WO2000077192A1 - Protéine se liant à reg - Google Patents

Protéine se liant à reg Download PDF

Info

Publication number
WO2000077192A1
WO2000077192A1 PCT/JP2000/003764 JP0003764W WO0077192A1 WO 2000077192 A1 WO2000077192 A1 WO 2000077192A1 JP 0003764 W JP0003764 W JP 0003764W WO 0077192 A1 WO0077192 A1 WO 0077192A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
reg
dna
cells
binding
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/003764
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2000077192A9 (fr
Inventor
Hiroshi Okamoto
Original Assignee
Hiroshi Okamoto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hiroshi Okamoto filed Critical Hiroshi Okamoto
Priority to CA002392514A priority Critical patent/CA2392514A1/en
Priority to KR1020017015854A priority patent/KR20020033635A/ko
Priority to AU51077/00A priority patent/AU777139B2/en
Priority to EP00935616A priority patent/EP1188828A4/en
Publication of WO2000077192A1 publication Critical patent/WO2000077192A1/ja
Publication of WO2000077192A9 publication Critical patent/WO2000077192A9/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein that binds to a Reg protein, its gene, and its production and use.
  • insulin administration is a symptomatic treatment, and at the same time, it is difficult to maintain physiological blood insulin levels, and when considering the treatment of complications of diabetes such as progression of arteriosclerosis, neuropathy, and eye disease.
  • the treatment had limitations.
  • Oral diabetic drugs also had side effects such as a decrease in insulin secretion ability, which may be due to excessive load on coronary atherosclerosis ⁇ ⁇ during long-term administration ⁇
  • the present inventors have analyzed the mechanism of /? Cell injury and its prevention (H. Yamamoto, et al., Nature 294, 284 (1981); Y. Uchigata, et al., J. Biol Chem. 257). , 6084 (1982); Y. Uchigata, et al., Diabetes 32, 316 (1983); H. Okamoto, Bioessays 2, 15 (1985); H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999).
  • the present inventors have succeeded in experimentally regenerating and proliferating ⁇ cells (T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 (1994); Yonemura, Y. .
  • Reg Regeneratinggene
  • H. Okamoto J. Mol. Med. 77, 74 (1999)
  • K. Terazono et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988)
  • K. Terazono T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990); T. Watanabe et al., Proc. Natl.
  • Reg protein is expected to be applied to the treatment of diabetes as a growth factor of glands / cells that compensates for the weakness of insulin administration, but its large molecular weight makes oral administration difficult. There are many technical issues in clinical application, such as difficulty in getting one. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel protein that binds to a Reg protein, a gene thereof, a method for producing them, and a use thereof.
  • the protein of the present invention is useful for the development of a new therapeutic agent for diabetes mellitus.
  • the present inventors used yeast to examine the effect of Reg protein on cell lines.
  • An experiment was performed in which the recombinant Reg protein produced as described above was added to a rat insulinoma cell-derived cell line RINm5F.
  • RINm5F rat insulinoma cell-derived cell line
  • the addition of Reg protein significantly increased the uptake of 5'-promo-2'-deoxyperidine (BrdU) in RINiii5F cells, and that the growth of the cells was promoted by the Reg protein.
  • the present inventors labeled the Reg protein with 125 1 and added it to RINm5F cells to examine its binding activity.
  • the present inventors have, to isolate Re g binding protein that functions as a Reg protein receptor, to construct an expression cDNA library with a phage vector from rat ⁇ islet polyA (+) RNA, was used labeled Reg protein
  • the gene encoding the Reg binding protein was screened by the West Western method.
  • this cDNA was inserted into a mammalian cell expression vector, expressed in C0S-7 cells, and the recombinant Reg protein was added to these cells, the Reg protein could bind specifically to the COS-7 cells. I was assured.
  • the present inventors have succeeded in further isolating the cDNA encoding the Reg binding protein by screening a rat Perlangehans islet cDNA library using this cDNA as a probe.
  • the cDNA coded for a cell surface protein consisting of 919 amino acids.
  • the protein was expressed on the cell surface and the cells bound the Reg protein with high affinity.
  • BrdU uptake was induced by the addition of Reg protein, and the cell number increased.
  • this Reg-binding protein transmits the signal of the Reg protein and regulates the amount (mass) of the ⁇ cells by controlling the cell proliferation and the like in the ⁇ cells.
  • the Reg-binding protein and the gene thereof of the present invention are useful tools for elucidating the etiological mechanism of diabetes, and are also considered to be applicable to the development of therapeutic drugs for diabetes.
  • the present invention relates to a Reg protein-binding protein and its gene, and methods for producing and using them, and more specifically,
  • MA which encodes a partial peptide of a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or 4, (2) a protein or peptide encoded by the DNA according to (1),
  • a polynucleotide that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary DNA thereof and has a chain length of at least 15 bases
  • (11) A method for screening a compound that promotes or inhibits signal transduction caused by the activation of the protein according to (2), (a) contacting a Reg protein with cells expressing the protein of (2) on the surface thereof in the presence of a test sample;
  • the (14) selected from the group consisting of a Reg binding agent, a regulator of intracellular signal transduction in response to a Reg protein, a cell growth regulator, a DNA synthesis regulator, and an apoptosis regulator.
  • a Reg binding agent selected from the group consisting of a Reg binding agent, a regulator of intracellular signal transduction in response to a Reg protein, a cell growth regulator, a DNA synthesis regulator, and an apoptosis regulator.
  • the present invention relates to a novel protein (Reg binding protein) that is expressed in the kidney and binds to a Reg protein.
  • the nucleotide sequences of the isolated rat “Reg-binding protein” cDNA included in the present invention are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, and the amino acid sequences of the “Reg-binding protein” encoded by these cDNAs are shown in SEQ ID NO: Shown in 2 and 4.
  • One of the cDNAs encoding the rat Reg binding protein of the present invention contains an open reading frame encoding a protein of 364 amino acid residues (SEQ ID NO: 2) (SEQ ID NO: 1). Screening using this cDNA as a probe also isolates a cDNA (SEQ ID NO: 3) encoding a rat Reg binding protein containing an open reading frame encoding a 919 amino acid residue protein (SEQ ID NO: 4). Was completed.
  • the rat “Reg binding protein” of the present invention is expressed on the cell surface, Has the activity of binding to As mentioned above, the Reg protein is a regenerative growth factor that is specifically expressed during the renewal of cells, and its proteins and genes have been shown to have therapeutic potential for diabetes.
  • the Reg binding protein of the present invention functions as a receptor for this Reg protein, and is considered to be involved in the regulation of the physiological functions of cells, including the control of proliferation of ⁇ cells. Therefore, the use of the Reg-binding protein of the present invention as a research target to elucidate the mechanism of the pathogenesis of diabetes and as a tool for the development of therapeutic agents for diseases involving the function of ru ⁇ cells (such as diabetes) are considered.
  • the type I Reg protein including the rat and human Reg proteins used in this example is expressed in regenerated islets (H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); K. Terazono, et al. al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33 , 250 (1990); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999)).
  • the identified Reg receptor is likely to function as a receptor for the product of the Reg family gene in various tissues and cells under physiological and pathological conditions.
  • the protein of the present invention can be used in addition to diabetes and gastrointestinal swelling (Asahara, M. et al., Gastroenterology 111, 45-55 (1996); Fukui, H. et al., Gastroenterology 115, 1483-1493 (1998)), neurodegenerative disease (Livesy, FJ et al., Nature 390, 614-618 (1997)), and prostatitis (Christa, L. et al., Am. J. Phsiol. 271, G993-G1002 (1996); Ortiz, E. et al., Gastroenterology 114, 808-816 (1998)).
  • Reg protein-Reg binding protein when abnormalities of Reg protein-Reg binding protein (eg, overstimulation) occur in tumors, etc., administration of soluble Reg-binding protein can suppress overstimulation and suppress tumor growth, etc. It is also conceivable to apply the Reg binding protein itself to therapy.
  • a protein structurally similar to rat “Reg binding protein” is also included as long as it has an activity of binding to the Reg protein.
  • Such structurally similar proteins include mutants of “Reg-binding protein” and “Reg-binding proteins” derived from other organisms.
  • Such proteins can be prepared by those skilled in the art, for example, using a known mutagenesis method.
  • Methods for modifying amino acids in proteins known to those skilled in the art include, for example, the Kunkel method (Kunkel, TA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488), Oligonucleotide-directed Dual Amber (ODA). (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275), PCR-restriction enzyme method (Ito, W. et al. (1991) Gene 102, 67-70), ODA-PCR method (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Ito, W.
  • the number of amino acid modifications in the protein is not limited, but is usually within 50 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids if artificially performed. Amino acid mutations in proteins can also occur naturally. Proteins that differ in amino acid sequence from the native rat “Reg-binding protein” due to artificial or natural amino acid substitutions, deletions, additions, and / or insertions as long as they have the activity to bind to the Reg protein. Are also included in the present invention.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to the amino acid before substitution.
  • Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, and Trp are all classified as non-polar amino acids, and are considered to have similar properties to each other.
  • examples of the non-charger include Gly ⁇ Ser ⁇ Thr ⁇ Cys and Tyr ⁇ Asn ⁇ Gin.
  • acidic amino acids include Asp and Glu.
  • basic amino acids include Lys, Arg, and His.
  • the protein in which the amino acid of the rat “Reg binding protein” is deleted includes a protein having only an extracellular region.
  • proteins in which amino acids have been added to rat “Reg-binding protein” include rat “Reg-binding protein” and other peptides. Fusion proteins are included.
  • the preparation of a protein that is structurally similar to rat “Reg-binding protein”, which has the activity to bind to the Reg protein can be performed by a known hybridization technique (edited by Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring). 'Harba-Laboratory 1, 1989 (Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press)) and polymerase chain reaction technology (edited by Sambrook et al., Molecular' cloning ' Second edition, Cold'Spring-Harber-Lab., 1989 (Sambrook, J. et al.
  • rat “Reg-binding protein” cDNA sequence SEQ ID NO: 1 or 3
  • an oligonucleotide that specifically hybridizes to rat “Reg-binding protein” cDNA is used.
  • As a primer it is common to isolate DNA highly homologous to rat “Reg-binding protein” from various other organisms and obtain a protein structurally similar to rat “Reg-binding protein” from the isolated DNA. It is a means.
  • a protein encoded by a DNA hybridizing with a rat “Reg binding protein” cDNA is included as long as it has an activity of binding to the Reg protein.
  • Other organisms from which such proteins can be isolated include, but are not limited to, humans, monkeys, mice, rabbits, goats, rabbits, bushes, dogs, and the like. In order to isolate a DNA encoding such a protein, for example, it is considered that Perangerhans islet cells of these organisms are suitable as a material.
  • DNA encoding a "Reg binding protein" derived from an organism other than a rat usually has a high homology to the nucleotide sequence of the rat "Reg binding protein” cDNA (SEQ ID NO: 1 or 3).
  • High homology means at least 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, most preferably at the nucleotide sequence level. Indicates 99% or more sequence identity.
  • FASTA search for sequences that maintain similarity in a long range
  • BLAST search for sequences with high local similarity
  • SSEARCH search using the Smith-Waterman algorithm
  • rat "Reg-binding protein" cDNA can be used to isolate a cDNA encoding a protein functionally equivalent to the rat "Reg-binding protein” from another organism.
  • 6 x SSC I 5 x FBP I 0.5% SDS / 0.2 mg / ml salmon (herring) sperm DNA / 10% formamide solution hybridized at 42 ° C (low stringency conditions) It can be performed.
  • 6X SSC I 5X FBP / 0.5% SDS / 0.2mg / ml salmon (herring) sperm DNA / 30% formamide solution hybridized at 42 ° C (intermediate stringent conditions) Perform a trial.
  • hybridization is carried out with a solution of 6 ⁇ SSC I 5 ⁇ FBP I 0.5% SDS / 0.2 mg / ral salmon (herring) sperm DNA / 50% formamide at 50 ° C. (high stringent conditions).
  • factors that influence the stringency of the hybridization may be a number of factors, such as temperature, formamide concentration, and salt concentration. It is possible to achieve stringency.
  • the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein using a gene recombination technique, in addition to a natural protein.
  • the natural protein is obtained, for example, by using an antibody against a “Reg-binding protein” described below to an extract of a tissue (eg, a islet of Langerhans /? Cells) in which “Reg-binding protein” is considered to be expressed. It can be prepared by a method using two-tipped mouth chromatography.
  • a recombinant protein can be prepared by culturing cells transformed with a DNA encoding a “Reg-binding protein” as described below, and expressing and recovering this protein.
  • the present invention includes a partial peptide of the protein of the present invention.
  • the peptide include, among the proteins of the present invention, a peptide corresponding to the binding site to the Reg protein.
  • the partial peptide of the protein of the present invention can be used as an agonist of the protein of the present invention, an antagonist of the Reg protein, and the like by being administered to a living body. These partial peptides are useful as activators and inhibitors of signal transmission via the protein of the present invention.
  • Examples of the partial peptide of the present invention include a partial peptide at the N-terminal region and a partial peptide at the C-terminal region of the protein of the present invention. These peptides are used for preparing antibodies. be able to .
  • the partial polypeptide having an amino acid sequence specific to the protein of the present invention has a chain length of at least 7 amino acids, preferably at least 8 amino acids, and more preferably at least 9 amino acids.
  • the partial peptide of the present invention can be produced, for example, by a genetic engineering technique, a known peptide synthesis method, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • partial peptides containing a region that binds to the Reg protein can be used to bind the Reg protein.
  • Such partial peptides can be used as Reg protein binders.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the protein of the present invention.
  • the MA encoding the protein of the present invention is not particularly limited as long as it can encode these proteins, and includes cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA.
  • a DNA having an arbitrary nucleotide sequence based on the degeneracy of the genetic code is included.
  • CDNA encoding the protein of the present invention for example, SEQ ID NO: cDNA or fragment thereof according to 1 or 3, their complementary RNA, or synthetic oligonucleotides comprising a portion of sequence of the cDNA 32 P etc.
  • Screening can be carried out by labeling with cDNA and hybridizing to a cDNA library derived from a tissue (eg, a kidney) expressing the protein of the present invention.
  • tissue eg, a kidney
  • oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequences of these cDNAs can be synthesized, and cDNA derived from an appropriate tissue (for example, a kidney) can be amplified and cloned into a type by polymerase chain reaction.
  • Genomic DNA includes, for example, the cDNA of SEQ ID NO: 1 or 3 or a fragment thereof
  • Screening can be performed by labeling a complementary RNA or a synthetic oligonucleotide containing a part of the sequence of the cDNA with 32 P or the like, and hybridizing the labeled oligonucleotide to a genomic DNA library.
  • oligonucleotides corresponding to the nucleotide sequences of these cDNAs can be synthesized, and genomic DNA can be amplified to form type II by polymerase chain reaction and then cloned.
  • a synthetic DNA can be prepared, for example, by chemically synthesizing an oligonucleotide having a partial sequence of the cDNA shown in SEQ ID NO: 1 or 3, annealing it to make it double-stranded, and binding it with DNA ligase. .
  • These DNAs are useful for producing recombinant proteins. That is, a DNA obtained by inserting a DNA encoding the protein of the present invention (for example, the DNA of SEQ ID NO: 1 or 3) into an appropriate expression vector and introducing the vector into an appropriate cell. By culturing the transformant and collecting the expressed protein, the protein of the present invention can be prepared as a recombinant protein.
  • the protein of the present invention can be prepared as a purified or partially purified protein, or expressed in a mammalian cell, and prepared as a membrane-bound form.
  • Specific host-vector systems include, for example, the E. coli-pGEX system (Amersham Armasiasia Biotech; expressed as a fusion protein with GST), the E. coli-pHB6 system and the pVB6 system (Roche Diagnostics). Stick; expressed as a fusion protein with 6 histidines), E. coli-pMAL system (New England Biolabs; expressed as a fusion protein with maltose binding protein), E.
  • coli-pTYB system New England Biolabs; expressed as a fusion protein with Intein, then the Interin portion is cleaved in the presence of DTT, making it easy to purify only the target protein
  • Pichia-pPIC and pGAP Invitorogen
  • mammalian cells eg COS -7) — pCI-neo system (Promega), pHook system (Invitorogen), etc.
  • the method of introducing a vector into a host is known as transformation or electroporation into known E. coli cells.
  • transformation into electrocompetent cells prepared by Pichia Easy Comp Kit see Example 1
  • electroporation electroporation into mammalian cells or known cationic It can be performed by a lipofection method using a lipid or the like.
  • the recombinant protein expressed in the host cell can be purified by a known method.
  • the protein of the present invention is expressed in the form of a fusion protein in which a tag of a histidine residue or glutathione S-transferase (GST) is bound at the N-terminus, for example, a nickel column or glutathione is used, respectively. It can be purified using a thiophene sepharose column or the like.
  • the DNA encoding the protein of the present invention can also be applied to gene therapy for diseases caused by the mutation.
  • gene therapy using a virus vector such as vaccinia virus or retrovirus can be considered.
  • the “Reg-binding protein” is introduced into a transplantation tract or a islet of Langerhans using these recombinant viruses under culture conditions, and transplantation is performed to expand Teng cells.
  • the transplantation treatment effect can be improved and the organ for transplantation can be effectively used.
  • the present invention also relates to a polynucleotide that hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3 or a complementary DNA thereof and has a chain length of at least 15 bases.
  • the polynucleotide is preferably a polynucleotide that specifically hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or 3, and has a chain length of at least 15 bases.
  • “Specifically hybridize” means under ordinary hybridization conditions, preferably under the above-mentioned intermediate stringent hybridization conditions, and more preferably under the above-mentioned highly stringent hybridization conditions. Means that cross-hybridization with DNA encoding other proteins does not significantly occur.
  • hybridization may be performed under the above conditions.
  • polynucleotides include probes or primers, nucleotides or nucleotide derivatives (eg, antisense oligonucleotides and ribozymes) capable of specifically hybridizing to DNA encoding the protein of the present invention or DNA complementary to the DNA. Etc.) are included.
  • the peptide can be used for cloning of a gene or cDNA encoding the protein of the present invention, or for amplification by PCR. Further, it is useful for detection and quantification of RNA encoding the protein of the present invention. Furthermore, methods such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) and single-stranded DNA conformational polymorphism (SSCP) can be used to detect gene or cDNA mutations, polymorphisms, or abnormalities (such as genetic diagnosis).
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • SSCP single-stranded DNA conformational polymorphism
  • the polynucleotide of the present invention can be used for the examination of the kidney, for example, Can be used for inspection. Further, the polynucleotide of the present invention can also be used for testing for diabetes. For example, it is possible to isolate a renal tissue sample from a subject and examine the expression level of the protein of the present invention in this tissue for abnormalities using Northern hybridization, RT-PCR, or a DNA chip (DNA microarray). it can.
  • DNA or RNA encoding the protein of the present invention can be determined by sequence determination or by SSCP or RFLP.
  • the polynucleotide when used as a test reagent, it can be appropriately mixed with sterile water, a buffer, a salt, or the like.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a DNA encoding the protein or the peptide, and a vector into which the DNA is inserted may be a compound that inhibits the binding between the protein of the present invention and a Reg protein described below. It can be used for screening, and for screening compounds that promote or inhibit signal transduction (eg, cell proliferation activity or cell DNA synthesis activity) resulting from activation of the protein of the present invention. These screenings can also be applied to the treatment or prophylaxis of diseases caused by abnormalities in the amount or function of cells, including diabetes. In addition to diabetes, it can be used for the treatment or prophylaxis of therapeutic or prophylactic agents for gastrointestinal tumors, neurodegenerative diseases, inflammatory diseases, tumors and the like.
  • the present invention also relates to an antibody that binds to the protein of the present invention.
  • the antibodies of the present invention include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • Polyclonal antibody For example, “Reg-binding protein” prepared from biological materials (eg, kidney islets of Langerhans), recombinant “Reg-binding protein” produced by the host-vector system described above, or general peptide synthesis A method known in the art using a partial peptide synthesized by the method as an antigen
  • Monoclonal antibodies were prepared from biomaterials (eg, liver islets of Langerhans)
  • polyclonal antibodies For polyclonal antibodies, serum, and for monoclonal antibodies, common biochemicals such as ammonium sulfate fraction, protein G Sepharose column, antigen-fixed affinity column, etc. from aseptic fluid of hybridoma culture supernatant or ascites of animals inoculated with hybridoma.
  • the antibody is purified by the technique.
  • the antibody thus prepared is used for affinity purification of the protein of the present invention.
  • examination and diagnosis of diseases caused by abnormal expression or structural abnormality of the protein of the present invention, and protein of the present invention It can be used for detection of the expression level of.
  • the antibody of the present invention can also be used for the examination of the kidney, for example, the examination of human cells. Further, the antibody of the present invention can also be used for testing for diabetes.
  • a liver tissue sample can be isolated from a subject, and the expression level or structure of the protein of the present invention in this tissue can be examined for abnormalities by Western plot, immunohistochemistry, ELISA, EIA and the like.
  • test reagents combine sterile water, buffers, salts, stabilizers, preservatives, etc. as appropriate. Can be matched. It is also conceivable to use the antibodies of the present invention for antibody therapy.
  • the antibody of the present invention is used for antibody therapy, it is preferably a humanized antibody or a human antibody.
  • human lymphocytes are fused with HGPRT (hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase) -deficient mouse myeloma, and human-mouse heterohybridoma is selected in HAT medium.
  • HGPRT hyperxantine-guanine phosphoribosyl transferase
  • human-mouse heterohybridoma is selected in HAT medium.
  • the myeloma cells are selected by a known RIA or ELISA method using “Reg-binding protein” as an antigen to obtain a clone that produces a humanized monoclonal antibody against “Reg-binding protein”. Purification of the antibody can be performed as described above.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound that binds to the protein of the present invention.
  • Such screening includes (a) a step of bringing a test sample into contact with the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and (b) detecting the binding between the protein of the present invention or a partial peptide thereof and the test sample. And (c) selecting a compound that binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof.
  • the protein of the present invention can be used for screening as a purified protein, in a form expressed on the cell surface, or as a cell membrane fraction, depending on the screening technique.
  • test sample examples include, but are not limited to, a cell extract, an expression product of a gene library, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, and a natural compound.
  • the test sample is used after being appropriately labeled as necessary.
  • label examples include, but are not limited to, radioactive labels and fluorescent labels.
  • Screening for a protein that binds to the protein of the present invention includes, for example, a culture supernatant of a cell that is expected to express the protein that binds to the protein of the present invention on an affinity column on which the protein of the present invention is immobilized.
  • a protein that binds to the protein of the present invention can be obtained by applying a cell extract and purifying a protein that specifically binds to the column. Can be screened.
  • a cDNA library using a phage vector is prepared from a tissue or a cell (for example, a cell) that is expected to express a protein that binds to the protein of the present invention, and this is prepared on agarose. After immobilizing the protein on the filter and expressing it, the labeled protein of the present invention is reacted to detect the break that expresses the protein to be bound.
  • the method can be carried out according to a “two hybrid system” or the like for detecting the binding between the protein of the present invention and the test protein.
  • a method of screening a molecule to be bound by allowing a synthetic compound, a natural product bank, or a random phage peptide display library to act on the immobilized protein of the present invention and a high-throughput method using combinatorial chemistry technology.
  • a method for isolating a compound that binds to the protein of the present invention by screening using a put is also a technique well known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound that inhibits the binding between the protein of the present invention and a Reg protein.
  • Screening includes: (a) a step of bringing the protein of the present invention into contact with a Reg protein in the presence of a test sample; (b) a step of detecting the binding between the protein of the present invention and the Reg protein; (c) Selecting a compound that reduces the binding.
  • the protein of the present invention can be used for screening as a purified protein, in a form expressed on the cell surface, or as a cell membrane fraction.
  • Reg protein is usually Used for screening as a purified protein.
  • As the Reg protein for example, human REG I or rat Reg I can be used. These proteins may be prepared as recombinant proteins (see Example 1). Reg protein may be labeled with a radioisotope such as [ 1251 ] if necessary.
  • test sample examples include, but are not limited to, a cell extract, an expression product of a gene library, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, and a natural compound.
  • the screening can be performed, for example, as follows.
  • a cell expressing the protein of the present invention, or a membrane fraction prepared therefrom, is contacted with a labeled ligand (Reg protein) in the presence of a test sample to form a labeled ligand that binds to the protein of the present invention.
  • a labeled ligand (Reg protein)
  • a test sample to form a labeled ligand that binds to the protein of the present invention.
  • Measure the amount Select a compound that reduces the amount of this ligand as compared to when no test sample is present.
  • the binding between the protein of the present invention and the Reg protein can also be measured using the above-described BIACORE or microphysiome.
  • the compound thus isolated is a candidate for the agonist of the protein of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for screening for a compound that promotes or inhibits signal transduction caused by activation of the protein of the present invention.
  • screening includes: (a) a step of contacting a Reg protein with a cell expressing the protein of the present invention on the surface in the presence of a test sample; and (b) a change of the cell in response to the Reg protein stimulation. And (c) selecting a compound that enhances or suppresses the change in the cells as compared with the case of detection in the absence of the test sample (control). It is possible.
  • Cells expressing the protein of the present invention on its surface are prepared by inserting the DNA encoding the protein of the present invention into an appropriate expression vector and introducing the vector constructed thereby into an appropriate host cell.
  • the host cell include cells such as RINm5F cell, CH0 cell, and COS-7 cell.
  • PCI-neo as vector (Promega), pHook (Invitrogen) and the like.
  • test sample examples include, but are not limited to, a cell extract, an expression product of a gene library, a synthetic low-molecular compound, a synthetic peptide, and a natural compound. Further, a compound isolated by the above-described screening using the binding to the protein of the present invention as an index can be used as a test sample.
  • Reg protein is usually used for screening as a purified protein.
  • As the Reg protein for example, human REG I or rat Reg I can be used. These proteins may be prepared as recombinant proteins (see Example 1).
  • Changes in cells in response to Reg protein stimulation include, for example, changes in cell growth activity, changes in cell DNA synthesis activity, changes in the degree of cell apoptosis, and phosphorylation of the protein of the present invention or a protein that transmits its signal. Examples include, but are not limited to, oxidation and changes in the expression of specific genes in cells.
  • Cellular DNA synthesis can be detected, for example, by measuring the incorporation of 5'-bromo-2'-dexperidine (BrdU) as shown in the Examples. Alternatively, it may be performed by adding 3 ⁇ 4-thymidine to cells and measuring the radioactivity incorporated into the cells. ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -thymidine incorporation into cells is commonly used to measure the effect of promoting or inhibiting DNA synthesis. This method has advantages such as handling a relatively large amount of sample and high sensitivity. For screening of compounds that promote or inhibit DNA synthesis, specifically, for example, seed cells on a multi-well plate or the like and incubate for about 1 to 2 days, change to the medium containing the test sample, and change to 24 hours, etc.
  • RhdU 5'-bromo-2'-dexperidine
  • cell proliferation can be performed by measuring the number of cells or the number of colonies, or by adding a dye such as MTT or Alamar Blue to the cells and measuring the color development depending on the number of cells.
  • the MTT method measures cell proliferation activity by color development with MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide). It acts on the mitochondrial respiratory chain to produce MTT formazan. This production reflects the number of cells. Specifically, for example, the cells are cultured in a 96-well plate, and the test sample is allowed to act. Then, 10-5 of a 5 mg / ml MTT solution is added, and the mixture is incubated for 4 hours.
  • Cell apoptosis can be measured using, for example, changes in nuclear morphology (condensation and fragmentation of nuclei) and chromosome fragmentation (dala formation). Specifically, apoptosis can be detected by, for example, the TUNEL method [Y. Gavriel et al., J. Cell Biol. 119, 493 (1992)] (see Example 11).
  • Protein phosphorylation is thought to occur at serine, threonine, or tyrosine residues. These changes in phosphorylation can be detected by measuring the phosphorylation state of intracellular proteins by the Wessin method ⁇ immunoprecipitation with anti-phosphorylated serine, threonine, or tyrosine antibodies. Proteins to be phosphorylated are expected to be MAP kinase system-STAT system or Fos-Jun protein involved in cell growth, but are not limited to these exemplified proteins.
  • the change in the expression of a specific gene can be detected by using a repo overnight gene. That is, the measurement can be performed by connecting the repo overnight gene downstream of the promoter of the gene and detecting the expression of the repo overnight gene. Changes in the expression of specific genes can be detected by methods such as Northern blotting or RT-PCR, such as methods for detecting mA, methods for detecting proteins that are translation products of genes using antibodies, and gene translation. It can also be measured by a method for detecting the activity of the product protein.
  • Compounds isolated by these screenings include, for example, 1) a compound that binds to the protein of the present invention and promotes or inhibits its activity, and 2) a ligand of the protein of the present invention such as the protein of the present invention or the Reg protein.
  • a compound that binds and promotes or inhibits the binding of the protein of the present invention to the ligand 3 a compound that binds to the ligand of the protein of the present invention and promotes or inhibits its activation; 4 a change in the cell from the protein of the present invention
  • These compounds can be applied to preventive and therapeutic agents for diseases caused by abnormalities in the signal transduction system mediated by the protein of the present invention (for example, diseases caused by abnormalities in cancer cells). For example, it may be applied to the treatment of diabetes.
  • the DNA of the present invention, the protein of the present invention or the partial peptide thereof, the vector containing the DNA of the present invention, the antibody against the protein of the present invention or the partial peptide thereof, and the compound which can be isolated by the above screening are used alone or It can be used as a drug in combination with other compounds.
  • the agents of the present invention include reagents and medicaments.
  • the protein of the present invention since the protein of the present invention has an activity of binding to the Reg protein, the protein of the present invention and its partial peptide can be used to bind to the Reg protein. Such a protein or peptide can be used for detection of a Reg protein, affinity purification, and the like.
  • the protein of the present invention or its partial peptide By bringing the protein of the present invention or its partial peptide into contact with the Reg protein, the protein of the present invention or its partial peptide can be bound to the Reg protein.
  • the protein of the present invention or its partial peptide has not been purified. Or expressed on the cell membrane surface. Also, it may be bound to a carrier.
  • a carrier There is no limitation on the origin of the Reg protein to be bound, and Reg proteins from mice, rats, humans and the like can be bound.
  • a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof and a vector into which the DNA is inserted are used for the same purpose by expressing the protein of the present invention or the partial peptide thereof in cells. be able to.
  • the drug containing the protein of the present invention and its partial peptide, the DNA encoding them, or the vector into which the DNA is inserted can be used as a Reg protein binding agent.
  • the protein of the present invention functions as a receptor for Reg protein. Therefore, the protein of the present invention can be used to regulate (promote or suppress) intracellular signal transduction in response to the Reg protein. By activating the protein of the present invention, signal transmission is promoted, and conversely, by inhibiting the activation of the protein of the present invention, signal transmission is blocked.
  • the protein of the present invention eg, SEQ ID NO: 4
  • a ligand or agonist of the protein of the present invention such as a Reg protein to activate the protein of the present invention, and a signal is produced in the cell.
  • the cells are preferably cells of a cell line or epithelial cells.
  • a protein that binds to a Reg protein but does not transmit a signal into a cell can be used to block signaling of the Reg protein.
  • proteins include proteins that retain the binding region to the Reg protein but do not have a downstream signaling site. By expressing such a protein in a cell or by adding it extracellularly, signal transmission by the Reg protein can be blocked.
  • DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof and a vector into which the DNA is inserted may be used for the same purpose by expressing the protein of the present invention or a partial peptide thereof in cells. Can be.
  • an antibody that binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a compound that can be isolated by the screening of the present invention can be used for the same purpose.
  • the protein of the present invention or its The partial peptide, the DNA encoding the protein or the peptide, the vector into which the DNA is inserted, the antibody of the present invention, and the compound that can be isolated by the screening of the present invention are capable of signaling intracellular signaling in response to the Reg protein.
  • Modulators such as accelerators or inhibitors
  • intracellular signal transduction in response to the Reg protein includes promotion of cell DNA synthesis and regulation (promotion or suppression) of cell growth. That is, it indicates that the protein of the present invention can be used to promote DNA synthesis of cells and to promote or suppress cell proliferation.
  • the target cell is preferably a cell of a cell line or an epithelial cell.
  • a vector that expresses the protein of the present invention eg, SEQ ID NO: 4
  • proteins that bind to the Reg protein but do not transmit signals into cells can be used to suppress DNA synthesis or suppress cell growth.
  • proteins include proteins that retain the binding region to the Reg protein but do not have a downstream signaling site.
  • a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof and a vector into which the DNA has been inserted can also be used for the same purpose as described above by expressing the protein of the present invention or a partial peptide thereof in cells.
  • an antibody that binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a compound that can be isolated by the screening of the present invention can also be used for regulating DNA synthesis or cell growth.
  • an antibody or compound acting as a ligand or agonist of the protein of the present invention can promote the proliferation of cells (eg, 5 cells) by administering it to a living body. Administration can be performed in vitro and in vivo.
  • Agents eg, accelerators or inhibitors.
  • signal transduction caused by activation of the protein of the present invention includes induction of cellular apoptosis. That is, the protein of the present invention can be used for regulating cell apoptosis (inducing or suppressing apoptosis).
  • DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof and a vector into which the DNA is inserted can be used for the same purpose by expressing the protein of the present invention or a partial peptide thereof in cells. .
  • an antibody that binds to the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a compound that can be isolated by the screening of the present invention can also be used for regulating apoptosis.
  • the target cell is preferably a cell of a cell line or an epithelial cell.
  • Apoptosis can be induced by contacting a cell that expresses the protein of the present invention with a ligand of the protein of the present invention (eg, a Reg protein) at a high concentration.
  • the Reg protein is contacted with the cells, for example, at a concentration higher than ⁇ , preferably at a concentration of 500 nM or more, more preferably at a concentration of ⁇ or more.
  • a vector expressing the protein of the present invention eg, SEQ ID NO: 4
  • a protein that binds to the Reg protein but does not transmit a signal into cells can be used to suppress the induction of apoptosis by the Reg protein.
  • Apoptosis can be suppressed by expressing such a protein in cells or by adding it extracellularly.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof, DNA encoding the protein or peptide, a vector into which the DNA is inserted, the antibody of the present invention, and the compound that can be isolated by the screening of the present invention include cell apoptosis.
  • the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a DNA encoding the protein or the peptide, a vector into which the DNA has been inserted, an antibody of the present invention, and a compound which can be isolated by the screening of the present invention include: According to a known pharmaceutical technique, a composition can be obtained by combining distilled water, a buffer, a salt, BSA, glycerol, a stabilizer, a preservative, a surfactant and the like. Further, the drug of the present invention can be used as a reagent for examining a kidney as described above. It is also useful as a pharmaceutical composition for treating or preventing diabetes, gastrointestinal tract tumors, neurodegenerative diseases, phlegmitis, tumors and the like.
  • the agent of the present invention When the agent of the present invention is used as a medicament, the protein of the present invention or a partial peptide thereof, a DNA encoding the protein or peptide, a vector into which the DNA has been inserted, an antibody of the present invention, and a DNA of the present invention
  • a suitable combination with a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water, physiological saline, dextrose, glycerol, ethanol, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, etc. May be formulated and administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in the form of an aqueous solution, tablet, capsule, troche, balical tablet, elixir, suspension, capsule, or the like.
  • the content of the active compound may be appropriately determined.
  • Administration to a patient can be performed, for example, by intraarterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc., or intranasally, transbronchially, intramuscularly, or orally by a method known to those skilled in the art. Administration can be systemic or local.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, the symptoms, and the like, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • Administration can be carried out once to several times.
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • Administration can be performed ex vivo or in vivo.
  • the dose and the administration method vary depending on the patient's body weight, age, symptoms and the like, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • FIG. 1 shows the results of measuring the uptake of BrdU when human REG protein (REGIa) was added to RINm5F cells derived from rat insulinoma (Example 3 and FIG. 2 show RINm5F cells).
  • 5 shows the results of measuring the binding to cells when [ 125 1] -labeled rat Reg protein (Reg I) was added to the cells (Example 4). Only “Hot + 100xCold” indicates the results when both labeled rat Reg protein and 100 times the amount of unlabeled rat Reg protein were added.
  • Figure 3 shows the results of expressing the isolated Reg-binding protein in COS-7 cells and measuring the binding to cells when [ 125 1] -labeled rat Reg protein (Reg I) was added.
  • PCI-neo indicates an empty vector
  • pCI-167.1 indicates the results of cells into which the Reg-binding protein expression vector has been introduced.
  • (-) shows the result when only labeled rat Reg protein was added
  • (+) shows the result when both labeled rat Reg protein and 100-fold amount of unlabeled rat Reg protein were added.
  • Figure 4 shows rat Reg binding protein (Reg receptor) (rEXTL3) (SEQ ID NO: 4), human EXTL3 / EXTR1 (hEXTL3) (GenBank accession numbers AF001690 and AB007042) (SEQ ID NO: 5), human EXT2 (hEXT2) (GenBank accession number U64511) (SEQ ID NO: 6), human EXT1 (hEXTl) (GenBank accession number S79639) (SEQ ID NO: 7), human EXTL1 (hEXTLl) (GenBank accession number) U67191) (SEQ ID NO: 8) and the predicted protein amino acid sequence of human EXTL2 (hEXTL2) (GenBank accession number AF000416) (SEQ ID NO: 9) are aligned (Example 7).
  • the transmembrane domain is underlined.
  • the numbers in the right column correspond to amino acid residues.
  • Residues identical to rat Reg binding protein (rEXTL3) are shown in dots.
  • a hyphen indicates that there is no residue corresponding to rat Reg binding protein (rEXTL3).
  • FIG. 5 is a diagram showing the cell distribution of the Reg binding protein.
  • Lane 1 control Homogenates of COS-7 cells transfected with vector;
  • Lanes 2-6 homogenates of C0S-7 cells transfected with Reg-binding protein expression vector, membrane fraction, mitochondrial fraction, microsome fraction, and cytochrome Tosol fraction (Example 8).
  • 10 / g of the protein was electrophoresed, and a Western plot was performed using an antibody against the HA fragment added to the Reg-binding protein. It can be seen that the Reg protein is expressed on the cell surface.
  • FIG. 6 shows that the rat homologue of human EXTL3 / EXTR1 is a cell surface type Reg binding protein (Example 9).
  • FIG. 3 shows binding of [ 125 I] Reg protein to cells expressing Reg-binding protein in the presence (100-fold excess) or absence ( ⁇ ) of unlabeled rat Reg protein.
  • PCIneo indicates the result of a control transfected with an empty vector
  • pCI ′ rEXTL3 indicates the result of a cell transfected with a rat Reg-binding protein expression vector. It is shown as the average soil standard error (sem) of four separate experiments.
  • FIG. 7 is a diagram showing a functional analysis of a Reg receptor.
  • A is a view showing BrdU incorporation by rat Reg protein into CH0 cells stably expressing a Reg receptor (Example 10). Two independent cell lines expressing Reg receptor (RegR- # 3 and RegR- # 22) were examined. The results are shown as the average standard error of the soil of eight separate experiments.
  • B Competition binding curves of rat Reg (circle) and human REG (square) with rat Reg receptor. The results are shown as the mean soil standard error of four separate experiments.
  • FIG. 8 is a diagram showing proliferation and apoptosis of Reg receptor-expressing /? Cells (Example 11). Three independent cell lines expressing the Reg receptor (# 1, # 6 and # 24) were examined. RIN stands for RINm5F control. The results are shown as the average standard error of the soil from 4 to 8 separate experiments.
  • A Uptake of BrdU by rat Reg protein into RINm5F cells stably expressing Reg receptor.
  • B Increase in cleavage of WST-1 by living cells by Reg protein.
  • C Results of quantitative evaluation of apoptosis of RINm5F cells induced by Reg protein by TUNEL method.
  • FIG. 9 shows the expression of Reg receptor mRNA (Example 12).
  • the expression of Reg receptor mRNA was examined by RNase protection assay.
  • the 309 base band is It corresponds to the size of protection by Reg receptor mMA.
  • Lane 1 normal islets; lane 2, whole; lane 3, liver; lane 4, kidney; lane 5, heart; lane 6, spleen; lane 7, thymus; lane 8, testis; lane 9, adrenal gland; lane Lane 10; stomach; lane 11, jejunum; lane 12, ileum; lane 13, colon; lane 14, pituitary; lane 15, brain.
  • FIG. 10 is a diagram showing that the degradation of WST-1 by viable cells in CH0 cells stably expressing the Reg receptor is increased by the Reg protein (Example 12). As in FIG. 7 (A), two independent cell lines were used. The results are shown as the mean soil standard error of eight separate experiments. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the full length of the protein coding region of human REG I cDNA was determined by using the vector for expression of Pichia, pPIC3.5 (manufactured by Invitrogen). Was inserted into the SnaBI / Avrl site downstream of the yeast alcohol oxidase promoter by using phosphorylation to construct an expression vector.
  • the full length of the protein coding region of rat Reg1 cDNA was inserted into the SnaBI / Notl site of PPIC3.5 using a linker.
  • Expression vector DNA was purified by the CsC1 method, and introduced into a competent cell (Pichia GS115 strain) prepared using a Pichia Easy Comp Kit (manufactured by Invitrogen).
  • Expression vector-introduced cells were selected for their ability to grow in a histidine-free medium. From the expression vector-introduced cells, a clone having the maximum human REG protein and rat Reg protein produced and secreted in the medium by the addition of methanol was selected.
  • Pichia Pichia (Pichia pastoris) producing the above human REG protein or rat Reg protein was added to BMGY medium (1% yeast extract, 2% polypton, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 1.34% yeast nitro base). , 0.00004% biotin, 1% glycerol) at 28-30 ° C for 16-18 hours, followed by large-scale cultivation in BMGY medium until 0D ⁇ was 2-5.
  • BMGY medium 1% yeast extract, 2% polypton, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 1.34% yeast nitro base).
  • the yeast is collected by centrifugation, and BMMY medium (1% yeast extract, 2% polypeptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% biotin so that 0D 6M becomes 1 , 0.5% methanol) and cultured at 28-30 ° C for 3-4 days. During this time, methanol was added to a final concentration of 0.5% every 24 hours. The culture was collected by centrifugation, and acetic acid was added to adjust the pH to 3.5.
  • BMMY medium 1% yeast extract, 2% polypeptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% biotin so that 0D 6M becomes 1 , 0.5% methanol
  • the pH-adjusted culture solution is applied to STREAMLINE SP (Pharmacia) equilibrated with 50 mM sodium acetate (pH 3.5), washed with 50 ⁇ sodium acetate (pH 3.5), and then 50 mM sodium acetate (pH 3.5) /0.5 M Eluted with NaCl. It was confirmed by mass spectrometry that the produced protein was human REG protein or rat Reg protein, respectively.
  • BrdU labeling solution (10 mM BrdU stock solution diluted to 100 ⁇ M with the medium) was added at 10 ⁇ l / ⁇ l (final concentration 10 ⁇ M BrdU).
  • FixDenat (manufactured by Roche Diagnostics) was added at 200 ⁇ 1 / ⁇ .
  • an anti-BrdU-POD antibody (diluted 1/100 of a stock solution (manufactured by Kuchig Diagnostics)) was added in a ratio of 100/1 / ⁇ .
  • wash solution (10X wash solution (manufactured by Roche Diagnostics) diluted 1/10) washes 3 times at 200/1 / well. did.
  • a substrate solution manufactured by Roche Diagnostics was added at 100 1 / ⁇ , and the mixture was incubated at room temperature until a sufficient color was obtained. The absorbance of each sample was measured at 370 nm using an ELISA reader (reference wavelength: about 492 nm).
  • Rat Perangerhans Island Poly (A) + RNA was transformed into type III, and a Perangerhans island-expressed cDNA library was prepared using the ZAP II vector.
  • Rat Reg protein prepared in Example 2 Bo 1 ton-Hunter reagent 125 1 labeled with, was selected and isolated phage clones that bind to Reg protein from the expression type cDNA Raipurari in West-Western method.
  • the cDNA was recombined into a plasmid vector (pBluescript SK (-), manufactured by Stratagene) by an in vivo excision method using a helper phage from the positive phage clone.
  • the nucleotide sequence of the cDNA was determined by the dideoxy method.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and the predicted amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the protein deduced from the nucleotide sequence was considered to be a cell membrane protein having a transmembrane domain of one hydrophobic amino acid class.
  • Example 5 The cDNA isolated in Example 5 was incorporated into a mammalian expression vector (pCI-neo) (Promega) having a cytomegalovirus promoter to construct a Reg-binding protein expression vector (pCI-167.1). Elect-mouth poration of this vector into COS-7 cells And transiently expressed. 48 hours after vector introduction, Reg binding activity was examined by the same protocol as in Example 4.
  • the protein encoded by the isolated cMA is a molecule that binds to the Reg protein on mammalian cell membranes, and may be a receptor molecule responsible for the regenerative / proliferation activity of the Reg protein.
  • a rat island cDNA library (5 ⁇ 10 6 clones) was screened by plaque hybridization to further isolate the cDNA encoding the Reg binding protein. As a result, eight positive clones were obtained. The eight clones largely overlapped each other, and the nucleotides in the overlapping region were completely identical.
  • the sequence of the obtained cDNA encoding the rat Reg-binding protein is shown in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the Reg-binding protein encoded by this cDNA is shown in SEQ ID NO: 4.
  • this cDNA has a 2,760 bp open reading frame encoding a protein consisting of 919 amino acids.
  • this protein Based on the amino acid sequence deduced from the cDNA, this protein has a long extracellular domain ( It was predicted to be a type II transmembrane protein having a transmembrane domain (residues 29 to 51) and a short intracellular region at the N-terminus.
  • Example 7 An expression vector for the rat Reg-binding protein cDNA isolated in Example 7 was prepared and transiently expressed in COS-7 cells. Insert the rat Reg binding protein cDNA ligated with an oligonucleotide encoding this tag so that hemagglutinin (HA) nonapeptide-Y (YPYDVPDYA) is added to the N-terminus into the pCI-neo mammalian expression vector (Promega) This vector was then introduced into COS-7 cells by electroporation and expressed. After incubation for 48 hours, cells were harvested and described previously [S. Takasawa et al., J. Biol. Chem. 268, 26052 (1983); H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280, 306].
  • Rat Reg-binding protein (also referred to as rat EXTL3 / EXTR1) prepared in Example 8 An expression vector or a control vector is introduced into C0S-7 cells by electroporation. And expressed transiently. From these cells, CH0 cells stably expressing the Reg binding protein were isolated.
  • RPMI1640 Roswel l Park Memorial Institute 1640
  • 1 1 -labeled rat Reg protein 50ng / ml, 1.5 x l0 5 cpm / ml
  • the cells were incubated with labeled rat Reg or human REG protein in RPMI 1640 containing 1% fetal calf serum on ice for 2 hours.
  • RPMI 1640 After three washes with RPMI 1640, the cells were solubilized with 1 ml of lOOmM Tris-HCl (pH 7.6), ImM EDTA and l% Triton X-100.
  • a homology search of the MA / protein database revealed that the rat Reg-binding protein cDNA (SEQ ID NO: 3) and the predicted amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) contained multiple exostose (EXT) family members, especially human EXT.
  • EXT exostose
  • Gene 3 EXTL3
  • EXTR1 ZEXT-related gene 1 (EXTR1)
  • the cDNA is a rat homologue of human EXTL3 / EXTR1 (amino acid identity is greater than 97%).
  • EXTL3 / EXTR1 The EXTL3 / EXTR1 gene was isolated as a member of the EXT family gene by homology screening, but its physiological function and pathophysiological significance are unknown.
  • EXTL3 / EXTR1 has homology with EXT2 and EXT1 in the C-terminal region (262 amino acids at the C-terminal are 52% of EXT2 and 247 amino acids at the C-terminal are EXT1 and 40% of EXT1) (see Fig. 4). ), EXT family (W. Van Hui et al., Genomics 47, 230 (1998); T. Saito et al., Biochem. Biophys. Res. Co bandad un. 243, 61 (1998)). ing.
  • the N-terminal region of EXTL3 / EXTR1 (residues 1 to 656) has no homology with any other member of the EXT family gene.
  • the N-terminal region of EXTL3 / EXTR1 contains a transmembrane domain, while another member of the family does not contain this domain, and therefore It was not considered a protein.
  • the 1.6 kbp cDNA originally isolated as a Reg binding protein in a screening of the rat islet cDNA expression library contained only the N-terminal region (amino acid residues 1-332). Therefore, it is reasonable to assume that the Reg binding domain is contained in the N-terminal region, and that members of the EXT family other than EXTL3 / EXTR1 have no binding ability to the Reg protein.
  • rat Reg binding protein hereinafter also referred to as “rat Reg receptor” expression vector constructed in Example 8 was introduced into CH0 cells, and several cell lines overexpressing the receptor protein were established. We examined the uptake of 5'-bromo-2'-deoxyperidine (BrdU) into cells by protein stimulation.
  • the HA-tagged rat Reg receptor expression vector was introduced into CH0 cells and RINm5F cells.
  • Cells were cultured for 2 weeks in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal calf serum (Bio Whittaker, Walerville, Maryland) and 250 ⁇ g / ml neomycin (Gibco) [S. Takasawa et al. , J. Biol. Chem. 273, 2497 (1998)].
  • Stable transformants expressing high levels of the recombinant protein were screened and isolated by immunoblot analysis of HA.
  • Stable transformants expressing the Reg receptor were cultured for 24 hours in RPMI 1640 medium supplemented with 1% fetal calf serum in the presence of various concentrations of rat Reg protein. Two hours before the end of the culture, BrdU (10 / M) was added to the medium, and BrdU incorporation was measured using a colorimetric cell proliferation ELISA kit (Boeringer).
  • a human REG protein showing 70% amino acid identity to rat Reg protein (K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H.
  • Reg is recognized as a cell growth factor (H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3589 ( 1994); DJ Gross et al., Endocrinology 139, 2369 (1998)).
  • Addition of Reg protein to RINm5F cells a cell line derived from rat insulinoma, increases BrdU incorporation (1.5- to 2-fold) and increases the number of cells in a Reg protein concentration-dependent manner It has been found.
  • the concentration of Reg protein that stimulates proliferation in RINm5F cells was consistent with that in primary rat islet cultures, suggesting that Reg protein acts through the same receptor in both cells.
  • the expression vector constructed in Example 8 was introduced into RINm5F cells, several cell lines overexpressing the Reg receptor were established, and the effect of the Reg protein was examined using these cells.
  • Rat regenerated knee islands were prepared as previously described (K. Terazono, et al., J. Am. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; Y. Yonemura et al., Diabetes 33, 401 (1984)).
  • RNA was isolated from various rat tissues and cell lines as previously described [T. Koguma et al., Biochem. Biophys. Acta 1223, 160 (1994); N. Noguchi et al., J. Biol Chem.
  • Radzuto Reg receptor cDNA SEQ ID NO: 3 to Pstl / BgIII fragment of pBluescript SK (-) was subcloned into Pstl / BgUI site, after linearized with Hindlll T3 RNA polymerase and [shed - 32 P] CTP, And transcribed in vitro. The obtained 0.45 kb cRNA was used as a probe.
  • RNase protection assay was performed using RPA III kit (Ambion) according to the instruction manual.
  • Reg receptor mRNA was expressed in normal islets, regenerating islets and RINm5F cells. No increase in the expression of Reg receptors was observed in regenerating islets compared to normal islets, indicating that the amount of cells was increased. It was suggested that it might be regulated by protein expression.
  • the Reg gene was first identified as a gene that is specifically expressed in regenerating ruto islands (K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono , T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed.
  • the present invention provides a protein (Reg receptor) that binds to Reg.
  • Reg protein is a cell growth factor for five cells of the kidney, and is also known to exhibit cell growth activity in epithelial cells and the like.
  • Reg-binding protein has the function of transmitting signals necessary for cell proliferation into cells by binding to Reg protein in kidney / cells. Renal ⁇ -cells are regenerated by binding of Reg protein and Reg-binding protein. It is thought that. Therefore, by analyzing the structure of the extracellular domain of the Reg-binding protein and searching for analogs of the ligand that binds to it, we have developed a therapeutic drug for diabetes that induces the proliferation of physiological tumor cells. Is possible.
  • the Reg protein does not cause excessive proliferation of the cells in the kidney cells, it is considered that there is no possibility of expressing hypoglycemia due to excessive administration such as insulin administration.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明細
Re g結合蛋白質 技術分野
本発明は、 Reg蛋白質に結合する新規な蛋白質およびその遺伝子、並びにこれら の製造および用途に関する。
—冃景技術
脬ランゲルハンス島/?細胞は生体における唯一の血糖降下因子ィンスリンを産 生する。 従来、 脬 5細胞は一旦傷害され細胞数が減少すると容易に再生増殖しな いと考えられ、 これが糖尿病発症の重要な要因であり、 同時に原因に基づく根本 的な糖尿病治療が出来ない理由とされてきた。
従来、 糖尿病治療はインスリンの投与、 またはスルホニルゥレア系の経口糖尿 病薬が投与される。 しかしインスリン投与は対症療法であり、 同時に生理的血中 インスリン濃度を維持することが難しく、 さらに、 動脈硬化症、 神経障害、 眼病 変を進行させるなど、 糖尿病の合併症治療を考えた場合にはその治療には限界が あった。 また経口糖尿病薬は副作用として長期投与における冠動脈硬化症ゃ脬臓 への過剰な負荷によると思われるィンスリン分泌能の低下などの副作用があった ο
本発明者らはこれまでに/?細胞障害およびその予防のメカニズムを解析してき た （H. Yamamoto, etal.， Nature 294, 284 (1981); Y. Uchigata, etal.， J. Biol Chem. 257, 6084 (1982); Y. Uchigata, et al.， Diabetes 32, 316 (1983); H. Okamoto, Bioessays 2, 15 (1985); H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999) )o さらに本発明者らは、 実験的に脬 ?細胞を再生増殖させることに成功し （T. Watanabe et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 3589 (1994); Yonemura, Y. et al. (1984) Diabetes 33, 401-404)、 再生時に特異的に発現する遺伝子を単離 して Reg(Regeneratinggene)と命名した（H. Okamoto, J. Mol. Med.77, 74 (1999); K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe , Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990)， pp.301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33， 250 (1990); T. Watanabe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 3589 (1994))。 また、 Reg遺伝子産物である Reg蛋白質が脬 ? 細胞の再生増殖因子であることを明らかにし、 糖尿病モデル動物を用いた実験か ら、 Reg蛋白質投与や Reg遺伝子の活性化、 さらには Reg遺伝子導入による糖尿病治 療の可能性を示した （Watanabe, T. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 3589-3592; Gross, D.J. et al. (1998) Endocrinology 139, 2369-2374; Okamoto, H. (1999) J. Mol. Med. 77, 74-79) 0 これらの解析から、 Reg蛋白質を 投与すると/?細胞の再生および増殖が誘導され、 それによつて/?細胞の量が増え 、 90%脬切除ラットおよび非肥満糖尿病マウスの糖尿病が寛解することが知られ ている。 しかしながら、 Reg蛋白質がどのような蛋白質と相互作用することにより 機能を発揮しているのかについては不明であった。
Reg蛋白質はィンスリン投与の弱点を補う脬臓/?細胞の増殖因子として糖尿病 治療への応用が期待されるが、 分子量が大きく、 経口投与が難しいことや、 さら に高分子蛋白質の生体内における夕一ゲッティングが困難であるなど、 臨床応用 には数多くの技術的課題が存在する。 発明の開示
本発明は、 Reg蛋白質に結合する新規な蛋白質およびその遺伝子、並びにそれら の製造方法および用途を提供することを課題とする。 特に本発明の蛋白質は、 糖 尿病に対する新しい治療薬の開発に有用である。
本発明者は、脬 ?細胞系細胞に対する Reg蛋白質の作用を調べるため、酵母を用 いて製造した組換え Reg蛋白質を、 ラットインスリノーマ細胞由来細胞株 RINm5F に添加する実験を行った。その結果、 Reg蛋白質添加により RINiii5F細胞の 5' -プロ モ -2' -デォキシゥリジン （BrdU) の取り込みは有意に増加し、 該細胞は Reg蛋白質 により増殖が促進されることが判明した。 次に本発明者は、 Reg蛋白質を 1251 で 標識し、 RINm5F細胞に添加してその結合活性を調べた。その結果、 Reg蛋白質の濃 度依存的な RINm5F細胞への結合が観察され、その結合は過剰量の非標識 Reg蛋白質 により阻害されることから特異的なものと考えられた。 これらの結果は、 滕 5細 胞には Reg蛋白質受容体が発現しており、 Reg蛋白質の結合により細胞増殖が促進 されることを示唆している。
本発明者は、 Reg蛋白質受容体として機能する Reg結合蛋白質を単離するため、 ラット脬ランゲルハンス島 polyA( + ) RNAからファージベクターによる発現 cDNA ライブラリーを構築し、標識した Reg蛋白質を用いたウェストウエスタン法により Reg結合蛋白質をコードする遺伝子のスクリーニングを行った。 その結果、 364ァ ミノ酸からなる蛋白質をコードする新規な cDNAを単離することに成功した。 この cDNAを哺乳動物細胞発現ベクターに挿入し、 C0S-7細胞で発現させ、 組換え Reg蛋 白質をこの細胞に添加したところ、 Reg蛋白質はこの COS- 7細胞に特異的に結合す ることが確かめられた。
本発明者は、 この cDNAをプローブにラット脬ランゲルハンス島 cDNAライブラリ —をスクリーニングすることにより、 Reg結合蛋白質をコードする cDNAをさらに単 離することに成功した。当該 cDNAは 919アミノ酸からなる細胞表面蛋白質をコー ドしていた。 この cDNAを哺乳動物細胞で発現させると、 蛋白質は細胞表面に発現 し、細胞は Reg蛋白質と高い親和性で結合した。この cDNAによるトランスフエクシ ヨンを受けた RINm5F ?細胞は、 Reg蛋白質の添加により BrdUの取り込みが誘導さ れ、 細胞数が増加した。 これらの結果から、 単離された cDNAがコードする Reg結合 蛋白質は Reg蛋白質の受容体であり、 脬 ?細胞において Reg蛋白質による細胞増殖 シグナルを媒介していることが示された。また、 この Reg結合蛋白質を高発現する RINm5F細胞は、高濃度の Reg蛋白質を添加するとアポト一シスが誘導されることが 判明した。
これらの事実から、 この Reg結合蛋白質は Reg蛋白質のシグナルを伝達し、 脬 ? 細胞などにおいて細胞増殖等を制御することにより脬 ?細胞等の量 （mass) を調 節していると考えられる。本発明の Reg結合蛋白質やその遺伝子は、糖尿病の病因 メカニズムを解明するための有用なツールとなり、 また、 糖尿病治療薬開発への 応用も可能であると考えられる。
本発明は、 Reg蛋白質結合蛋白質およびその遺伝子、並びにそれらの製造方法お よび用途に関し、 より具体的には、
( 1 ) 下記 （a) から （i) のいずれかに記載の DNA、
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA,
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA，
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 Reg蛋白質 と結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA,
(d) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとハイプリダイズする DNAで あって、 Reg蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA，
(e) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA， (f ) 配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA,
(g) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸 が置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 Reg蛋白質 と結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA,
(h) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイプリダイズする DNAで あって、 Reg蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA，
(i ) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分ぺプ チドをコ一ドする MA， (2) ( 1) に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはペプチド、
(3) ( 1) に記載の DNAが挿入されたべクタ一、
(4) (3) に記載のベクタ一を保持する宿主細胞、
(5) (4)に記載の宿主細胞を培養し、 該細胞で発現した組み換え蛋白質を、 該 培養細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、 （2)に記載の蛋白質また はぺプチドの製造方法、
(6) (2) に記載の蛋白質またはペプチドに対する抗体、
(7) 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補 DNAと ハイブリダイズし、 少なくとも 15塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
(8) (2)に記載の蛋白質またはべプチドに結合する化合物のスクリーニング方 法であって、
(a) 該蛋白質またはペプチドに被検試料を接触させる工程，
(b) 該蛋白質またはペプチドと被検試料との結合を検出する工程， および
(c) 該蛋白質またはペプチドに結合する化合物を選択する工程， を含む方法
(9) (2) に記載の蛋白質またはペプチドと Reg蛋白質との結合を阻害する化合 物のスクリーニング方法であって、
(a)被検試料存在下で （2)に記載の蛋白質またはペプチドと Reg蛋白質とを 接触させる工程，
(b) (2) に記載の蛋白質またはペプチドと Reg蛋白質との結合を検出するェ 程， および
(c) 該結合を低下させる化合物を選択する工程， を含む方法、
( 10) (9) に記載の方法により単離されうる、 （2) に記載の蛋白質またはぺ プチドと Reg蛋白質との結合を阻害する化合物、
( 1 1 ) (2)に記載の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達を促進または阻 害する化合物をスクリーニングする方法であって、 (a) 被検試料の存在下で （2) に記載の蛋白質をその表面に発現する細胞に Reg蛋白質を接触させる工程，
(b) Reg蛋白質による刺激に応答した該細胞の変化を検出する工程， および
( c ) 被検試料非存在下において検出した場合 （対照） 比較して、 該細胞の変 化を増強または抑制する化合物を選択する工程， を含む方法、
( 1 2) 該細胞の変化が、 細胞増殖活性または細胞の DNA合成活性の変化である、 ( 1 1 ) に記載の方法、
( 1 3) ( 1 1 ) または （ 1 2) に記載の方法により単離されうる、 （2) に記載 の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達を促進または阻害する化合物、
( 14) ( 1 ) に記載の DNA、 (2) に記載の蛋白質またはペプチド、 （3) に記載 のベクター、 （6) に記載の抗体、 （ 10) に記載の化合物、 または （ 1 3) に記 載の化合物を含む薬剤、
( 1 5) Reg結合剤、 Reg蛋白質に応答した細胞内シグナル伝達の調節剤、 細胞増 殖調節剤、 DNA合成調節剤、およびアポトーシス調節剤からなる群より選択される 、 （ 1 4) に記載の薬剤、
( 1 6) 糖尿病治療薬である、 （ 14) または （ 1 5) に記載の薬剤、 に関する。 本発明は、 脬臓で発現し Reg蛋白質に結合する新規な蛋白質 （Reg結合蛋白質） に関する。 本発明に含まれる、 単離されたラット 「Reg結合蛋白質」 cDNAの塩基配 列を配列番号： 1および 3に、 これらの cDNAによりコードされる 「Reg結合蛋白質 」 のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号： 2および 4に示す。
本発明のラット Reg結合蛋白質をコードする cDNAの 1つは、 364アミノ酸残基の 蛋白質 （配列番号： 2) をコードするオープンリーディングフレームを含有する (配列番号： 1 )。 この cDNAをプローブにしたスクリーニングにより、 919ァミノ 酸残基の蛋白質 （配列番号： 4) をコードするオープンリーディングフレームを 含有するラット Reg結合蛋白質をコードする cDNA (配列番号： 3) も単離すること ができた。 本発明のラット 「Reg結合蛋白質」 は、 細胞表面に発現し、 Reg蛋白質 と結合する活性を有する。前述のように、 Reg蛋白質は勝^細胞の再生時に特異的 に発現する再生増殖因子であり、 その蛋白質や遺伝子は糖尿病への治療の可能性 が示されている。 本発明の Reg結合蛋白質は、 この Reg蛋白質の受容体として機能 し、 脬 ?細胞の増殖制御を含む細胞の生理機能の調節に関与していると考えられ る。従って、本発明の Reg結合蛋白質は糖尿病の病原のメカニズムを解明するため の研究対象として、 また臈 ^細胞の機能が関与する疾患 （糖尿病など） に対する 治療剤開発のためのツールとしての利用が考えられる。
最近、 Regおよび Reg関連遺伝子がいくつか単離され、これらは多重遺伝子群 Reg フアミリーを構成していることが明らかにされた （H. Okamoto, J. Mol. Med.77, 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999); M. Unno et al . , J. Biol. Chem.268, 15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185， 159 (1997); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000))。 Regファミリ一のメンバー はすべてェクソン 6個およびィントロン 5個からなる保存された遺伝子構成を示し 、 ファミリ一内のアミノ酸配列の相同性は 40〜85%であり、 3対の分子内 S-S結合 を形成する 6個の保存されたシスティン残基を有する （H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 254 (1999); M. Unno et al., J. Biol. Chem. 268,15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185, 159 (1997); T. Itoh et al., FEBS Lett. 272, 85 (1990); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000))。 このファミリ一のメンバーは、 Reg蛋白質の一次構造に 基づいて I型、 II型および III型の 3つのサブクラスに分けられる （H. Okamoto, J. Mol. Med.77， 74 (1999); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg.6， 254 (1999); M. Unno et al., J. Biol. Chem.268,15974 (1993); Y. Narushima et al., Gene 185, 159 (1997); T. Watanabe et al., J. Biol. Chem. 265, 7432 (1990); M. Abe et al., Gene 246, 111 (2000))。 本実施例で用いたラットおよびヒ卜の Reg蛋白質を含む I型 Reg蛋白質は再生脬島で発現される（H. Okamoto, J. Mol. Med. 77, 74 (1999); K. Terazono, et al., J. Biol. Chem. 263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe , Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990)， pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33， 250 (1990); H. Okamoto, J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6， 254 (1999))。 最近、 病的条件下での I型 Regの発現が、 ヒト大腸癌 (T. Watanabe et al . , J. Biol. Chem.265， 7432 (1990); M. E. Zenilman et al., J. Gastrointest. Surg. 1， 194 (1997); F. R. Bernard- Perrone et al., J. Histochem. Cytochem. 47, 863 (1999))、 ラッ ト胃 粘膜 (H. Fukui et al., Gastroenterology 115, 1483 (1998))、 およびェンテロ クロマフィン様細胞 （M. Asahara et al., Gastroenterology 111, 45 (1996)) において報告されており、 腸パネ一ト細胞 （L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996))、 肝細胞癌 （L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996))、 膝腺房細胞 (L. Christa et al., Am. J. Physiol. 271, G993 (1996); E. M. Ortiz et al., Gastroenterology 114， 808 (1998))、 およびシュワン細胞
(J. F. Livesey et al., Nature 390, 614 (1997)) の細胞増殖における III型 Reg 蛋白質の関与も指摘されている。 したがって、 同定された Reg受容体は、 Regファ ミリー遺伝子の産物に対する受容体として生理的条件下および病的条件下での種 々の組織および細胞で機能しているものと考えられる。
以上の知見からもわかるように、 本発明の蛋白質は、 糖尿病に加え、 消化管腫 煬 (Asahara, M. et al. , Gastroenterology 111, 45-55 (1996); Fukui, H. et al. , Gastroenterology 115， 1483-1493 (1998))、 神経変性症 (Livesy, F.J. et al., Nature 390， 614-618 (1997))、 脬炎 (Christa, L. et al., Am. J. Phsiol. 271, G993-G1002 (1996); Ortiz, E. et al., Gastroenterology 114, 808-816 (1998) ) などの治療や予防のための医薬品開発にも有用である。 また、 腫瘍などにおい て Reg蛋白質—Reg結合蛋白質の異常 （例えば過剰刺激） が起こる場合には、 可溶 型の Reg結合蛋白質の投与により過剰刺激を抑制し、腫瘍の増殖等を抑えることが 可能であり、 Reg結合蛋白質自体を治療に応用することも考えられる。 本発明においては、 Reg蛋白質と結合する活性を有する限り、 ラット 「Reg結合 蛋白質」 と構造的に類似した蛋白質も含まれる。 このような構造的に類似した蛋 白質には、 「Reg結合蛋白質」の変異体や他の生物由来の「Reg結合蛋白質」が含ま れる。
このような蛋白質は、 当業者であれば、 例えば、 公知の変異導入法を用いて調 製することができる。 当業者に公知の蛋白質中のアミノ酸を改変する方法として は、 例えば、 Kunkel法 (Kunkel , T.A. ( 1985 ) Proc. Natl . Acad. Sci . USA 82, 488 )、 Ol igonucleotide - directed Dual Amber (ODA)法 (Hashimoto - Gotoh, T. et al . ( 1995 ) Gene 152, 271-275)、 PCR-制限酵素法 （Ito, W. et al . ( 1991 ) Gene 102, 67-70)、 ODA-PCR法 (Hashimoto- Gotoh, T. et al . ( 1995) Gene 152, 271-275 ; Ito, W. et al . ( 1991 ) Gene 102, 67-70) などが挙げられる。 蛋白質におけるァミノ 酸の改変はその数に制限はないが、 人為的に行うのであれば、 通常、 50アミノ酸 以内、 好ましくは 10アミノ酸以内、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内である。 また、蛋白質のアミノ酸の変異は天然においても生じうる。このように Reg蛋白 質に結合する活性を有する限り、 人為的なまたは自然界におけるアミノ酸の置換 、 欠失、 付加、 および/または挿入により天然型ラット 「Reg結合蛋白質」 に対し てアミノ酸配列が異なる蛋白質も、 本発明に含まれる。
置換されるアミノ酸は、 置換前のアミノ酸と似た性質を有するアミノ酸である ことが好ましいと考えられる。例えば、 Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、 Trp は、 共に非極性アミノ酸に分類されるため、 互いに似た性質を有すると考えられ る。 また、 非荷電性としては、 Glyヽ Serヽ Thrヽ Cys、 Tyrヽ Asnヽ Ginが挙げられる 。 また、 酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Gluが挙げられる。 また、 塩基性アミ ノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hisが挙げられる。
本発明において、 ラット 「Reg結合蛋白質」 のアミノ酸が欠失した蛋白質には、 細胞外領域のみを有する蛋白質が含まれる。 また、 ラット 「Reg結合蛋白質」 に対 してアミノ酸が付加した蛋白質には、 ラット 「Reg結合蛋白質」 と他のペプチドと の融合蛋白質が含まれる。
また、 Reg蛋白質に結合する活性を有する、 ラット 「Reg結合蛋白質」 と構造的 に類似した蛋白質の調製は、 公知のハイブリダィゼ一シヨン技術 （サムブルック 他編集、 モレキュラー ' クローニング 第 2版， コールド 'スプリング 'ハーバ 一 - ラボラトリ一， 1989年 (Sambrook, J. et al . ( 1989) Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)) やポリメラ一ゼ連鎖反応技術 (サ ムブルック他編集、 モレキュラー ' クローニング 第 2版， コールド 'スプリン グ -ハーバ一 · ラボラトリー， 1989年 （Sambrook, J. et al . ( 1989) Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press)； Innis, .A. et al .， PCR protocols, Academic Press ( 1990)) を利用して行うことができる。 即ち、 当業者にとってはラット 「Reg結合蛋白質」 cDNA配列 （配列番号： 1または 3 ) 若 しくはその一部をプローブとして、 また、 ラット 「Reg結合蛋白質」 cDNAに特異的 にハイブリダィズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、 種々の他の生物 からラット 「Reg結合蛋白質」 cDNAと相同性の高い DNAを単離し、 さらに単離した DNAからラット 「Reg結合蛋白質」 と構造的に類似した蛋白質を得ることが常套手 段となっている。
本発明においては、 Reg蛋白質に結合する活性を有する限り、 ラット 「Reg結合 蛋白質」 cDNAとハイブリダィズする DNAがコ一ドする蛋白質を包含する。このよう な蛋白質を単離する他の生物としては、 例えば、 ヒト、 サル、 マウス、 ゥサギ、 ャギ、 ゥシ、 ブ夕、 ィヌなどが挙げられるが、 これらに制限されない。 このよう な蛋白質をコードする DNAを単離するには、例えば、 これら生物の脬ランゲルハン ス島 ?細胞が材料として適していると考えられる。
ラット以外の生物に由来する 「Reg結合蛋白質」 をコードする DNAは、 通常、 ラ ット 「Reg結合蛋白質」 cDNAの塩基配列 （配列番号： 1または 3 ) と高い相同性を 有する。高い相同性とは、塩基配列レベルで少なくとも 60%以上、好ましくは 80 %以上、 さらに好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 最も好ましく は 99%以上の配列の同一性を指す。 配列の相同性は、 FASTA (長い範囲で配列の 類似性を保っているものを検索)、 BLAST (局所的に高い類似性を有する配列を検 索）、 SSEARCH (Smith-Waterman algorithmを採用した検索） により決定すること ができる。これらは日本 DNAデータベースなどの公知の遺伝子デ一夕ベース、 ホー ムページで使用することが可能である。
ラット 「Reg結合蛋白質」 cDNAを利用してラット 「Reg結合蛋白質」 と機能的に 同等な蛋白質をコードする cDNAを他の生物から単離するためのハイプリダイゼ一 シヨンの条件としては、 当業者であれば適宜選択することができる。 一例を示せ ば、 6 x SSC I 5 x FBP I 0.5% SDS / 0.2mg/ml 鮭 （鰊） 精子 DNA / 10%ホルムアミ ド溶液で 42°C (低ストリンジェントな条件） でハイブリダィゼーシヨンを行うこ とができる。 好ましくは、 6 X SSC I 5 X FBP / 0.5% SDS / 0.2mg/ml 鮭 （鰊） 精 子 DNA / 30%ホルムアミ ド溶液で 42°C (中間的なストリンジェントの条件） でハイ ブリダィゼーシヨンを行う。 さらに好ましくは、 6 X SSC I 5 X FBP I 0.5% SDS / 0.2mg/ral 鮭 （鰊） 精子 DNA / 50%ホルムアミ ド溶液で 50°C (高ストリンジヱント な条件） でハイブリダィゼ一シヨンを行う。 但し、 ハイブリダィゼーシヨンのス トリンジヱンシ一に影響する要素としては温度やホルムアミ ドの濃度、 塩濃度な ど複数の要素が考えられ、 当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様 のストリンジエンシーを実現することが可能である。
本発明の蛋白質は、 天然の蛋白質の他、 遺伝子組換え技術を利用した組換え蛋 白質として調製することができる。 天然の蛋白質は、 例えば、 「Reg結合蛋白質」 が発現していると考えられる組織 （例えば、 脬ランゲルハンス島/?細胞） の抽出 液に対し、 後述する 「Reg結合蛋白質」に対する抗体を用いたァフィ二ティーク口 マトグラフィ一を行う方法により調製することが可能である。 一方、 組換え蛋白 質は、 後述するように 「Reg結合蛋白質」 をコードする DNAで形質転換した細胞を 培養し、 この蛋白質を発現させ回収することにより調製することが可能である。 本発明は、 本発明の蛋白質の部分ペプチドを包含する。 本発明の蛋白質の部分 ペプチドとしては、 例えば、 本発明の蛋白質のうち、 Reg蛋白質との結合部位に相 当するペプチドが挙げられる。 本発明の蛋白質の部分ペプチドは、 生体投与する ことで、本発明の蛋白質のァゴニストゃアン夕ゴニスト、 Reg蛋白質の拮抗剤等と しての利用が考えられる。 これら部分ペプチドは、 本発明の蛋白質を介したシグ ナル伝達の活性化剤や阻害剤として有用である。 また、 本発明の部分ペプチドと しては、 例えば、 本発明の蛋白質の N末端領域の部分ペプチドや、 C末端領域の部 分べプチドが挙げられ、 これらのぺプチドは抗体の調製に利用することができる 。 本発明の蛋白質に特異的なアミノ酸配列を有する部分ポリペプチドは、 少なく とも 7アミノ酸、好ましくは少なくとも 8アミノ酸、 さらに好ましくは少なくとも 9 アミノ酸の鎖長を有する。 本発明の部分ペプチドは、 例えば、 遺伝子工学的手法 、 公知のペプチド合成法、 あるいは本発明の蛋白質を適当なぺプチダ一ゼで切断 することによって製造することがきでる。例えば Reg蛋白質と結合する領域を含む 部分べプチドは、 Reg蛋白質を結合させるために使用されうる。このような部分べ プチドは、 Reg蛋白質結合剤として使用され得る。
また、 本発明は、 本発明の蛋白質をコードする DNAに関する。本発明の蛋白質を コードする MAとしては、これら蛋白質をコ一ドしうるものであれば特に制限はな く、 cDNA、 ゲノム DNA、 および合成 DNAが含まれる。 また、 本発明の蛋白質をコ一 ドしうる限り、 遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有する DNAが含まれる。 本発明の蛋白質をコードする cDNAは、 例えば、 配列番号： 1または 3に記載の cDNAあるいはその断片、 それらに相補的な RNA、 または該 cDNAの配列の一部を含む 合成オリゴヌクレオチドを 32P などで標識し、 本発明の蛋白質が発現している組 織 （例えば脬臓など） 由来の cDNAライブラリーにハイブリダィズさせることによ りスクリーニングすることができる。 あるいは、 これら cDNAの塩基配列に対応す るオリゴヌクレオチドを合成し、 適当な組織 （例えば脬臓など） 由来の cDNAを錄 型にポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅しクロ一ニングすることもできる。 ゲノム DNAは、 例えば、 配列番号： 1または 3に記載の cDNAあるいはその断片、 それらに 相補的な RNA、または該 cDNAの配列の一部を含む合成ォリゴヌクレオチドを 32Pな どで標識し、ゲノム DNAライブラリーにハイブリダィズさせることによりスクリー ニングすることができる。 あるいは、 これら cDNAの塩基配列に対応するオリゴヌ クレオチドを合成し、ゲノム DNAを錶型にポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅し、 ク ローニングすることもできる。 一方、 合成 DNAは、 例えば、 配列番号： 1または 3 に記載の cDNAの部分配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合成し、 ァニーリング させて二本鎖にし、 DNAリガーゼで結合させることにより調製することができる。 これら DNAは、 組換え蛋白質の生産に有用である。即ち、 本発明の蛋白質をコー ドする DNA (例えば、 配列番号： 1または 3に記載の DNA) を適当な発現べクタ一 に挿入し、 該ベクタ一を適当な細胞に導入して得た形質転換体を培養し、 発現さ せた蛋白質を回収することにより本発明の蛋白質を組換え蛋白質として調製する ことが可能である。 本発明の蛋白質は精製または粗精製蛋白質として、 また、 哺 乳動物細胞で発現させ、 膜に結合した形態として調製すること等が可能である。 具体的な宿主一べクタ一系としては、 例えば E. col i— pGEX系 （アマシャムフ アルマシアバイオテク； GSTとの融合蛋白質として発現）、 E. col i— pHB6系および pVB6系（ロッシュダイァグノスティク；6個のヒスチジンとの融合蛋白質として発 現）、 E. col i— pMAL系 （New England Biolabs；マルト一ス結合蛋白質との融合蛋 白質として発現）、 E. col i— pTYB系 (New England Biolabs； Inteinとの融合蛋白 質として発現、 その後 DTT存在下に Interin部分が切断され、 目的蛋白質のみの精 製が容易）、 Pichia— pPIC系および pGAP系 (Invitorogen), 哺乳動物細胞（例えば C0S-7) — pCI- neo系 (Promega) および pHook系 (Invitorogen) などが挙げられる 宿主へのベクタ一の導入法は、 E. col iへは公知のコンビテント細胞へのトラン スフォーメーションまたは電気穿孔法、 Pichiaへは、例えば Pichia Easy Comp Kit (実施例 1参照） により調製したコンビテント細胞へのトランスフォーメーショ ン、 または電気穿孔法、 哺乳動物細胞へは電気穿孔法または公知のカチォニック リピッドを用いたリポフエクション法等により行うことができる。
宿主細胞において発現させた組換え蛋白質は、 公知の方法により精製すること ができる。 また、 本発明の蛋白質を、 例えば、 N末端にヒスチジン残基のタグ、 ま たはグルタチオン S-トランスフェラーゼ （GST) などを結合した融合蛋白質の形 で発現させた場合には、 それぞれニッケルカラムまたはグル夕チオンセフアロー スカラム等により精製することができる。
本発明の蛋白質をコードする DNAは、 また、 その変異に起因する疾患の遺伝子治 療に応用することも可能である。 例えば、 ワクシニアウィルス、 レトロウイルス 等のウィルスベクターなどを用いた遺伝子治療が考え得る。 治療の実際方法とし ては、 例えば移植用の臈臓、 または脬ランゲルハンス島に培養条件下でこれらの 組換えウィルスを用いて 「Reg結合蛋白質」を導入し、 移植を行うことで滕 細胞 の増殖により移植治療効果の向上と、 移植用臓器の有効利用が図りうる。
本発明はまた、配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその 相補 DNAとハイプリダイズし、少なくとも 15塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド に関する。 該ポリヌクレオチドは、 好ましくは配列番号： 1または 3に記載の塩 基配列からなる DNAと特異的にハイブリダィズし、少なくとも 15塩基の鎖長を有す るポリヌクレオチドである。 「特異的にハイブリダィズする」とは、通常のハイブ リダィゼーシヨン条件下、 好ましくは上記した中間的なストリンジェントなハイ ブリダィゼ一シヨンの条件下、 より好ましくは上記した高ストリンジェントなハ ィブリダィゼ一シヨン条件下で、他の蛋白質をコ一ドする DNAとのクロスハイプリ ダイゼーシヨンが有意に生じないことを意味する。 ハイプリダイゼ一シヨンは、 上記の条件で行えばよい。 これらのポリヌクレオチドには、 本発明の蛋白質をコ ―ドする DNA又は該 DNAと相補的な DNAと特異的にハイプリダイズし得るプローブ やプライマー、 ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体 （例えばアンチセンスオリ ゴヌクレオチドゃリボザィム等） が含まれる。
本発明の蛋白質をコ一ドする cDNAあるいはその配列の一部を含むォリゴヌクレ ォチドは、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子や cDNAのクローニング、 あるいは PCRによる増幅に利用できる。 また、 本発明の蛋白質をコードする RNAの検出およ び定量に有用である。 さらに、 制限断片長多型 （RFLP)、 1本鎖 DNA高次構造多型 (SSCP) などの方法により、 遺伝子あるいは cDNAの変異、 多型、 あるいは異常の 検出（遺伝子診断など） に利用できる。
本発明の蛋白質は、 脬臓の形成、 再生、 および/または維持、 特に滕 ?細胞の量 の調節に重要な機能を有することから、 本発明のポリヌクレオチドを脬臓の検査 、 例えば脬 ?細胞の検査に利用することができる。 また、 本発明のポリヌクレオ チドは糖尿病の検査に用いることもできる。 例えば、 被検者より臈臓組織サンプ ルを単離し、 この組織における本発明の蛋白質の発現量の異常をノーザンハイブ リダィゼーシヨン、 RT-PCR、 または DNAチップ （DNAマイクロアレイ） 等で検査す ることができる。 また、 本発明の蛋白質をコードする DNAまたは RNAの変異または 多型の有無を、 配列を決定したり、 SSCPまたは RFLP等により検査することができ る。 ポリヌクレオチドを検査試薬として使用する場合は、 適宜滅菌水や緩衝液、 塩などと共に混合することができる。
また、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチド、 該蛋白質またはペプチドをコ —ドする DNA、および該 DNAが挿入されたべクタ一は、後述の本発明の蛋白質と Reg 蛋白質との結合を阻害する化合物のスクリーニング、 および本発明の蛋白質の活 性化により生じるシグナル伝達 (例えば細胞増殖活性または細胞の DNA合成活性な ど） を促進または阻害する化合物のスクリーニングのために使用され得る。 これ らのスクリーニングは、 糖尿病等を含む脬 細胞の量または機能の異常に起因す る疾患の治療薬または予防薬のアツセィにも適用することができる。 糖尿病以外 にも、 消化管腫瘍、 神経変性症、 脬炎、 腫瘍などの治療薬または予防薬のアツセ ィまたはスクリーニングのためにも使用され得る。
また、 本発明は、 本発明の蛋白質に結合する抗体に関する。 本発明の抗体には 、 ポリクーナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。 ポリクローナル抗体 は、 例えば生体材料 （例えば脬臓ランゲルハンス島） から調製した 「Reg結合蛋白 質」 や、 先に述べた宿主—ベクター系などで製造した組換え 「Reg結合蛋白質」、 または一般的なぺブチド合成法により合成した部分べプチドを抗原に公知の方法
(Harlow, E. and Lane, D. Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988) など） でゥサギ、 ャギ、 ヒッジなどを免疫してポリクロ一ナル抗体を作製する。 モノクローナル抗体は、 生体材料 （例えば脬臓ランゲルハンス島） から調製した
「Reg結合蛋白質」 や、 先に述べた宿主—ベクター系などで作製した組換え 「Reg 結合蛋白質」、または一般的なぺプチド合成法により合成した部分べプチドを抗原 に公知の方法 ( Harlow, E. and Lane, D. Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1988)など） で免疫したマウスゃラットの脾細胞を用い、 モノクロ一 ナル抗体を産生するハイプリ ドーマを得る。
ポリクローナル抗体では血清から、 モノクローナル抗体ではハイプリ ドーマ培 養上清またはハイプリ ドーマを接種した動物の腹水から硫安分画、 プロテイン G セファロースカラム、 抗原を固定したァフィ二ティーカラムなどの一般的な生化 学的手法で抗体を精製する。
これにより調製された抗体は、 本発明の蛋白質のァフィ二ティ一精製のために 用いられる他、 例えば、 本発明の蛋白質の発現異常や構造異常に起因する疾患の 検査や診断、 本発明の蛋白質の発現量の検出などに利用することが可能である。 具体的には、 例えば組織または細胞などから蛋白質を抽出し、 ウエスタンブロッ ティング、 免疫沈降、 ELISA等の方法による本発明の蛋白質の検出を通して、 発現 や構造の異常の有無を検査，診断することができる。 本発明の抗体は、 脬臓の検 査、 例えば脬 ^細胞の検査に利用することもできる。 また、 本発明の抗体は糖尿 病の検査に用いることもできる。 例えば、 被検者より脬臓組織サンプルを単離し 、 この組織における本発明の蛋白質の発現量または構造の異常をウェスタンプロ ット、 免疫組織化学、 ELISA、 EIA等により検査することができる。 抗体を検査試 薬として使用する場合は、 適宜滅菌水や緩衝液、 塩、 安定剤、 保存剤などを組み 合わせることができる。 また、 本発明の抗体を抗体治療に用いることも考えられ る。 本発明の抗体を抗体治療に用いる場合、 ヒト型抗体もしくはヒト抗体である ことが好ましい。 この場合は、 ヒ ト リンパ球と HGPRT (hypoxantine-guanine phosphoribosyl transferase)欠損マウスミエローマを融合し HAT培地にてヒト― マウスへテロハイプリ ドーマを選択する。 このミエローマ細胞を、 「Reg結合蛋白 質」 を抗原とした公知の RIA、 ELISA法で選択し、 「Reg結合蛋白質」 に対するヒト 型モノクローナル抗体を産生するクローンを得る。 抗体の精製は上記の通り行う ことができる。
また、 本発明は、 本発明の蛋白質に結合する化合物のスクリーニング方法に関 する。このようなスクリーニングは、 （a )本発明の蛋白質またはその部分べプチ ドに被検試料を接触させる工程、 （b )本発明の蛋白質またはその部分べプチドと 被検試料との結合を検出する工程、 および （c ) 本発明の蛋白質またはその部分 ぺプチドに結合する化合物を選択する工程、 を含む方法により実施することが可 能である。
本発明の蛋白質は、 スクリーニングの手法に応じて、 精製蛋白質として、 細胞 表面に発現された形態として、 細胞膜画分としてスクリーニングに用いることが できる。
被検試料としては、 これらに制限されないが、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝子ラ イブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合物などを用 いることができる。 被検試料は、 必要に応じて適宜標識して用いられる。 標識と しては、 例えば、 放射標識、 蛍光標識などが挙げられるが、 これらに制限されな レ
本発明の蛋白質と結合する蛋白質のスクリーニングは、 例えば、 本発明の蛋白 質を固定したァフィ二ティーカラムに本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現し ていることが予想される細胞の培養上清もしくは細胞抽出物をのせ、 カラムに特 異的に結合する蛋白質を精製することにより、 本発明の蛋白質に結合する蛋白質 のスクリ一ニングを実施することが可能である。
さらに、 本発明の蛋白質と結合する蛋白質を発現していることが予想される組 織若しくは細胞 （例えば、 脬 ?細胞など） よりファージベクタ一を用いた cDNAラ ィブラリーを作製し、 これをァガロース上で発現させフィル夕一に蛋白質を固定 後、 標識した本発明の蛋白質を反応させ、 結合する蛋白質を発現しているブラー クを検出する 「ウェストウェスタンブロッテイング法」 や、 GAL4 DNA結合領域お よび GAL4転写活性化領域を、 本発明の蛋白質および被検蛋白質との融合蛋白質と して発現させ、 GAL4 DNA結合蛋白質の結合配列を有するプロモー夕一の下流に連 結させたレポ一ター遺伝子の発現を通して本発明の蛋白質と被検蛋白質との結合 を検出する 「twoハイブリッドシステム」 等に従い実施することも可能である。 また、 固定化した本発明の蛋白質に、 合成化合物、 天然物バンク、 もしくはラ ンダムファージぺプチドディスプレイライブラリーを作用させ、 結合する分子を スクリーニングする方法や、 コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスル
—プットを用いたスクリーニングにより本発明の蛋白質に結合する化合物を単離 する方法も当業者に周知の技術である。
また、 BIACORE (Biacore社製） を利用したスクリーニングやマイクロフイジォ メーター（モレキユラ一デバイス社製）などを用いて本発明の Reg結合蛋白質を強 制発現させた培養細胞の酸分泌速度の変化をモニターする方法などが考えられる また、本発明は、本発明の蛋白質と Reg蛋白質との結合を阻害する化合物のスク リ一ニング方法に関する。このようなスクリーニングは、 （a )被検試料存在下で 本発明の蛋白質と Reg蛋白質とを接触させる工程、 （b )本発明の蛋白質と Reg蛋白 質との結合を検出する工程、 （c )該結合を低下させる化合物を選択する工程、 を 含む方法により実施することが可能である。
本発明の蛋白質は、 精製蛋白質として、 細胞表面に発現された形態として、 細 胞膜画分としてスクリーニングに用いることができる。 また、 Reg蛋白質は、 通常 、 精製蛋白質としてスクリーニングに用いる。 Reg蛋白質としては、 例えば、 ヒト REG Iひやラット Reg Iを用いることができる。 これらの蛋白質は、 組換え蛋白質 として調製してもよい （実施例 1参照）。 Reg蛋白質は 、 必要に応じて [1251 ]等の 放射性同位元素等で標識しておいてもよい。
被検試料としては、 これらに制限されないが、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝子ラ イブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合物などを用 いることができる。
スクリーニングは、 例えば、 以下の如く行なうことができる。 本発明の蛋白質 を発現した細胞や、 それから調製された膜画分に、 被検試料の存在下で標識した リガンド （Reg蛋白質） を接触させ、 本発明の蛋白質に結合する標識されたリガン ドの量を測定する。 被検試料が存在しない場合と比較して、 このリガンドの量を 低下させるような化合物を選択する。本発明の蛋白質と Reg蛋白質との結合は、上 記 BIAC0REやマイクロフイジオメ一夕一を用いて測定することもできる。これによ り単離される化合物は、 本発明の蛋白質のアン夕ゴニストゃァゴニス卜の候補と なる。
また、 本発明は、 本発明の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達を促進ま たは阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。 このようなスクリー二 ングは、 （a ) 被検試料の存在下で、 本発明の蛋白質を表面に発現する細胞に Reg 蛋白質を接触させる工程、 （b ) Reg蛋白質刺激に応答した該細胞の変化を検出す る工程、 および （c ) 被検試料非存在下において検出した場合 （対照） 比較して 、 該細胞の変化を増強または抑制する化合物を選択する工程、 を含む方法により 実施することが可能である。
本発明の蛋白質をその表面に発現する細胞は、本発明の蛋白質をコードする DNA を適当な発現べクタ一に挿入し、 これにより構築したベクターを適当な宿主細胞 に導入することにより調製することができる。宿主細胞としては、例えば、 RINm5F 細胞、 CH0細胞、 COS- 7細胞などの細胞が挙げられる。 ベクターとしては pCI-neo (Promega)、 pHook ( Invitrogen) などが挙げられる。
被検試料としては、 これらに制限されないが、 例えば、 細胞抽出液、 遺伝子ラ イブラリーの発現産物、 合成低分子化合物、 合成ペプチド、 天然化合物などを用 いることができる。 また、 本発明の蛋白質との結合を指標とした上記のスクリー ニングにより単離された化合物を被検試料として用いることも可能である。
Reg蛋白質は、 通常、 精製蛋白質としてスクリーニングに用いる。 Reg蛋白質と しては、 例えば、 ヒト REG Iひやラット Reg Iを用いることができる。 これらの蛋 白質は、 組換え蛋白質として調製してもよい （実施例 1参照）。
スクリーニングにおいては、被検試料存在下での Reg蛋白質刺激に応答した上記 細胞の変化を検出する。 Reg蛋白質刺激に応答した細胞の変化としては、 例えば、 細胞増殖活性の変化、細胞の DNA合成活性の変化、細胞のアポトーシスの程度の変 化、 本発明の蛋白質やそのシグナルを伝達する蛋白質のリン酸化、 細胞内の特定 の遺伝子の発現の変化などが挙げられるが、 これらに制限されない。
細胞の DNA合成は、例えば実施例に示されるように 5' -ブロモ -2' -デォキシゥリ ジン （BrdU) の取り込みを測定することで検出することができる。 また、 ¾—チ ミジンを細胞に添加し、 細胞内に取り込まれた放射活性を測定することにより行 つてもよい。 ¾—チミジンの細胞への取り込み試験は、 DNA合成促進または抑制 効果の測定に一般的に用いられている。 この方法は比較的多量のサンプルを扱え 、感度も高いなどの利点を有している。 DNA合成を促進または抑制する化合物のス クリーニングにおいては、 具体的には、 例えば、 細胞をマルチウエルプレート等 に蒔き 1〜2日ほど培養後、 被検試料を含む培地に交換し、 24時間など一定時間 インキュベートし、 その後、 例えば l〃Ci/nilの ¾—チミジンを添加する。 イン キュベ一ト後、培地を除き細胞を洗浄してから 10% TCAを加え 20分ほど氷上に置 き、 氷冷した 5% TCAで洗浄する。 0.5N NaOHで細胞を溶解し、 氷上に 10分置いて から 1/2容の IN HC1を加え穏やかに混合し、 さらに 40% TCAを終濃度 10%になる ように加えて穏やかに混合する。 20分氷上に静置した後、 Whatman GF/Cフィルタ —などで濾過して不溶物を回収する。 100%エタノールで 3回洗浄し乾燥させた後 、 液体シンチレ一シヨンカウンターで放射活性を計測する。
また、 細胞の増殖は、 細胞数の計測やコロニー数の計測、 または細胞に MTTもし くは Alamar Blueなどの色素を加え、細胞数に依存した発色を測定することにより 行うことができる。 MTT法は MTT (3- (4, 5-ジメチルチアゾル- 2-ィル） -2，5-ジフエ ニルテトラゾリゥム プロマイ ド）による発色によって細胞増殖活性を測定するも ので、生細胞のミ トコンドリアの呼吸鎖に作用し MTTホルマザンを生成する。この 生成量は細胞数を反映する。 具体的には、 例えば、 96ゥエルプレートで細胞を培 養し、 被検試料を作用させたのち、 5 mg/ml MTT溶液を 10〃1加え、 4時間インキュ ペートする。 0.04N HC1/イソプロパノールを 100 1加え、 よく混合し、 数分放置 する。 マイクロプレートリーダーを用いて、 レファレンス波長 630皿、 テスト波 長 570nmで測定する。また、実施例 1 1のようにテトラゾリゥム塩 4[-3- (4-ョ一ド フエニル） -2- (4-二トロフエ二ル）- 2H- 5-テトラゾリオ]- 1，3-ベンゼンジスルホネ —ト （WST- 1) を用いて測定することもできる。
細胞のアポトーシスは、 例えば核の形態変化 （核の凝縮、 分断)、 染色体の断片 化 （ダラ一形成） などを指標として測定することができる。 具体的には、 例えば TUNEL法 [Y. Gavriel i et al .， J. Cel l Biol . 119, 493 ( 1992)] 等によりアポ トーシスを検出することができる （実施例 1 1参照）。
蛋白質のリン酸化は、 セリン、 スレオニン、 またはチロシン残基等に起こると 考えられる。 これらリン酸化の変化は、 抗リン酸化セリン、 スレオニン、 または チロシン抗体によるウェス夕ン法ゃ免疫沈降法により、 細胞内蛋白質のリン酸化 状態を測定することで検出が可能である。 リン酸化される蛋白質としては、 細胞 増殖に関与する MAPキナーゼ系ゃ STAT系、 あるいは Fos- Jun系蛋白質などが予想さ れるが、 これら例示した蛋白質に限らない。
上記蛋白質リン酸化などにより、 種々の遺伝子の転写が誘導されたり抑制され たりすることが知られている。 本発明の蛋白質とそのリガンドとの結合に依存し た特定の遺伝子の発現の変化は、 レポ一夕一遺伝子を利用して検出することがで きる。 即ち、 該遺伝子のプロモーターの下流にレポ一夕一遺伝子を連結し、 レポ —夕一遺伝子の発現を検出することで測定できる。 また、 特定の遺伝子の発現の 変化は、 ノーザンブロッテイング法や RT- PCR法などの m Aを検出する方法、 遺伝 子の翻訳産物である蛋白質を抗体などを用いて検出する方法、 遺伝子の翻訳産物 である蛋白質の活性を検出する方法により測定することもできる。
これらのスクリーニングにより単離される化合物としては、 例えば、 ①本発明 の蛋白質に結合し、 その活性を促進または阻害する化合物、 ②本発明の蛋白質ま たは Reg蛋白質等の本発明の蛋白質のリガンドに結合し、本発明の蛋白質とリガン ドとの結合を促進または阻害する化合物、 ③本発明の蛋白質のリガンドに結合し 、 その活性化を促進または阻害する化合物、 ④本発明の蛋白質から細胞の変化を 発現するに至るシグナル伝達を促進または阻害する化合物が含まれる。
これら化合物は、 本発明の蛋白質を介したシグナル伝達系の異常などに起因す る疾患 （例えば、 脬 ?細胞の機能の異常に起因する疾患） の予防薬や治療薬への 応用が考えられる。 例えば、 糖尿病の治療薬への応用が考えらる。
本発明の DNA、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチド、 本発明の DNAを含むベ クタ一、 本発明の蛋白質またはその部分ペプチドに対する抗体、 および上記スク リーニングにより単離し得る化合物は、 単独で、 または他の化合物と組み合わせ て薬剤として用いることができる。 本発明の薬剤には、 試薬および医薬が含まれ る。
例えば、本発明の蛋白質は Reg蛋白質と結合する活性を有することから、本発明 の蛋白質およびその部分ぺプチドを、 Reg蛋白質と結合させるために使用すること ができる。このような蛋白質またはべプチドは、 Reg蛋白質の検出やァフィ二ティ 一精製などに利用し得る。本発明の蛋白質またはその部分べプチドを Reg蛋白質と 接触させることにより、本発明の蛋白質またはその部分べプチドを Reg蛋白質と結 合させることができる。 本発明の蛋白質またはその部分べプチドは精製されてい てもよいし、 細胞膜表面に発現していてもよい。 また、 担体に結合していてもよ レ、。 結合させる Reg蛋白質の由来に制限はなく、 マウス、 ラット、 ヒトなどの Reg 蛋白質を結合させることができる。 また、 本発明の蛋白質またはその部分べプチ ドをコードする DNAおよび該 DNAが揷入されたべクターも、 本発明の蛋白質または その部分べプチドを細胞で発現させることにより、 同様の目的で使用することが できる。 このように本発明の蛋白質およびその部分ペプチド、 これらをコードす る DNA、あるいは該 DNAが挿入されたベクターを含む薬剤は、 Reg蛋白質結合剤とす ることができる。
また本発明の蛋白質は、 Reg蛋白質の受容体として機能する。従って、 本発明の 蛋白質は、 Reg蛋白質に応答した細胞内シグナル伝達を調節（促進または抑制）す るために使用することができる。 本発明の蛋白質を活性化することによりシグナ ル伝達が促進され、 逆に本発明の蛋白質の活性化を阻害することによりシグナル 伝達は遮断される。 例えば、 本発明の蛋白質 （例えば配列番号： 4 ) を発現する 細胞に Reg蛋白質などの本発明の蛋白質のリガンドまたはァゴニストを接触させ ることにより本発明の蛋白質を活性化させ、 細胞内にシグナルを伝達させること ができる。 細胞は、 好ましくは脬 ?細胞系の細胞または上皮細胞などである。 ま た、 Reg蛋白質と結合するが、 細胞内にシグナルを伝達しない蛋白質は、 Reg蛋白 質のシグナル伝達を遮断するために使用することができる。 このような蛋白質と しては、 Reg蛋白質との結合領域を保持するが、下流へのシグナル伝達部位を持た ない蛋白質などが挙げられる。 このような蛋白質を細胞で発現させることにより 、 または細胞外に添加することにより、 Reg蛋白質によるシグナル伝達を遮断する ことができる。本発明の蛋白質またはその部分ぺプチドをコ一ドする DNAおよび該 DNAが挿入されたベクターも、本発明の蛋白質またはその部分べプチドを細胞で発 現させることにより、 同様の目的で使用することができる。 また、 本発明の蛋白 質またはその部分ペプチドに結合する抗体、 本発明のスクリーニングにより単離 し得る化合物も、 同様の目的で使用し得る。 このように本発明の蛋白質またはそ の部分ペプチド、 該蛋白質またはペプチドをコードする DNA、 該 DNAが挿入された ベクタ一、 本発明の抗体、 および本発明のスクリーニングにより単離し得る化合 物は、 Reg蛋白質に応答した細胞内シグナル伝達の調節剤（促進剤または抑制剤な ど） とすることができる。
また、 Reg蛋白質に応答した細胞内シグナル伝達としては、 細胞の DNA合成の促 進、 および細胞の増殖の調節 （促進または抑制） が挙げられる。 すなわち、 本発 明の蛋白質は、 細胞の DNA合成を促進するために、 また、 細胞増殖を促進または抑 制するために使用することができることを示している。 対象となる細胞は、 好ま しくは脬 ?細胞系の細胞または上皮細胞などである。 本発明の蛋白質を発現する 細胞に、 本発明の蛋白質のリガンド （例えば Reg蛋白質） またはァゴニストを接触 させることにより、 DNA合成を促進し、 細胞増殖 （または分裂） を促進することが できる。 本発明の蛋白質を外来的に細胞に発現させる場合は、 本発明の蛋白質 （ 例えば配列番号： 4 ) を発現するべクタ一を細胞に導入する。 また、 Reg蛋白質と 結合するが、 細胞内にシグナルを伝達しない蛋白質は、 DNA合成を抑制、 または細 胞増殖を抑制するために使用することができる。このような蛋白質としては、 Reg 蛋白質との結合領域を保持するが、 下流へのシグナル伝達部位を持たない蛋白質 が挙げられる。 このような蛋白質を細胞で発現させることにより、 または細胞外 に添加することにより DNA合成を抑制または細胞増殖を抑制することができる。本 発明の蛋白質またはその部分ペプチドをコードする DNAおよび該 DNAが挿入された ベクターも、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドを細胞で発現させることに より、 上記と同様の目的で使用し得る。 また、 本発明の蛋白質またはその部分べ プチドに結合する抗体、本発明のスクリーニングにより単離し得る化合物も、 DNA 合成または細胞増殖を調節するために使用することができる。 例えば、 本発明の 蛋白質のリガンドまたはァゴニストとして作用する抗体や化合物は、 これを生体 に投与することにより細胞 （脬 5細胞など） の増殖を促進することが可能である 。 投与は in vitroおよび in vivoで行い得る。 このように本発明の蛋白質また はその部分ペプチド、 該蛋白質またはペプチドをコードする DNA、 該 DNAが挿入さ れたベクタ一、 本発明の抗体、 および本発明のスクリーニングにより単離し得る 化合物は、 細胞の DNA合成または細胞増殖の調節剤（促進剤または抑制剤など） と することができる。
また、 本発明の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達としては、 細胞のァ ポトーシスの誘導が挙げられる。 すなわち、 本発明の蛋白質は、 細胞のアポトー シスを調節 （アポトーシスの誘導または誘導の抑制） するために使用することが できる。 本発明の蛋白質またはその部分ぺプチドをコードする DNAおよび該 DNAが 挿入されたベクターも、 本発明の蛋白質またはその部分べプチドを細胞で発現さ せることにより、 同様の目的で使用することができる。 また、 本発明の蛋白質ま たはその部分べプチドに結合する抗体、 本発明のスクリーニングにより単離し得 る化合物も、 アポトーシスを調節するために使用することができる。 対象となる 細胞は、 好ましくは脬 ?細胞系の細胞または上皮細胞などである。 本発明の蛋白 質を発現する細胞に、 本発明の蛋白質のリガンド （例えば Reg蛋白質） を高濃度で 接触させることにより、 アポトーシスを誘導することができる。 Reg蛋白質は、 例 えば ΙΟΟηΜより高い濃度、 好ましくは 500nM以上の濃度、 より好ましくは ΙΟΟΟηΜ以 上の濃度で細胞に接触させる。 本発明の蛋白質を外来的に細胞に発現させる場合 は、 本発明の蛋白質 （例えば配列番号： 4 ) を発現するベクターを細胞に導入す る。また、 Reg蛋白質と結合するが、細胞内にシグナルを伝達しない蛋白質は、 Reg 蛋白質によるアポトーシスの誘導を抑制するために使用することができる。 この ような蛋白質を細胞で発現させることにより、 または細胞外に添加することによ りアポトーシスを抑制することができる。 このように本発明の蛋白質またはその 部分ペプチド、 該蛋白質またはペプチドをコードする DNA、 該 DNAが挿入されたべ クタ一、 本発明の抗体、 および本発明のスクリーニングにより単離し得る化合物 は、 細胞のアポトーシスの調節剤 （誘導剤または抑制剤など） とすることができ る o 本発明の蛋白質またはその部分べプチド、 該蛋白質またはペプチドをコードす る DNA、 該 DNAが揷入されたべクタ一、 本発明の抗体、 および本発明のスクリ一二 ングにより単離し得る化合物は、 公知の薬学的手法に従い、 蒸留水、 緩衝液、 塩 、 BSA、 グリセロール、 安定剤、 保存剤、 界面活性剤などを組み合わせて組成物と することができる。 また、 本発明の薬剤は、 上述のように脬臓の検査のための試 薬として用いることもできる。 また、 糖尿病、 消化管腫瘍、 神経変性症、 脬炎、 腫瘍などの治療または予防のための医薬組成物としても有用である。
本発明の薬剤を医薬として用いる場合には、 本発明の蛋白質またはその部分ぺ プチド、 該蛋白質またはペプチドをコードする DNA、 該 DNAが挿入されたべク夕一 、 本発明の抗体、 および本発明のスクリーニングにより単離し得る化合物自体を 直接患者に投与する以外に、 公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うこ とが可能である。 例えば、 薬理学上許容される担体もしくは媒体、 具体的には、 滅菌水や生理食塩水、 デキストロース、 グリセロール、 エタノール、 植物油、 乳 化剤、 懸濁剤、 界面活性剤、 安定剤などと適宜組み合わせて製剤化して投与する ことが考えられる。 本発明の医薬組成物は、 水溶液、 錠剤、 カプセル、 トローチ 、 バヅカル錠、 エリキシル、 懸濁液、 シ口ップなどの形態であり得る。 活性化合 物の含有率は適宜決定すればよい。 患者への投与は、 例えば、 動脈内注射、 静脈 内注射、 皮下注射などのほか、 鼻腔内的、 経気管支的、 筋内的、 または経口的に 当業者に公知の方法により行いうる。 投与は、 全身投与または局所投与で行い得 る。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法、 症状などにより変動するが、 当業 者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 投与は 1回から数回 に分けて行うことができる。また、該化合物が DNAによりコ一ドされうるものであ れば、該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられ る。 投与はェクスビボまたはインビボで行い得る。 投与量、 投与方法は、 患者の 体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可 能である。 図面の簡単な説明
図 1は、 ラヅ トインスリノ一マ由来細胞株 RINm5F細胞にヒ ト REG蛋白質 （REG I a) を添加したときの BrdUの取り込みを測定した結果を示す図である （実施例 3 図 2は、 RINm5F細胞に [1251]標識したラット Reg蛋白質 （Reg I) を添加したと きの細胞への結合を測定した結果を示す図である （実施例 4)。 「Hot」は標識した ラッ ト Reg蛋白質のみ、 「Hot + 100xCold」 は、 標識したラッ ト Reg蛋白質と 100 倍量の非標識ラット Reg蛋白質を共に添加したときの結果を示す。
図 3は、 単離された Reg結合蛋白質を COS- 7細胞で発現させ、 [1251] 標識したラ ット Reg蛋白質 （Reg I) を添加したときの細胞への結合を測定した結果を示す図 である （実施例 6)。 「pCI- neo」 は空ベクター、 「pCI-167.1」 は Reg結合蛋白質発 現べクタ一を導入した細胞の結果を表す。 また、 （-)は標識したラット Reg蛋白質 のみ、 （+ )は標識したラット Reg蛋白質と 100倍量の非標識ラット Reg蛋白質を共に 添加したときの結果を表す。
図 4は、 ラット Reg結合蛋白質 （Reg受容体） （rEXTL3) (配列番号： 4)、 ヒト EXTL3/EXTR1 (hEXTL3) (GenBankァクセッション番号 AF001690および AB007042) ( 配列番号： 5)、 ヒ ト EXT2 (hEXT2) (GenBankァクセッション番号 U64511) (配列 番号： 6 )、 ヒ ト EXT1 (hEXTl) (GenBankァクセッション番号 S79639) (配列番号 ： 7)、 ヒト EXTL1 (hEXTLl) (GenBankァクセッション番号 U67191) (配列番号： 8)、 およびヒト EXTL2 (hEXTL2) (GenBankァクセッション番号 AF000416) (配列 番号： 9) の予想される蛋白質アミノ酸配列を整列化した図である （実施例 7 ) 。 膜貫通ドメインには下線を施した。 右欄の数字はアミノ酸残基に対応する。 ラ ット Reg結合蛋白質（rEXTL3) と同一の残基はドヅトで示した。ハイフンはラット Reg結合蛋白質 （rEXTL3) に対応する残基がないことを示す。
図 5は、 Reg結合蛋白質の細胞分布を示す図である。 レーン 1， コントロールべ クタ一を導入した COS- 7細胞のホモジネート ； レーン 2〜6， Reg結合蛋白質発現べ クタ一を導入した C0S-7細胞のホモジネート、 膜画分、 ミ トコンドリア画分、 ミク ロソーム画分、 およびサイ トゾル画分 （実施例 8 )。 各レーンで蛋白質 10/ gを電 気泳動し、 Reg結合蛋白質に付加した HA夕グに対する抗体でウェスタンプロットを 行った。 Reg蛋白質は細胞表面に発現することが分かる。
図 6は、 ヒト EXTL3/EXTR1のラット相同体は細胞表面型 Reg結合蛋白質であるこ とを示す図である （実施例 9 )。 非標識ラット Reg蛋白質の存在下 、 100倍過剰 量） または非存在下 （-） における [125I] Reg蛋白質の Reg結合蛋白質発現細胞と の結合を示す。 「pCIneo」 は空ベクターを導入した対照、 「pCI ' rEXTL3」 はラッ ト Reg結合蛋白質発現ベクターを導入した細胞の結果を示す。 4回の別々の実験の平 均土標準誤差 （s. e.m. ) として示した。
図 7は、 Reg受容体の機能解析を示す図である。 （A) Reg受容体を安定に発現す る CH0細胞へのラット Reg蛋白質による BrdU取り込みを示す図である （実施例 1 0 )。 Reg受容体を発現する 2つの独立した細胞系 （RegR- #3および RegR-#22) を検討 した。 結果は 8回の別々の実験の平均土標準誤差として示した。 （B) ラッ ト Reg ( 丸） およびヒト REG (四角） とラット Reg受容体との競合結合曲線を示す図である 。 結果は 4回の別々の実験の平均土標準誤差として示した。
図 8は、 Reg受容体を発現する/?細胞の増殖およびアポトーシスを示す図である (実施例 1 1 )。 Reg受容体を発現する 3つの独立した細胞系 （#1、 #6および #24) を検討した。 RINは RINm5Fコントロールを表わす。結果は 4〜8回の別々の実験の平 均土標準誤差として示した。 （A)Reg受容体を安定に発現する RINm5F細胞へのラッ ト Reg蛋白質による BrdUの取り込み。 （B)生細胞による WST- 1の切断の Reg蛋白質に よる増加。 （C) Reg蛋白質によって誘導される RINm5F細胞のアポトーシスを TUNEL 法によつて定量的に評価した結果。
図 9は、 Reg受容体 mRNAの発現を示す図である （実施例 1 2 )。 RNaseプロテクシ ヨンアツセィにより Reg受容体 mRNAの発現を調べた。 309塩基のバンドは、 ラット Reg受容体 mMAによるプロテクションサイズに対応する。 （A) 細胞における Reg 受容体 mRNAの発現を示す。ニコチンアミ ド 0.5mg/kg/日の腹腔内投与を 1〜3箇月間 行った 90%脬切除ラットから再生ラ島を単離した（Κ· Terazono, etal., J. Biol. Chem. 263， 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans , H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990)， pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33, 250 (1990); Y. Yonemura et al., Diabetes 33， 401 (1984))。 レーン 1、 正常脬 島； レーン 2、 脬部分切除から 1箇月後の再生ラ島； レーン 3、 脬部分切除から 2箇 月後の再生ラ島； レーン 4、 脬部分切除から 3箇月後の再生ラ島； レーン 5、 RINm5F 細胞； レーン 6、 ARIP細胞。 レーン Pにはプローブのみを泳動した。 （B) ラッ ト組 織における Reg受容体 mRNAの発現。 レーン 1、 正常脬島； レーン 2、 脬全体； レーン 3、 肝臓； レーン 4、 腎臓；レーン 5、 心臓； レーン 6、 脾臓； レーン 7、 胸腺； レー ン 8、 精巣； レーン 9、 副腎； レーン 10、 胃； レーン 11、 空腸； レーン 12、 回腸； レーン 13、 結腸； レーン 14、 下垂体； レーン 15、 脳。
図 1 0は、 Reg受容体を安定に発現する CH0細胞における生細胞による WST-1の分 解は Reg蛋白質によって増加することを示す図である （実施例 1 2)。 図 7 (A) と 同様に 2つの独立した細胞系を用いた。 結果は 8回の別々の実験の平均土標準誤差 として示した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。
[実施例 1 ] ヒト REG蛋白質 （REG la) およびラット Reg蛋白質 （Reg I) 発現 ベクターの構築
ヒト REG Iひ cDNA (Terazono, K. etal., J. Biol. Chem.263, 2111-2114 (1998) ) の蛋白質コード領域の全長を Pichia発現用べクタ一 pPIC3.5 (Invitrogen社製） の酵母アルコールォキシダーゼプロモー夕一の下流の SnaBI/Avrl lサイ 卜にリン 力一を用いて挿入し、 発現べク夕一を構築した。 ラット Reg l cDNA (Terazono, K. et al .，上記） の蛋白質コード領域の全長も同様に、 PPIC3.5の SnaBI/Notlサイ ト にリンカ一を用いて挿入した。 これら 2種類の発現べク夕一 DNAを CsC 1法で精製し 、 Pichia Easy Comp Kit ( Invitrogen社製） を用いて調製したコンビテント細胞 (Pichia GS115株） に導入した。 発現べクタ一導入細胞は、 ヒスチジンを含まな い培地で増殖できるようになることで選択した。 発現べク夕一導入細胞の中から 、 メタノール添加により培地中に産生 ·分泌されるヒト REG蛋白質 · ラット Reg蛋 白質が最大となるクローンを選択した。
[実施例 2 ] ヒト REG蛋白質 （REG Iひ） およびラット Reg蛋白質 （Reg I ) の調 製
上記ヒト REG蛋白質またはラット Reg蛋白質を産生する Pichia (Pichia pastoris ) を BMGY培地 ( 1% 酵母エキストラクト、 2% ポリぺプトン、 lOOmM リン酸カリゥ ム緩衝液 （pH6.0 )、 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% ビォチン、 1% グリセ ロール） で 28〜30°Cで 16〜18時間前培養後、 BMGY培地で 0D咖が 2〜5 にまるま で大量培養を行った。 酵母を遠心分離で回収し、 0D6Mが 1になるように BMMY培地 ( 1%酵母エキストラクト、 2%ポリペプトン、 lOOmMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0) 、 1.34% Yeast Nitroge Base, 0.00004% ピオチン、 0.5% メタノール） に再懸濁 し、 28〜30°Cで 3〜4日培養した。この間 24時間おきに終濃度 0.5%になるようにメ 夕ノールを加えた。 遠心分離で培養液を回収し、 酢酸を加え pHを 3.5 に調整し た。 pH調整済みの培養液を 50mM 酢酸ナ ト リウム （pH 3.5 )で平衡化した STREAMLINE SP (Pharmacia)にアプライし、 50πιΜ酢酸ナトリゥム (pH 3.5 )で洗浄 後、 50mM酢酸ナトリウム （pH 3.5 )/0.5M NaClで溶出した。 産生された蛋白質が それぞれヒト REG蛋白質またはラット Reg蛋白質であることは、 マススぺクトロメ トリーで確認した。
[実施例 3 ] ラットインスリノ一マ由来培養細胞 RINm5F細胞に対する REG蛋白質 の添加効果
ラッ トイ ンスリノ一マ由来の培養細胞 RINm5F細胞 （Zenilman, M.E. et al.， Gastroenterology 110, 1208-1214 (1996)) に REG蛋白質を添加し、 5，-ブロモ - 2，- デォキシゥリジン （BrdU)の取り込み（細胞増殖活性） を測定した。 まず 5xl05細 胞 /mlの RINm5F細胞 100 1を 96穴プレートに蒔き、 37°Cで 2日間培養した。 その 後、 培養液を下記に示す培養液 100 /1に置換した。 ヒト REG Iひは実施例 2で調製 したものを用いた。
培地 +1% FCS
培地 +1% FCS+ヒト REG la (1 nM; 0.016〃g/ml)
培地 +1% FCS+ヒ ト REG Iひ (10 nM; 0.16 zg/ml)
培地 +1% FCS+ヒ ト REG la (100 nM; 1.6 g/ml)
培地 +1% FCS+ヒ ト REG la (1000 nM; 16〃g/ml)
37°Cで 24時間ィンキュベ一トし、 BrdUラベリング溶液 （10mMの BrdU原液を培地 で 100〃Mになるように希釈したもの） を 10〃1/ゥヱル加えた （終濃度 10〃M BrdU )。 37°Cで 12時間ィンキュベ一トしたのち培地を除き、 FixDenat (ロッシュダイァ グノスティック社製）を 200〃1/ゥエル加えた。室温で 15分間ィンキュベ一トして から F i xDenat溶液を除き、 抗 BrdU-POD抗体 （ストック溶液 （口ッシュダイァグノ スティック社製） を 1/100希釈したもの） を 100 /1/ゥエル加えた。 室温で 60分間 インキュベートし、 抗 BrdU- P0D抗体溶液を除いた後、 洗浄液 （10X洗浄液 （ロッ シュダイァグノスティック社製）を 1/10希釈したもの） 200〃1/ゥエルで 3回リン スした。 基質溶液 （ロッシュダイァグノスティック社製） を 100 1/ゥエル加え、 十分な発色が得られるまで室温でィンキュベートした。各試料は ELISAリーダ一を 用いて 370nmの吸光度を測定した （レファレンス波長：約 492nm)。
その結果、 REG蛋白質の濃度依存的な細胞増殖が見られた （図 1)。
[実施例 4 ] MNm5F細胞に対する Reg蛋白質の結合活性の測定
まず、 以下のようにして、 [125I]RegI希釈液を調製した。 [1251]ラット Regl原液 (50ng/〃l=〜3.33〃M， 8.6 x 10 cpra/ / l)を DMEMで、それそれ InMヽ 333pM、 ΙΟΟρΜ 、 33pM、 および ΙΟρΜとなるように希釈した。 また、 非標識の Regl原液 （460ng/〃 1=30.6 iM) を、 [125I ]RegIの 100倍濃度で含むように加えた希釈液を同様に調製し た。 4 X 105細胞/ mlの RINm5F細胞 3mlを 6穴プレートに蒔き、 37°Cで 2日間培養し た。冷 DMEMで洗浄後、上記 [1251 ]ラット Reglを含む DMEM 3mlを加えた（終濃度 ΙΟρΜ, 33ρΜ, ΙΟΟρΜ, 333ρΜ, 1ηΜ)。 競合阻害実験においては、 100倍の非標識 Reglを共 存させた DMEMを用いた。氷上で 2時間静置し、 DMEMで 3回洗浄した後、 0.5〜 l ml/ ゥエルの [ lOOmM Tris-HCl (pH7.6 ) , ImM EDTA, 1% Triton X- 100] を加えてリシ スさせ、 ァ -カウン夕で [1251 ]をカウントした。
その結果、大過剰の非標識 Reg蛋白質により結合が阻害されており、特異的な結 合に必須の分子が RINm5F細胞膜上に存在することが示された （図 2 )。
[実施例 5 ] Reg結合蛋白質の同定と単離
ラッ ト脬ランゲルハンス島 Poly(A)+ RNAを鍩型にえ ZAP I Iベクターによる脬ラ ンゲルハンス島発現型 cDNAライブラリーを作製した。 実施例 2で調製したラット Reg蛋白質を Bo 1 ton- Hunter試薬を用いて1251標識し、発現型 cDNAラィプラリーから West-Western法で Reg蛋白質と結合するファージクローンを選択 ·単離した。 陽性ファージクローンからヘルパーファージを用いた in vivo 切り出し法で cDNAをプラスミ ドベクター （pBluescript SK (-)， Stratagene社製） に組み換えた 。 ジデォキシ法で cDNAの塩基配列を決定した。 その塩基配列を配列番号： 1に、 予想されるアミノ酸配列を配列番号： 2に示す。 塩基配列から推定される蛋白質 は 1個の疎水性アミノ酸クラス夕一の膜貫通領域を有する細胞膜蛋白質と考えら れた。
[実施例 6 ] Reg結合蛋白質の COS- 7細胞での発現
実施例 5で単離した cDNAをサイ トメガロウィルスプロモータ一を持つ哺乳動物 用発現ベクター （pCI- neo) (Promega) に組み込み、 Reg結合蛋白質発現べクタ一 (pCI-167.1 ) を構築した。 このベクターを COS- 7細胞へエレクト口ポレーシヨン 法で導入して一過性に発現させた。ベクター導入 48時間後に、実施例 4と同様の プロトコールで Reg結合活性を検討した。
具体的には、 まず [1251 ]ラッ ト Regl原液 （50ng/〃l=〜3.33〃M， 2.7 x l05 cpm/ j l ) を DMEMで ΙΟηΜ となるように希釈した。 また、 非標識の Regl原液 （2250ng/ 〃1=150〃M) を、 [125I ]RegIの 100倍濃度 （1〃M) 含むようにこの液に加えた希釈 液を別に調製した。
2.5 X 105細胞/ mlのトランスフエクトした COS細胞 3mlを 6穴プレートに蒔き、 37°Cで 2日間培養した。 冷 DMEMで洗浄後、 [1251 ]ラヅ ト Reglを含む DMEM 3ml を加 えた （終濃度 10nM)。 競合阻害実験においては、 100倍の非標識 Reglを共存させ た。 氷上で 2時間静置し、 DMEMで 3回洗浄した後、 1 ml/ゥエルの [ lOOmM Tris- HC1 (pH7.6 ) , lmM EDTA, 1% Triton X- 100] を加えてリシスさせ、 γ -カウンタで [1251 ]をカウントした。
その結果、 この cDNAを導入した細胞では、 ベクターのみを導入した細胞に比較 して1251標識 Reg蛋白質との結合が著明に増大していた。 また、 この結合は過剰量 の非標識 Reg蛋白質の添加により消失した（図 3 )。このことから、単離された cMA がコードする蛋白質は哺乳動物細胞膜上で Reg蛋白質と結合する分子であると考 えられ、 Reg蛋白質の/?細胞再生増殖活性を担う受容体分子である可能性が考えら れた。
[実施例 7 ] ラット脬島 cDNAラィブラリ一のスクリ一二ング
Reg結合蛋白質をコードする cDNAをさらに単離するため、 実施例 5で得られた cDNAをプローブとして用い、 プラークハイブリダィゼーシヨンにより、 ラット脬 島 cDNAライブラリ一 （5 X 106クローン） をスクリーニングした結果、 陽性クロー ン 8個を得た。 この 8個のクローンは互いに大部分が重複しており、 重複領域のヌ クレオチドは完全に一致していた。 得られたラット Reg結合蛋白質をコードする cDNAの配列を配列番号： 3に、 この cDNAによりコードされる Reg結合蛋白質のアミ ノ酸配列を配列番号： 4に示す。 図 4に示す通り、 この cDNAは 919アミノ酸からなる蛋白質をコードする 2，760bp のオープンリ一ディングフレームを有しており、 cDNAから推定されるアミノ酸配 列から、 この蛋白質は長い細胞外ドメイン （868アミノ酸残基）、 膜貫通ドメイン (残基 29〜51)および N末端に短い細胞内領域を有する II型膜貫通蛋白質であるこ とが予想された。
[実施例 8 ] ラット Reg結合蛋白質の発現
実施例 7で単離されたラッ ト Reg結合蛋白質 cDNAの発現べクタ一を作製し、 COS- 7細胞内で一過的に発現させた。 N末端にへマグルチニン （HA) ノナペプチド- 夕グ（YPYDVPDYA)を付加するようにこのタグをコードするオリゴヌクレオチドを 連結したラット Reg結合蛋白質 cDNAを pCI-neo哺乳動物発現べクタ一（Promega)に 挿入し、 このベクターを電気穿孔法によって COS- 7細胞に導入して発現させた。 48 時間インキュベートした後に細胞を回収し、 以前の記載 [S. Takasawaetal., J. Biol. Chem. 268, 26052 (1983) ； H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280, 306
(1997)] の通りにホモジェナイズおよび分画を行った。 蛋白質試料を 12.5% (w/v) SDSポリアク リルアミ ドゲル上での電気泳動にかけ、 ii iobilon-P ( Millipore) にトランスファ一した。 HAに対するモノクローナル抗体を用いて、 以 前の記載の通りにウエスタンプロッ ト解析を行った [S. Takasa a et al., J. Biol. Chem 270, 30257 (1995) ； H. Okamoto et al., Meth. Enzymol. 280， 306
(1997)]。 HAに対するモノクローナル抗体は抗 HA 3F10 (Boeringer) を用いた。 ィムノブ口ット解析の結果、 この cDNAによってコードされる蛋白質は主として 細胞膜画分に発現され、 見かけの分子量は 105kDであり （図 5A)、 予想されるアミ ノ酸配列から算出された分子量（104,682)とよく一致することが明らかになった
[実施例 9] ラッ ト Reg結合蛋白質の Reg蛋白質への結合
実施例 8で作製したラッ ト Reg結合蛋白質 （ラット EXTL3/EXTR1とも称す） 発現 ベクターまたはコントロールベクタ一を電気穿孔法によつて C0S-7細胞内に導入 し、 一過的に発現させた。 これらの細胞から Reg結合蛋白質を安定に発現する CH0 細胞を単離した。細胞（7.5 X 105個）を RPMI1640 (Roswel l Park Memorial Institute 1640) で洗い、 1 1標識ラット Reg蛋白質 (50ng/ml、 1.5 x l05 cpm/ml ) の存在下 において、種々の濃度の非標識ラット Regまたはヒト REG蛋白質とともに、 1%ゥシ 胎児血清を含む RPMI 1640中にて氷上で 2時間ィンキュベ一トした。 RPMI 1640で 3回 洗った後、 細胞を lmlの lOOmM Tris- HC1 (pH7.6)、 ImM EDTAおよび l %Triton X- 100 で可溶化した。 可溶化物の放射活性をァ線計数機 （Cobra、 Packard) によって測 定した。その結果、 ラッ ト Reg結合蛋白質発現ベクターを導入した COS- 7細胞は1251 標識ラット Reg蛋白質と結合し、 この結合は非標識 Reg蛋白質の添加によって減少 した （図 6 )。
MA/蛋白質データベースの相同性検索により、 ラット Reg結合蛋白質 cDNA (配 列番号： 3 ) および予想されるアミノ酸配列 （配列番号： 4 ) には複数の外骨腫 (EXT) ファミリ一遺伝子、 特にヒト EXT様遺伝子 3 (EXTL3) ZEXT関連遺伝子 1 ( EXTR1) (W. Van Hui et al . , Genomics 47, 230 ( 1998) ; T. Saito et al . , Biochem. Biophys. Res. Co腿 un. 243, 61 ( 1998)) との著明な相同性 （アミノ酸同一性が 97 %を上回る） が認められることが明らかになり、 この cDNAがヒト EXTL3/EXTR1 のラット相同体 （homologue) であることが示された。 EXTL3/EXTR1遺伝子は相同 性スクリーニングによって EXTフアミリー遺伝子の一員として単離されたが、その 生理的機能および病態生理学的意義は不明である。 EXTL3/EXTR1は、 C末端領域で EXT2および EXT1との相同性 （C末端の 262アミノ酸が EXT2と 52%、 C末端の 247アミ ノ酸が EXT1と 40%)が認められることから（図 4参照）、 EXTフアミリー（W. Van Hui et al . , Genomics 47， 230 ( 1998) ; T. Saito et al . , Biochem. Biophys. Res. Co匪 un. 243, 61 ( 1998) ) に属すると考えられている。 しかし、 EXTL3/EXTR1の N 末端領域（残基 1〜656)は EXTフアミリ一遺伝子の他のいずれのメンバ一とも相同 性が認められない。 さらに、 EXTL3/EXTR1の N末端領域は膜貫通ドメインを含んで いるが、 ファミリ一の他のメンバ一はこのドメインを含まず、 このため細胞表面 蛋白質であるとは考えられなかった。 これに加えて、 ラット脬島 cDNA発現ライブ ラリーのスクリーニングで最初に Reg結合蛋白質として単離された 1.6kbp cDNAは 、 N末端領域のみを含んでいた （アミノ酸残基 1〜332)。 したがって、 Reg結合ドメ ィンは N末端領域に含まれており、 EXTL3/EXTR1以外の EXTフアミリーのメンバーに は Reg蛋白質との結合能はないとみなすことが妥当と思われる。
[実施例 1 0 ] ラット Reg結合蛋白質 （ラット Reg受容体） 発現細胞の Reg蛋白質 による刺激効果
実施例 8で構築したラット Reg結合蛋白質 （以後 「ラット Reg受容体」 とも称す )発現べクタ一を CH0細胞に導入して、受容体蛋白質を過剰発現する細胞系をいく つか樹立し、 ラット Reg蛋白質刺激による細胞内への 5' -ブロモ -2' -デォキシゥリ ジン （BrdU) の取り込みを検討した。
HA-タグを付加したラット Reg受容体発現ベクターを CH0細胞および RINm5F細胞 に導入した。 10%ゥシ胎児血清 （Bio Whittaker, Walerevi l le, Maryland) およ び 250〃g/mlのネオマイシン（Gibco)を加えた RPMI 1640培地中で細胞を 2週間培養 した [S. Takasawa et al .， J. Biol . Chem. 273、 2497 (1998)]。 組換え蛋白質 を高レベルに発現する安定形質転換体は、 HAのィムノブロット解析によってスク リーニングし単離した。 Reg受容体を発現する安定形質転換体を、種々の濃度のラ ット Reg蛋白質の存在下において、 1%ゥシ胎児血清を加えた RPMI 1640培地中で 24 時間培養した。 培養終了の 2時間前に BrdU (10 /M) を培地に添加し、 比色法によ る細胞増殖 ELISAキット （Boeringer) を用いて BrdU取り込みを測定した。
1〜300ηΜのラット Reg蛋白質とともにインキュベートすると、 EXTL3/EXTR1 (ラ ット Reg受容体） を発現する細胞系の BrdU取り込みは （#3および #22とも） 著明に 増加した （細胞系 #3では EC5。=4.01nM、 細胞系 #22では 1. 11ηΜ、 図 7 (A) )。 CHO細 胞系に対する増殖刺激効果を示した Reg蛋白質の濃度は初代培養ラッ ト脬島での 値と一致しており （T. Watanabe et al .， Proc. Natl . Acad. Sci . USA 91， 3589 ( 1994 ) )、このことから Reg蛋白質による脬 ?細胞の増殖は EXTL3/EXTR1のラッ ト相 同体によつて媒介されることが示唆された。
1251標識ラット Reg蛋白質はラット Reg受容体発現 CH0細胞と結合し （Κα=4.41ηΜ )、 非標識ラット Reg蛋白質の濃度を高めることによって結合は置換された （ = 1·61ηΜ、図 7(B)) (実施例 9参照）。ラット Reg蛋白質に関するヒル係数は ηΗ=1.18 と推定され、 単一の均質な結合部位の集団との相互作用が考えられた。 さらに、 ラット Reg蛋白質と 70%のアミノ酸の同一性を示すヒト REG蛋白質 （K. Terazono, et al.， J. Biol. Chem. 263， 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313) も、 上記のラ ット Reg受容体を発現する CH0細胞と結合した （Κα = 14.0ηΜ)。 放射性標識したラ ット Reg蛋白質の CH0細胞との結合は、 ヒト REG蛋白質によっても置換されたが、置 換にはより高い濃度を必要とした （ =7.41 、 図 7(B))。 以上の結果は、 Reg 結合蛋白質（EXTL3/EXTR1)が Reg蛋白質と結合する細胞表面 Reg受容体であり、 Reg 蛋白質の増殖刺激シグナルを伝達することを強く示唆する。
[実施例 1 1] ラット Reg受容体の機能解析
Regは/?細胞増殖因子として認識されている （H. Okamoto, J. Mol. Med.77, 74 (1999); T. Watanabe et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 3589 (1994); D. J. Gross et al., Endocrinology 139, 2369 (1998))。 ラットインスリノ一マ由 来の 細胞株である RINm5F細胞に Reg蛋白質を添加したところ、細胞の BrdUの取り 込みが増加し （1.5〜2倍)、 Reg蛋白質の濃度依存的に細胞数を増加させることが 判明した。 RINm5F細胞において増殖を刺激する Reg蛋白質の濃度はラット脬島初代 培養におけるものと一致しており、 Reg蛋白質は両者の細胞において同じ受容体を 介して作用していることが示唆された。 そこで、 次に RINm5F細胞に実施例 8で構 築した発現ベクターを導入し、 Reg受容体を過剰発現する細胞系をいくつか樹立し 、 これらの細胞を用いて Reg蛋白質の作用を調べた。
0.3〜300nMのラット Reg蛋白質とともにィンキュペートすると、受容体を発現す る細胞系 （細胞系 #1、 #6および #24) の BrdU取り込み （測定方法に関しては実施例
1 0参照） は著明に増加した （図 8 A)。
Reg受容体を発現するこれらの安定形質転換体を、 種々の濃度のラッ ト Reg蛋白 質の存在下において、 1%ゥシ胎児血清を加えた RPMI 1640培地中で 24時間ィンキュ ベートした後、 細胞増殖試薬であるテトラゾリゥム塩 4[-3-(4-ョ一ドフヱニル） - 2- (4-ニトロフエ二ル）- 2H-5-テトラゾリオ]- 1 , 3-ベンゼンジスルホネート （WST- 1) (Boeringer) を含む溶液を培地に添加し、 30分培養して、 生細胞内のミ トコン ドリアデヒドロゲナ一ゼによる WST-1の切断を測定することにより細胞増殖を測 定した。 その結果、 Reg受容体を発現するこれらの RINffl5F細胞は、 Reg蛋白質 （0.3 〜100nM) の添加に応答して細胞数を増加させたが、 細胞を高濃度の Reg蛋白質と ともにィンキュベ一トした際には減少した （図 8 B)。
高濃度の Reg蛋白質が、これらの細胞のアポトーシスを誘導している可能性を検 証するため、この Reg受容体を発現する安定形質転換体を、種々の濃度のラット Reg 蛋白質の存在下において、 1 %ゥシ胎児血清を加えた RPMI 1640培地中で 24時間ィン キュベー卜した後、 Apoptosis Screening Kit (Wako, Osaka, Japan) を用いて、 TUNEL法 [Y. Gavriel i et al .， J. Cel l Biol . 119， 493 ( 1992)] によりアポト 一シスを検出した。
これらの細胞のアポトーシスを測定したところ、 高濃度の Reg蛋白質が Reg受容 体発現 RINm5F細胞のアポトーシスを誘導したことが明らかになった （図 8 C)。 以 上の結果は、 Reg受容体が Reg蛋白質に応答して脬 細胞の増殖およびアポトーシ スを媒介し、 それによつて/?細胞の量を安定的に維持していることを示している
[実施例 1 2 ] Reg受容体 mRNAの発現解析
RNaseプロテクションアツセィにより、 種々のラット組織および細胞における Reg受容体 mRNAの発現を検討した。
ラット再生膝島は以前記載したようにして調製した （K. Terazono, et al .， J. Biol. Chem. 263， 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans, H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp.301-313; Y. Yonemura et al. , Diabetes 33, 401 (1984))。 RNAは以前の記載に従って種々のラット組織および細胞株から 単離した [T. Koguma et al., Biochem. Biophys. Acta 1223, 160 (1994); N. Noguchi et al., J. Biol Chem. 272,, 3133 (1997); H. Okamoto et al., Meth. Enzymol.280, 306 (1997)]。 ラヅト Reg受容体 cDNA (配列番号： 3) の Pstl/Bglll 断片を pBluescript SK (-)の Pstl/BgUI部位にサブクローニングし、 Hindlllで直 鎖化した後 T3 RNAポリメラーゼおよび [ひ-32 P]CTPを用いて in vitro で転写さ せた。 得られた 0.45kb cRNAをプローブとして用いた。 RNaseプロテクションアツ セィは、 RPA III kit (Ambion) を用いて説明書に従って行った。
図 9Aに示す通り、 Reg受容体 mRNAは正常脬島、 再生脬島および RINm5F ?細胞に おいて発現していた。正常脬島と比較して再生脬島における Reg受容体の発現増強 は認められず、 このことから脬 細胞の量を増加させる/?細胞の再生および増殖 は、受容体の発現ではなく、主として Reg蛋白質の発現によって調節される可能性 が示唆された。 この仮説は、 Reg遺伝子が再生臈島で特異的に発現される遺伝子と してまず同定されたこと（K. Terazono, etal., J. Biol. Chem.263, 2111 (1988); K. Terazono, T. Watanabe, Y. Yonemura, in Molecular biology of the islets of Langerhans , H. Okamoto, Ed. (Cambridge University Press, Cambridge, 1990), pp. 301-313; K. Terazono et al., Diabetologia 33， 250 (1990)) や、 糖尿病緩解期にある BB/Wor/Tkyラヅトの脬島 (C. Ishii et al., Endocr. J. 40, 269 (1993))、 糖尿病発生活動期にある NODマウスの脬島 （N. J, Baeza et al., Diabetes 45, 67 (1996)) などの一過性の/?細胞増殖期、 および自己免疫性糖尿 病のマウスモデルにおける分化 ·増殖期の脬管細胞 （^細胞の前駆細胞と考えら れている） （E. Anastasi et al., Eur. J. Endocrinol. 141， 644-52 (1999)) に も Reg遺伝子の発現が認められるという観察結果と一致する。滕管細胞株の一つで あり、 Reg受容体を発現する ARIP細胞 （図 9 A、 レーン 6) も、 Reg蛋白質依存的な 様式で増殖することが報告されている (M. E. Zeni lman et al . , Gastroenterology 110， 1208 ( 1996 ) ; M. E. Zeni lman et al .， Pancreas 17, 256 ( 1998) )。 Reg受 容体 mRNAの発現は心臓では認められなかったが、 肝臓、 腎臓、 胃、 小腸、 大腸、 副腎、 下垂体および脳などでも認められ（図 9 B)、 このことから Reg-Reg受容体シ グナル系が脬 ^細胞以外のさまざまな種類の細胞における細胞増殖およびアポト 一シスの制御機構として関与する可能性が示唆された。事実、 Reg受容体を発現す る CH0細胞系は Reg蛋白質に応答して増殖した （図 7 A)。 さらに、 この CH0細胞の細 胞数は Reg蛋白質濃度に依存して増加-減少した（測定方法に関しては実施例 1 1 参照） （図 1 0 )。 産業上の利用の可能性
本発明により Regに結合する蛋白質（Reg受容体）が提供された。 Reg蛋白質は脬 臓の 5細胞の細胞増殖因子であり、 同時に上皮細胞等においても細胞増殖活性を 示すことが知られている。 Reg結合蛋白質は脬臓/?細胞において Reg蛋白質と結合 することにより細胞増殖に必要なシグナルを細胞内に伝達する働きを持っており 、 脬臓 β細胞は Reg蛋白質と Reg結合蛋白質の結合によって再生すると考えられる 。 このため、 Reg結合蛋白質の細胞外ドメインの構造を解析し、 これに結合するリ ガンドのアナログ物質を検索することにより、 生理的な脬 ?細胞の増殖を誘発す る 「糖尿病治療薬」の開発が可能である。 また、 Reg蛋白質は脬臓細胞において 細胞の過剰な増殖を引き起こさないため、 ィンスリン投与のような過剰投与によ る低血糖を発現する可能性がないと考えられる。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （a) から （i) のいずれかに記載の DNA。
(a) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。
(b) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
(c) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 Reg蛋白質と 結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(d) 配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダィズする DNAであ つて、 Reg蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(e) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードする DNA。 (f ) 配列番号： 3に記載の塩基配列のコード領域を含む DNA。
(g) 配列番号： 4に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が 置換、 欠失、 挿入、 および/または付加したアミノ酸配列からなり、 Reg蛋白質と 結合する活性を有する蛋白質をコードする DNA。
(h) 配列番号： 3に記載の塩基配列からなる DNAとハイブリダィズする DNAであ つて、 Reg蛋白質と結合する活性を有する蛋白質をコ一ドする DNA。
(i) 配列番号： 2または 4に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の部分べプチ ドをコードする DNA。
2. 請求項 1に記載の DNAによりコードされる蛋白質またはペプチド。
3. 請求項 1に記載の DNAが挿入されたべクタ一。
4. 請求項 3に記載のべクターを保持する宿主細胞。
5. 請求項 4に記載の宿主細胞を培養し、 該細胞で発現した組み換え蛋白質を 、 該培養細胞またはその培養上清から回収する工程を含む、 請求項 2に記載の蛋 白質またはぺプチドの製造方法。
6. 請求項 2に記載の蛋白質またはべプチドに対する抗体。
7. 配列番号： 1または 3に記載の塩基配列からなる DNAまたはその相補 DNAと ハイプリダイズし、 少なくとも 15塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド。
8. 請求項 2に記載の蛋白質またはぺプチドに結合する化合物のスクリーニン グ方法であって、
(a) 該蛋白質またはぺプチドに被検試料を接触させる工程、
(b) 該蛋白質またはペプチドと被検試料との結合を検出する工程、 および
(c) 該蛋白質またはペプチドに結合する化合物を選択する工程、 を含む方法。
9. 請求項 2に記載の蛋白質またはべプチドと Reg蛋白質との結合を阻害する化 合物のスクリーニング方法であって、
( a )被検試料存在下で請求項 2に記載の蛋白質またはべプチドと Reg蛋白質とを 接触させる工程、
(b)請求項 2に記載の蛋白質またはべプチドと Reg蛋白質との結合を検出するェ 程、 および
(c) 該結合を低下させる化合物を選択する工程、 を含む方法。
10. 請求項 9に記載の方法により単離されうる、 請求項 2に記載の蛋白質ま たはべプチドと Reg蛋白質との結合を阻害する化合物。
1 1. 請求項 2に記載の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達を促進また は阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a) 被検試料の存在下で請求項 2に記載の蛋白質をその表面に発現する細胞に Reg蛋白質を接触させる工程、
(b) Reg蛋白質による刺激に応答した該細胞の変化を検出する工程、 および
(c) 被検試料非存在下において検出した場合 （対照） 比較して、 該細胞の変化 を増強または抑制する化合物を選択する工程、 を含む方法。
12. 該細胞の変化が、 細胞増殖活性または細胞の DNA合成活性の変化である、 請求項 1 1に記載の方法。
13. 請求項 1 1または 1 2に記載の方法により単離されうる、 請求項 2に記 載の蛋白質の活性化により生じるシグナル伝達を促進または阻害する化合物。
1 4 . 請求項 1に記載の DNA、 請求項 2に記載の蛋白質またはペプチド、 請求項 3に記載のベクター、 請求項 6に記載の抗体、 請求項 1 0に記載の化合物、 また は請求項 1 3に記載の化合物を含む薬剤。
1 5 . Reg結合剤、 Reg蛋白質に応答した細胞内シグナル伝達の調節剤、 細胞増 殖調節剤、 DNA合成調節剤、およびアポトーシス調節剤からなる群より選択される 、 請求項 1 4に記載の薬剤。
1 6 . 糖尿病治療薬である、 請求項 1 4または 1 5に記載の薬剤。
PCT/JP2000/003764 1999-06-10 2000-06-09 Protéine se liant à reg WO2000077192A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002392514A CA2392514A1 (en) 1999-06-10 2000-06-09 Reg-binding protein
KR1020017015854A KR20020033635A (ko) 1999-06-10 2000-06-09 Ｒｅｇ 결합단백질
AU51077/00A AU777139B2 (en) 1999-06-10 2000-06-09 Reg-binding protein
EP00935616A EP1188828A4 (en) 1999-06-10 2000-06-09 REG-BINDING PROTEIN

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11/164488 1999-06-10
JP16448899 1999-06-10

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10009178 A-371-Of-International 2002-02-05
US10/866,259 Division US20040248184A1 (en) 1999-06-10 2004-06-14 Reg-binding protein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2000077192A1 true WO2000077192A1 (fr) 2000-12-21
WO2000077192A9 WO2000077192A9 (fr) 2002-01-17

Family

ID=15794125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/003764 WO2000077192A1 (fr) 1999-06-10 2000-06-09 Protéine se liant à reg

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP1188828A4 (ja)
KR (1) KR20020033635A (ja)
CN (1) CN1361822A (ja)
AU (1) AU777139B2 (ja)
CA (1) CA2392514A1 (ja)
WO (1) WO2000077192A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1408333A3 (en) * 2001-10-03 2006-10-25 Pfizer Products Inc. Diagnosis and treatment of Alzheimer's disease

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1188828A4 *
SEIICHI KOBAYASHI ET AL.: "Identification of a receptor for reg (regenerating gene) protein, a pancreatic beta-cell regeneration factor", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 15, 14 April 2000 (2000-04-14), pages 10723 - 10726, XP002931580 *
TOSHIYUKI SAITO ET AL.: "Structure, chromosomal location and expression profile of EXTR1 and EXTR2, new members of the multiple exostoses gene family", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 243, no. 1, 1998, pages 61 - 66, XP002931578 *
WIM VAN HUL ET AL.: "Identification of a third EXT-like gene (EXTL3) belonging to the EXT gene family", GENOMICS, vol. 47, no. 2, 1998, pages 230 - 237, XP002931579 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1408333A3 (en) * 2001-10-03 2006-10-25 Pfizer Products Inc. Diagnosis and treatment of Alzheimer's disease

Also Published As

Publication number Publication date
CN1361822A (zh) 2002-07-31
EP1188828A1 (en) 2002-03-20
KR20020033635A (ko) 2002-05-07
AU5107700A (en) 2001-01-02
CA2392514A1 (en) 2000-12-21
EP1188828A4 (en) 2002-11-06
WO2000077192A9 (fr) 2002-01-17
AU777139B2 (en) 2004-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5955306A (en) Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US20090136970A1 (en) Nogo receptor homologues and their use
JPH06506598A (ja) 副甲状腺ホルモンのレセプターとそれをコードしているｄｎａ
JPWO2003008446A1 (ja) 後期糖化産物受容体のシグナル伝達に関連するポリペプチド
AU2010257887B2 (en) SorCS1-like agent for use in the treatment of insulin resistance and diseases related thereto
US7972813B2 (en) Tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
WO1996018651A1 (en) Human somatostatin-like receptor
JP4476491B2 (ja) 新規膜貫通蛋白質をコードする遺伝子
CA2477534A1 (en) Cloning and characterization of slc26a6, slc26a1, and slc26a2 anion exchangers
ES2368072T3 (es) Receptor de proteínas similares a tgr3.
WO1998046748A1 (en) Therapeutic compositions and diagnostic assays for diseases involving trbp
WO2000077192A1 (fr) Protéine se liant à reg
US7749758B2 (en) Human and mammalian stem cell-derived neuron survival factors
WO2003057827A2 (en) Insulin-responsive dna binding protein-1 and methods to regulate insulin-responsive genes
JP2001526030A (ja) カドヘリン様ポリペプチド、それに関連する方法および組成物
WO1999041376A9 (en) Retinoblastoma protein complexes and retinoblastoma interacting proteins
US20040248184A1 (en) Reg-binding protein
JP2002171977A (ja) 新規なヒトｓｈ２蛋白質
JP2006166703A (ja) 軟骨分化制御遺伝子
JP2000125862A (ja) 新規な哺乳類のタンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド
US20080200408A1 (en) Deletion mutants of tetrodotoxin-resistant sodium channel alpha subunit
JP2003024075A (ja) 新規チロシンキナーゼ遺伝子及びそれにコードされるタンパク質
JP2006166704A (ja) 軟骨分化抑制遺伝子
WO2001030840A1 (fr) Nouveau polypeptide, une proteine 57 a doigt de zinc, et polynucleotide codant pour ce polypeptide
WO2001029076A1 (fr) Nouveau polypeptide, une proteine-22 humaine p24, et polynucleotide codant pour ce polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2001 503637

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020017015854

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2392514

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 51077/00

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000935616

Country of ref document: EP

AK Designated states

Kind code of ref document: C2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: C2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PUBLISHED STATEMENT CONCERNING NON-PREJUDICIAL DISCLOSURE OR EXCEPTION TO LACK OF NOVELTY, REPLACED BY CORRECT STATEMENT

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 008104654

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10009178

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000935616

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 51077/00

Country of ref document: AU