발명의 단백질에, 합성 화합물, 천연물 뱅크, 또는 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리를 작용시켜, 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법이나, combinatorial chemistry 기술에 의한 High Throughput syatem을 사용한 스크리닝에 의해 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물을 단리하는 방법도 당업자에게 주지의 기술이다.

또한, BIACORE(Biacore사제)를 이용한 스크리닝이나 마이크로피지오미터(microphysiometer)(Molecular Device사제) 등을 사용하여 본 발명의 Reg 결합단백질을 강제 발현시킨 배양세포의 산분비속도의 변화를 모니터하는 방법 등을 생각할 수 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질과 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝은, (a) 피검시료 존재하에서 본 발명의 단백질과 Reg 단백질을 접촉시키는 공정, (b) 본 발명의 단백질과 Reg 단백질과의 결합을 검출하는 공정, (c) 상기 결합을 저하시키는 화합물을 선택하는공정을 포함하는 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다.

본 발명의 단백질은, 정제단백질로서, 세포표면에 발현된 형태로서, 세포막획분으로서 스크리닝에 사용할 수 있다. 또한, Reg 단백질은, 통상, 정제단백질로서 스크리닝에 사용한다. Reg 단백질로서는, 예를 들면, 인간 REG Iα나 래트 Reg I를 사용할 수 있다. 이들 단백질은, 재조합 단백질로서 조제하더라도 좋다(실시예1 참조). Reg 단백질은, 필요에 따라 [¹²⁵I] 등의 방사성 동위원소 등으로 표지해 두더라도 좋다.

피검시료로서는, 이들에 제한되지 않지만, 예를 들면, 세포추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 저분자화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등을 사용할 수 있다.

스크리닝은, 예를 들면, 아래와 같이 행할 수 있다. 본 발명의 단백질을 발현한 세포나, 그것으로부터 조제된 막획분에, 피검시료의 존재하에서 표지한 리간드(Reg 단백질)를 접촉시켜, 본 발명의 단백질에 결합하는 표지된 리간드의 양을 측정한다. 피검시료가 존재하지 않는 경우와 비교하여, 이 리간드의 양을 저하시키는 화합물을 선택한다. 본 발명의 단백질과 Reg 단백질과의 결합은, 상기 BIACORE나 마이크로피지오미터를 사용하여 측정하는 것도 가능하다. 이것에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명 단백질의 안타고니스트나 아고니스트의 후보가 된다.

또한, 본 발명은, 본 발명 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 이러한 스크리닝은,(a) 피검시료의 존재하에서, 본 발명의 단백질을 표면에 발현하는 세포에 Reg 단백질을 접촉시키는 공정, (b) Reg 단백질자극에 응답한 상기 세포의 변화를 검출하는 공정, 및 (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우(대조)와 비교하여, 상기 세포의 변화를 증강 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법에 의해 실시하는 것이 가능하다.

본 발명의 단백질을 그 표면에 발현하는 세포는, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 적당한 발현벡터에 삽입하여, 이것에 의해 구축한 벡터를 적당한 숙주세포에 도입함으로써 조제할 수 있다. 숙주세포로서는, 예를 들면, RINm5F 세포, CHO 세포, COS-7 세포 등의 세포를 들 수 있다. 벡터로서는 pCI-neo(Promega), pHook(Invitrogen) 등을 들 수 있다.

피검시료로서는, 이들에 제한되지 않지만, 예를 들면, 세포추출액, 유전자 라이브러리의 발현산물, 합성 저분자화합물, 합성 펩티드, 천연 화합물 등을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질과의 결합을 지표로 한 상기의 스크리닝에 의해 단리된 화합물을 피검시료로서 사용하는 것도 가능하다.

Reg 단백질은, 통상, 정제단백질로서 스크리닝에 사용한다. Reg 단백질로서는, 예를 들면, 인간 REG Iα나 래트 Reg I를 사용할 수 있다. 이들 단백질은, 재조합 단백질로서 조제하더라도 좋다(실시예1 참조).

스크리닝에 있어서는, 피검시료 존재하에서의 Reg 단백질자극에 응답한 상기 세포의 변화를 검출한다. Reg 단백질자극에 응답한 세포의 변화로서는, 예를 들면, 세포증식활성의 변화, 세포의 DNA 합성활성의 변화, 세포의 아포토시스 정도의 변화, 본 발명의 단백질이나 그 시그날을 전달하는 단백질의 인산화, 세포내의 특정 유전자 발현의 변화 등을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다.

세포의 DNA 합성은, 예를 들면 실시예에 나타내어지는 바와 같이 5'-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 함입을 측정함으로써 검출할 수 있다. 또한,³H-티미딘을 세포에 첨가하여, 세포내에 함입된 방사활성을 측정함으로써 행하더라도 좋다.³H-티미딘의 세포로의 함입시험은, DNA 합성촉진 또는 억제효과의 측정에 일반적으로 사용되고 있다. 이 방법은 비교적 다량의 샘플을 취급할 수 있고, 감도도 높은 등의 이점을 가지고 있다. DNA 합성을 촉진 또는 억제하는 화합물의 스크리닝에 있어서는, 구체적으로는, 예를 들면, 세포를 멀티 웰 플레이트 등에 뿌려 1~2일 정도 배양후, 피검시료를 포함하는 배지로 교환하여, 24시간 등 일정 시간 인큐베이트하고, 그 후, 예를 들면 1 μCi/ml의³H-티미딘을 첨가한다. 인큐베이트 후, 배지를 제거하고 세포를 세척한 후 10% TCA를 가하여 20분 정도 빙상에 두고, 빙냉한 5% TCA로 세척한다. 0.5 N NaOH로 세포를 용해하고, 빙상에 10분 둔 후 1/2부피의 1 N HCl을 가하여 완만하게 혼합하고, 더욱이 40% TCA를 최종농도 10%가 되도록 가하여 완만하게 혼합한다. 20분간 빙상에 정치한 후, Whatman GF/C 필터 등으로 여과하여 불용물을 회수한다. 100% 에탄올로 3회 세척하여 건조시킨 후, 액체 섬광계수기(liquid scintillation counter)로 방사활성을 계측한다.

또한, 세포의 증식은, 세포수의 계측이나 콜로니수의 계측, 또는 세포에 MTT 또는 Alamar Blue 등의 색소를 가하여, 세포수에 의존한 발색을 측정함으로써 행할수 있다. MTT법은 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)에 의한 발색에 의해 세포증식활성을 측정하는 것으로, 생세포의 미토콘드리아의 호흡사슬에 작용하여 MTT 포르마잔(MTT formazan)을 생성한다. 이 생성량은 세포수를 반영한다. 구체적으로는, 예를 들면, 96웰 플레이트에서 세포를 배양하고, 피검시료를 작용시킨 후, 5 mg/ml MTT 용액을 10 ㎕ 가하여, 4시간 인큐베이트한다. 0.04 N HCl/이소프로판올을 100 ㎕ 가하고 잘 혼합하여, 몇 분간 방치한다. 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여, 기준 파장 630 nm, 테스트 파장 570 nm에서 측정한다. 또한, 실시예 11과 같이 테트라졸리움염4[-3-(4-요오드페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠디설포네이트(WST-1)를 사용하여 측정하는 것도 가능하다.

세포의 아포토시스는, 예를 들면 핵의 형태변화(핵의 응축, 분단), 염색체의 단편화(ladder 형성) 등을 지표로서 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 TUNEL법[Y. Gavrieli et al., J. Cell Biol. 119, 493 (1992)] 등에 의해 아포토시스를 검출할 수 있다(실시예11 참조).

단백질의 인산화는, 세린, 트레오닌(threonine), 또는 티로신잔기 등에 일어난다고 생각된다. 이들 인산화의 변화는, 항인산화 세린, 트레오닌, 또는 티로신항체에 의한 웨스턴법이나 면역침강법에 의해, 세포내 단백질의 인산화상태를 측정함으로써 검출이 가능하다. 인산화되는 단백질로서는, 세포증식에 관여하는 MAP 키나아제계나 STAT계, 또는 Fos-Jun계 단백질 등을 예상할 수 있지만, 이들 예시한 단백질에 한정되지 않는다.

상기 단백질인산화 등에 의해, 여러 유전자의 전사가 유도되거나 억제되는 것이 알려져 있다. 본 발명의 단백질과 그 리간드와의 결합에 의존한 특정 유전자의 발현 변화는, 리포터유전자를 이용하여 검출할 수 있다. 즉, 상기 유전자의 프로모터의 하류에 리포터유전자를 연결하여, 리포터유전자의 발현을 검출함으로써 측정할 수 있다. 또한, 특정 유전자의 발현변화는, 노던블로팅법이나 RT-PCR법 등의 mRNA를 검출하는 방법, 유전자의 번역산물인 단백질을 항체 등을 사용하여 검출하는 방법, 유전자의 번역산물인 단백질의 활성을 검출하는 방법에 의해 측정하는 것도 가능하다.

이들 스크리닝에 의해 단리되는 화합물로서는, 예를 들면, ① 본 발명의 단백질에 결합하여, 그 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물, ② 본 발명의 단백질 또는 Reg 단백질 등의 본 발명 단백질의 리간드에 결합하여, 본 발명의 단백질과 리간드와의 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물, ③ 본 발명 단백질의 리간드에 결합하여, 그 활성화를 촉진 또는 저해하는 화합물, ④ 본 발명의 단백질로부터 세포의 변화를 발현하기에 이르는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물이 포함된다.

이들 화합물은, 본 발명의 단백질을 매개로 한 시그날전달계의 이상 등에 기인하는 질환(예를 들면, 췌장 β세포의 기능의 이상에 기인하는 질환)의 예방약이나 치료약으로의 응용을 생각할 수 있다. 예를 들면, 당뇨병의 치료약으로의 응용을 생각할 수 있다.

본 발명의 DNA, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 본 발명의 DNA를 포함하는 벡터, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 대한 항체 및 상기 스크리닝에 의해 단리될 수 있는 화합물은, 단독으로, 또는 다른 화합물과 조합하여 약제로서 사용할 수 있다. 본 발명의 약제에는, 시약 및 의약이 포함된다.

예를 들면, 본 발명의 단백질은 Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 것으로부터, 본 발명의 단백질 및 그 부분펩티드를, Reg 단백질과 결합시키기 위해 사용할 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드는, Reg 단백질의 검출이나 친화성 정제 등에 이용할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 Reg 단백질과 접촉시킴으로써, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 Reg 단백질과 결합시킬 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드는 정제되어 있더라도 좋고, 세포막표면에 발현하고 있더라도 좋다. 또한, 담체에 결합하고 있더라도 좋다. 결합시키는 Reg 단백질의 유래에 제한은 없고, 마우스, 래트, 인간 등의 Reg 단백질을 결합시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 코드하는 DNA 및 상기 DNA가 삽입된 벡터도, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 세포에 발현시킴으로써, 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 단백질 및 그 부분펩티드, 이들을 코드하는 DNA, 또는 상기 DNA가 삽입된 벡터를 포함하는 약제는, Reg 단백질 결합제로 할 수 있다.

또한 본 발명의 단백질은, Reg 단백질의 수용체로서 기능한다. 따라서, 본 발명의 단백질은, Reg 단백질에 응답한 세포내 시그날전달을 조절(촉진 또는 억제)하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질을 활성화함으로써 시그날전달이 촉진되고, 반대로 본 발명 단백질의 활성화를 저해함으로써 시그날전달은 차단된다. 예를 들면, 본 발명의 단백질(예를 들면 서열번호: 4)를 발현하는 세포에 Reg 단백질등의 본 발명 단백질의 리간드 또는 아고니스트를 접촉시킴으로써 본 발명의 단백질을 활성화시켜, 세포내에 시그날을 전달시킬 수 있다. 세포는, 바람직하게는 췌장 β세포계의 세포 또는 상피세포 등이다. 또한, Reg 단백질과 결합하지만, 세포내에 시그날을 전달하지 않는 단백질은, Reg 단백질의 시그날전달을 차단하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 단백질로서는, Reg 단백질과의 결합영역을 보유하지만, 하류로의 시그날전달부위를 가지지 않는 단백질 등을 들 수 있다. 이러한 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 또는 세포외에 첨가함으로써, Reg 단백질에 의한 시그날전달을 차단할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 코드하는 DNA 및 상기 DNA가 삽입된 벡터도, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 세포에서 발현시킴으로써, 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 결합하는 항체, 본 발명의 스크리닝에 의해 단리될 수 있는 화합물도, 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡터, 본 발명의 항체 및 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물은, Reg 단백질에 응답한 세포내 시그날전달의 조절제(촉진제 또는 억제제 등)로 할 수 있다.

또한, Reg 단백질에 응답한 세포내 시그날전달로서는, 세포 DNA 합성의 촉진 및 세포증식의 조절(촉진 또는 억제)을 들 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질은, 세포의 DNA 합성을 촉진하기 위해, 또한, 세포증식을 촉진 또는 억제하기 위해 사용할 수 있는 것을 나타내고 있다. 대상이 되는 세포는, 바람직하게는 췌장 β세포계 세포 또는 상피세포 등이다. 본 발명의 단백질을 발현하는 세포에, 본 발명 단백질의 리간드(예를 들면 Reg 단백질) 또는 아고니스트를 접촉시킴으로써, DNA 합성을 촉진하여, 세포증식(또는 분열)을 촉진할 수 있다. 본 발명의 단백질을 외래적으로 세포에 발현시키는 경우는, 본 발명의 단백질(예를 들면 서열번호: 4)을 발현하는 벡터를 세포에 도입한다. 또한, Reg 단백질과 결합하지만, 세포내에 시그날을 전달하지 않는 단백질은, DNA 합성을 억제, 또는 세포증식을 억제하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 단백질로서는, Reg 단백질과의 결합영역을 보유하지만, 하류로의 시그날전달부위를 가지지 않는 단백질을 들 수 있다. 이러한 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 또는 세포외에 첨가함으로써 DNA 합성을 억제 또는 세포증식을 억제할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 코드하는 DNA 및 상기 DNA가 삽입된 벡터도, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 세포에서 발현시킴으로써, 상기와 같은 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 결합하는 항체, 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물도, DNA 합성 또는 세포증식을 조절하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명 단백질의 리간드 또는 아고니스트로서 작용하는 항체나 화합물은, 이것을 생체에 투여함으로써 세포(췌장 β세포 등)의 증식을 촉진하는 것이 가능하다. 투여는 인 비트로 및 인 비보에서 행할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡터, 본 발명의 항체 및 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물은, 세포의 DNA 합성 또는 세포증식의 조절제(촉진제 또는 억제제 등)로 할 수 있다.

또한, 본 발명 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달로서는, 세포 아포토시스의 유도를 들 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질은, 세포의 아포토시스를 조절(아포토시스의 유도 또는 유도의 억제)하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 코드하는 DNA 및 상기 DNA가 삽입된 벡터도, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드를 세포에서 발현시킴으로써, 동일한 목적으로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드에 결합하는 항체, 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물도, 아포토시스를 조절하기 위해 사용할 수 있다. 대상이 되는 세포는, 바람직하게는 췌장 β세포계 세포 또는 상피세포 등이다. 본 발명의 단백질을 발현하는 세포에, 본 발명 단백질의 리간드(예를 들면 Reg 단백질)를 고농도로 접촉시킴으로써, 아포토시스를 유도할 수 있다. Reg 단백질은, 예를 들면 100 nM 보다 높은 농도, 바람직하게는 500 nM 이상의 농도, 보다 바람직하게는 1000 nM 이상의 농도로 세포에 접촉시킨다. 본 발명의 단백질을 외래적으로 세포에서 발현시키는 경우는, 본 발명의 단백질(예를 들면 서열번호: 4)을 발현하는 벡터를 세포에 도입한다. 또한, Reg 단백질과 결합하지만, 세포내에 시그날을 전달하지 않는 단백질은, Reg 단백질에 의한 아포토시스의 유도를 억제하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 단백질을 세포에서 발현시킴으로써, 또는 세포외에 첨가함으로써 아포토시스를 억제할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡터, 본 발명의 항체 및 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물은, 세포의 아포토시스의 조절제(유도제 또는 억제제 등)로 할 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡터, 본 발명의 항체 및 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물은, 공지의 약학적 수법에 따라, 증류수, 완충액, 염, BSA, 글리세롤, 안정제, 보존제, 계면활성제 등을 조합하여 조성물로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제는, 상술한 바와 같이 췌장의 검사를 위한 시약으로서 사용하는 것도 가능하다. 또한, 당뇨병, 소화관종양, 신경변성증, 췌장염, 종양 등의 치료 또는 예방을 위한 의약조성물로서도 유용하다.

본 발명의 약제를 의약으로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 단백질 또는 그 부분펩티드, 상기 단백질 또는 펩티드를 코드하는 DNA, 상기 DNA가 삽입된 벡터, 본 발명의 항체 및 본 발명의 스크리닝에 의해 단리할 수 있는 화합물 자체를 직접환자에게 투여하는 것 이외에, 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화하여 투여하는 것이 가능하다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제 등과 적절히 조합하고 제제화하여 투여하는 것을 생각할 수 있다. 본 발명의 의약조성물은, 수용액, 정제, 캡슐, 트로키(troche), 버칼정(buccal tablet), 일릭서(elixir), 현탁액, 시럽 등의 형태일 수 있다. 활성화합물의 함유율은 적절히 결정하면 좋다. 환자로의 투여는, 예를 들면, 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등 외에, 비강내적(intranasally), 경기관지적(transbronchially), 근내적(intramuscularly), 또는 경구적으로 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 투여는, 전신 투여 또는 국소 투여로 행할 수 있다. 투여량은, 환자의 체중이나 연령, 투여방법, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적당한 투여량을적절히 선택하는 것이 가능하다. 투여는 1회에서 수회로 나눠 행할 수 있다. 또한, 상기 화합물이 DNA에 의해 코드될 수 있는 것이라면, 상기 DNA를 유전자치료용 벡터에 함입하여, 유전자치료를 행하는 것도 생각할 수 있다. 투여는 ex vivo 또는 인 비보에서 행할 수 있다. 투여량, 투여방법은, 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되지만, 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.

도면의 간단한 설명

도1은, 래트 인슐리노마 유래 세포주 RINm5F 세포에 인간 REG 단백질(REG Iα)을 첨가했을 때의 BrdU의 함입을 측정한 결과를 나타내는 도이다(실시예 3).

도2는, RINm5F 세포에 [¹²⁵I] 표지한 래트 Reg 단백질(Reg I)을 첨가했을 때의 세포로의 결합을 측정한 결과를 나타내는 도이다(실시예 4). 「Hot」는 표지한 래트 Reg 단백질 만, 「Hot + 100×Cold」는, 표지한 래트 Reg 단백질과 100배량의 비표지 래트 Reg 단백질을 같이 첨가했을 때의 결과를 나타낸다.

도3은, 단리된 Reg 결합단백질을 COS-7 세포에서 발현시켜, [¹²⁵I] 표지한 래트 Reg 단백질(Reg I)을 첨가했을 때의 세포로의 결합을 측정한 결과를 나타내는 도이다(실시예 6). 「pCI-neo」는 공벡터, 「pCI-167.1」은 Reg 결합단백질 발현벡터를 도입한 세포의 결과를 나타낸다. 또한, (-)는 표지한 래트 Reg 단백질 만, (+)는 표지한 래트 Reg 단백질과 100배량의 비표지 래트 Reg 단백질을 같이 첨가했을 때의 결과를 나타낸다.

도4a~도4c는, 래트 Reg 결합단백질(Reg 수용체)(rEXTL3)(서열번호: 4), 인간 EXTL3/EXTR1(hEXTL3)(GenBank 승인번호 AF001690 및 AB007042)(서열번호: 5), 인간 EXT2(hEXT2)(GenBank 승인번호 U64511)(서열번호: 6), 인간 EXT1(hEXT1)(GenBank 승인번호 S79639)(서열번호: 7), 인간 EXTL1(hEXTL1)(GenBank 승인번호 U67191)(서열번호: 8) 및 인간 EXTL2(hEXTL2)(GenBank 승인번호 AF000416)(서열번호: 9)의 예상되는 단백질 아미노산서열을 정렬화한 도이다(실시예 7). 막관통 도메인에는 밑줄을 그었다. 오른쪽란의 숫자는 아미노산잔기에 대응한다. 래트 Reg 결합단백질(rEXTL3)과 동일한 잔기는 점으로 나타냈다. 하이픈은 래트 Reg 결합단백질(rEXTL3)에 대응하는 잔기가 없는 것을 나타낸다.

도5는, Reg 결합단백질의 세포분포를 나타내는 도이다. 레인 1, 대조군벡터를 도입한 COS-7 세포의 호모제네이트(homogenate); 레인 2~6, Reg 결합단백질 발현벡터를 도입한 COS-7 세포의 호모제네이트, 막획분, 미토콘드리아획분, 마이크로솜획분(microsomal fraction) 및 사이토졸획분(cytosolic fraction)(실시예 8). 각 레인에서 단백질 10 ㎍을 전기영동하여, Reg 결합단백질에 부가된 HA 태그에 대한 항체에서 웨스턴 블로팅을 행했다. Reg 단백질은 세포표면에 발현하는 것을 알 수 있다.

도6은, 인간 EXTL3/EXTR1의 래트 상동체는 세포표면형 Reg 결합단백질인 것을 나타내는 도이다(실시예 9). 비표지 래트 Reg 단백질의 존재하(+, 100배 과잉량) 또는 비존재하(-)에 있어서의 [¹²⁵I] Reg 단백질의 Reg 결합단백질 발현세포와의결합을 나타낸다. 「pCIneo」는 공벡터를 도입한 대조, 「pCI ·rEXTL3」는 래트 Reg 결합단백질 발현벡터를 도입한 세포의 결과를 나타낸다. 4회의 각각 실험의 평균 ±표준오차(s.e.m.)으로서 나타냈다.

도7은, Reg 수용체의 기능해석을 나타내는 도이다. (A) Reg 수용체를 안정하게 발현하는 CHO 세포로의 래트 Reg 단백질에 의한 BrdU 함입을 나타내는 도이다(실시예 10). Reg 수용체를 발현하는 2개의 독립된 세포계(RegR-#3 및 RegR-#22)를 검토했다. 결과는 8회의 각각 실험의 평균 ±표준오차로서 나타냈다. (B) 래트 Reg(동그라미) 및 인간 REG(사각)가 래트 Reg 수용체와의 경합결합곡선을 나타내는 도이다. 결과는 4회의 각각 실험의 평균 ±표준오차로서 나타냈다.

도8은, Reg 수용체를 발현하는 β세포의 증식 및 아포토시스를 나타내는 도이다(실시예 11). Reg 수용체를 발현하는 3개의 독립된 세포계(#1, #6 및 #24)를 검토했다. RIN은 RINm5F 대조군을 나타낸다. 결과는 4~8회의 각각 실험의 평균 ± 표준오차로서 나타냈다. (A) Reg 수용체를 안정하게 발현하는 RINm5F 세포로의 래트 Reg 단백질에 의한 BrdU의 함입. (B) 생세포에 의한 WST-1 절단의 Reg 단백질에 의한 증가. (C) Reg 단백질에 의해 유도되는 RINm5F 세포의 아포토시스를 TUNEL법에 의해 정량적으로 평가한 결과.

도9는, Reg 수용체 mRNA의 발현을 나타내는 도이다(실시예 12). RNase 프로텍션 어세이(protection assay)에 의해 Reg 수용체 mRNA의 발현을 조사했다. 309염기의 밴드는, 래트 Reg 수용체 mRNA에 의한 프로텍션 사이즈에 대응한다. (A) β세포에 있어서의 Reg 수용체 mRNA의 발현을 나타낸다. 니코틴아미드 0.5 mg/kg/day의복강내 투여를 1~3개월간 행한 90% 췌장 절제 래트로부터 재생 랑게르한스섬을 단리했다(K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990); Y. Yonemura et al., Diabetes 33, 401 (1984)). 레인 1, 정상 랑게르한스섬; 레인 2, 췌장부분 절제로부터 1개월 후의 재생 랑게르한스섬; 레인 3, 췌장부분 절제로부터 2개월 후의 재생 랑게르한스섬; 레인 4, 췌장부분 절제로부터 3개월 후의 재생 랑게르한스섬; 레인 5, RINm5F 세포; 레인 6, ARIP 세포. 레인 P에는 프로브 만을 영동했다. (B) 래트 조직에 있어서의 Reg 수용체 mRNA의 발현. 레인 1, 정상 췌장섬; 레인 2, 췌장 전체; 레인 3, 간장; 레인 4, 신장; 레인 5, 심장; 레인 6, 비장; 레인 7, 흉선; 레인 8, 정소; 레인 9, 부신; 레인 10, 위; 레인 11, 공장; 레인 12, 회장; 레인 13, 결장; 레인 14, 뇌하수체; 레인 15, 뇌.

도10은, Reg 수용체를 안정하게 발현하는 CHO 세포에 있어서의 생세포에 의한 WST-1의 분해는 Reg 단백질에 의해 증가하는 것을 나타내는 도이다(실시예 12). 도7(A)과 동일하게 2개의 독립된 세포계를 사용했다. 결과는 8회의 각각 실험의 평균 ± 표준오차로서 나타냈다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인간 REG 단백질(REG Iα) 및 래트 Reg 단백질(Reg I)발현벡터의 구축

인간 REG Iα cDNA(Terazono, K. et al., J. Biol. Chem. 263, 2111-2114 (1998))의 단백질 코드영역의 전장을 Pichia 발현용 벡터 pPIC3.5(Invitrogen사제)의 효모 알코올옥시다아제프로모터 하류의 SnaBI/AvrII 사이트에 링커를 사용하여 삽입하여, 발현벡터를 구축했다. 래트 Reg I cDNA(Terazono, K. et al., 상기)의 단백질 코드영역의 전장도 동일하게, pPIC3.5의 SnaBI/NotI 사이트에 링커를 사용하여 삽입했다. 이들 2가지 발현벡터 DNA를 CsCl법으로 정제하여, Pichia Easy Comp Kit(Invitrogen사제)를 사용하여 조제한 캄피턴트 세포(Pichia GS115주)에 도입했다. 발현벡터 도입세포는, 히스티딘을 포함하지 않는 배지에서 증식할 수 있도록 하여 선택했다. 발현벡터 도입세포 중에서, 메탄올 첨가에 의해 배지중에 생산 ·분비되는 인간 REG 단백질 ·래트 Reg 단백질이 최대가 되는 클론을 선택했다.

[실시예 2] 인간 REG 단백질(REG Iα) 및 래트 Reg 단백질(Reg I)의 조제

상기 인간 REG 단백질 또는 래트 Reg 단백질을 생산하는 Pichia(Pichia pastoris)를 BMGY 배지(1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 100 mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0), 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% 비오틴, 1% 글리세롤)로 28~30℃에서 16~18시간 전배양후, BMGY 배지에서 OD₆₀₀이 2~5가 될 때까지 대량배양을 행했다. 효모를 원심분리로 회수하여, OD₆₀₀이 1이 되도록 BMMY 배지(1% 효모 추출물, 2% 폴리펩톤, 100 mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0), 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% 비오틴, 0.5% 메탄올)에 재현탁하여, 28~30℃에서 3~4일 배양했다. 이 24시간 마다 최종농도 0.5%가 되도록 메탄올을 가했다. 원심분리로 배양액을 회수하고, 초산을 가하여 pH를 3.5로 조정했다. pH 조정이 끝난 배양액을 50 mM 초산 나트륨(pH 3.5)으로 평형화한 STREAMLINE SP(Pharmacia)에 어플라이하고, 50 mM 초산 나트륨(pH 3.5)으로 세척후, 50 mM 초산 나트륨(pH 3.5)/0.5 M NaCl로 용출했다. 생산된 단백질이 각각 인간 REG 단백질 또는 래트 Reg 단백질인 것은, 질량 분광광도법(mass spectrometry)으로 확인했다.

[실시예 3] 래트 인슐리노마 유래 배양세포 RINm5F 세포에 대한 REG 단백질의 첨가효과

래트 인슐리노마 유래의 배양세포 RINm5F 세포(Zenilman, M.E. et al., Gastroenterology 110, 1208-1214 (1996))에 REG 단백질을 첨가하여, 5'-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 함입(세포증식활성)을 측정했다. 먼저 5×10⁵세포/ml의 RINm5F 세포 100 ㎕를 96웰 플레이트에 뿌려, 37℃에서 2일간 배양했다. 그 후, 배양액을 아래에 나타내는 배양액 100 ㎕로 치환했다. 인간 REG Iα는 실시예 2에서 조제한 것을 사용했다.

배지 + 1% FCS

배지 + 1% FCS + 인간 REG Iα(1 nM; 0.016 ㎍/ml)

배지 + 1% FCS + 인간 REG Iα(10 nM; 0.16 ㎍/ml)

배지 + 1% FCS + 인간 REG Iα(100 nM; 1.6 ㎍/ml)

배지 + 1% FCS + 인간 REG Iα(1000 nM; 16 ㎍/ml)

37℃에서 24시간 인큐베이트하여, BrdU 라벨링용액(10 mM의 BrdU 원액을 배지에서 100 μM이 되도록 희석한 것)을 10 ㎕/웰 가했다(최종농도 10 μM BrdU). 37℃에서 12시간 인큐베이트한 후 배지를 제거하고, FixDenat(Roche Diagnostics사제)를 200 ㎕/웰 가했다. 실온에서 15분간 인큐베이트한 후 FixDenat 용액을 제거하고, 항BrdU-POD 항체(스톡용액(Roche Diagnostics사제)을 1/100 희석한 것)를 100 ㎕/웰 가했다. 실온에서 60분간 인큐베이트하고, 항BrdU-POD 항체용액을 제거한 후, 세척액(10×세척액(Roche Diagnostics사제)를 1/10 희석한 것) 200 ㎕/웰로 3회 린스했다. 기질용액(Roche Diagnostics사제)를 100 ㎕/웰 가하여, 충분한 발색이 얻어질 때까지 실온에서 인큐베이트했다. 각 시료는 ELISA 리더를 사용하여 370 nm의 흡광도를 측정했다(기준 파장: 약 492 nm).

그 결과, REG 단백질의 농도 의존적인 세포증식이 보였다(도 1).

[실시예 4] RINm5F 세포에 대한 Reg 단백질 결합활성의 측정

먼저, 아래와 같이 하여, [¹²⁵I] RegI 희석액을 조제했다. [¹²⁵I] 래트 RegI 원액(50 ng/㎕=~3.33 μM, 8.6×10⁵cpm/㎕)을 DMEM으로, 각각 1 nM, 333 pM, 100 pM, 33 pM 및 10 pM이 되도록 희석했다. 또한, 비표지의 RegI 원액(460 ng/㎕= 30.6 μM)을, [¹²⁵I] RegI의 100배 농도로 포함하도록 가한 희석액을 동일하게 조제했다. 4×10⁵세포/ml의 RINm5F 세포 3 ml를 6웰 플레이트에 뿌려, 37℃에서 2일간 배양했다. 냉 DMEM으로 세척후, 상기 [¹²⁵I] 래트 RegI를 포함하는 DMEM 3 ml를 가했다(최종농도 10 pM, 33 pM, 100 pM, 333 pM, 1 nM). 경합저해실험에 있어서는, 100배의 비표지 RegI를 공존시킨 DMEM을 사용했다. 빙상에서 2시간 정치하고, DMEM으로 3회 세척한 후, 0.5~1 ml/웰의 [100 mM Tris-HCl(pH7.6), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100] 를 가하여 리시스시켜, γ-카운터로 [¹²⁵I]를 카운트했다.

그 결과, 대과잉의 비표지 Reg 단백질에 의해 결합이 저해되어 있고, 특이적인 결합에 필수인 분자가 RINm5F 세포막상에 존재하는 것이 나타내어졌다(도 2).

[실시예 5] Reg 결합단백질의 동정과 단리

래트 췌장 랑게르한스섬 Poly(A)⁺RNA를 주형으로 λZAP II 벡터에 의한 췌장 랑게르한스섬 발현형 cDNA 라이브러리를 제작했다. 실시예 2에서 조제한 래트 Reg 단백질을 Bolton-Hunter 시약을 사용하여¹²⁵I 표지하여, 발현형 cDNA 라이브러리로부터 West-Western법으로 Reg 단백질과 결합하는 파지클론을 선택 ·단리했다.

양성 파지클론으로부터 헬퍼파지를 사용한 인 비보 절제방법으로 cDNA를 플라스미드 벡터(pBluescript SK(-), Stratagene사제)에 함입했다. 디데옥시법으로 cDNA의 염기서열을 결정했다. 그 염기서열을 서열번호: 1에, 예상되는 아미노산서열을 서열번호: 2에 나타낸다. 염기서열로부터 추정되는 단백질은 1개의 소수성 아미노산 클러스터의 막관통영역을 갖는 세포막단백질이라고 생각되었다.

[실시예 6] Reg 결합단백질의 COS-7 세포에서의 발현

실시예 5에서 단리한 cDNA를 사이토메갈로바이러스프로모터를 가지는 포유동물용 발현벡터(pCI-neo)(Promega)에 함입하여, Reg 결합단백질 발현벡터(pCI-167.1)를 구축했다. 이 벡터를 COS-7 세포에 일렉트로포레이션법(electroporation method)으로 도입하여 일과성으로 발현시켰다. 벡터도입 48시간 후에, 실시예 4와 동일한 프로토콜로 Reg 결합활성을 검토했다.

구체적으로는, 먼저 [¹²⁵I] 래트 RegI 원액(50 ng/㎕=~3.33 μM, 2.7×10⁵cpm/㎕)을 DMEM으로 10 nM이 되도록 희석했다. 또한, 비표지의 RegI 원액(2250 ng/㎕= 150 μM)을, [¹²⁵I] RegI의 100배 농도(1 μM) 포함하도록 이 액에 가한 희석액을 별도로 조제했다.

2.5×10⁵세포/ml의 트랜스펙션한 COS 세포 3 ml를 6웰 플레이트에 뿌려, 37℃에서 2일간 배양했다. 냉 DMEM으로 세척후, [¹²⁵I] 래트 RegI를 포함하는 DMEM 3 ml를 가했다(최종농도 10 nM). 경합저해실험에 있어서는, 100배의 비표지 RegI를 공존시켰다. 빙상에서 2시간 정치하여, DMEM으로 3회 세척한 후, 1 ml/웰의 [100 mM Tris-HCl (pH7.6), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100] 을 가하여 리시스시키고, γ-카운터로 [¹²⁵I]를 카운트했다.

그 결과, 이 cDNA를 도입한 세포에서는, 벡터만을 도입한 세포에 비교하여¹²⁵I 표지 Reg 단백질과의 결합이 두드러지게 증대되어 있었다. 또한, 이 결합은 과잉량의 비표지 Reg 단백질의 첨가에 의해 소실되었다(도 3). 이것으로부터, 단리된 cDNA가 코드하는 단백질은 포유동물 세포막상에서 Reg 단백질과 결합하는 분자인 것으로 생각되고, Reg 단백질의 β세포 재생증식활성을 담당하는 수용체분자일 가능성이 생각되었다.

[실시예 7] 래트 췌장섬 cDNA 라이브러리의 스크리닝

Reg 결합단백질을 코드하는 cDNA를 더욱 단리하기 위해, 실시예 5에서 얻어진 cDNA를 프로브로서 사용하고, 플라크 하이브리다이제이션에 의해, 래트 췌장섬 cDNA 라이브러리(5×10⁶클론)를 스크리닝한 결과, 양성 클론 8개를 얻었다. 이 8개의 클론은 서로 대부분이 중복하고 있고, 중복영역의 뉴클레오티드는 완전히 일치하고 있었다. 얻어진 래트 Reg 결합단백질을 코드하는 cDNA의 서열을 서열번호: 3에, 이 cDNA에 의해 코드되는 Reg 결합단백질의 아미노산서열을 서열번호: 4에 나타낸다.

도4에 나타내는 바와 같이, 이 cDNA는 919 아미노산으로 된 단백질을 코드하는 2,760 bp의 오픈 리딩 프레임을 가지고 있어, cDNA로부터 추정되는 아미노산서열로부터, 이 단백질은 긴 세포외 도메인(868 아미노산잔기), 막관통 도메인(잔기 29~51) 및 N 말단에 짧은 세포내영역을 갖는 II형 막관통단백질인 것이 예상되었다.

[실시예 8] 래트 Reg 결합단백질의 발현

실시예 7에서 단리된 래트 Reg 결합단백질 cDNA의 발현벡터를 제작하여, COS-7 세포내에서 일과적으로 발현시켰다. N 말단에 헤마글루티닌(HA)노나펩티드-태그(YPYDVPDYA)를 부가하도록 이 태그를 코드하는 올리고뉴클레이티드를 연결한 래트 Reg 결합단백질 cDNA를 pCI-neo 포유동물 발현벡터(Promega)에 삽입하고, 이 벡터를 전기천공법에 의해 COS-7 세포에 도입하여 발현시켰다. 48시간 인큐베이트한 후에 세포를 회수하고, 이전의 기재 [S. Takasawa et al., J. Biol. Chem. 268, 26052(1983); H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280, 306(1997)]와 같이 호모게나이즈(homogenize) 및 분획을 행했다. 단백질시료를 12.5%(w/v) SDS 폴리아크릴아미드겔상에서의 전기영동에 걸어, immobilon-P(Millipore)에 트랜스퍼했다. HA에 대한 단일클론항체를 사용하여, 이전의 기재와 같이 웨스턴 블롯해석을 행했다[S. Takasawa et al., J. Biol. Chem 270, 30257(1995); H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280, 306(1997)]. HA에 대한 단일클론항체는 항HA 3F10(Roche Diagnostics)을 사용했다.

이뮤노블롯 해석결과, 이 cDNA에 의해 코드되는 단백질은 주로 세포막획분에 발현되고, 겉보기의 분자량은 105 kD으로(도5A), 예상되는 아미노산서열로부터 산출된 분자량(104,682)과 잘 일치하는 것이 명백해졌다.

[실시예 9] 래트 Reg 결합단백질의 Reg 단백질로의 결합

실시예 8에서 제작한 래트 Reg 결합단백질(래트 EXTL3/EXTR1이라고도 칭한다)발현벡터 또는 대조군 벡터를 전기천공법에 의해 COS-7 세포내에 도입하여, 일과적으로 발현시켰다. 이들 세포로부터 Reg 결합단백질을 안정하게 발현하는 CHO세포를 단리했다. 세포(7.5×10⁵개)를 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640)으로 씻고,¹²⁵I 표지 래트 Reg 단백질(50 ng/ml, 1.5×10⁵cpm/ml)의 존재하에서, 여러 농도의 비표지 래트 Reg 또는 인간 REG 단백질과 함께, 1% 소태아혈청을 포함하는 RPMI1640중에서 빙상에서 2시간 인큐베이트했다. RPMI1640으로 3회 씻은 후, 세포를 1 ml의 100 mM Tris-HCl(pH7.6), 1 mM EDTA 및 1% Triton X-100으로 가용화했다. 가용화물의 방사활성을 γ선계수기(Cobra, Packard)에 의해 측정했다. 그 결과, 래트 Reg 결합단백질 발현벡터를 도입한 COS-7 세포는¹²⁵I 표지 래트 Reg 단백질과 결합하고, 이 결합은 비표지 Reg 단백질의 첨가에 의해 감소되었다(도6).

DNA/단백질 데이터베이스의 상동성검색에 의해, 래트 Reg 결합단백질 cDNA(서열번호: 3) 및 예상되는 아미노산서열(서열번호: 4)에는 복수의 외골종(EXT) 패밀리유전자, 특히 인간 EXT양 유전자3(EXTL3)/EXT 관련유전자1(EXTR1)(W. Van Hui et al., Genomics 47, 230 (1998); T. Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 61 (1998))과의 두드러진 상동성(아미노산 동일성이 97%를 상회한다)이 인정되는 것이 명백해져, 이 cDNA가 인간 EXTL3/EXTR1의 래트 상동체(homologue)인 것이 나타내어졌다. EXTL3/EXTR1유전자는 상동성 스크리닝에 의해 EXT 패밀리유전자의 일원으로서 단리되었지만, 그 생리적 기능 및 병태생리학적 의의는 불명확하다. EXTL3/EXTR1은, C 말단영역에서 EXT2 및 EXT1과의 상동성(C 말단의 262 아미노산이 EXT2와 52%, C 말단의 247 아미노산이 EXT1과 40%)이 인정되는 것으로부터(도4 참조), EXT 패밀리(W. Van Hui et al., Genomics 47, 230(1998); T. Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 243, 61 (1998))에 속하는 것으로 생각되고 있다. 그러나, EXTL3/EXTR1의 N 말단영역(잔기 1~656)은 EXT 패밀리유전자의 다른 어느 쪽 멤버와도 상동성이 인정되지 않았다. 더욱이, EXTL3/EXTR1의 N 말단영역은 막관통 도메인을 포함하고 있지만, 패밀리의 다른 멤버는 이 도메인을 포함하지 않고, 이 때문에 세포표면 단백질이라고는 생각할 수 없었다. 이에 더하여, 래트 췌장섬 cDNA 발현 라이브러리의 스크리닝으로 최초로 Reg 결합단백질로서 단리된 1.6 kbp cDNA는, N 말단영역 만을 포함하고 있었다(아미노산잔기 1~332). 따라서, Reg 결합 도메인은 N 말단영역에 포함되어 있고, EXTL3/EXTR1 이외의 EXT 패밀리의 멤버에는 Reg 단백질과의 결합능은 없다고 간주하는 것이 타당하다고 생각된다.

[실시예 10] 래트 Reg 결합단백질(래트 Reg 수용체)발현세포의 Reg 단백질에 의한 자극효과

실시예 8에서 구축한 래트 Reg 결합단백질(이후「래트 Reg 수용체」라고도 칭한다)발현벡터를 CHO 세포에 도입하여, 수용체단백질을 과잉발현하는 세포계를 몇개 수립하여, 래트 Reg 단백질자극에 의한 세포내로의 5'-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)의 함입을 검토했다.

HA-태그를 부가한 래트 Reg 수용체 발현벡터를 CHO 세포 및 RINm5F 세포에 도입했다. 10% 소태아혈청(Bio Whittaker, Walereville, Maryland) 및 250 ㎍/ml의 네오마이신(Gibco)을 가한 RPMI1640 배지중에서 세포를 2주간 배양했다[S. Takasawa et al., J. Biol. Chem. 273,2497 (1998)]. 재조합 단백질을 높은 레벨로발현하는 안정형질전환체는, HA의 이뮤노블롯 해석에 의해 스크리닝하여 단리했다. Reg 수용체를 발현하는 안정형질전환체를, 여러 농도의 래트 Reg 단백질의 존재하에서, 1% 소태아혈청을 가한 RPMI1640 배지중에서 24시간 배양했다. 배양종료 2시간 전에 BrdU(10 μM)를 배지에 첨가하여, 비색법에 의한 세포증식 ELISA 키트(Roche Diagnostics)를 사용하여 BrdU 함입을 측정했다.

1~300 nM의 래트 Reg 단백질과 함께 인큐베이트하면, EXTL3/EXTR1(래트 Reg 수용체)을 발현하는 세포계의 BrdU 함입은(#3 및 #22 모두) 두드러지게 증가했다(세포계 #3에서는 EC₅₀=4.01 nM, 세포계 #22에서는 1.11 nM, 도7(A)). CHO 세포계에 대한 증식자극효과를 나타낸 Reg 단백질의 농도는 초대배양 래트 췌장섬에서의 값과 일치하고 있어(T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 (1994)),이것으로부터 Reg 단백질에 의한 췌장 β세포의 증식은 EXTL3/EXTR1의 래트상동체에 의해 매개되는 것이 시사되었다.

¹²⁵I 표지 래트 Reg 단백질은 래트 Reg 수용체발현 CHO 세포와 결합하고(K_α= 4.41 nM), 비표지 래트 Reg 단백질의 농도를 높임으로써 결합은 치환되었다(K_i=1.61 nM, 도7(B))(실시예9 참조). 래트 Reg 단백질에 관한 힐계수(Hill coefficient)는 n_H=1.18으로 추정되어, 단일의 균질한 결합부위의 집단과의 상호작용을 생각할 수 있었다. 더욱이, 래트 Reg 단백질과 70%의 아미노산의 동일성을 나타내는 인간 REG 단백질(K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T.Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313)도, 상기의 래트 Reg 수용체를 발현하는 CHO 세포와 결합했다(K_α=14.0 nM). 방사성 표지한 래트 Reg 단백질의 CHO 세포와의 결합은, 인간 REG 단백질에 의해서도 치환되었지만, 치환에는 보다 높은 농도를 필요로 했다(K_i=7.41 nM, 도7(B)). 이상의 결과는, Reg 결합단백질(EXTL3/EXTR1)이 Reg 단백질과 결합하는 세포표면 Reg 수용체로서, Reg 단백질의 증식자극 시그날을 전달하는 것을 강하게 시사한다.

[실시예 11] 래트 Reg 수용체의 기능해석

Reg는 β세포 증식인자로서 인식되어 있다(H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 (1994); D. J. Gross et al., Endocrinology 139, 2369 (1998)). 래트 인슐리노마 유래의 β세포주인 RINm5F 세포에 Reg 단백질을 첨가한 바, 세포의 BrdU의 함입이 증가하고(1.5~2배), Reg 단백질의 농도 의존적으로 세포수를 증가시키는 것이 판명되었다. RINm5F 세포에 있어서 증식을 자극하는 Reg 단백질의 농도는 래트 췌장섬 초대배양에 있어서의 것과 일치하고 있어, Reg 단백질은 양자의 세포에 있어서 동일한 수용체를 매개로 하여 작용하고 있는 것이 시사되었다. 따라서, 이어서 RINm5F 세포에 실시예 8에서 구축한 발현벡터를 도입하여, Reg 수용체를 과잉발현하는 세포계를 몇개 수립하고, 이들 세포를 사용하여 Reg 단백질의 작용을 조사했다.

0.3~300 nM의 래트 Reg 단백질과 함께 인큐베이트하면, 수용체를 발현하는 세포계(세포계 #1, #6 및 #24)의 BrdU 함입(측정방법에 관해서는 실시예10 참조)은 두드러지게 증가했다(도8A).

Reg 수용체를 발현하는 이들 안정형질전환체를, 여러 농도의 래트 Reg 단백질의 존재하에서, 1% 소태아혈청을 가한 RPMI1640 배지중에서 24시간 인큐베이트한 후, 세포증식시약인 테트라졸리움염 4[-3-(4-요오드페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠디설포네이트(WST-1)(Roche Diagnostics)를 포함하는 용액을 배지에 첨가하고, 30분 배양하여, 생세포내의 미토콘드리아 데히드로게나아제에 의한 WST-1의 절단을 측정함으로써 세포증식을 측정했다. 그 결과, Reg 수용체를 발현하는 이들 RINm5F 세포는, Reg 단백질(0.3~100 nM)의 첨가에 응답하여 세포수를 증가시켰지만, 세포를 고농도의 Reg 단백질과 함께 인큐베이트했을 때에는 감소했다(도8B).

고농도의 Reg 단백질이, 이들 세포의 아포토시스를 유도하고 있을 가능성을 검증하기 위해, 이 Reg 수용체를 발현하는 안정형질전환체를, 여러 농도의 래트 Reg 단백질의 존재하에서, 1% 소태아혈청을 가한 RPMI1640 배지중에서 24시간 인큐베이트한 후, Apoptosis screening kit(Wako, Osaka, Japan)를 사용하여, TUNEL법[Y. Gavrieli et al., J. Cell Biol. 119, 493 (1992)]에 의해 아포토시스를 검출했다.

이들 세포의 아포토시스를 측정한 바, 고농도의 Reg 단백질이 Reg 수용체발현 RINm5F 세포의 아포토시스를 유도한 것이 명백해졌다(도8C). 이상의 결과는,Reg 수용체가 Reg 단백질에 응답하여 췌장 β세포의 증식 및 아포토시스를 매개하고, 그것에 의해 β세포의 양을 안정적으로 유지하고 있는 것을 나타내고 있다.

[실시예 12] Reg 수용체 mRNA의 발현해석

RNase 프로텍션 어세이에 의해, 여러 래트조직 및 세포에 있어서의 Reg 수용체 mRNA의 발현을 검토했다.

래트 재생 췌장섬은 상기한 바와 같이하여 조제했다(K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; Y. Yonemura et al., Diabetes 33, 401 (1984)). RNA는 이전 기재에 따라 여러 래트조직 및 세포주로부터 단리했다[T. Koguma et al., Biochem. Biophys. Acta 1223, 160 (1994); N. Noguchi et al., J. Biol Chem. 272,, 3133 (1997); H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280, 306 (1997)]. 래트 Reg 수용체 cDNA(서열번호: 3)의 PstI/BglII 단편을 pBluescript SK(-) 의 PstI/BglII 부위에 서브클로닝하여, HindIII으로 직쇄화한 후 T3 RNA 폴리머라아제 및 [α-³²P] CTP를 사용하여 인 비트로에서 전사시켰다. 얻어진 0.45 kb cRNA를 프로브로 하여 사용했다. RNase 프로텍션 어세이는, RPA III kit(Ambion)를 사용하여 설명서에 따라 행했다.

도9A에 나타내는 바와 같이, Reg 수용체 mRNA는 정상 췌장섬, 재생 췌장섬 및 RINm5F β세포에서 발현하고 있었다. 정상 췌장섬과 비교하여 재생 췌장섬에 있어서의 Reg 수용체의 발현증강은 인정되지 않고, 이것으로부터 췌장 β세포의 양을 증가시키는 β세포의 재생 및 증식은, 수용체의 발현이 아니라, 주로 Reg 단백질의 발현에 의해 조절될 가능성이 시사되었다. 이 가설은, Reg 유전자가 재생 췌장섬에서 특이적으로 발현되는 유전자로서 먼저 동정된 것(K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990))이나, 당뇨병 완해기(remission phase)에 있는 BB/Wor/Tky 래트의 췌장섬(C. Ishii et al., Endocr. J. 40, 269 (1993)), 당뇨병 발생활동기에 있는 NOD 마우스의 췌장섬(N. J. Baeza et al., Diabetes 45, 67 (1996)) 등의 일과성 β세포증식기 및 자기면역성 당뇨병의 마우스 모델에 있어서의 분화 ·증식기의 췌관세포(β세포의 전구세포라고 생각되고 있다)(E. Anastasi et al., Eur. J. Endocrinol. 141, 644-52 (1999))에도 Reg 유전자의 발현이 인정된다고 하는 관찰결과와 일치한다. 췌관세포주의 하나로서, Reg 수용체를 발현하는 ARIP 세포(도9A, 레인 6)도, Reg 단백질 의존적인 양식으로 증식하는 것이 보고되어 있다(M. E. Zenilman et al., Gastroenterology 110, 1208 (1996); M. E. Zenilman et al., Pancreas 17, 256 (1998)). Reg 수용체 mRNA의 발현은 심장에서는 인정되지 않았지만, 간장, 신장, 위, 소장, 대장, 부신, 뇌하수체 및 뇌 등에서도 인정되고(도9B), 이것으로부터 Reg-Reg 수용체 시그날계가 췌장 β세포 이외의 여러 종류의 세포에 있어서의 세포증식 및 아포토시스의 제어기구로서 관여할 가능성이 시사되었다. 사실, Reg 수용체를 발현하는 CHO 세포계는 Reg 단백질에 응답하여 증식했다(도7A). 더욱이 CHO 세포의 세포수는 Reg 단백질농도에 의존하여 증가 ·감소했다(측정방법에 관해서는 실시예11 참조)(도10).

산업상이용가능성

본 발명에 의해 Reg에 결합하는 단백질(Reg 수용체)이 제공되었다. Reg 단백질은 췌장 β세포의 세포증식인자이고, 동시에 상피세포 등에 있어서도 세포증식활성을 나타내는 것이 알려져 있다. Reg 결합단백질은 췌장 β세포에 있어서 Reg 단백질과 결합함으로써 세포증식에 필요한 시그날을 세포내에 전달하는 작용을 가지고 있어, 췌장 β세포는 Reg 단백질과 Reg 결합단백질의 결합에 의해서 재생하는 것으로 생각된다. 이 때문에, Reg 결합단백질의 세포외 도메인의 구조를 해석하고, 이것에 결합하는 리간드의 아날로그물질을 검색함으로써, 생리적인 췌장 β세포의 증식을 유발하는 「당뇨병치료약」의 개발이 가능하다. 또한, Reg 단백질은 췌장세포에 있어서 β세포의 지나친 증식을 일으키지 않기 때문에, 인슐린투여와 같은 과잉투여에 의한 저혈당을 발현할 가능성이 없다고 생각된다.

Claims (16)

1. 하기 (a)에서 (i) 중 어느 하나의 DNA.

   (a) 서열번호: 2의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.

   (b) 서열번호: 1의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA.

   (c) 서열번호: 2의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환,결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열로 되고, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

   (d) 서열번호: 1의 염기서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA로서, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

   (e) 서열번호: 4의 아미노산서열로 된 단백질을 코드하는 DNA.

   (f) 서열번호: 3의 염기서열의 코드영역을 포함하는 DNA.

   (g) 서열번호: 4의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산서열로 되고, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

   (h) 서열번호: 3의 염기서열로 된 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA로서, Reg 단백질과 결합하는 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

   (i) 서열번호: 2 또는 4의 아미노산서열로 된 단백질의 부분펩티드를 코드하는 DNA.
2. 제1항의 DNA에 의해 코드되는 단백질 또는 펩티드.
3. 제1항의 DNA가 삽입된 벡터.
4. 제3항의 벡터를 보유하는 숙주세포.
5. 제4항의 숙주세포를 배양하여, 상기 세포에서 발현된 재조합 단백질을, 상기 배양세포 또는 그 배양상청에서 회수하는 공정을 포함하는, 제2항의 단백질 또는 펩티드의 제조방법.
6. 제2항의 단백질 또는 펩티드에 대한 항체.
7. 서열번호: 1 또는 3의 염기서열로 된 DNA 또는 그 상보 DNA와 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 사슬길이를 갖는 폴리뉴클레오티드.
8. 제2항의 단백질 또는 펩티드에 결합하는 화합물의 스크리닝방법으로서,

   (a) 상기 단백질 또는 펩티드에 피검시료를 접촉시키는 공정,

   (b) 상기 단백질 또는 펩티드와 피검시료와의 결합을 검출하는 공정, 및

   (c) 상기 단백질 또는 펩티드에 결합하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법.
9. 제2항의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물의 스크리닝방법으로서,

   (a) 피검시료 존재하에서 제2항의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질을 접촉시키는 공정,

   (b) 제2항의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 검출하는 공정, 및

   (c) 상기 결합을 저하시키는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법.
10. 제9항의 방법에 의해 단리될 수 있는, 제2항의 단백질 또는 펩티드와 Reg 단백질과의 결합을 저해하는 화합물.
11. 제2항의 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,

    (a) 피검시료의 존재하에서 제2항의 단백질을 그 표면에 발현되는 세포에 Reg 단백질을 접촉시키는 공정,

    (b) Reg 단백질에 의한 자극에 응답한 상기 세포의 변화를 검출하는 공정, 및

    (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우(대조)에 비해, 상기 세포의 변화를 증강 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정을 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 세포의 변화가, 세포증식활성 또는 세포의 DNA 합성활성의 변화인 방법.
13. 제11항 또는 제12항의 방법에 의해 단리될 수 있는, 제2항의 단백질의 활성화에 의해 생기는 시그날전달을 촉진 또는 저해하는 화합물.
14. 제1항의 DNA, 제2항의 단백질 또는 펩티드, 제3항의 벡터, 제6항의 항체, 제10항의 화합물, 또는 제13항의 화합물을 포함하는 약제.
15. 제14항에 있어서, Reg 결합제, Reg 단백질에 응답한 세포내 시그날전달의 조절제, 세포증식조절제, DNA 합성조절제 및 아포토시스조절제로 이루어진 군으로부터 선택되는 약제.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 당뇨병치료인 약제.