CN1618807A - 分泌蛋白及其编码序列和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类新的分泌蛋白,编码分泌蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种分泌蛋白的方法。本发明还公开了编码这类分泌蛋白的多核苷酸的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域,具体地说,本发明涉及新的编码人分泌蛋白的多核苷酸,以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
分泌蛋白在生物体具有非常重要的作用,常常与某些生理异常或疾病有关,因此一直是人们研究的重点,本领域迫切需要开发新的人分泌蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的人分泌蛋白以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的分泌蛋白,它包括:具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽选自下组:
(a)具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽;
(b)将SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有相同功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地,该多肽是具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50氨基酸序列的多肽。
在本发明的第二方面,提供编码分离的这些多肽的多核苷酸,该多核苷酸包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性,较佳地85%,更佳地95%:(a)编码上述人分泌蛋白的多核苷酸;和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或3所示氨基酸序列的多肽。
更佳地,该多核苷酸的序列是选自下组:SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有人分泌蛋白活性的多肽的方法,该方法包含:(a)在适合表达人分泌蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有人分泌蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的人分泌蛋白特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面,提供了检测样品中是否存在分泌蛋白的方法,它包括:将样品与分泌蛋白的特异性抗体接触,观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。
在本发明的第七方面,提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人分泌蛋白活性的激动剂,或者筛选抑制人分泌蛋白活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人分泌蛋白的编码序列或其片段,可被作为引物用于PCR扩增反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1是对表达的NSP019的免疫印迹检测图。
具体实施方式
在本发明中,术语“分泌蛋白”、可互换使用,都指具有人分泌蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的分泌蛋白。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的分泌蛋白或多肽”是指分泌蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化分泌蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。分泌蛋白的纯度能用氨基酸序列分析。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人分泌蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人分泌蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“人分泌蛋白”指具有人分泌蛋白活性的SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50序列的多肽。该术语还包括具有与人分泌蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人分泌蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人ZZ DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人分泌蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含人分泌蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了人分泌蛋白的可溶性片段。通常,该片段具有人分泌蛋白序列的至少约10个连续氨基酸,通常至少约30个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人分泌蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人分泌蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化,如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸,磷酸丝氨酸,磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中,“人分泌蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表 1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1-50中奇数所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1-50偶数序列所示的蛋白质,但与SEQ ID NO:1-50中奇数序列所示的编码区序列有差别的核酸序列。
在本发明中,术语“人分泌蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人分泌蛋白活性的多肽的核苷酸序列。以NSP019为例,该术语还包括能在中度严紧条件下,更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO:1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO:1中的核苷酸序列的同源性至少70%,较佳地至少80%,更佳地至少90%,最佳地至少95%的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的人ZZ相同功能的蛋白的、SEQ ID NO:1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-90个,较佳地1-60个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为10个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性(以NSP19为例)。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码分泌蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的人分泌蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或分泌蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的分泌蛋白。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码人分泌蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,人分泌蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人分泌蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et al.Molecular Cloning,a Laboratory Manual,cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人分泌蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗分泌蛋白功能低下或丧失所致的疾病,和用于筛选促进或对抗分泌蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人分泌蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人分泌蛋白功能的多肽分子。
另一方面,本发明还包括对人分泌蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,尤其是单克隆抗体。这里,“特异性”是指抗体能结合于人分泌蛋白的基因产物或片段。较佳地,指那些能与人分泌蛋白的基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人分泌蛋白的分子,也包括那些并不影响人分泌蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人分泌蛋白的基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体,而且还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab’或(Fab)2片段;抗体重链;抗体轻链;遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人,美国专利No.4,946,778);或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,纯化的人分泌蛋白的基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的,表达人分泌蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,
Nature 256;495,1975;Kohler等人,
Eur.J.Immunol.6;511,1976;Kohler等人,
Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,
In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人分泌蛋白功能的抗体以及不影响人分泌蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人分泌蛋白的基因产物的片段或功能区,通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人分泌蛋白的基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生;与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽),可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
抗人分泌蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的人分泌蛋白。
本发明中的抗体可用于治疗或预防与人分泌蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断人分泌蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人分泌蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP,攻击抗体的氨基,通过二硫键的交换,将毒素结合于抗体上,这种杂交抗体可用于杀灭人分泌蛋白阳性的细胞。
多克隆抗体的生产可用人分泌蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
利用本发明蛋白,通过各种常规筛选方法,可筛选出与分泌蛋白发生相互作用的物质,如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等,当在治疗上进行施用(给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明分泌蛋白或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的分泌蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
人分泌蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于分泌蛋白的无表达或异常/无活性的分泌蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的分泌蛋白,以抑制内源性的分泌蛋白活性。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将分泌蛋白的基因转移至细胞内。构建携带分泌蛋白的基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,et al.)。另外重组人分泌蛋白的基因可包装到脂质体中,然后再转移至细胞内。
抑制人分泌蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。
能与人分泌蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对人分泌蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测人分泌蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人分泌蛋白水平,可以用作解释人分泌蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断分泌蛋白起作用的疾病。
一种检测检测样品中是否存在分泌蛋白的方法是利用分泌蛋白的特异性抗体进行检测,它包括:将样品与分泌蛋白特异性抗体接触;观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。
分泌蛋白的多聚核苷酸可用于分泌蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,分泌蛋白的多聚核苷酸可用于检测分泌蛋白的表达与否或在疾病状态下分泌蛋白的异常表达。如分泌蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断分泌蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用分泌蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测分泌蛋白的转录产物。
检测分泌蛋白的基因的突变也可用于诊断分泌蛋白相关的疾病。分泌蛋白突变的形式包括与正常野生型分泌蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之,根据本发明分泌蛋白的cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 人分泌蛋白基因的克隆
1.mRNA的分离(mRNA isolation)
取人的脑垂体、肝癌组织、下丘脑等各种不同组织,用研钵研碎,加入盛有裂解液的50ml管,充分振荡后,再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管,抽提总RNA(TRIzol Reagents,Gibco,NY,USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量。用带Oligo d(T)的纤维素柱分离总RNA中的mRNA,定量。
3.cDNA文库的构建(Construction of cDNA library)
以mRNA为模板,合成双链cDNA,反转录引物见SEQ ID NO:1。补平末端后,加含EcoRI切点的接头,接头序列分别见SEQ ID NO:1-50中的偶数序列和3。磷酸化EcoRI末端后,用XhoI限制性内切酶消化1.5小时,再进行片段分离。过柱筛选长度>500bp的片段,用酚-氯仿抽提,乙醇沉淀,无菌水溶解,连接至Uni-ZAP XR载体(Stratagene,CA9203,USA),以Zap-cDNA Gigapack III GoldCloning Kit(Stratagene,CA9203,USA)进行包装,宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene,CA9203,USA)细菌。涂板并测定滴度。
4.测序及数据库建立(Seqencing and Database Constructing)
挑选文库中有外源片段插入的克隆,扩增后抽提质粒(Qiagen,Germany),用T3和T7作为3’端和5’端的通用引物,采用终止物荧光标记(Big-Dye,Perkin-Elmer,USA)的方法,在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer,USA)上进行EST大规模测序。测序结果用FACTURA软件去除载体序列,传输到SUN Ultra 450 Server上进行下一步的处理。所有的序列信息再用GCG软件包(Wisconsin group,USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL),将无同源性或同源性低于95%的序列视为新基因建立数据库。
5.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
在得到的新基因片段序列信息基础上,进行cDNA全长克隆,分两阶段进行:
(1)“电子克隆”(Electronic Cloning)
以新基因片段序列作为探针搜寻dbEST数据库,将重叠序列>50bp,同源性在98%以上的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,简称“EST”)序列认为同一序列(consensus sequence),取出并用AUTOASSEMBLER软件进行拼接,部分EST可以延伸探针序列。再用STRIDER软件分析被延伸的序列是否具有完整的开放阅读框架(Open Reading Frame,ORF),用BLAST搜寻Genbank或SwissProt以确定该序列在核苷酸和氨基酸水平上是否与其他物种有同源性,以帮助判别所得到的基因全长完整性如何。通过电子克隆的方法,通常可获取人分泌蛋白基因的全长序列。
(2)cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)
如果通过“电子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全长,则在已有序列的5’或3’端设计引物,在人类肝脏Marathon-Ready cDNA文库(Clontech Lab,Inc,USA)中进行长距离PCR反应。然后对PCR产物克隆、测序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER软件分析被延长的序列有无完整的ORF,如无,重复上述过程直至获得全长。
(3)RT-PCR
对于5’和3’端已知的序列,如果中间尚有一段间隙(gap)无法从已有的公共数据库或自身数据库获得,可考虑采用RT-PCR的方法。在序列5’端设计引物,3’端引物采用Oligo-dT,在肝脏总RNA库中进行扩增。然后对产物进行克隆、测序。最后拼接并获得全长。
通过组合使用上述3种方法,获得了25种人分泌蛋白的全长编码序列,它们编码的分泌蛋白如表2所示:
表2
DNA序列 | 氨基酸序列 | 克隆来源 | 备注 | |
Nsp019 | SEQIDNO:1 | SEQIDNO:2 | 人脑垂体 | 人垂体库中克隆了一个新的分泌蛋白基因,命名为NSP019。其编码241个氨基酸,在N端含有一段信号肽。生物信息学分析示其拥有一个谷胺酰胺富集区,可能起着调节转录的作用。NSP019含有5个外显子,定位与2q32。WESTERN-BLOT证实NSP019能分泌到细胞外,NORTHERN-BLOT证实其在人体广泛表达。 |
Nsp007 | SEQIDNO:3 | SEQIDNO:4 | 基因长度:1904bp,编码框长度:528bp,蛋白序列长度:177个氨基酸。该蛋白理论分子量为18.6kDa,理论等电点是5.89,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长23氨基酸的信号肽,是 |
个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。除了hypothetical protein外,没有已知的同源基因。该蛋白在小鼠里有它的对应的同源基因,这说明该基因在进化上是保守的,是真实的基因。 | ||||
nsp008 | SEQIDNO:5 | SEQIDNO:6 | 基因长度:2248bp,编码框长度:636bp,蛋白序列长度:212个氨基酸。该蛋白理论分子量为24kDa,理论等电点是5.7,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长19氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白,在GenBank的nr库里除了hypothetical protein外,没有已知的蛋白与它同源,但显而易见,该蛋白在小鼠里有它的对应的同源基因,这说明该基因在进化上是保守的,是真实的基因。同源EST分析表明,该基因在各个组织中广泛表达,在脑中有较高的表达。该蛋白在第40-135氨基酸范围内,与gnl|CDD|10416,COG0545,FkpA,FKBP-type peptidyl-prolylcis-trans isomerases 1有44.9%的同源性,而这个domain与蛋白质翻译后修饰有关,有分子伴侣的作用。基因已经克隆,荧光染色表明,该蛋白表达在COS-7细胞的胞浆里。 | |
Nsp014 | SEQIDNO:7 | SEQIDNO:8 | 肝癌组织 | 基因长度:2657bp,编码框长度:1170bp,蛋白序列长度:390个氨基酸。该蛋白理论分子量为41kDa,理论等电点是9.24,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长25氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白,在GenBank的nr库里除了hypothetical protein外,没有已知的蛋白与它同源,但显而易见,该蛋白在小鼠里有它的对应的同源基因,这说明该基因在进化上是保守的,是真实的基因。同源EST分析表明,该基因在各个组织中广泛表达,在脑中有较高的表达。该蛋白在第50-256氨基酸范围内,与gnl|CDD|9938/COG0063/Predicted sugar kinase domain有69.7%的同源性,而这个domain与糖类的转运的代谢有关。 |
Nsp015 | SEQIDNO:9 | SEQIDNO:10 | 基因长度:1718bp,编码框长度:1260bp,蛋白序列长度:420个氨基酸。该蛋白理论分子量为47kDa,理论等电点是8.89,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长21氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白,含有一个gnl|CDD|10437,COG0566,SpoU,rRNA methylases的domain,该domain与翻译,核糖体结构有关。该蛋白在小鼠里有它的对应的同源基因,这说明该基因在进化上是保守的,是真实的基因。 | |
Nsp016 | SEQIDNO:11 | SEQIDNO:12 | 基因长度:1885bp,编码框长度:1734bp,蛋白序列长度:578个氨基酸。该蛋白理论分子量为65kDa,理论等电点是5.16,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长21氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白,含有一个gnl|CDD|9328,pfam01532,Glyco_hydro_47,Glycosyl hydrolase family 47的domain,该domain的功能是催化水解N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)上的alpha-D甘露糖残基。基因位于第20号染色体。该蛋白在小鼠里有它的对应的同源基因,这说明该基因在进化上是保守的,是真实的基因。 | |
Nsp010 | SEQIDNO:13 | SEQIDNO:14 | 基因长度:1683bp,编码框长度:729bp,蛋白序列长度:243个氨基酸。该蛋白理论分子量为26.6kDa,理论等电点是4.98,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长17氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。除了hypothetical protein外,没有已知的同源基因。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp011 | SEQID | SEQID | 基因长度:1196bp,编码框长度:888bp,蛋白序列长度:296个氨基酸。该蛋白理论分子量为31.2kDa,理论等电点是9.8,是一种 |
NO:15 | NO:16 | 碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长30氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。除了hypothetical protein外,没有已知的同源基因。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | ||
Nsp022 | SEQIDNO:17 | SEQIDNO:18 | 基因长度:441bp,编码框长度:285bp,蛋白序列长度:95个氨基酸。该蛋白理论分子量为10.46kDa,理论等电点是4.7,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长23氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。它与大鼠的pir||S17449 probableligandbinding protein RYD5基因有74%的同源性。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp023 | SEQIDNO:19 | SEQIDNO:20 | 基因长度:473bp,编码框长度:306bp,蛋白序列长度:102个氨基酸。该蛋白理论分子量为10.28kDa,理论等电点是4.26,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长19氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。在公共数据库中尚没有同源蛋白。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
Nsp024 | SEQIDNO:21 | SEQIDNO:22 | 基因长度:525bp,编码框长度:279bp,蛋白序列长度:93个氨基酸。该蛋白理论分子量为10.16kDa,理论等电点是6.71,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长21氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。在公共数据库中尚没有同源蛋白。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
Nsp025 | SEQIDNO:23 | SEQIDNO:24 | 基因长度:436bp,编码框长度:363bp,蛋白序列长度:121个氨基酸。该蛋白理论分子量为13.89kDa,理论等电点是4.1,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长16氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。与公共数据库中dbj|BAB15579.1|(AK026874)unnamed protein product[Homosapiens]有很少的同源性。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp026 | SEQIDNO:25 | SEQIDNO:26 | 基因长度:501bp,编码框长度:273bp,蛋白序列长度:91个氨基酸。该蛋白理论分子量为9.4kDa,理论等电点是10.2,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长24氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp027 | SEQIDNO:27 | SEQIDNO:28 | 基因长度:819bp,编码框长度:387bp,蛋白序列长度:129个氨基酸。该蛋白理论分子量为15kDa,理论等电点是8.31,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长22氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp028 | SEQIDNO:29 | SEQIDNO:30 | 基因长度:754bp,编码框长度:276bp,蛋白序列长度:92个氨基酸。该蛋白理论分子量为10.79kDa,理论等电点是7.68,是一种中性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长24氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | |
Nsp029 | SEQIDNO:31 | SEQIDNO:32 | 基因长度:1107bp,编码框长度:300bp,蛋白序列长度:100个氨基酸。该蛋白理论分子量为11.5kDa,理论等电点是9.7,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长28氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | |
Nsp030 | SEQID | SEQID | 基因长度:333bp,编码框长度:294bp,蛋白序列长度:98个氨基酸。该蛋白理论分子量为10.87kDa,理论等电点是9.86,是一 |
NO:33 | NO:34 | 种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长30氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | ||
nsp031 | SEQIDNO:35 | SEQIDNO:36 | 基因长度:723bp,编码框长度:366bp,蛋白序列长度:122个氨基酸。该蛋白理论分子量为13.5kDa,理论等电点是5.85,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长28氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | |
nsp032 | SEQIDNO:37 | SEQIDNO:38 | 基因长度:758bp,编码框长度:258bp,蛋白序列长度:86个氨基酸。该蛋白理论分子量为9.8kDa,理论等电点是10.6,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长17氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。 | |
Sp5 | SEQIDNO:39 | SEQIDNO:40 | 基因长度:3294bp,编码框长度:1452bp,蛋白序列长度:483个氨基酸。该基因在本中心所对应的克隆为:DCBCUF06。该蛋白理论分子量为55816Da,理论等电点是10.3,4.59,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长20氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。已克隆。 | |
Nsp018 | SEQIDNO:41 | SEQIDNO:42 | 基因长度:1873bp,编码框长度:620bp,蛋白序列长度:204个氨基酸。该基因在本中心所对应的克隆为:cdABFB09。该蛋白理论分子量为23088Da,理论等电点是10.4,9.81,是一种碱性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长23氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。已克隆。荧光定位表达在胞浆内。 | |
Nsp020 | SEQIDNO:43 | SEQIDNO:44 | 基因长度:975bp,编码框长度:252bp,蛋白序列长度:84个氨基酸。该基因在本中心所对应的克隆为:DCBAMA12。该蛋白理论分子量为9051Da,理论等电点是10.6,6,是一种酸性蛋白质,经预测,它的N-端含有一个长20氨基酸的信号肽,是个分泌蛋白。该蛋白是个全新的蛋白。该蛋白分子量偏小,可能为一种未知的细胞因子。已克隆。 | |
Holf44 | SEQIDNO:45 | SEQIDNO:46 | HOLF44是其中被用生物学实验证实的分泌蛋白之一。经生物信息学分析,HOLF44蛋白N端1到22为信号肽,135到401为OLF(Olfactomedin-like)Domain,是一个新的OLF家族蛋白,该族蛋白多为分泌蛋白,主要参与中枢神经系统的发育;此外,HOLF44蛋白含有2个N-糖基化位点,5个PKC磷酸化位点。试验表明,HOLF44为分泌蛋白。 | |
Mandaselin-long-form | SEQIDNO:47 | SEQIDNO:48 | 胎儿的下丘脑 | 生物信息学分析,Mandaselin-long-form蛋白N端1到22为信号肽,该蛋白含有1个N-糖基化位点。可能的生物学功能:甘露糖苷酶(endo-alpha-D-mannosidase) |
Mandaselin-short-form | SEQIDNO:49 | SEQIDNO:50 | 胎儿的下丘脑 | 该基因是Mandaselin-long-form基因经过不同的剪接方式而形成的。经生物信息学分析,Mandaselin-short-form蛋白N端1到22为信号肽。可能的生物学功能:甘露糖苷酶(endo-alpha-D-mannosidase) |
实施例2 人分泌蛋白的制备和提纯
在该实施例中,将全长的人分泌蛋白编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中,以表达和提纯重组蛋白。
1.将人分泌蛋白以GST融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建,以及转化大肠杆菌
根据人分泌蛋白的全长编码序列,设计扩增出完整编码阅读框的引物(分别对应于编码序列5’和3’端的约20个以上核苷酸),并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pGEX-2T载体而定),以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板,经PGR扩增后,将人分泌蛋白基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pGEX-2T载体(Pharmacia,Piscataway,NJ)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌DH5α,筛选鉴定得到含有pGEX-2T-分泌蛋白表达载体的工程菌DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白。
表达GST-分泌蛋白重组蛋白的工程菌的分离鉴定
挑取单菌落的DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜,按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时,至OD600达0.5后,加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0,1,2,3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心,在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl,蒸馏水45μl,二巯基乙醇5μl),混悬细菌沉淀,沸水浴中煮5分钟,10000rpm离心1分钟,上清加入12%SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达GST-分泌蛋白融合蛋白的工程菌。
GST-分泌蛋白融合蛋白的提取纯化
按上述方法诱导表达GST-分泌蛋白融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-分泌蛋白。诱导后的细菌离心沉淀,按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌,超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50%谷胱苷肽Sepharose 4B,37℃振摇结合30分钟,10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-分泌蛋白的谷胱苷肽Sepharose 4B,弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次,而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液,室温置10分钟,10000rpm离心10分钟,上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃,并进行SDS-PAGE电泳,检测纯化效果。获得人分泌蛋白(SEQ ID NO:1-50中的偶数序列)。
实施例3 人分泌蛋白或多肽在人胚肾293细胞中进行真核细胞表达
1.人分泌蛋白杆状病毒表达载体的构建及转染293细胞株
根据人分泌蛋白的全长编码序列,设计扩增出完整编码阅读框的引物,并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定),以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板,经PCR扩增后,将人分泌蛋白cDNA在保证阅读框架的前提下克隆至pcDNA3.1A载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)。鉴定好的表达载体3μg,pcDNA3.1A DNA(BaCuloGoldTM ACMNPV DNA,Pharmingen,SanDiego,CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL,NY)25μl,加入1ml无血清的DMEM培养基中,振荡15秒混匀,室温孵育15分钟备用。取1ml(2×106)293细胞悬液于60mm组织培养板中,贴壁1小时后换转染培养基,室温孵育15分钟后弃培养基,加入前面制备好的DNA载体转染混合物,Parafilm密封培养板,于室温27℃振摇培养4小时,而后换完全培养基培养3天,收集上清备用。
2.转入重组表达载体的293细胞株的筛选鉴定
转染3天后的293细胞进行Western鉴定。将细胞裂解后进行SDS-PAGE电泳,电泳后的胶于Pharmacia的Multiphor II半干电转移仪中将蛋白质转印到硝酸纤维膜上,将硝酸纤维膜置于封闭液中封闭1小时,而后于抗人分泌蛋白的抗体溶液中封闭1小时,TBS液振摇清洗5分钟共2次,而后将膜置于生物素标记的抗人分泌蛋白一抗的第二抗体溶液中振摇1小时,TBS清洗,加入亲和素-碱性磷酸酶复合物反应30分钟,TBS清洗2次,加入新鲜配制的显色液显色观察蛋白条带。
挑取高表达人分泌蛋白的293细胞克隆。
3.人分泌蛋白的提取纯化
用高表达人分泌蛋白的Sf9细胞克隆收集细胞,PBS洗涤。每2×108细胞加入20ml细胞裂解液(0.5%Triton X-100,20mM Na3PO4(磷酸钠,pH7.8),500mMNaCl,1mM Na3VO4(钒酸钠),1mM Pefabloc,1μg/ml胃蛋白酶抑制剂,亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破细胞,12000×g离心20min去除细胞碎片,上清按每2×108的细胞加入2ml NTA-琼脂糖(Qiagen,Germany),4℃吸附1小时。而后用含100nM咪唑的His缓冲液洗涤两次,用含20mM N,N’-二哌嗪,500mM NaCl,300mM咪唑的缓冲液洗脱以得到纯化的蛋白。洗脱液保存于4℃,并进行SDS-PAGE电泳检测提取的人分泌蛋白的纯度。得到各人分泌蛋白(SEQ ID NO:1-50中的偶数序列)。
NSP019的表达电泳图见图1,表明其被分泌于细胞外。对于其他蛋白获得的结果列于表2。
实施例4 抗人分泌蛋白抗体的制备
1.免疫小鼠和脾细胞的制备:将实施例2和3制备的本发明SEQ ID NO:1-50中的偶数序列所示的分泌蛋白用层析法进行分离后备用,也可以用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离,将电泳条带从凝胶中割下,并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。取6-8周龄Balb/C雌鼠,用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白,对小鼠进行腹膜内注射。14天后,用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量再加强免疫一次,3-5天后用于融合。其中,脾细胞制备见鄂征主编,《组织培养和分子细胞学技术》,北京出版社,第210页。
2.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上),第371页中的方法,制备饲养细胞。
3.按《组织培养和分子细胞学技术》(同上),第213页中的方法,进行细胞融合。
4.抗体的检测:在细胞融合10-15天后,需逐孔进行检查,一旦发现旺盛的杂交细胞集落生长,就应用人分泌蛋白做抗体活性的初步筛选,常用的方法有:免疫荧光试验、发射免疫试验(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。检查出抗体活性的孔后,立刻进行克隆培养,并分离出抗体。
获得的抗体的特异反应活性用它在体外沉淀对应分泌蛋白的能力加以评估。结果发现,抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海人类基因组研究中心
<120>人分泌蛋白及其编码序列
<130>035910
<160>50
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>5716
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
cgagcgagcg ggcgctgcca ggagcccgca gccctggcgc ccgccgccgc ccggagcccc 60
gcaatatgcc gccgcggccc tctggctcta ggccatggcg aggctctgcc ggcgtgtccc 120
ctgcaccctg cttctcggcc tggccgtggt gctgctgaaa gcgcggctgg tccccgcggc 180
cgccagagcg gaactcagcc gctccgacct cagcctcatc caacagcagc agcagcagca 240
gcagcagcaa caacaacaac aacagcaaaa gcagctggag gaggctgagg aggagaggac 300
agaggtgcct ggggcaacct ccaccttgac ggttccagtg tctgtattta tgttgaaagt 360
ccaggtgaat gacatcatca gtcgtcagta cctgagccaa gcagttgtag aagtgtttgt 420
aaactacacg aagacaaatt ccacagtaac taaaagcaat ggagcagtgc tgataaaagt 480
accctacaaa ttaggactta gtttaactat tattgcttac aaagatggct acgtgttgac 540
ccctctgcct tggaaaacca gaagaatgcc aatatattca tcagttacac tttcactgtt 600
cccgcaaagc caagcaaata tatggctatt tgaagacact gttttaatta ctggaaaatt 660
agctgatgcc aagtctcaac caagtgttca gttttcaaaa gccttaatta aacttcctga 720
caaccatcat attagcaacg ttactggcta tcttacagtt ctacaacagt ttttgaaagt 780
ggacaatttt ctgcatacaa ctggaattac tctcaataaa ccaggttttg aaaacattga 840
attgactcct cttgctgcaa tatgtgtgaa aatatattct ggaggaaaag aactaaaggt 900
caatggctct attcaagttt ctcttcctct tctacgtctg aatgatataa gtgcagggga 960
tcgcatacct gcttggacat ttgatatgaa cacaggtgct tgggtaaatc atggtcgggg 1020
aatggtcaag gaacataaca atcatttaat ctggacatat gatgcaccac atttggggta 1080
ctggatagca gctccacttc caggaactag aggttcaggt ataaatgaag attccaagga 1140
cataactgcc taccacacag tgtttcttac agccatatta ggaggaacaa tagtcattgt 1200
cattggattt tttgctgtac tactttgtta ttgcagggac aagtgtggta ctccacagaa 1260
aagagaaaga aatatcacta aacttgaggt cctcaagaga gaccagacaa cttcaacaac 1320
acacataaat catatcagta cagttaaagt tgcattaaaa gctgaggaca agtcgcagtt 1380
attcaatgcc aaaaactcct catatagtcc tcagaaaaag gaaccatcaa aggcagaaac 1440
agaagaaaga gtttccatgg taaaaactcg ggacgatttt aaaatctaca atgaagatgt 1500
ttcatttcta tcagtcaatc aaaataatta ctcaagaaac ccaacacagt ctttggagcc 1560
caatgtaggg tccaaacaac ctaaacatat taacaacaat ctatcttcat ctctaggtga 1620
tgctcaagat gaaaagaggt atctcacagg taatgaggag gcgtatgggc gttcccatat 1680
tcctgaacag cttatgcata tttacagcca acccattgcc atccttcaaa catctgacct 1740
tttctccaca ccggaacaat tacatactgc taagtcagct actttgccaa gaaagggaca 1800
gttagtctat ggccaattga tggaaccagt aaatcgagag aactttacgc agaccttgcc 1860
caaaatgcca attcattctc atgcacagcc cccagatgcc agggaagagg atatcatact 1920
tgaaggtcaa cagagcctgc catcccaggc ttcagattgg agccgatact caagcagctt 1980
actggaatcc gtctctgttc ctggaacact aaatgaggct gttgtaatga ctccattttc 2040
atcggaactt caaggaattt cagaacagac cctcctggag ctgtccaaag gaaagccctc 2100
cccgcatccc agagcctggt ttgtgtctct tgatggaaag ccagttgcac aagtgaggca 2160
ctcctttata gacctgaaaa agggcaagag aacccagagc aatgacacca gtctggactc 2220
tggggtggac atgaatgagc ttcactcaag tagaaagctc gagagggaga aaacattcat 2280
caaaagcatg catcagccca agatccttta cttagaagat ttagacctaa gcagcagtga 2340
gagtggaacc accgtctgtt cccctgagga cccagcttta aggcacatcc tagatggagg 2400
gagtggagtg atcatggagc accctggaga agagtcgcca ggaaggaaaa gcactgttga 2460
agattttgaa gctaatacat cccccactaa aagaaggggc agaccaccac tagccaaaag 2520
agatagcaag actaacatct ggaagaagcg agaggaacgc ccactgattc ccataaatta 2580
actccaatgg ggattgtgtg tctgctgtct cgtgctgttt attcttgctt cttgttgtaa 2640
attgcagtac gaacttaaga aaatgagact gagcaatctc atggttcttg gacatgtctc 2700
aagcagagta aatggtaatt cagtaatcag agagaaagat accaaggaat gctttttctg 2760
gcctattcat ttatttttgg gtgatgaatt tacagtatct aagttttcaa aatgtaaaat 2820
agcttcaaga tgttagttat ctgaaaatgt tgctcagcca gccagtttgg ccttgactct 2880
cttaagaata acagtgaaat atatactcct caagttgcct ccaaaaatgt tgcctctacc 2940
atggtgacta ccccatggaa catttagaaa caaaactgac ttcaggcatc atattatttt 3000
aaatgttact attacgtctt cttctgccta tacttaaaaa taacttgata aatgacttgg 3060
actgatgtta ctctggagtt atcacaaaga aaatgttgtt tggtctttaa agagcatgtg 3120
tattgtatca tcccaaacgt aaatcctaca tttatataag atgggcaaga agctacttgg 3180
tcattagaga gggagacacc agctctttgg ttgtttttgg atataacttt acaaaataag 3240
taagatgtta atttagaaat ttgagaaatt aatgctctaa tactgagttt ttatttaaaa 3300
attatttttt cttcccctca acaatgaagc aagcttagct gtcaagggaa actttttaca 3360
aatctgaaaa aaacaatcta tgactttggt ttaaggctca ctgatacttt taggctaaat 3420
tggttttaat atatttcttc tattctaaaa acctgaactc agtcacttaa aggctatgaa 3480
atttaaaaaa aaagtcgatg tgaaagtttc ttttgaacac taaaataaaa tatgtgcaga 3540
taaaatatac attgatttgt ttttcttaaa tgttgatgag aagaaaaaga gatgccattt 3600
tcctgaggct caaaaatacc ttcaggatag ttgtatatcc agttattgat tttcttaaaa 3660
gatgtgtaag gaaaacagtt tcaatttcag gggaaaagta aaagtttttc cctaagtcac 3720
ttaaagcctt tgcaacttct tttttcagtt ttgtaagtaa tatatctatg ttcttttcat 3780
tatagcaagc attcaatgtg aacaactttt taattaactc tgaattacca ttcatacatc 3840
ctaaaaataa aagctcgtta ttcattaaaa tcaactgatc ccatttttct taaaatttcc 3900
ctgaaggcaa atgtctgaag cacctttccc ttgtgggggt aaaaatccta aattgcttta 3960
tttttcattc cctcctattc aacatgggag cagcatagag acccaaacca tgtaaacaag 4020
ttcagtgaac caaaacagcc acattagctt cagtaaaatt atagctagat gtgcaatttt 4080
ttcctccaac ttctaacgtg tcaaataacc ttcctactgt tctgtgttaa ctgaaagaac 4140
ataaagaccc taggcaaata tttgctatat attaccccaa tccatagaag aaataatgtt 4200
ttgggtaata cctaggcttc cttttttttt tttttttttt ttttttagtg ataaggctca 4260
taacaattaa ttagagaagg cttcttattg gtcttacaca gaaagataca tcaaaagcag 4320
catgactcaa aatgatttgg aaaaggttaa agttagtgct ctgctgaagt gcctttgata 4380
tagacttgca ttattagaag gatataacat cttttttaag tgtgcatttt ctttcagtta 4440
accaaattaa acagatgtgc agttttatta aaaatataga cctagtgttt catgttggaa 4500
caataaatat tgcatgtgag tagtatttct tgttttttga atacagtata tattgataaa 4560
ttgtttatgt tggaatgaag ttagaaacta tatagcaaaa cattatattt taagtgttta 4620
tttttcccac ctttaaataa aaatgtttca tctcagcttg gtaatgaaat acacatattg 4680
gtataagggt ataccattca ggtatgccac ttattttatt catttttgtg taagggaaat 4740
gagatgatgt atcccaaggg cttttctaga actacttgtt tgctttcaga ataaaacctt 4800
attatttttt acactgcaca tgctgttctc aattggtaat tataggcaat ttatcttttc 4860
taatgatcaa aagagtgtga cttctcattt gtgagtagtt cacaaatttc ctgttaaaaa 4920
gctgaaacca tctacttttt cttaacccaa gtgataataa acaatattca caactttctt 4980
aaatttttaa attgaaaacc aaggtttttt caaatataaa cctagatgat tttggtcaca 5040
aattgttaac atttgtcgat cctttgtata tactttggat atatattaaa ggcaaaacta 5100
tctcttgact aactgatgga ttcatttact aaagcacagc tgtatgtatt tttgaataca 5160
tattatgatc ttgagacttt ataaatcaat ttttatgact ttatgcagtt gtatagggat 5220
tatgcccttt cagttctata gggattatgc ccttttataa tacataatat accacagaga 5280
ttacaaatgt tgaggaatga aagcacttct ttgctttggc aatcattttc agaccactat 5340
gtgtttgaat cctctggtat caatacgtat tatagggttt tagagatctg tgggtcaaat 5400
gatgtccctc aaaacttcct aaaaaggtga agctcaaagt cacacattct tataaggcgc 5460
atgagtttct cattttccca tgtacgagca ttgtaaagga attcagctgt attaatttct 5520
atttcagatc tagaattgac attttgcctt cttgtttcca ggtgtttcta ttttttgtat 5580
tctttcagag aaatctcata tttcggtgta tttattgctg ttactactat atttactgct 5640
gaaaactgta acaacctgaa gatttgtaaa atgttaaaca tagttcatta aaaataataa 5700
aataaatcta aaatgt 5716
<210>2
<211>241
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ala Arg Leu Cys Arg Arg Val Pro Cys Thr Leu Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Leu Leu Lys Ala Arg Leu Val Pro Ala Ala Ala Arg Ala
20 25 30
Glu Leu Ser Arg Ser Asp Leu Ser Leu Ile Gln Gln Gln Gln Gln Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Gln Leu Glu Glu Ala
50 55 60
Glu Glu Glu Arg Thr Glu Val Pro Gly Ala Thr Ser Thr Leu Thr Val
65 70 75 80
Pro Val Ser Val Phe Met Leu Lys Val Gln Val Asn Asp Ile Ile Ser
85 90 95
Arg Gln Tyr Leu Ser Gln Ala Val Val Glu Val Phe Val Asn Tyr Thr
100 105 110
Lys Thr Asn Ser Thr Val Thr Lys Ser Asn Gly Ala Val Leu Ile Lys
115 120 125
Val Pro Tyr Lys Leu Gly Leu Ser Leu Thr Ile Ile Ala Tyr Lys Asp
130 135 140
Gly Tyr Val Leu Thr Pro Leu Pro Trp Lys Thr Arg Arg Met Pro Ile
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Val Thr Leu Ser Leu Phe Pro Gln Ser Gln Ala Asn Ile
165 170 175
Trp Leu Phe Glu Asp Thr Val Leu Ile Thr Gly Lys Leu Ala Asp Ala
180 185 190
Lys Ser Gln Pro Ser Val Gln Phe Ser Lys Ala Leu Ile Lys Leu Pro
195 200 205
Asp Asn His His Ile Ser Asn Val Thr Gly Tyr Leu Thr Val Leu Gln
210 215 220
Gln Phe Leu Lys Val Asp Asn Phe Leu His Thr Thr Gly Asn Tyr Ser
225 230 235 240
Gln
<210>3
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
ggaagggagg gagcgaaggt aggaggcagg gcttgcctca ctggccaccc tcccaacccc 60
aagagcccag ccccatggtc cccgccgccg gcgcgctgct gtgggtcctg ctgctgaatc 120
tgggtccccg ggcggcgggg gcccaaggcc tgacccagac tccgaccgaa atgcagcggg 180
tcagtttacg ctttgggggc cccatgaccc gcagctaccg gagcaccgcc cggactggtc 240
ttccccggaa gacaaggata atcctagagg acgagaatga tgccatggcc gacgccgacc 300
gcctggctgg accagcggct gccgagctct tggccgccac ggtgtccacc ggctttagcc 360
ggtcgtccgc cattaacgag gaggatgggt cttcagaaga gggggttgtg attaatgccg 420
gaaaggatag caccagcaga gagcttccca gtgcgactcc caatacagcg gggagttcca 480
gcacgaggtt tatagccaat agtcaggagc ctgaaatcag gctgacttca agcctgccgc 540
gctcccccgg gaggtctact gaggacctgc catgccatct cctgaggatc tgcggctggt 600
gctgatgccc tttccgggcg ccttcgagtt ggggcgctga gccagctccg cacggagcac 660
aagccttgca cctatcaaca atgtccctgc aaccgacttc gggaagagtg ccccctggac 720
acaagtctct gtactgacac caactgtgcc tctcagagca ccaccagtac caggaccacc 780
actaccccct tccccaccat ccacctcaga agcagtccca gcctgccacc cgccagcccc 840
tgcccagccc tggctttttg gaaacgggtc aggattggcc tggaggatat ttggaatagc 900
ctctcttcag tgttcacaga gatgcaacca atagacagaa accagaggta atggccactt 960
catccacatg aggagatgtc agtatctcaa cctctcttgc cctttcaatc ctagcgccca 1020
ctag 1024
<210>4
<211>176
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Met Val Pro Ala Ala Gly Ala Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Asn Leu
1 5 10 15
Gly Pro Arg Ala Ala Gly Ala Gln Gly Leu Thr Gln Thr Pro Thr Glu
20 25 30
Met Gln Arg Val Ser Leu Arg Phe Gly Gly Pro Met Thr Arg Ser Tyr
35 40 45
Arg Ser Thr Ala Arg Thr Gly Leu Pro Arg Lys Thr Arg Ile Ile Leu
50 55 60
Glu Asp Glu Asn Asp Ala Met Ala Asp Ala Asp Arg Leu Ala Gly Pro
65 70 75 80
Ala Ala Ala Glu Leu Leu Ala Ala Thr Val Ser Thr Gly Phe Ser Arg
85 90 95
Ser Ser Ala Ile Asn Glu Glu Asp Gly Ser Ser Glu Glu Gly Val Val
100 105 110
Ile Asn Ala Gly Lys Asp Ser Thr Ser Arg Glu Leu Pro Ser Ala Thr
115 120 125
Pro Asn Thr Ala Gly Ser Ser Ser Thr Arg Phe Ile Ala Asn Ser Gln
130 135 140
Glu Pro Glu Ile Arg Leu Thr Ser Ser Leu Pro Arg Ser Pro Gly Arg
145 150 155 160
Ser Thr Glu Asp Leu Pro Cys His Leu Leu Arg Ile Cys Gly Trp Cys
165 170 175
<210>5
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
aacaatgtgc cacgtcttct aagaaggggg agtcctgaac ttgtctgaag cccttgtccg 60
taagccttga actacgttct taaatctatg aagtcgaggg acctttcgct gcttttgtag 120
ggacttcttt ccttgcttca gcaacatgag gcttttcttg tggaacgcgg tcttgactct 180
gttcgtcact tctttgattg gggctttgat ccctgaacca gaagtgaaaa ttgaagttct 240
ccagaagcca ttcatctgcc atcgcaagac caaaggaggg gatttgatgt tggtccacta 300
tgaaggctac ttagaaaagg acggctcctt atttcactcc actcacaaac ataacaatgg 360
tcagcccatt tggtttaccc tgggcatcct ggaggctctc aaaggttggg accagggctt 420
gaaaggaatg tgtgtaggag agaagagaaa gctcatcatt cctcctgctc tgggctatgg 480
aaaagaagga aaaggtaaaa ttcccccaga aagtacactg atatttaata ttgatctcct 540
ggagattcga aatggaccaa gatcccatga atcattccaa gaaatggatc ttaatgatga 600
ctggaaactc tctaaagatg aggttaaagc atatttaaag aaggagtttg aaaaacatgg 660
tgcggtggtg aatgaaagtc atcatgatgc tttggtggag gatatttttg ataaagaaga 720
tgaagacaaa gatgggttta tatctgccag agaatttaca tataaacacg atgagttata 780
gagatacatc taccctttta atatagcact catctttcaa gagagggcag tcatctttaa 840
agaacatttt atttttatac aatgttcttt cttgctttgt tttttatttt tatatatttt 900
ttctgactcc tatttaaaga accccttagg tttctaagta cccatttctt tctgataagt 960
tattgggaag aaaaagctaa ttggtctttg aatagaagac ttctggacaa tttttcactt 1020
tcac 1024
<210>6
<211>211
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Met Arg Leu Phe Leu Trp Asn Ala Val Leu Thr Leu Phe Val Thr Ser
1 5 10 15
Leu Ile Gly Ala Leu Ile Pro Glu Pro Glu Val Lys Ile Glu Val Leu
20 25 30
Gln Lys Pro Phe Ile Cys His Arg Lys Thr Lys Gly Gly Asp Leu Met
35 40 45
Leu Val His Tyr Glu Gly Tyr Leu Glu Lys Asp Gly Ser Leu Phe His
50 55 60
Ser Thr His Lys His Asn Asn Gly Gln Pro Ile Trp Phe Thr Leu Gly
65 70 75 80
Ile Leu Glu Ala Leu Lys Gly Trp Asp Gln Gly Leu Lys Gly Met Cys
85 90 95
Val Gly Glu Lys Arg Lys Leu Ile Ile Pro Pro Ala Leu Gly Tyr Gly
100 105 110
Lys Glu Gly Lys Gly Lys Ile Pro Pro Glu Ser Thr Leu Ile Phe Asn
115 120 125
Ile Asp Leu Leu Glu Ile Arg Asn Gly Pro Arg Ser His Glu Ser Phe
130 135 140
Gln Glu Met Asp Leu Asn Asp Asp Trp Lys Leu Ser Lys Asp Glu Val
145 150 155 160
Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Glu Phe Glu Lys His Gly Ala Val Val Asn
165 170 175
Glu Ser His His Asp Ala Leu Val Glu Asp Ile Phe Asp Lys Glu Asp
180 185 190
Glu Asp Lys Asp Gly Phe Ile Ser Ala Arg Glu Phe Thr Tyr Lys His
195 200 205
Asp Glu Leu
210
<210>7
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
catttggccc ggggatggtc acacgcgcgg gggccggaac tgccgtcgcc ggcgcggtcg 60
ttgtcgcatt gctctcggcc gcactcgcgc tgtacgggcc gccactggac gcagttttag 120
aaagagcgtt ttcgctacgt aaagcacatt cgataaagga tatggaaaat actttgcagc 180
tggtgagaaa tatcatacct cctctgtctt ccacaaagca caaagggcaa gatggaagaa 240
taggcgtagt tggaggctgt caggagtaca ctggagcccc atattttgca gcaatctcag 300
ctctcaaagt gggcgcagac ttgtcccacg tgttctgtgc cagtgcggcc gcacctgtga 360
ttaaggccta cagcccggag ctgatcgtcc acccagttct tgacagcccc aatgctgttc 420
atgaggtgga gaagtggctg ccccggctgc atgctcttgt cgtaggacct ggcttgggta 480
gagatgatgc gcttctcaga aatgtccagg gcattttgga agtgtcaaag gccagggaca 540
tccctgttgt catcgacgcg gatggcctgt ggctggtcgc tcagcagccg gccctcatcc 600
atggctaccg gaaggctgtg ctcactccca accacgtgga gttcagcaga ctgtatgacg 660
ctgtgctcag aggccctatg gacagcgatg acagccatgg atctgtgcta agactcagcc 720
aagccctggg caacgtgacg gtggtccaga aaggagagcg cgacatcctc tccaacggcc 780
agcaggtgct tgtgtgcagc caggaaggca gcagccgcag gtgtggaggg caaggggacc 840
tcctgtcggg ctccctgggc gtcctggtac actgggcgct ccttgctgga ccacagaaaa 900
caaatggggg catatcagac ttgaaattga caatttgggg tcctgagatt gaaacaggag 960
tcaaaaccag agcccagggt agctgcggcc cccggaccac gacgcccact tccccacacc 1020
tcct 1024
<210>8
<211>390
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Met Val Thr Arg Ala Gly Ala Gly Thr Ala Val Ala Gly Ala Val Val
1 5 10 15
Val Ala Leu Leu Ser Ala Ala Leu Ala Leu Tyr Gly Pro Pro Leu Asp
20 25 30
Ala Val Leu Glu Arg Ala Phe Ser Leu Arg Lys Ala His Ser Ile Lys
35 40 45
Asp Met Glu Asn Thr Leu Gln Leu Val Arg Asn Ile Ile Pro Pro Leu
50 55 60
Ser Ser Thr Lys His Lys Gly Gln Asp Gly Arg Ile Gly Val Val Gly
65 70 75 80
Gly Cys Gln Glu Tyr Thr Gly Ala Pro Tyr Phe Ala Ala Ile Ser Ala
85 90 95
Leu Lys Val Gly Ala Asp Leu Ser His Val Phe Cys Ala Ser Ala Ala
100 105 110
Ala Pro Val Ile Lys Ala Tyr Ser Pro Glu Leu Ile Val His Pro Val
115 120 125
Leu Asp Ser Pro Asn Ala Val His Glu Val Glu Lys Trp Leu Pro Arg
130 135 140
Leu His Ala Leu Val Val Gly Pro Gly Leu Gly Arg Asp Asp Ala Leu
145 150 155 160
Leu Arg Asn Val Gln Gly Ile Leu Glu Val Ser Lys Ala Arg Asp Ile
165 170 175
Pro Val Val Ile Asp Ala Asp Gly Leu Trp Leu Val Ala Gln Gln Pro
180 185 190
Ala Leu Ile His Gly Tyr Arg Lys Ala Val Leu Thr Pro Asn His Val
195 200 205
Glu Phe Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Val Leu Arg Gly Pro Met Asp Ser
210 215 220
Asp Asp Ser His Gly Ser Val Leu Arg Leu Ser Gln Ala Leu Gly Asn
225 230 235 240
Val Thr Val Val Gln Lys Gly Glu Arg Asp Ile Leu Ser Asn Gly Gln
245 250 255
Gln Val Leu Val Cys Ser Gln Glu Gly Ser Ser Arg Arg Cys Gly Gly
260 265 270
Gln Gly Asp Leu Leu Ser Gly Ser Leu Gly Val Leu Val His Trp Ala
275 280 285
Leu Leu Ala Gly Pro Gln Lys Thr Asn Gly Gly Ile Ser Asp Leu Lys
290 295 300
Leu Thr Ile Trp Gly Pro Glu Ile Glu Thr Gly Val Lys Thr Arg Ala
305 310 315 320
Gln Gly Ser Cys Gly Pro Arg Thr Thr Thr Pro Thr Ser Pro His Leu
325 330 335
Leu Leu Ser Pro Ser Pro Gln Val Gln Pro Ser Pro Gly Gly Arg Val
340 345 350
Trp Arg Leu Leu Ser His Gln Ala Val Gln Pro Pro Ser Leu Pro Glu
355 360 365
Ala Arg Ser Leu His His His Leu Arg His Asp Arg Arg Gly Gly Gly
370 375 380
Arg Leu Gln Gln Ala Leu
385 390
<210>9
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
gtgacgcagc ccgggtctca gggaacatgg cggcgctggt gagacccgcg aggtttgtcg 60
tgcgaccgtt gctgcaggtg gtccaggctt gggaccttga cgcgaggcgc tgggtccggg 120
cgctgcggcg gagcccagtg aaagtggtgt ttccttccgg agaggtggtg gaacagaagc 180
gcgctcctgg gaagcagccc cgcaaggcac catctgaggc cagtgcccag gagcaacgag 240
agaaacaacc gctcgaggag tccgcatccc gcgctcccag cacctgggaa gagtctgggc 300
ttcgctacga taaagcttat cccggggaca ggaggctgag cagtgtaatg acaatagtaa 360
agtccaggcc atttcgggaa aaacaaggga agatcctgct ggaaggtcgc aggctcattt 420
cagacgctct caaggctgga gctgtgccaa aaatgttctt ctttagccgt ctagaatacc 480
taaaggagtt gccagtcgat aagctgaaag gtgtcagcct cattaaggtg aaatttgagg 540
atatcaagga ttggtccgac ctcgtaacgc cacaaggaat aatggggatt tttgccaagc 600
ctgaccatgt taagatgaca tatccaaaga ctcagcttca gcattcactg cctttattat 660
tgatttgtga caatctccgt gaccctggga acctggggac aattctgaga tctgcagctg 720
gggcaggctg cagcaaagtg ttactcacca aaggctgtgt ggatgcctgg gagcccaaag 780
tgctccgggc gggtatgggc gcacatttcc ggatgcccat tatcaataat ctggaatggg 840
aaaccgtgcc caattacctg ccccctgaca ctcgggtcta tgtggctgac aactgtggcc 900
tttatgccca ggctgagatg tctaataaag ctagtgacca tggctgggtg tgtgatcaac 960
gagtgatgaa gtttcacaag tatgaggaag aggaagatgt agaaaccgga gccagtcaag 1020
attg 1024
<210>10
<211>420
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>10
Met Ala Ala Leu Val Arg Pro Ala Arg Phe Val Val Arg Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gln Val Val Gln Ala Trp Asp Leu Asp Ala Arg Arg Trp Val Arg Ala
20 25 30
Leu Arg Arg Ser Pro Val Lys Val Val Phe Pro Ser Gly Glu Val Val
35 40 45
Glu Gln Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gln Pro Arg Lys Ala Pro Ser Glu
50 55 60
Ala Ser Ala Gln Glu Gln Arg Glu Lys Gln Pro Leu Glu Glu Ser Ala
65 70 75 80
Ser Arg Ala Pro Ser Thr Trp Glu Glu Ser Gly Leu Arg Tyr Asp Lys
85 90 95
Ala Tyr Pro Gly Asp Arg Arg Leu Ser Ser Val Met Thr Ile Val Lys
100 105 110
Ser Arg Pro Phe Arg Glu Lys Gln Gly Lys Ile Leu Leu Glu Gly Arg
115 120 125
Arg Leu Ile Ser Asp Ala Leu Lys Ala Gly Ala Val Pro Lys Met Phe
130 135 140
Phe Phe Ser Arg Leu Glu Tyr Leu Lys Glu Leu Pro Val Asp Lys Leu
145 150 155 160
Lys Gly Val Ser Leu Ile Lys Val Lys Phe Glu Asp Ile Lys Asp Trp
165 170 175
Ser Asp Leu Val Thr Pro Gln Gly Ile Met Gly Ile Phe Ala Lys Pro
180 185 190
Asp His Val Lys Met Thr Tyr Pro Lys Thr Gln Leu Gln His Ser Leu
195 200 205
Pro Leu Leu Leu Ile Cys Asp Asn Leu Arg Asp Pro Gly Asn Leu Gly
210 215 220
Thr Ile Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ser Lys Val Leu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Gly Cys Val Asp Ala Trp Glu Pro Lys Val Leu Arg Ala Gly
245 250 255
Met Gly Ala His Phe Arg Met Pro Ile Ile Asn Asn Leu Glu Trp Glu
260 265 270
Thr Val Pro Asn Tyr Leu Pro Pro Asp Thr Arg Val Tyr Val Ala Asp
275 280 285
Asn Cys Gly Leu Tyr Ala Gln Ala Glu Met Ser Asn Lys Ala Ser Asp
290 295 300
His Gly Trp Val Cys Asp Gln Arg Val Met Lys Phe His Lys Tyr Glu
305 310 315 320
Glu Glu Glu Asp Val Glu Thr Gly Ala Ser Gln Asp Trp Leu Pro His
325 330 335
Val Glu Val Gln Ser Tyr Asp Ser Asp Trp Thr Glu Ala Pro Ala Ala
340 345 350
Val Val Ile Gly Gly Glu Thr Tyr Gly Val Ser Leu Glu Ser Leu Gln
355 360 365
Leu Ala Glu Ser Thr Gly Gly Lys Arg Leu Leu Ile Pro Val Val Pro
370 375 380
Gly Val Asp Ser Leu Asn Ser Ala Met Ala Ala Ser Ile Leu Leu Phe
385 390 395 400
Glu Gly Lys Arg Gln Leu Arg Gly Arg Ala Glu Asp Leu Ser Arg Asp
405 410 415
Arg Ser Tyr His
420
<210>11
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>11
ggaagaaccc gcagcagctc ccaggatgaa ctggttgcag tggctgctgc tgctgcgggg 60
gcgctgagag gacacgagct ctatgccttt ccggctgctc atcccgctcg gcctcctgtg 120
cgcgctgctg cctcagcacc atggtgcgcc aggtcccgac ggctccgcgc cagatcccgc 180
ccactacagg gagcgagtca aggccatgtt ctaccacgcc tacgacagct acctggagaa 240
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tttctctctg actctaattg atgcactgga caccttgctg attttgggga atgtctcaga 360
attccaaaga gtggttgaag tgctccagga cagcgtggac tttgatattg atgtgaacgc 420
ctctgtgttt gaaacaaaca ttcgagtggt aggaggactc ctgtctgctc atctgctctc 480
caagaaggct ggggtggaag tagaggctgg atggccctgt tccgggcctc tcctgagaat 540
ggctgaggag gcggcccgaa aactcctccc agcctttcag acccccactg gcatgccata 600
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agggattggg accttcattg ttgaatttgc caccctgagc agcctcactg gtgacccggt 720
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cgatgactgg tacctgtggg ttcagatgta caaggggact gtgtccatgc cagtcttcca 1020
gtcc 1024
<210>12
<211>578
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Pro Phe Arg Leu Leu Ile Pro Leu Gly Leu Leu Cys Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gln His His Gly Ala Pro Gly Pro Asp Gly Ser Ala Pro Asp Pro
20 25 30
Ala His Tyr Arg Glu Arg Val Lys Ala Met Phe Tyr His Ala Tyr Asp
35 40 45
Ser Tyr Leu Glu Asn Ala Phe Pro Phe Asp Glu Leu Arg Pro Leu Thr
50 55 60
Cys Asp Gly His Asp Thr Trp Gly Ser Phe Ser Leu Thr Leu Ile Asp
65 70 75 80
Ala Leu Asp Thr Leu Leu Ile Leu Gly Asn Val Ser Glu Phe Gln Arg
85 90 95
Val Val Glu Val Leu Gln Asp Ser Val Asp Phe Asp Ile Asp Val Asn
100 105 110
Ala Ser Val Phe Glu Thr Asn Ile Arg Val Val Gly Gly Leu Leu Ser
115 120 125
Ala His Leu Leu Ser Lys Lys Ala Gly Val Glu Val Glu Ala Gly Trp
130 135 140
Pro Cys Ser Gly Pro Leu Leu Arg Met Ala Glu Glu Ala Ala Arg Lys
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Leu Leu Pro Ala Phe Gln Thr Pro Thr Gly Met Pro Tyr Gly Thr Val
165 170 175
Asn Leu Leu His Gly Val Asn Pro Gly Glu Thr Pro Val Thr Cys Thr
180 185 190
Ala Gly Ile Gly Thr Phe Ile Val Glu Phe Ala Thr Leu Ser Ser Leu
195 200 205
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210 215 220
Leu Trp Glu Ser Arg Ser Asp Ile Gly Leu Val Gly Asn His Ile Asp
225 230 235 240
Val Leu Thr Gly Lys Trp Val Ala Gln Asp Ala Gly Ile Gly Ala Gly
245 250 255
Val Asp Ser Tyr Phe Glu Tyr Leu Val Lys Gly Ala Ile Leu Leu Gln
260 265 270
Asp Lys Lys Leu Met Ala Met Phe Leu Glu Tyr Asn Lys Ala Ile Arg
275 280 285
Asn Tyr Thr Arg Phe Asp Asp Trp Tyr Leu Trp Val Gln Met Tyr Lys
290 295 300
Gly Thr Val Ser Met Pro Val Phe Gln Ser Leu Glu Ala Tyr Trp Pro
305 310 315 320
Gly Leu Gln Ser Leu Ile Gly Asp Ile Asp Asn Ala Met Arg Thr Phe
325 330 335
Leu Asn Tyr Tyr Thr Val Trp Lys Gln Phe Gly Gly Leu Pro Glu Phe
340 345 350
Tyr Asn Ile Pro Gln Gly Tyr Thr Val Glu Lys Arg Glu Gly Tyr Pro
355 360 365
Leu Arg Pro Glu Leu Ile Glu Ser Ala Met Tyr Leu Tyr Arg Ala Thr
370 375 380
Gly Asp Pro Thr Leu Leu Glu Leu Gly Arg Asp Ala Val Glu Ser Ile
385 390 395 400
Glu Lys Ile Ser Lys Val Glu Cys Gly Phe Ala Thr Ile Lys Asp Leu
405 410 415
Arg Asp His Lys Leu Asp Asn Arg Met Glu Ser Phe Phe Leu Ala Glu
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Thr Val Lys Tyr Leu Tyr Leu Leu Phe Asp Pro Thr Asn Phe Ile His
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Asp Pro Ala Ala Leu His Cys Cys Gln Arg Leu Lys Glu Glu Gln Trp
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Glu Val Glu Asp Leu Met Arg Glu Phe Tyr Ser Leu Lys Arg Cys Arg
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Gln Pro Phe Thr Ser Lys Leu Ala Leu Leu Gly Gln Val Phe Leu Asp
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Ser Ser
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<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>13
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ggac 1024
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<400>14
Met Leu Arg Leu Leu Arg Leu Ala Leu Ala Phe Tyr Gly Arg Thr Ala
1 5 10 15
Asp Pro Ala Glu Arg Gln Gly Pro Gln Gln Gln Gly Leu Pro Gln Gly
20 25 30
Asp Thr Gln Leu Thr Thr Val Gln Gly Val Val Thr Ser Phe Cys Gly
35 40 45
Asp Tyr Gly Met Ile Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Ser Ser Asp Val Val
50 55 60
Thr Gly Asn Val Pro Leu Lys Val Gly Gln Lys Val Asn Val Val Val
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Pro His Tyr Gly Leu Arg Ala Ile Lys Val Asp Val
85 90 95
Val Pro Arg His Leu Tyr Gly Ala Gly Pro Ser Asp Ser Gly Thr Arg
100 105 110
Val Leu Ile Gly Cys Val Thr Ser Ile Asn Glu Asp Asn Ile Tyr Ile
115 120 125
Ser Asn Ser Ile Tyr Phe Ser Ile Ala Ile Val Ser Glu Asp Phe Val
130 135 140
Pro Tyr Lys Gly Asp Leu Leu Glu Val Glu Tyr Ser Thr Glu Pro Gly
145 150 155 160
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180 185 190
Asp Tyr Thr Ile Phe Phe Thr Leu Asp Ser Val Lys Leu Pro Asp Gly
195 200 205
Tyr Val Pro Gln Val Asp Asp Ile Val Asn Val Val Met Val Glu Ser
210 215 220
Ile Gln Phe Cys Phe Ile Trp Arg Ala Ile Ser Ile Thr Pro Val His
225 230 235 240
Lys Ser
<210>15
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>15
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>16
Met Gly Leu Pro Val Ser Trp Ala Pro Pro Ala Leu Trp Val Leu Gly
1 5 10 15
Cys Cys Ala Leu Leu Leu Ser Leu Trp Ala Leu Cys Thr Ala Cys Arg
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Arg Pro Glu Asp Ala Val Ala Pro Arg Lys Arg Ala Arg Arg Gln Arg
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Ala Arg Leu Gln Gly Ser Ala Thr Ala Ala Glu Ala Ser Leu Leu Arg
50 55 60
Arg Thr His Leu Cys Ser Leu Ser Lys Ser Asp Thr Arg Leu His Glu
65 70 75 80
Leu His Arg Gly Pro Arg Ser Ser Arg Ala Leu Arg Pro Ala Ser Met
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Leu Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Leu Glu Ala Thr
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Ser Pro Val Val Ala Glu Tyr Ala Arg Val Gln Lys Arg Lys Gly Thr
165 170 175
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Ala Ala Gln Val Asp Val Leu Tyr Ser Arg Val Cys Lys Pro Lys Arg
195 200 205
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210 215 220
Ala Ile Leu Ala Leu Ala Gly Asp Leu Ala Tyr Gln Thr Leu Pro Leu
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Arg Ala Leu Asp Val Gly Ser Gly Pro Leu Glu Asn Val Tyr Glu Ser
245 250 255
Ile Arg Glu Leu Gly Asp Pro Ala Gly Arg Ser Ser Thr Cys Gly Ala
260 265 270
Gly Thr Pro Pro Ala Ser Ser Cys Pro Ser Leu Gly Arg Gly Trp Arg
275 280 285
Pro Leu Pro Ala Ser Leu Pro
290 295
<210>17
<211>441
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>17
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>18
Met Lys Gly Ser Arg Ala Leu Leu Leu Val Ala Leu Thr Leu Phe Cys
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Ile Cys Arg Met Ala Thr Gly Glu Asp Asn Asp Glu Phe Phe Met Asp
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Phe Leu Gln Thr Leu Leu Val Gly Thr Pro Glu Glu Leu Tyr Glu Gly
35 40 45
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Glu Leu Lys Ser Cys Arg Asp Gly Leu Gln Pro Met His Lys Ala Glu
65 70 75 80
Leu Val Lys Leu Leu Val Gln Val Leu Gly Ser Gln Asp Gly Ala
85 90 95
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>19
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<210>20
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>20
Met Lys Leu Ile Ala Leu Leu Phe Leu Thr Ala Leu Ala Gly Ala Leu
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Val Cys Ala Gln Asp Ala Pro Val Glu Glu Thr Pro Thr Glu Thr Pro
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Ile Thr Pro Ala Lys Ser Gly Ser Phe Leu Asp Gly Leu Lys Asn Lys
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100
<210>21
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>21
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aaaaatatcc cagataactg tcatgaagct ggtaactatc ttcctgctgg tgaccatcag 120
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gaaaactctg ggcatttctg ttgagcacct tgtggagggg ctaaggaagt gtgtaaatga 300
gctgggacca gaggcttctg aagctgtgaa gaaactgctg gaggcgctat cacacttggt 360
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aaggacaaat aaagcaatga atacaaaaac ataccacctc ttaat 525
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>22
Met Lys Leu Val Thr Ile Phe Leu Leu Val Thr Ile Ser Leu Cys Ser
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Tyr Ser Ala Thr Ala Phe Leu Ile Asn Lys Val Pro Leu Pro Val Asp
20 25 30
Lys Leu Ala Pro Leu Pro Leu Asp Asn Ile Leu Pro Phe Met Asp Pro
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Leu Lys Leu Leu Leu Lys Thr Leu Gly Ile Ser Val Glu His Leu Val
50 55 60
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Ala Val Lys Lys Leu Leu Glu Ala Leu Ser His Leu Val
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<211>436
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>23
tcctttttta ctttcacagc aatagtgcag aatccagaat ggatgtcctc tttgtagcca 60
tctttgctgt gccacttatc ctgggacaag aatatgagga tgaagaaaga ctgggagagg 120
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aggacataac agaagcaata gagactacca ttagtcttga aacagcacgt gcagaccatc 300
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ttactatcct cagaaa 436
<210>24
<211>121
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<213>智人(Homo sapiens)
<400>24
Met Asp Val Leu Phe Val Ala Ile Phe Ala Val Pro Leu Ile Leu Gly
1 5 10 15
Gln Glu Tyr Glu Asp Glu Glu Arg Leu Gly Glu Asp Glu Tyr Tyr Gln
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Val Val Tyr Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Ser Tyr Asp Asp Phe Ser Ala
35 40 45
Asp Phe Thr Ile Asp Tyr Ser Ile Phe Glu Ser Glu Asp Arg Leu Asn
50 55 60
Arg Leu Asp Lys Asp Ile Thr Glu Ala Ile Glu Thr Thr Ile Ser Leu
65 70 75 80
Glu Thr Ala Arg Ala Asp His Pro Lys Pro Val Thr Val Lys Pro Val
85 90 95
Thr Thr Glu Pro Val Glu Glu Gly Cys Tyr Asp Ser Leu Asp Gly Ser
100 105 110
Leu Ala Arg Gly Asn Trp Lys Ile Lys
115 120
<210>25
<211>501
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>25
gatctgggta atgcgatgca gaggaaacaa gttttaactt tgtgctttgc caccatgtga 60
tccccactct ccctgggtgg gatgcaagga tggactccag cggccctcat ggtaagattt 120
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attccaaagg agggggaggg gcggttcaga cccatctccg ccaaaactta ctgggggcag 300
agtgctgctg gggcgggggc tgatgcgggt cacaaacgag ggttggacgg aggatagggt 360
tcagtgtctg atgggatgag gggagggcag agaggtcgag gatgggagtg attcagtctt 420
gagcctgtcg ggcgtgcgcc ctgaaggtcg ccagtccgtg tgaagttctg aaggatgggg 480
caacagcgag gaggggggaa a 501
<210>26
<211>91
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>26
Met Gln Gly Trp Thr Pro Ala Ala Leu Met Val Arg Phe Ile Ile Leu
1 5 10 15
Arg Ser Val Gln Ala Ala Ser Ala Thr Pro Pro Pro Thr Pro Pro Pro
20 25 30
Gln Lys Ala Pro Ser Thr Pro Leu Cys Pro Pro Asn Ser Ala His Thr
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Pro Leu Ser Ser Gln Ile Pro Lys Glu Gly Glu Gly Arg Phe Arg Pro
50 55 60
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Asp Ala Gly His Lys Arg Gly Leu Asp Gly Gly
85 90
<210>27
<211>819
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>27
cctccactca gtaaaataca gcctctgtca ttccatggca ggtgtccagg gggaaggaaa 60
agtaagtctc catcagacag tcagcatgcc atttatgatc cacgcaggac catgaataat 120
atgagaggac agattttgct cttgttcctc ttgatttggc tttggaacag atatggacaa 180
ttagtgggat cgtctgaaaa gcacaagatt gcaagtcagt tggaactgat tcaatctcaa 240
ttccactact gtgtgacctt ggacaagttg cttaacttct ctgagcctgt ccatgtaaaa 300
caagagcaac tgctttcagt gtgtagtgag aaggaagtaa cagaggtgaa aggtgccggc 360
acttgtaaat catgttggca gcaagtgttg cttcctaatt ttttgttctg gccccaagtt 420
gaaacaagtt ttcagtctcc caagtctctt ctgactaacc aatggttcaa agtctgctta 480
ttttccactg catccatttg agagcaggag ttgggtcctt ctcattgctc tgttcttagt 540
ttctataaca acacctggtg ctgggaggtg ttcataaagt tctgttcaat ttatccgaac 600
cactgtgacc agtccacgaa acacgtgagt tataggtgaa tgtccaagaa gtaccttggt 660
ttcccacaga ctcattccag acttggagct ggtgtcatct tgaataatat gctagatggc 720
ttctccacca gccatgtgtc ccacgacttc ctccgctcat gattcagtag gtggaatctt 780
aacatgcagt ttcttagcac gcgcatggca cacacacac 819
<210>28
<211>129
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>28
Met Ash Ash Met Arg Gly Gln Ile Leu Leu Leu Phe Leu Leu Ile Trp
1 5 10 15
Leu Trp Asn Arg Tyr Gly Gln Leu Val Gly Ser Ser Glu Lys His Lys
20 25 30
Ile Ala Ser Gln Leu Glu Leu Ile Gln Ser Gln Phe His Tyr Cys Val
35 40 45
Thr Leu Asp Lys Leu Leu Asn Phe Ser Glu Pro Val His Val Lys Gln
50 55 60
Glu Gln Leu Leu Ser Val Cys Ser Glu Lys Glu Val Thr Glu Val Lys
65 70 75 80
Gly Ala Gly Thr Cys Lys Ser Cys Trp Gln Gln Val Leu Leu Pro Asn
85 90 95
Phe Leu Phe Trp Pro Gln Val Glu Thr Ser Phe Gln Ser Pro Lys Ser
100 105 110
Leu Leu Thr Asn Gln Trp Phe Lys Val Cys Leu Phe Ser Thr Ala Ser
115 120 125
Ile
<210>29
<211>754
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>29
ttctagatgt tttacggttt taaattttac ctttaggtct acaaccattg tgatttagat 60
tttgtattta atgtaaggta taagttgaga ttcatttctc tctgtttttg gagacttatg 120
tccagctatt ccagaaccat ttgttggaaa gagtatcttt atcccaacaa gttatgtggg 180
cactttgttg aaaaagatct attgaccata tatacatgcg tttatttcca agactctatt 240
ttgttctgtt gaccgacttg tttgtcctta tgacaatatc acactgtttt gattacagtg 300
gcattattgt acctcttgca aaaatcaagt gtgaatcttc caaagaagat ttggaagatt 360
ttctctttca aagttgtgtg agttatttaa gtgccttttc attttcatat aagtttagaa 420
ttagcttgca gtttctaaaa gaaaaaaaaa aaaaggctga tgagactttg attgtgattc 480
cattggatct atagctcagt ttgcagggat ttacatctta acaatactga gtcctcaaat 540
ccatgaacat ggtacatctc tccatttatt taggtcttct tgtatttttt ctcatcaaca 600
tcttatagtt ttaagtaaac aaattttgca catattttgt aagatttatc attaagtatt 660
tcatgtttgt gatgttatgg tgaatattgt ttttaaattc aatttcctat tgtccactgc 720
tagtatacgg aaatacaatt ggttttcata catt 754
<210>30
<211>92
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>30
Met Arg Leu Phe Pro Arg Leu Tyr Phe Val Leu Leu Thr Asp Leu Phe
1 5 10 15
Val Leu Met Thr Ile Ser His Cys Phe Asp Tyr Ser Gly Ile Ile Val
20 25 30
Pro Leu Ala Lys Ile Lys Cys Glu Ser Ser Lys Glu Asp Leu Glu Asp
35 40 45
Phe Leu Phe Gln Ser Cys Val Ser Tyr Leu Ser Ala Phe Ser Phe Ser
50 55 60
Tyr Lys Phe Arg Ile Ser Leu Gln Phe Leu Lys Glu Lys Lys Lys Lys
65 70 75 80
Ala Asp Glu Thr Leu Ile Val Ile Pro Leu Asp Leu
85 90
<210>31
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>31
cctaaaaagc aaaagttatt atagaatatt gtggcattga agtagccgaa aaattgttag 60
ttttagcatc aaaaaagtaa atagatgttg aaatgaattt gggtatgtgc caggttgaag 120
agagtgtgcc agtgacagga agtagtctaa aaaattaaca gttatggttt taataggatc 180
tgaaagacaa tctttaaaga aatgggagaa attgggggta tcagtgaacc tataccaacc 240
tctctttgta cataaatatg gtgatgtagc tagatataaa aatcagtgtc ttactggcac 300
catttacagt ttagaaaaca atctttttct taaaaatgcc catctgattt ctatttttag 360
gagctacttg gatttgtatg tattttttct acgtgaaaat atatgtactc tccacttggg 420
ggcccagtac tataattgct catgcactct ttctcccctt tgagaacatt cagtgaaata 480
caacttcatc aaagatttgc tcaaaggaga agaatcgcat gagtgtgaaa agtagatgct 540
cgtagccaga acagaaaagg ttacacatga tcatggcaca gaagatagga ggtttgactt 600
ggtgggccat aatgtttatt atcctttttg aaataacagg gaccagcagc agttttctca 660
ggataaatgc tctaccccac ttctctatga acaggtgtgg ggaggcttac tttccatttt 720
catatttata cacctctcta caaaagcaat ttttaatgaa ggttagtgga attgttaaaa 780
atctgagagg aatgatgact ggaggtgttt ggggtttttt tctgtattca ttttttaatg 840
agaaaagttt taaatgtagt acaggttaga cccaactact accttactat tataggacga 900
ttctatgttt ctgttaaagt attcaagtag ctttctctgg gggaaaaagt accacttgga 960
cacttaaagg aattgggatt tttgtctact ttggataagg cagttgactt cttaagtaaa 1020
agca 1024
<210>32
<211>100
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>32
Met Ile Met Ala Gln Lys Ile Gly Gly Leu Thr Trp Trp Ala Ile Met
1 5 10 15
Phe Ile Ile Leu Phe Glu Ile Thr Gly Thr Ser Ser Ser Phe Leu Arg
20 25 30
Ile Asn Ala Leu Pro His Phe Ser Met Asn Arg Cys Gly Glu Ala Tyr
35 40 45
Phe Pro Phe Ser Tyr Leu Tyr Thr Ser Leu Gln Lys Gln Phe Leu Met
50 55 60
Lys Val Ser Gly Ile Val Lys Asn Leu Arg Gly Met Met Thr Gly Gly
65 70 75 80
Val Trp Gly Phe Phe Leu Tyr Ser Phe Phe Asn Glu Lys Ser Phe Lys
85 90 95
Cys Ser Thr Gly
100
<210>33
<211>333
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>33
ggagatggtt ctcgccatgc tgggggctct gcacccccgg gctgggctca gcctcttcct 60
ccacctcatc ctggcagtgg cactgcttcg ctcccagcct ctgaggtctc agcggtctgt 120
tcctgaggca ttttccgccc ccctggaact ctcgcagcca ctttccggcc tggtggatga 180
ctatggcatc ctccccaagc acccaaagcc gcgagggcct cgacccctcc tgtctagggc 240
ccagcagcgc aagcgggacg ggcccgacct tgccgagtat tactatgatg cacacctatg 300
acccaaggcc ctcataaaga taccatgtgt gac 333
<210>34
<211>98
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>34
Met Val Leu Ala Met Leu Gly Ala Leu His Pro Arg Ala Gly Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu His Leu Ile Leu Ala Val Ala Leu Leu Arg Ser Gln Pro
20 25 30
Leu Arg Ser Gln Arg Ser Val Pro Glu Ala Phe Ser Ala Pro Leu Glu
35 40 45
Leu Ser Gln Pro Leu Ser Gly Leu Val Asp Asp Tyr Gly Ile Leu Pro
50 55 60
Lys His Pro Lys Pro Arg Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ser Arg Ala Gln
65 70 75 80
Gln Arg Lys Arg Asp Gly Pro Asp Leu Ala Glu Tyr Tyr Tyr Asp Ala
85 90 95
His Leu
<210>35
<211>723
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(49)..(49)
<223>n=a,t,c,g
<400>35
ggtgcacgga tcctgctggg cactgggagc agggggcggc caaaggaang tgggtgggca 60
ggtccatgcc tcccctggcc ccccagctct gcagggcagt gttcctggtt cctatcttgc 120
tgctgctgca ggtgaagcct ctgaacggga gcccaggccc caaagatggg agccagacag 180
agaaaacgcc ctctgcagac cagaatcaag aacagttcga agagcacttt gtggcctcct 240
cagtgggtga gatgtggcag gtggtggaca tggcccagca ggaagaagac cagtcgtcca 300
agacggcagc tgttcacaag cactctttcc acctcagctt ctgctttagt ctggccagtg 360
tcatggtttt ctcaggaggg ccattgaggc ggacattccc aaatatccaa ctctgcttca 420
tgctcactca ctgaccctcc ctccctcctg ggctccaggt cacaactccc aaaggagatg 480
caggcatggc tctctgcctc tgatcaccat cactgtatct caaggttcag cagcagagat 540
accagttgcc atcagtgcta actgactgcc tctccaggtt cggagtttca tctcccaggg 600
ccagagacag cagacccaca tccttctctc ccacacctct cctggttttg ttcaggacag 660
cagattagag gcaggaggca atgacaataa aataacgata aaatcctgag aacaattaaa 720
aaa 723
<210>36
<211>122
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>36
Met Pro Pro Leu Ala Pro Gln Leu Cys Arg Ala Val Phe Leu Val Pro
1 5 10 15
Ile Leu Leu Leu Leu Gln Val Lys Pro Leu Asn Gly Ser Pro Gly Pro
20 25 30
Lys Asp Gly Ser Gln Thr Glu Lys Thr Pro Ser Ala Asp Gln Asn Gln
35 40 45
Glu Gln Phe Glu Glu His Phe Val Ala Ser Ser Val Gly Glu Met Trp
50 55 60
Gln Val Val Asp Met Ala Gln Gln Glu Glu Asp Gln Ser Ser Lys Thr
65 70 75 80
Ala Ala Val His Lys His Ser Phe His Leu Ser Phe Cys Phe Ser Leu
85 90 95
Ala Ser Val Met Val Phe Ser Gly Gly Pro Leu Arg Arg Thr Phe Pro
100 105 110
Asn Ile Gln Leu Cys Phe Met Leu Thr His
115 120
<210>37
<211>758
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>37
tttaatttta gaagtgtttt gggtctttat tagaaatttg gtagtgtttt tgtaaccaga 60
aatatatgcc atagggactt aactcttatt tatatcagtt cacctatggt aaaattgatt 120
tcattatatg ttgtttttct taaacttgca gtttcccaga acctatcaac aacattgagg 180
acttattgta ttataaatta tctttatatg aatataaaga ctttccctat ttcaattgcg 240
aatatacaga tctgtgcact caaaaataac aagcctatta ggactcaaac agttatttgt 300
atacccacgt tcacagaagc attattcaca atagccaaaa agcagaagca acccagtgtc 360
cattaatgga tgaactgata aacaaaatac ggtatttaca tactacggca tatttggcct 420
ttaagaggaa agaaattcta atacatgcta caacatgaat gaactttgaa gacattatgg 480
taaatgaaat aagaatgaat ccatttagat atctagagta gtcaatgcat agagactgaa 540
tgctggttac cagaggctga ggagagagga ggtaatgggt ggttattgtt taatgaatac 600
ataatttcag tttgggaaga tgaagagttc tgtagacgga tggtggtggt ggttgcacaa 660
tagtatgaat atacttaatg ccacagaatt gaacacttaa aactggttaa agtggtgaat 720
tttacgatat gcatatttaa tcatttttgg gaaagaaa 758
<210>38
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<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>38
Met Val Lys Leu Ile Ser Leu Tyr Val Val Phe Leu Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Ser Gln Asn Leu Ser Thr Thr Leu Arg Thr Tyr Cys Ile Ile Asn Tyr
20 25 30
Leu Tyr Met Asn Ile Lys Thr Phe Pro Ile Ser Ile Ala Asn Ile Gln
35 40 45
Ile Cys Ala Leu Lys Asn Asn Lys Pro Ile Arg Thr Gln Thr Val Ile
50 55 60
Cys Ile Pro Thr Phe Thr Glu Ala Leu Phe Thr Ile Ala Lys Lys Gln
65 70 75 80
Lys Gln Pro Ser Val His
85
<210>39
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>39
gtgaagagag gcgcggcgtg actgagctac ggttctggct gcgtcctaga ggcatccggg 60
gcagtaaaac cgctgcgatc gcggaggcgg cggccaggcc gagaggcagg ccgggcaggg 120
gtgtcggacg cagggcgctg ggccgggttt cggcttcggc cacagctttt tttctcaagg 180
tgcaatgaaa gccttccaca ctttctgtgt tgtccttctg gtgtttggga gtgtctctga 240
agccaagttt gatgattttg aggatgagga ggacatagta gagtatgatg ataatgactt 300
cgctgaattt gaggatgtca tggaagactc tgttactgaa tctcctcaac gggtcataat 360
cactgaagat gatgaagatg agaccactgt ggagttggaa gggcaggatg aaaaccaaga 420
aggagatttt gaagatgcag atacccagga gggagatact gagagtgaac catatgatga 480
tgaagaattt gaaggttatg aagacaaacc agatacttct tctagcaaaa ataaagaccc 540
aataacgatt gttgatgttc ctgcacacct ccagaacagc tgggagagtt attatctaga 600
aattttgatg gtgactggtc tgcttgctta tatcatgaat tacatcattg ggaagaataa 660
aaacagtcgc cttgcacagg cctggtttaa cactcatagg gagcttttgg agagcaactt 720
tactttagtg ggggatgatg gaactaacaa agaagccaca agcacaggaa agttgaacca 780
ggagaatgag cacatctata acctgtggtg ttctggtcga gtgtgctgtg agggcatgct 840
tatccagctg aggttcctca agagacaaga cttactgaat gtcctggccc ggatgatgag 900
gccagtgagt gatcaagtgc aaataaaagt aaccatgaat gatgaagaca tggataccta 960
cgtatttgct gttggcacac ggaaagcctt ggtgcgacta cagaaagaga tgcaggattt 1020
gagt 1024
<210>40
<211>483
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>40
Met Lys Ala Phe His Thr Phe Cys Val Val Leu Leu Val Phe Gly Ser
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Lys Phe Asp Asp Phe Glu Asp Glu Glu Asp Ile Val
20 25 30
Glu Tyr Asp Asp Asn Asp Phe Ala Glu Phe Glu Asp Val Met Glu Asp
35 40 45
Ser Val Thr Glu Ser Pro Gln Arg Val Ile Ile Thr Glu Asp Asp Glu
50 55 60
Asp Glu Thr Thr Val Glu Leu Glu Gly Gln Asp Glu Asn Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asp Phe Glu Asp Ala Asp Thr Gln Glu Gly Asp Thr Glu Ser Glu Pro
85 90 95
Tyr Asp Asp Glu Glu Phe Glu Gly Tyr Glu Asp Lys Pro Asp Thr Ser
100 105 110
Ser Ser Lys Asn Lys Asp Pro Ile Thr Ile Val Asp Val Pro Ala His
115 120 125
Leu Gln Asn Ser Trp Glu Ser Tyr Tyr Leu Glu Ile Leu Met Val Thr
130 135 140
Gly Leu Leu Ala Tyr Ile Met Asn Tyr Ile Ile Gly Lys Asn Lys Asn
145 150 155 160
Set Arg Leu Ala Gln Ala Trp Phe Asn Thr His Arg Glu Leu Leu Glu
165 170 175
Ser Asn Phe Thr Leu Val Gly Asp Asp Gly Thr Asn Lys Glu Ala Thr
180 185 190
Ser Thr Gly Lys Leu Asn Gln Glu Asn Glu His Ile Tyr Asn Leu Trp
195 200 205
Cys Ser Gly Arg Val Cys Cys Glu Gly Met Leu Ile Gln Leu Arg Phe
210 215 220
Leu Lys Arg Gln Asp Leu Leu Asn Val Leu Ala Arg Met Met Arg Pro
225 230 235 240
Val Ser Asp Gln Val Gln Ile Lys Val Thr Met Asn Asp Glu Asp Met
245 250 255
Asp Thr Tyr Val Phe Ala Val Gly Thr Arg Lys Ala Leu Val Arg Leu
260 265 270
Gln Lys Glu Met Gln Asp Leu Ser Glu Phe Cys Ser Asp Lys Pro Lys
275 280 285
Ser Gly Ala Lys Tyr Gly Leu Pro Asp Ser Leu Ala Ile Leu Ser Glu
290 295 300
Met Gly Glu Val Thr Asp Gly Met Met Asp Thr Lys Met Val His Phe
305 310 315 320
Leu Thr His Tyr Ala Asp Lys Ile Glu Ser Val His Phe Ser Asp Gln
325 330 335
Phe Ser Gly Pro Lys Ile Met Gln Glu Glu Gly Gln Pro Leu Lys Leu
340 345 350
Pro Asp Thr Lys Arg Thr Leu Leu Phe Thr Phe Asn Val Pro Gly Ser
355 360 365
Gly Asn Thr Tyr Pro Lys Asp Met Glu Ala Leu Leu Pro Leu Met Asn
370 375 380
Met Val Ile Tyr Ser Ile Asp Lys Ala Lys Lys Phe Arg Leu Asn Arg
385 390 395 400
Glu Gly Lys Gln Lys Ala Asp Lys Asn Arg Ala Arg Val Glu Glu Asn
405 410 415
Phe Leu Lys Leu Thr His Val Gln Arg Gln Glu Ala Ala Gln Ser Arg
420 425 430
Arg Glu Glu Lys Lys Arg Ala Glu Lys Glu Arg Ile Met Asn Glu Glu
435 440 445
Asp Pro Glu Lys Gln Arg Arg Leu Glu Glu Ala Ala Leu Arg Arg Ala
450 455 460
Lys Lys Lys Leu Glu Lys Lys Gln Met Lys Met Lys Gln Ile Lys Val
465 470 475 480
Lys Ala Met
<210>41
<211>1024
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>41
agggatccca ccccttctct gtgttttcac tctgaagctc tacacaactt tacacctgaa 60
tgaacgccaa acctctatgg atatataaag ggaagcttga ggaggaattt cacagttaca 120
gtgcagaagc agaagcaaaa gaattaacca gctcttcagt caagcaaatc ctctactcac 180
catgcttcct cctgccattc atttctatct ccttcccctt gcatgcatcc taatgaaaag 240
ctgtttggct tttaaaaatg atgccacaga aatcctttat tcacatgtgg ttaaacctgt 300
tccagcacac cccagcagca acagcacgtt gaatcaagcc agaaatggag gcaggcattt 360
cagtaacact ggactggatc ggaacactcg ggttcaagtg ggttgccggg aactgcgttc 420
caccaaatac atctctgatg gccagtgcac cagcatcagc cctctgaagg agctggtgtg 480
tgctggcgag tgcttgcccc tgccagtgct ccctaactgg attggaggag gctatggaac 540
aaagtactgg agcaggagga gctcccagga gtggcggtgt gtcaatgaca aaacccgtac 600
ccagagaatc cagctgcagt gccaagatgg cagcacacgc acctacaaaa tcacagtagt 660
cactgcctgc aagtgcaaga ggtacacccg gcagcacaac gagtccagtc acaactttga 720
gagcatgtca cctgccaagc cagtccagca tcacagagag cggaaaagag ccagcaaatc 780
cagcaagcac agcatgagtt agaactcaga ctcccataac tagacttact agtaaccatc 840
tgctttacag atttgattgc ttggaagact caagcctgcc actgctgttt tctcacttga 900
aagtatatgc tttctgcttt gatcaaaccc agcaagctgt cttaagtatc aggaccttct 960
ttgggaatag tttttccttt tcaagttttt caagatgtag gtatatccat gaatgcaatt 1020
tgca 1024
<210>42
<211>204
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>42
Met Leu Pro Pro Ala Ile His Phe Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Cys Ile
1 5 10 15
Leu Met Lys Ser Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu Ile Leu
20 25 30
Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser
35 40 45
Thr Leu Asn Gln Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Asn Thr Gly
50 55 60
Leu Asp Arg Asn Thr Arg Val Gln Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser
65 70 75 80
Thr Lys Tyr Ile Ser Asp Gly Gln Cys Thr Ser Ile Ser Pro Leu Lys
85 90 95
Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn
100 105 110
Trp Ile Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser
115 120 125
Gln Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gln Arg Ile Gln
130 135 140
Leu Gln Cys Gln Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys Ile Thr Val Val
145 150 155 160
Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gln His Asn Glu Ser Ser
165 170 175
His Asn Phe Glu Ser Met Ser Pro Ala Lys Pro Val Gln His His Arg
180 185 190
Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser
195 200
<210>43
<211>975
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>43
gggacacccc gtgtgtggca ggcggcgaag cgctctggag aatcccggac agccctgctc 60
cctgcagcca ggtgtagttt cgggagccac tggggccaaa gtgagagtcc agcggtcttc 120
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agatgaaagg ctggggttgg ctggccctgc ttctgggggc cctgctggga accgcctggg 240
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cagatggcag ccagtcagtg gtggaggtaa ctgttactgt tcccccaaac aaagtagctc 420
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aaaacagact cagaaaaaag atttggctct gtctcatttg gaagaagctg caggcttatt 540
ccccatgcac ttgcttcctg gctgcaaacc ttaatacttt gtttctgctg tagaatttgt 600
tagcaaacag ggagtcctga tcagcaccct tctccacatc cacatgactg gtttttaatg 660
tagcactgtg gtatacatgc aaacatccgt tcaaaatctg agtcggagct aaaaataaaa 720
aatgaaaaaa cagaaataag gaataaaagg tcttatcctc ataattagga aattttaatc 780
gaaaacaaca cacatgtaca caaaggtgta tctaataagc aatatataag gcagtgttaa 840
gattacagtg ctagcctggg catcatggca aaacaccaac tctacaaaaa aatgcaaaag 900
ttagcagtgc atggtggcat gtgcctgtag tgacagctgc ttggaaggct gaggtgggag 960
gatcacttga gccca 975
<210>44
<211>84
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>44
Met Lys Gly Cys Cys Trp Leu Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Leu Gly
1 5 10 15
Thr Ala Trp Ala Arg Arg Ser Gln Asp Leu His Cys Gly Ala Cys Arg
20 25 30
Ala Leu Val Asp Glu Leu Glu Trp Glu Ile Ala Gln Val Asp Pro Lys
35 40 45
Lys Thr Ile Gln Met Gly Ser Phe Gln Ile Asn Pro Asp Gly Ser Gln
50 55 60
Ser Val Val Glu Val Thr Val Thr Val Pro Pro Asn Lys Val Ala His
65 70 75 80
Ser Gly Phe Gly
<210>45
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>45
ccccaccccg cctccaaagc taaccctcgg gcttgagggg aagaggctga ctgtacgttc 60
cttctactct ggcaccactc tccaggctgc catggggccc agcacccctc tcctcatctt 120
gttccttttg tcatggtcgg gacccctcca aggacagcag caccaccttg tggagtacat 180
ggaacgccga ctagctgctt tagaggaacg gctggcccag tgccaggacc agagtagtcg 240
gcatgctgct gagctgcggg acttcaagaa caagatgctg ccactgctgg aggtggcaga 300
gaaggagcgg gaggcactca gaactgaggc cgacaccatc tccgggagag tggatcgtct 360
ggagcgggag gtagactatc tggagaccca gaacccagct ctgccctgtg tagagtttga 420
tgagaaggtg actggaggcc ctgggaccaa aggcaaggga agaaggaatg agaagtacga 480
tatggtgaca gactgtggct acacaatctc tcaagtgaga tcaatgaaga ttctgaagcg 540
atttggtggc ccagctggtc tatggaccaa ggatccactg gggcaaacag agaagatcta 600
cgtgttagat gggacacaga atgacacagc ctttgtcttc ccaaggctgc gtgacttcac 660
ccttgccatg gctgcccgga aagcttcccg agtccgggtg cccttcccct gggtaggcac 720
agggcagctg gtatatggtg gctttcttta ttttgctcgg aggcctcctg gaagacctgg 780
tggaggtggt gagatggaga acactttgca gctaatcaaa ttccacctgg caaaccgaac 840
agtggtggac agctcagtat tcccagcaga ggggctgatc cccccctacg gcttgacagc 900
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ggaggatgac aggcacttgt gtctggccaa gttagatcca cagacact 1008
<210>46
<211>406
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>46
Met Gly Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ile Leu Phe Leu Leu Ser Trp Ser
1 5 10 15
Gly Pro Leu Gln Gly Gln Gln His His Leu Val Glu Tyr Met Glu Arg
20 25 30
Arg Leu Ala Ala Leu Glu Glu Arg Leu Ala Gln Cys Gln Asp Gln Ser
35 40 45
Ser Arg His Ala Ala Glu Leu Arg Asp Phe Lys Asn Lys Met Leu Pro
50 55 60
Leu Leu Glu Val Ala Glu Lys Glu Arg Glu Ala Leu Arg Thr Glu Ala
65 70 75 80
Asp Thr Ile Ser Gly Arg Val Asp Arg Leu Glu Arg Glu Val Asp Tyr
85 90 95
Leu Glu Thr Gln Asn Pro Ala Leu Pro Cys Val Glu Phe Asp Glu Lys
100 105 110
Val Thr Gly Gly Pro Gly Thr Lys Gly Lys Gly Arg Arg Asn Glu Lys
115 120 125
Tyr Asp Met Val Thr Asp Cys Gly Tyr Thr Ile Ser Gln Val Arg Ser
130 135 140
Met Lys Ile Leu Lys Arg Phe Gly Gly Pro Ala Gly Leu Trp Thr Lys
145 150 155 160
Asp Pro Leu Gly Gln Thr Glu Lys Ile Tyr Val Leu Asp Gly Thr Gln
165 170 175
Asn Asp Thr Ala Phe Val Phe Pro Arg Leu Arg Asp Phe Thr Leu Ala
180 185 190
Met Ala Ala Arg Lys Ala Ser Arg Val Arg Val Pro Phe Pro Trp Val
195 200 205
Gly Thr Gly Gln Leu Val Tyr Gly Gly Phe Leu Tyr Phe Ala Arg Arg
210 215 220
Pro Pro Gly Arg Pro Gly Gly Gly Gly Glu Met Glu Asn Thr Leu Gln
225 230 235 240
Leu Ile Lys Phe His Leu Ala Asn Arg Thr Val Val Asp Ser Ser Val
245 250 255
Phe Pro Ala Glu Gly Leu Ile Pro Pro Tyr Gly Leu Thr Ala Asp Thr
260 265 270
Tyr Ile Asp Leu Ala Ala Asp Glu Glu Gly Leu Trp Ala Val Tyr Ala
275 280 285
Thr Arg Glu Asp Asp Arg His Leu Cys Leu Ala Lys Leu Asp Pro Gln
290 295 300
Thr Leu Asp Thr Glu Gln Gln Trp Asp Thr Pro Cys Pro Arg Glu Asn
305 310 315 320
Ala Glu Ala Ala Phe Val Ile Cys Gly Thr Leu Tyr Val Val Tyr Asn
325 330 335
Thr Arg Pro Ala Ser Arg Ala Arg Ile Gln Cys Ser Phe Asp Ala Ser
340 345 350
Gly Thr Leu Thr Pro Glu Arg Ala Ala Leu Pro Tyr Phe Pro Arg Arg
355 360 365
Tyr Gly Ala His Ala Ser Leu Arg Tyr Asn Pro Arg Glu Arg Gln Leu
370 375 380
Tyr Ala Trp Asp Asp Gly Tyr Gln Ile Val Tyr Lys Leu Glu Met Arg
385 390 395 400
Lys Lys Glu Glu Glu Val
405
<210>47
<211>1010
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>47
ggtctgggct cggggcgcgg cggcagtcag ctctatgttc gcggtcttaa cctctcctct 60
ggccgagtcc ttgcaagaag tgaattaccc gaccctgcaa aacacttact attttggagt 120
ttaaagtatg tcatcatggc aaagtttcgg agaaggactt gcatcatttt ggcacttttt 180
attctattta ttttctctct gatgatgggt ttaaaaatgc tgagaccaaa tacagctact 240
tttggagctc cttttggact tgaccttctt ccagaacttc atcaacgaac tattcatttg 300
gggaaaaatt ttgatttcca aaagagtgac agaatcaaca gtgaaacaaa taccaagaat 360
ttaaaaagtg ttgaaatcac tatgaaacct tccaaagcct ctgaacttaa cttggatgaa 420
ctaccacctc tgaacaatta tctacatgta ttttattaca gttggtatgg aaatccacaa 480
tttgatggta aatatataca ttggaatcat ccagtgttag agcattggga ccctagaata 540
gccaagaatt atccacaagg gagacacaac cctccagatg acattggctc cagcttttat 600
cctgaattgg gaagttacag ttctcgggat ccttctgtca tagaaactca catgagacaa 660
atgcgctcag cttcaattgg taattattgt atatatatat atatatgtgt gtttgtgtct 720
gtatatatgc atataaatga ttttttgtgt aactttacta gttaattttc tcattattat 780
taattatatt gttaagctca tacctccaaa ttaaactgta tgtatgatct taaacatcca 840
ggcaaccaca ttttaacact gcccttagtg tatattgttt aatttttaca ttttggagca 900
tttctggata tattgttgat ttctaattta attcactttc tcaattttat taaattatga 960
tttacataaa atacaatgaa tttcccactt taagtttaca gctcattgat 1010
<210>48
<211>209
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>48
Met Ala Lys Phe Arg Arg Arg Thr Cys Ile Ile Leu Ala Leu Phe Ile
1 5 10 15
Leu Phe Ile Phe Ser Leu Met Met Gly Leu Lys Met Leu Arg Pro Asn
20 25 30
Thr Ala Thr Phe Gly Ala Pro Phe Gly Leu Asp Leu Leu Pro Glu Leu
35 40 45
His Gln Arg Thr Ile His Leu Gly Lys Asn Phe Asp Phe Gln Lys Ser
50 55 60
Asp Arg Ile Asn Ser Glu Thr Asn Thr Lys Asn Leu Lys Ser Val Glu
65 70 75 80
Ile Thr Met Lys Pro Ser Lys Ala Ser Glu Leu Asn Leu Asp Glu Leu
85 90 95
Pro Pro Leu Asn Asn Tyr Leu His Val Phe Tyr Tyr Ser Trp Tyr Gly
100 105 1l0
Asn Pro Gln Phe Asp Gly Lys Tyr Ile His Trp Asn His Pro Val Leu
115 120 125
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130 135 140
Asn Pro Pro Asp Asp Ile Gly Ser Ser Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Arg Asp Pro Ser Val Ile Glu Thr His Met Arg Gln Met
165 170 175
Arg Ser Ala Ser Ile Gly Asn Tyr Cys Ile Tyr Ile Tyr Ile Cys Val
180 185 190
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195 200 205
Ser
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165 170 175
Arg Ser Ala Ser Ile Gly Val Leu Ala Leu Ser Trp Tyr Pro Pro Asp
180 185 190
Val Asn Glu
195
Claims (10)
1.一种分离的人分泌蛋白,其特征在于,该多肽含有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、或50所示。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列选自下组:
(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码具有SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50所示氨基酸序列的多肽。
5.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49的编码区序列或全长序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求6所述的载体。
8.一种分泌蛋白的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出分泌蛋白。
9.一种能与权利要求1所述的人分泌蛋白特异性结合的抗体。
10.一种检测样品中是否存在分泌蛋白的方法,其特征在于,包括:
将样品与权利要求9所述的抗体接触,
观察是否形成抗体复合物,形成了抗体复合物就表示样品中存在分泌蛋白。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN 200310108763 CN1618807A (zh) | 2003-11-21 | 2003-11-21 | 分泌蛋白及其编码序列和用途 |
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CN 200310108763 CN1618807A (zh) | 2003-11-21 | 2003-11-21 | 分泌蛋白及其编码序列和用途 |
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CN114364694A (zh) * | 2019-07-12 | 2022-04-15 | 国立大学法人京都大学 | 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体 |
CN114364694B (zh) * | 2019-07-12 | 2024-05-10 | 国立大学法人京都大学 | 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体 |
-
2003
- 2003-11-21 CN CN 200310108763 patent/CN1618807A/zh active Pending
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CN114364694B (zh) * | 2019-07-12 | 2024-05-10 | 国立大学法人京都大学 | 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体 |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |