CN114364694B - 靶向usag-1分子的用于牙齿再生治疗的中和抗体 - Google Patents
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Abstract
提供了特异性结合并中和USAG‑1的抗体或其抗原结合片段；以及含有所述抗体或抗原结合片段的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及靶向USAG-1的中和抗体，用于治疗牙齿发育不全或牙齿再生。
背景技术
在大多数患者中，后天性疾病例如龋齿和牙周病会导致牙齿发育不全(牙齿缺失的患者)。也据报道，先天性牙齿发育不全的发病率高达1％。目前，缺牙的唯一治疗方法是修复治疗，包括牙种植和假牙，并没有根本性的治疗方法。已经报道了许多使用组织工程方法进行牙齿再生的研究。各种细胞例如干细胞(非专利文献1)被用作细胞源。此外，为了使体外制造的牙齿在口腔中发挥功能，报道了“器官原基法”(非专利文献2)——一种细胞操作技术——用于在胶原蛋白凝胶中再生牙齿器官原基(器官的雏形)。然而，由于确保细胞来源的成本和安全问题，组织工程方法尚未达到临床应用。
已经鉴定了大量先天性牙齿发育不全的致病基因，其中许多基因对人类和小鼠都是常见的。例如，RUNX2、MSX1、EDA、WNT10A、PAX9、AXIN2等是已知的。在列出的基因中，据报道WNT10A基因在最多的患者中导致先天性牙齿发育不全。EDA基因是无汗型外胚层发育不良的致病基因，无汗型外胚层发育不良是综合征型先天性牙齿发育不全的代表疾病。先天性牙齿发育不全是由于该致病基因的缺陷和该致病基因的功能受到抑制而导致牙齿发育过早停止所致。
引用列表
专利文献
专利文献1：Ohazama,J Denr Res,2004
专利文献2：Nakao,Nat Methods,2007
发明内容
本发明解决的问题
从治疗的观点出发，发明人构思了治疗先天性牙齿发育不全的新治疗方法。新方法促进了从已过早停止的牙齿发育状态的分化诱导，以形成完整的牙齿。本发明的目的是提供治疗牙齿发育不全的技术，该技术包括利用牙齿器官中固有的分化诱导，而不是利用外科组织移植。
问题的解决方案
作为勤奋研究的结果，本发明人成功地开发了靶向USAG-1的中和抗体。此外，他们发现在先天性牙齿发育不全模型小鼠中施用抗体再生了缺失的牙齿，并在先天性牙齿发育不全模型小鼠或野生型小鼠中形成多生牙。因此完成了本发明。
即，本发明涉及：
[1]抗体或其抗原结合片段，其特异性结合并中和USAG-1；
[2]根据[1]所述的抗体或其抗原片段，其与USAG-1特异性结合并中和USAG-1的BMP信号传导抑制活性；
[3]根据[1]或[2]所述的抗体或其抗原片段，其与USAG-1特异性结合并中和USAG-1的WNT信号传导抑制活性。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(a)三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(b)三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(c)三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(d)三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56和SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(f)重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:4所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(g)重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:13所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(h)重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:23所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:24所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(i)重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:40所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:41所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(j)重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:50所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:51所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
[6]根据[1]至[3]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(k)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(l)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19和SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(m)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(n)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:45、SEQ IDNO:46和SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(o)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56和SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
[7]根据[1]至[3]和[6]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(p)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:3所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:4所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(q)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:13所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(r)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:23所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:24所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
(s)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:40所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:41所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(t)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:50所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:51所列出的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；
[8]抗体或其抗原结合片段，其与根据[4]至[7]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段竞争与USAG-1的结合；
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体；和
[10]用于牙科再生治疗的药物组合物，其包含根据[1]至[9]中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
发明的效果
在本发明中，我们通过使用抗体制剂成功地在体内再生牙齿。用本发明的抗体制剂进行的治疗可以在临床上用作一般牙科和口腔外科方法中的牙齿再生疗法，例如常规的拔牙、牙齿矫正和牙齿移植。
附图说明
[图1]图1示出了在实施例中用作抗原的源自大肠杆菌的重组人UASG-1蛋白的Wnt抑制活性。
[图2]图2示出了在实施例中用作抗原的源自大肠杆菌的重组人UASG-1蛋白的BMP抑制活性。
[图3]图3示出了使用CRISPR-CAS9新建立的USAG-1KO小鼠。
[图4-1]图4-1示出了抗USAG-1中和抗体的初步筛选结果。
[图4-2]图4-2示出了抗USAG-1中和抗体的初步筛选结果。
[图5]图5示出了在N末端具有PA标签的小鼠USAG-1(WISE)的纯化和浓缩结果。
[图6]图6示出了小鼠USAG-1蛋白的剂量依赖性WNT信号传导抑制活性。
[图7]图7示出了小鼠USAG-1蛋白的剂量依赖性BMP信号传导抑制活性。
[图8]图8示出了抗体以剂量依赖性方式中和小鼠USAG-1的WNT信号传导抑制活性。
[图9]图9示出了抗体以剂量依赖性方式中和小鼠USAG-1的BMP信号传导抑制活性。
[图10]图10示出了抗USAG-1中和抗体使得在牙齿发育不全模型小鼠中长出牙齿。
[图11]图11示出了抗-USAG-1中和抗体具有与USAG-1KO相同的效果。
[图12]图12示出了小鼠抗-USAG-1抗体与小鼠/人USAG-1蛋白结合的实验结果。
[图13]图13示出了用小鼠抗USAG-1抗体在瞬时强制表达人FLAG-标记的USAG-1的HEK293细胞中进行的免疫染色。
[图14]图14示出了抗体A和抗体B的重链和轻链可变区的序列。
[图15]图15示出了小鼠抗-USAG-1抗体与小鼠/人USAG-1蛋白结合的实验结果。
[图16]图16示出了获得的6种抗体的竞争结合数据。在该图中，6种测试抗体中的每一种与由6种抗体捕获的USAG-1的传感器反应时获得的传感图被叠加。
[图17]图17示出了本发明的抗体对小鼠USAG-1的WNT信号传导抑制活性和BMP信号传导抑制活性的中和活性。
[图18]图18提供了牙科X射线照片，示出了施用USAG-1中和抗体对患有先天性牙齿发育不全的犬的影响。
[图19]图19提供了μCT图像和3D重建图像，示出了通过在雪貂中施用USAG-1中和抗体，在下颌第三前臼齿部位诱导第三牙列。
[图20]图20提供了μCT图像和3D重建图像，示出了通过在臭鼩属中施用USAG-1中和抗体，在下颌第三前臼齿部位诱导第三牙列。
[图21]图21示出了抗体C的重链和轻链可变区的序列。
[22]图22示出了抗体D和抗体E的重链和轻链可变区的序列。
[图23]图23提供了μCT切片图像和3D重建图像，示出了通过在雪貂中施用USAG-1中和抗体在上颌前牙部位诱导第三牙列。
[24]图24提供了基于μCT数据创建的3D重建图像，示出了通过在雪貂中施用USAG-1中和抗体在下颌前臼齿部位诱导第三牙列。
[图25]图25示出了本发明的抗体对小鼠USAG-1的WNT信号传导抑制活性和BMP信号传导抑制活性的中和活性。
[图26]图26示出了拉下(pull-down)测定的结果，示出了小鼠抗-USAG-1抗体与小鼠USAG-1蛋白的复合物与LRP6-E1E2结构域之间的相互作用。
实施本发明的方式
USAG-1(子宫增敏相关基因-1)(Uterine Sensitization Associated Gene-1)是一种骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂和Wnt拮抗剂，也称为Sostdc-1、Ectodin或Wise。众所周知，在USAG-1缺陷模型小鼠中，观察到BMP信号的增加，导致多生牙的形成。本发明人将作为先天性牙齿发育不全模型小鼠的Runx2缺陷型小鼠与作为多生牙模型小鼠(牙齿数量超过正常齿数)的USAG-1基因缺陷型小鼠进行杂交，产生了双敲除小鼠。作为双敲除小鼠的分析结果，发现牙齿形成得以恢复。因此，暗示抑制USAG-1可以治疗牙齿发育不全。
此次，本发明人将缺乏除Runx2以外的致病基因Msx1、Eda和Wnt10a的先天性牙齿发育不全模型小鼠与通过CRISPER-CAS9系统新创建的USAG-1基因缺陷小鼠作为多生牙模型小鼠进行杂交，以产生双敲除小鼠。作为双敲除小鼠的分析结果，发现所有牙齿发育不全模型小鼠的牙齿形成都恢复了。由此表明，通过抑制USAG-1的治疗可以应用于由各种基因突变引起的先天性牙齿发育不全的患者。
然后，在本发明中，将活性得到证实的人USAG-1重组蛋白用作抗原以产生抗体。因此获得了与USAG-1特异性结合的抗体。发现这些抗体可增加BMP信号传导和/或Wnt信号传导。
因此，本发明的一个方面提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，即抗USAG-1中和抗体及其抗原结合片段。如本文所用，除非另有说明，否则USAG-1是指哺乳动物USAG-1。哺乳动物的实例包括但不限于人、狗、猫、马、小鼠、雪貂、臭鼩属(suncus)、猪和猴子，优选人。
如本文所用，中和是指抑制USAG-1的功能。USAG-1的功能包括例如BMP信号抑制活性(也称为“BMP拮抗剂活性”)和Wnt信号抑制活性(也称为“Wnt拮抗剂活性”)。本公开的抗体或其抗原结合片段抑制USAG-1的BMP信号传导抑制活性和/或Wnt信号传导抑制活性。因此，本公开的抗体或其抗原结合片段中和了USAG-1的BMP信号传导抑制活性和USAG-1的Wnt信号传导抑制活性中的一个或两个。例如，本公开的抗体或其抗原结合片段包括但不限于特异性结合USAG-1并中和USAG-1的BMP信号传导抑制活性且不中和USAG-1的Wnt信号抑制活性的抗体或其抗原结合片段，以及特异性结合USAG-1以中和USAG-1的Wnt信号抑制活性且不中和USAG-1的BMP信号抑制活性的抗体或其抗原结合片段。如本文所用，“抑制”包括阻制和减少。
抗体或抗原结合片段的中和活性可以通过常规方法确定。中和USAG-1的BMP拮抗剂活性的活性(也称为“BMP拮抗剂中和活性”)可以通过例如ALP(碱性磷酸酶)测定法或报告基因测定法在体外测量。在ALP测定中，例如，在BMP的存在下，添加USAG-1蛋白质和抗体或其抗原结合片段，培养成骨细胞祖细胞等，测定诱导分化成成骨细胞时产生的ALP。中和USAG-1的Wnt拮抗剂活性的活性(也称为“Wnt拮抗剂中和活性”)可以在体外测定，例如，通过报告基因测定。在报告基因测定中，例如，将含有与BMP或Wnt反应、与报告基因如萤光素酶连接的启动子区的载体引入细胞中，在BMP或Wnt的存在下培养细胞并加入USAG-1蛋白和抗体或其抗原结合片段，并测量表达的萤光素酶活性。将被本公开的抗-USAG-1抗体或其抗原结合片段中和的BMP拮抗剂活性可以是针对任何BMP家族的拮抗剂活性。例如，本公开的抗-USAG-1抗体或其抗原结合片段可以中和针对BMP2、BMP4、BMP6、BMP7等的拮抗剂活性。将被本公开的抗-USAG-1抗体或其抗原结合片段中和的Wnt拮抗剂活性可以是针对任何Wnt家族的拮抗剂活性。例如，本公开的抗USAG-1抗体或其抗原结合片段可以中和针对Wnt-1、Wnt-3等的拮抗剂活性。
此外，在本发明中，对得到的抗体A、抗体B、抗体C、抗体D和抗体E这5种抗体进行测序和分析。然后，确定每种抗体的可变区和互补决定区。抗体A包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:1所列出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:2所列出的氨基酸序列，并且所述重链包含重链可变区(SEQ ID NO:3)，所述重链可变区包含重链互补决定区，所述重链互补决定区包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所列出的氨基酸序列，并且所述轻链包含轻链可变区(SEQ ID NO:4)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出。抗体B包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:11所列出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:12所列出的氨基酸序列，并且所述重链包含重链可变区(SEQ ID NO:13)，所述重链可变区包含重链互补决定区，所述重链互补决定区在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出，并且所述轻链包含轻链可变区(SEQ ID NO:14)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中列出。抗体C包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:21所列出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:22所列出的氨基酸序列，并且所述重链包含重链可变区(SEQ ID NO:23)，所述重链可变区包含重链互补决定区，所述重链互补决定区在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出，并且所述轻链包含轻链可变区(SEQ ID NO:24)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中列出。抗体D包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:38所列出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO:39所列出的氨基酸序列，并且所述重链包含重链可变区(SEQ ID NO:40)，所述重链可变区包含重链互补决定区，所述重链互补决定区在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出，并且所述轻链包含轻链可变区(SEQ ID NO:41)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出。抗体E包含重链和轻链，所述重链包含SEQ ID NO:48所列出的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ IDNO:49所列出的氨基酸序列，并且所述重链包含重链可变区(SEQ ID NO:50)，所述重链可变区包含重链互补决定区，所述重链互补决定区在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ IDNO:54中列出，并且所述轻链包含轻链可变区(SEQ ID NO:51)，所述轻链可变区包含轻链互补决定区，所述轻链互补决定区在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中列出。抗体A、抗体B和抗体C特别具有BMP拮抗剂中和活性。抗体C特别具有BMP拮抗剂中和活性和Wnt拮抗剂中和活性两者。抗体D和抗体E特别具有Wnt拮抗剂中和活性。
因此，在本发明的一个方面，提供抗体A、抗体B、抗体C、抗体D和抗体E及其突变体作为本公开的抗体或其抗原结合片段。抗体A或其突变体的实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选地提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列组成。
抗体A或其突变体的另一个实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:ID NO 6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:ID NO 6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列组成。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:4中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列组成。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:ID NO 6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:ID NO 6和SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:3中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:4中所列出的氨基酸序列组成。
抗体A或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:4中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:3中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:4中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体B或其突变体的实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，并包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选的是提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列组成。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:ID NO 16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:ID NO16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:14中所列出的氨基酸序列组成。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:20中所列出的氨基酸序列组成。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:ID NO 16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:ID NO16和SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:14中所列出的氨基酸序列组成。
抗体B或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:13中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:14中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体C或其突变体的实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选的是提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列组成。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:ID NO 26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:ID NO26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体C或突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:24中所列出的氨基酸序列组成。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30中所列出的氨基酸序列组成。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:ID NO 26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:ID NO26和SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:23中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:24中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:24中所列出的氨基酸序列组成。
抗体C或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:23中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:24中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体D或其突变体的实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选的是提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列组成。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:ID NO43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:ID NO 43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体D或突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与在SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1并包含重链可变区或轻链可变区的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区由在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQID NO:41中所列出的氨基酸序列组成。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ IDNO:47中所列出的氨基酸序列组成。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:ID NO 43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与在SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:41中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列组成。
抗体D或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:40中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:41中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体E或其突变体的实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选的是提供特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列组成。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区或三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:ID NO 53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体E或突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与在SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ IDNO:51中所列出的氨基酸序列组成。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含与分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由与分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ IDNO:57中所列出的氨基酸序列组成。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列，所述三个轻链互补决定区包含分别在SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述重链互补决定区由分别在SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:53和SEQ ID NO:54中所列出的氨基酸序列组成，所述三个轻链互补决定区由分别在SEQID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与在SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与在SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列。更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由与在SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:51中列出的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的氨基酸序列组成。还更优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列组成。
抗体E或其突变体的进一步实例包括特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列，所述轻链可变区包含在SEQ ID NO:51中所列出的氨基酸序列，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。优选提供的是特异性结合并中和USAG-1的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由在SEQ ID NO:50中所列出的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由在SEQID NO:51中所列出的氨基酸序列组成，并且包含上述氨基酸序列中的至少一个中一个至数个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
如本文所用，术语“数个”是指约2至10个，并且优选地是指(取决于氨基酸序列的长度)约2至7个，例如3、4、5或6个。如本文所用，“取代”可以是保守或非保守取代，优选保守取代。保守取代是本领域技术人员已知的，是指不影响所得分子的生物学活性的取代。保守氨基酸取代的实例包括丙氨酸取代为甘氨酸或丝氨酸、精氨酸取代为赖氨酸或组氨酸、天冬酰胺取代为谷氨酰胺或组氨酸、天冬氨酸取代为谷氨酸或天冬酰胺、半胱氨酸取代为丝氨酸或丙氨酸、谷氨酰胺取代为天冬酰胺、谷氨酸取代为天冬氨酸或谷氨酰胺、甘氨酸取代为丙氨酸、组氨酸取代为天冬酰胺或谷氨酰胺、异亮氨酸取代为亮氨酸或缬氨酸、亮氨酸取代为异亮氨酸或缬氨酸、赖氨酸取代为精氨酸或组氨酸、甲硫氨酸取代为亮氨酸、异亮氨酸或酪氨酸、苯丙氨酸取代为酪氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸、脯氨酸取代为丙氨酸、丝氨酸取代为苏氨酸、苏氨酸取代为丝氨酸、色氨酸取代为酪氨酸或苯丙氨酸、酪氨酸取代为色氨酸或苯丙氨酸，和缬氨酸取代为异亮氨酸或亮氨酸。
如本文所用，可以根据常规方法在两个序列的最佳比对中确定序列同一性。例如，序列同一性可以使用本领域已知的算法来确定，例如BLAST或FASTA。本公开的抗体或其抗原结合片段可包含上述序列同一性范围内的氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加。
此外，在本发明的另一个方面，提供与抗体A、抗体B、抗体C、抗体D或抗体E、或其突变体或其抗原结合片段所结合的USAG-1上的表位的全部或部分相同的表位结合的抗体或其抗原结合片段，作为本公开的抗体或其抗原结合片段。此外，本发明提供与抗体A、抗体B、抗体C、抗体D或抗体E或其突变体或其抗原结合片段竞争结合USAG-1或与USAG-1上的表位的全部或部分竞争结合的抗体或其抗原结合片段。
此外，在本发明中，发现抗体A识别并结合包含人USAG-1上的VNDKTRTQRI(SEQ IDNO:31)的多肽(表位)(对应于人USAG-1蛋白的第134至143个氨基酸的序列)。因此，与包含在SEQ ID NO:31所列出的氨基酸序列的USAG-1多肽结合的抗体或其抗原结合片段也是本公开的抗体或其抗原结合片段的一个方面。此外，与抗体A或其突变体或其抗原结合片段竞争结合包含在SEQ ID NO:31所列出的氨基酸序列的USAG-1多肽的抗体或其抗原结合片段也是本公开的抗体或其抗原结合片段的一个方面。例如，USAG-1多肽可以是由在SEQ IDNO:31所列出的氨基酸序列组成的多肽。包含在SEQ ID NO:31所列出的氨基酸序列的USAG-1多肽可以是与包含在SEQ ID NO:31所列出的氨基酸序列的USAG-1多肽基本相同的多肽。基本上相同的多肽的实例包括位于除人以外的动物的USAG-1蛋白上相应位置的多肽。
如本文所用，术语“竞争”是指抗体或其抗原结合片段与参考抗体(例如，抗体A、抗体B、抗体C、抗体D、抗体E或其突变体，或其抗原结合片段)在使用USAG-1蛋白或多肽的结合测定中竞争。例如，如果测试抗体或其抗原结合片段在结合测定中降低参考抗体与USAG-1蛋白或多肽的结合，则测试抗体与参考抗体“竞争”。例如，与参考抗体竞争的抗体将参考抗体与抗原蛋白或多肽的结合降低至少约40％，优选至少约50％，更优选至少约60％，还更优选至少约80％，或还更优选至少90％。竞争性结合测定可以通过本领域已知的方法进行，包括但不限于ELISA、流式细胞术、SPR(表面等离振子共振)和BLI(生物层干涉法)。
表位分箱是一种根据其表位对两种或多种抗体进行分类的技术，例如，通过使用SPR或BLI。例如，在表位分箱中，将抗原蛋白(靶标)添加到生物传感器中，在该生物传感器上固定有参考抗体，以允许参考抗体结合靶标，保持参考抗体和靶标的复合物的生物传感器与测试抗体反应，然后分析测试抗体与生物传感器结合(即测试抗体与固定在生物传感器上的参考抗体捕获的靶标结合)和结合的解离。如果测试抗体与参考抗体共享相同的表位，则测试抗体无法与生物传感器结合，因为靶标上的表位已被参考抗体的结合占据。相反，如果测试抗体识别的表位与参考抗体识别的表位不同，则测试抗体可以与生物传感器结合。此外，如果测试抗体识别空间上接近由参考抗体识别的表位的区域，则测试抗体不能与生物传感器结合，因为参考抗体与靶标的结合会干扰测试抗体与表位的结合。因此，表位分箱的使用能够确定两个或更多个抗体克隆是否竞争结合靶蛋白。
本公开的抗体或其抗原结合片段以例如1μM或更小，优选100nM或更小，更优选地50nM或更小，还更优选30nM或更小，还更优选10nM或更小，还更优选8nM或更小，或者还更优选5nM或更小的KD结合USAG-1或USAG-1上的表位的全部或部分。
在本发明中，抗体优选为分离的抗体。在本发明中，抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在本发明中，抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(CDR)被来自具有所需特异性、亲和力和结合能力的非人物种(供体抗体)的CDR的残基取代。任选地，人免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基可以被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。通常，人源化抗体包含至少一个可变区，通常两个可变区，其中所有或基本上所有CDR被非人免疫球蛋白CDR替换，并且所有或基本上所有FR区由人免疫球蛋白序列组成。嵌合抗体包括通过基因重组技术产生的抗体，其中来自供体抗体的可变区与受体抗体的恒定区连接。上述抗体可以通过本领域已知的方法产生。
在本发明中，抗原结合片段的实例包括但不限于F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、rIgG、Fd、线性抗体、ScFv、Fv-clasp、微抗体、双抗体、三抗体、四抗体、单域抗体(纳米抗体)和由抗体片段形成的多特异性抗体。可以通过本领域已知的方法制备抗体片段。
编码本公开的抗体或其抗原结合片段的分离的核酸也包括在本发明中。
本公开的抗体或其抗原结合片段与USAG-1特异性结合，以抑制USAG-1的功能，进而诱导牙齿形成。因此，本发明的另一方面提供了一种用于牙齿再生治疗的药物组合物，其包含本公开的抗体或其抗原结合片段。牙齿再生包括例如缺牙的再生(缺牙的修复)和新牙如第三牙列的形成。
除了本公开的抗体或其抗原结合片段之外，本公开的药物组合物还可以含有药学上可接受的载体，以及添加剂例如稳定剂或赋形剂。药学上可接受的载体的实例包括但不限于生理盐水、缓冲液、乙二醇、甘油、明胶、明胶水凝胶、聚乳酸、胶原海绵、琼脂糖、聚乙烯醇、海藻酸、纤维蛋白凝胶、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物，以及乳酸-乙醇酸共聚物。添加剂的实例包括但不限于碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂和低分子量蛋白质。本领域技术人员可以根据药物组合物的施用形式、施用途径等适当地选择如上所述的载体和添加剂。本公开的药物组合物可以通过常规方法使用抗体或其抗原结合片段以及适当的添加剂来制备。
本公开的药物组合物的形式的实例包括片剂、粉末、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、缓释片剂、缓释胶囊剂、肠溶包衣药物、嵌合药物、输注剂和注射剂。其优选的实例是注射剂。本公开的药物组合物是全身或局部施用的。本领域技术人员可以适当地选择施用途径，其实例包括但不限于口服、鼻腔、皮下、静脉内、肌内和骨内施用。本公开的药物组合物可局部施用至例如牙齿形成部位。
在本发明中，牙齿再生治疗包括先天性牙齿发育不全的治疗和后天性牙齿缺失的治疗。可以用本公开的药物组合物治疗的先天性牙齿发育不全没有特别限制，还可以包括任何致病基因引起的先天性牙齿发育不全。可用本公开的药物组合物治疗的先天性牙齿发育不全的实例包括但不限于其致病基因为RUNX2、MSX1、EDA、WNT10A、PAX9或AXIN2的先天性牙齿发育不全。其优选实例包括其致病基因为RUNX2、MSX1、EDA或WNT10A的先天性牙齿发育不全。此外，本公开的抗体在野生型小鼠中诱导了多生牙的形成。因此，即使在牙齿发育不全的致病基因不缺陷的正常个体和出生后牙齿缺失的个体中，本公开的药物组合物也可以诱导牙齿形成。
本公开的药物组合物可以施用至哺乳动物。哺乳动物的实例包括人、狗、猫、马、小鼠、雪貂、臭鼩属(suncus)、猪和猴子。其优选的实例是人。
本公开的药物组合物的剂量没有特别限制。本领域技术人员可以根据药物组合物中所含的本公开的抗体或其抗原结合片段的量、施用对象的体重等适当确定剂量，从而可以施用所需剂量的本公开的抗体或其抗原结合片段。例如，本公开的抗体或其抗原结合片段以产生中和活性的量施用，使得与不施用本公开的抗体或其抗原结合片段的情况相比，使得BMP信号传导增加至少30％，优选至少60％和/或以产生中和活性的量施用，使得Wnt信号传导增加至少30％，优选至少60％。中和活性可以基于通过例如ALP测定或报告基因测定在体外测量的活性来确定。
本发明的进一步方面提供了再生牙齿的方法，该方法包括将本公开的抗体或其抗原结合片段施用于有需要的受试者。上述药物组合物可用作本公开的抗体或其抗原结合片段。需要的受试者是具有牙齿缺失的受试者，受试者的实例包括如上所述的哺乳动物。本公开的抗体或其抗原结合片段的施用途径和剂量，以及牙齿再生的治疗方法如上文对本公开的药物组合物所述。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明，本发明不限于这些实施例。
实施例1
抗体1的制备
为了制备小鼠USAG-1中和抗体，使用源自大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统(R&D systems)的人USAG-1蛋白作为抗原。在使用HEK293细胞的Wnt报告基因测定中，证实了源自大肠杆菌表达系统的人USAG-1蛋白的Wnt抑制活性(图1)。在使用C2C12细胞添加BMP7的ALP测定中，证实了源自大肠杆菌表达系统的人USAG-1蛋白的BMP抑制活性(图2)。为了制备小鼠USAG-1中和抗体，使用CRISPR-CAS9新建立了三个多生牙模型小鼠USAG-1KO小鼠系(#116、#118、#138)(图3)。中和抗体是在ITM Co.,Ltd.中使用USAG-1 KO(#116)小鼠通过髂淋巴结法制备的。
使用免疫抗原通过ELISA对284个孔进行初筛，发现大量阳性孔(图4-1和图4-2)。基于0.7的截止值，选择了79个克隆。扩增后，使用免疫抗原和源自Sysmex Corporation制备的CHO细胞表达系统的小鼠USAG-1蛋白进行ELISA。当吸光度的截止值设定为0.025或更高时，在大约一半的克隆中发现了阳性孔(图4-1和图4-2)。作为抗体亚类的测量结果，发现它们是IgG1、2a、2b和2c(图4-1和图4-2)。
各抗体的中和活性如下确认。在实验系统中，通过添加300ng/ml的BMP7(由R&Dsystems制造)增加的C2C12细胞中的ALP活性，被添加了300ng/ml源自哺乳动物细胞表达系统的大鼠USAG-1蛋白(由MyBiosource制造)抑制，添加每种抗体以确认抑制的ALP活性的中和。将抗体分为具有轻度中和活性的组(*：60-100％中和活性)、具有中等中和活性(**：100-140％中和活性)的组和具有高度中和活性(***：140％或更高的中和活性)的组。对于BMP报告基因测定，使用结合了BRE-Luc的市售细胞系BMP反应性报告基因成骨细胞系(Briter cell)(由Kerafast，Inc.制造)。在通过添加300ng/ml来自哺乳动物细胞表达系统的大鼠USAG-1蛋白来抑制通过添加300ng/ml BMP7表达的萤光素酶活性的实验系统中，添加每种抗体以确认抑制的萤光素酶活性的中和。将抗体分为具有轻度中和活性(*：40-60％中和活性)的组和具有中度中和活性(**：60％或更高中和活性)的组。对于WNT报告基因测定，将用于表达TOP-Flash报告基因的表达质粒引入HEK293细胞中，所述表达质粒具有与激活WNT信号传导下游的转录因子TCF结合的DNA序列、WNT1基因和在HSV-胸苷激酶启动子控制下的报告基因，用于获得内标值，并在细胞培养时加入源自哺乳动物细胞表达系统的大鼠USAG-1蛋白，其浓度为对Wnt信号传导产生50％的最大抑制作用的浓度(EC50)。USAG-1蛋白的添加量预先确定。将产生抗体的杂交瘤的培养上清液添加到细胞中，使其在用于筛选的培养基中为25％、20％或10％。实验进行了3次以进行评估。当以25％添加时，抗体分为具有轻度中和活性的组(*：发光校正值1.5-2.0)和具有中度中和活性的组(**：发光校正值2.0或者更多)。当以20％添加时，抗体分为具有轻度中和活性的组(*：发光校正值1-1.1)和具有中度中和活性的组(**：发光校正值1.1或者更多)。当以10％添加时，抗体分为具有轻度中和活性的组(*：发光校正值1-1.1)和具有中度中和活性的组(**：发光校正值1.1或者更多)。根据未添加USAG-1蛋白条件下的活性(100％)计算中和活性％。计算基于发光值的中和活性作为相对于未添加抗体时的活性(1)的值。
通过WNT和BMP报告基因测定和BMP7 ALP测定的测量，存在三种类型的中和抗体：激活BMP或WNT信号传导的抗体，以及同时激活BMP和WNT信号传导的抗体。基于中和活性的测量结果选择六种抗体(图4-1和图4-2)。一个克隆的活性在扩增和纯化过程中消失。最后获得了5种小鼠抗USAG-1中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)。
其中，对E37(称为抗体A)和E57(称为抗体B)进行了测序。抗体A的包含信号序列的全长重链序列和包含信号序列的全长轻链序列分别显示在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。抗体B的包含信号序列的全长重链序列和包含信号序列的全长轻链序列分别显示在SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12中。抗体A和B的可变区显示在图14中。
实施例2
抗体的体外试验-1
N末端添加PA标签的小鼠USAG-1(WISE)重组蛋白在Expi293F细胞中瞬时表达，建立稳定表达系。使用PA标签系统进行亲和纯化，从150mL培养上清液中获得0.2mg PA-mUSAG-1(WISE)(图5)。经还原(R)和非还原(NR)电泳显示纯化的PA-mUSAG-1(WISE)蛋白的分子量约为28kDa，接近理论值(24kDa)。源自哺乳动物细胞Expi293F细胞表达系统的N末端PA标记的小鼠USAG-1(WISE)蛋白在WNT报告基因测定中显示出剂量依赖性WNT信号传导抑制活性(图6)和在BMP ALP测定中显示出剂量依赖性BMP信号传导抑制活性(图7)。使用确认了活性的小鼠USAG-1蛋白来确认5种小鼠抗USAG-1中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)的中和活性。在WNT报告基因测定中，将导入了含有与启动子连接的萤光素酶基因的载体和用于表达Wnt1的载体的细胞在添加了1.7μg的小鼠USAG-1重组蛋白和抗体的培养基中培养，抗体的量为培养基的1/1000、1/300或1/100，测量萤光素酶活性。在BMP ALP测定中，C2C12细胞与30ng/ml小鼠USAG-1重组蛋白和1倍(30ng/ml)、10倍(300ng/ml)或100倍(3μg/ml)量的抗体在存在30ng/ml BMP7的情况下培养，并测量ALP活性。
结果，在WNT报告基因测定中，发现存在剂量依赖性地中和小鼠USAG-1的WNT信号传导抑制活性的抗体(图8)。在BMP ALP测定中，发现存在剂量依赖性地中和小鼠USAG-1的BMP信号传导抑制活性的抗体(图9)。
实施例3
抗体的体内施用试验-1
具有纯合EDA缺陷的先天性牙齿发育不全模型小鼠具有高损失(约90％)的下颌第三臼齿(M3)。对怀有由于EDA缺陷的先天性牙齿发育不全模型小鼠的母鼠腹膜内施用单剂量的小鼠抗USAG-1中和抗体A(E37)。结果，8只出生的EDA缺陷小鼠中有7只恢复了下颌第三臼齿(M3)的缺失(图10)。在施用小鼠抗-USAG-1中和抗体A的EDA缺陷型先天性牙齿发育不全模型小鼠中未观察到多生牙。因此，发现抗体A可以修复缺失的牙齿。在这里，术语“恢复”是指出生的EDA缺陷小鼠在EDA缺陷小鼠通常会缺失牙齿的部位(不缺失M3)具有牙齿。
实施例4
抗体的体内施用试验-2
对怀有由于EDA缺陷的先天性牙齿发育不全模型小鼠的母鼠腹膜内施用单剂量的小鼠抗USAG-1中和抗体B(E57)。结果，在3只出生的EDA缺陷纯合小鼠中的2只中诱导了在前牙部位形成多生牙或在上颌臼齿部位形成融合牙(图10)。在5只出生的EDA缺陷杂合子小鼠中，有5只观察到前牙部位的多生牙或臼齿部位的融合牙。此外，当将小鼠抗-USAG-1中和抗体B(E57)以单剂量腹膜内施用至怀有野生型小鼠的母鼠时，在12只出生的野生型小鼠中的11只中观察到前牙部位的多生牙或臼齿部位的融合牙。因此，发现抗体B可以增加EDA缺陷纯合小鼠、EDA缺陷杂合小鼠和野生型小鼠的牙齿数量。
实施例5
抗体的体内施用试验-3
将实施例1中获得的包括抗体A和B在内的五种抗-USAG-1中和抗体的混合物以单剂量腹膜内施用至怀有Wnt10a缺陷型小鼠(该小鼠是牙齿发育不全模型小鼠)的母鼠。结果，在上颌前牙部位形成了多生牙(图10)。
实施例6
抗体识别人USAG-1的数据
进行本实施例以确认使用在实施例1中源自大肠杆菌表达系统的人USAG-1蛋白作为抗原获得的五种小鼠抗-USAG-1(WISE)中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)识别人USAG-1蛋白。使用小鼠/人N末端PA标记的USAG-1蛋白进行结合测定。将实施例1中获得的五种小鼠抗USAG-1(WISE)中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)中的每一种(1ml PBS中的5μg)捕获在蛋白A琼脂糖凝胶(30μl)上(室温，2.5小时)。将瞬时表达人或小鼠N末端PA标记的USAG-1(WISE)重组蛋白的Expi293F细胞的培养上清液(1mL)和NZ1琼脂糖(30μl)添加到蛋白A琼脂糖中，然后孵育(室温，2.5小时)。用PBS缓冲液洗涤3次以去除未结合的蛋白质。与琼脂糖凝胶结合的所有蛋白质均被洗脱，通过SDS-PAGE电泳检测条带。结果发现，所有五种抗体不仅与小鼠USAG-1结合，而且与人USAG-1蛋白结合(图12)。
此外，人FLAG标记的USAG-1cDNA在HEK293细胞中瞬时强制表达，然后使用5种小鼠抗USAG-1中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)进行免疫染色。结果，当使用中和抗体(E12、E37、E57)时，观察到明显的阳性反应。因此，发现在体内确认了效力的小鼠抗USAG-1中和抗体A(E37)和小鼠抗USAG-1中和抗体B(E57)均识别人USAG-1蛋白(图13)。
实施例7
抗体的制备-2
为了制备小鼠USAG-1中和抗体，使用源自杆状病毒表达系统的大鼠USAG-1蛋白作为抗原。使用USAG-1KO(#116)小鼠通过髂淋巴结法制备中和抗体。源自杆状病毒表达系统的大鼠USAG-1蛋白显示出以与实施例1中所述相同的方式具有BMP抑制活性和Wnt抑制活性。使用免疫抗原(源自杆状病毒表达系统的大鼠USAG-1蛋白)和源自大肠杆菌表达系统的人USAG-1蛋白，通过ELISA对获得的抗体克隆进行初步筛选，并获得大量阳性孔。基于1.0的截止值，选择了111个克隆。扩增后，使用免疫抗原对克隆进行夹心ELISA。当吸光度的截止值设置为0.5或更大(His标签)或1.4或更大(Myc标签)时，在大约一半的克隆中发现了阳性孔。作为抗体亚类的测量结果，发现它们是IgG1、2a、2b和G3。此外，以与实施例1中所述相同的方式测量获得的抗体的中和活性。最后，获得了四种类型的小鼠抗-USAG-1中和抗体(B14、B48、B103、B108)。
此外，以与实施例6相同的方式，使用小鼠/人N末端PA标记的USAG-1蛋白进行结合测定以确认获得的小鼠抗-USAG-1中和抗体(B14、B48、B103、B108)识别人USAG-1蛋白。每种小鼠抗USAG-1中和抗体[5μg在250μl蛋白A/G IgG结合缓冲液(PierceTM)+250μl PBS中]被捕获在蛋白A琼脂糖(30μl)上(室温，1.5小时)。将瞬时表达人或小鼠N末端PA标记的USAG-1(WISE)重组蛋白的Expi293F细胞的培养上清液(0.75mL)添加到蛋白A琼脂糖凝胶中，然后孵育(室温，2小时)。用PBS缓冲液洗涤3次以去除未结合的蛋白质。与琼脂糖结合的所有蛋白质均被洗脱，通过SDS-PAGE电泳和CBB(考马斯亮蓝)染色检测条带。结果，所有测试的小鼠抗-USAG-1中和抗体均与小鼠USAG-1和人USAG-1蛋白结合(图15)，虽然B103和B108的结合弱于B14和B48。
其中，对B14(称为抗体C)进行测序。抗体C的包含信号序列的全长重链序列和包含信号序列的全长轻链序列分别显示在SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中。抗体C的可变区显示在图21中。此外，对B48(称为抗体D)和B103(称为抗体E)进行了测序。抗体D和E的包含信号序列的全长重链序列分别显示在SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:48中。抗体D和E的包含信号序列的全长轻链序列分别显示在SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:49中。抗体D和E的可变区显示在图22中。
实施例8
表位分箱
将实施例1中选择的5种小鼠USAG-1中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57)和实施例7中制备的中和抗体(B14、B48、B103、B108)进行表位分箱。图16显示了获得的竞争结合数据中6种抗体的比较。使用Octet(注册商标)Red(由Pall ForteBio制造)进行表位分箱。简而言之，将九种抗体中的每一种作为捕获抗体固定在生物传感器上，加入包含纯化的全长重组小鼠USAG-1的靶标以结合捕获抗体，然后将生物传感器与测试抗体反应以检测结合信号。使用9种测试抗体(包括用于捕获的相同抗体)连续重复该循环。不与固定在生物传感器上的捕获抗体竞争识别位点的抗体可以与捕获的USAG-1蛋白结合，因此信号增加。相反，竞争性抗体与捕获的USAG-1蛋白结合较弱，因此观察到信号没有增加或微量增加。基于获得的信号数据，9种抗体基于它们的表位进行分组。具体地，在测试抗体与固定有九种捕获抗体中任一种的传感器的反应中，当反应产生的信号等于或弱于当添加与捕获抗体相同的抗体时产生的信号(由图16中的粗下划线表示)时，将测试抗体视为与捕获抗体属于同一组。结果，E37和E48与E12抗体竞争，E48、E57和B14与E16抗体竞争，E12与E37抗体竞争，E16、E57和B14与E48抗体竞争，E16、E48和B14与E57抗体竞争、E16、E48和E57与B14抗体竞争，和B108与B103抗体竞争。根据这些结果，将9种抗体分为4组，如表1所示。然而，E48抗体也接近第1组，因为它与E12竞争，尽管E48抗体基本上被归入第2组。
[表1]
实施例9
表位作图
对第1组的抗体E37(中和抗体A)进行表位作图。简而言之，基于不包括信号肽的人USAG-1蛋白序列(183个氨基酸长度)，通过将15个氨基酸序列从开头移动一个氨基酸来合成169个15个氨基酸的重叠肽以制备肽文库。将169种肽结合在纤维素膜上，以制备肽阵列。添加E37抗体(0.3μg/ml)作为一抗并孵育。洗涤后，加入HRP缀合的抗小鼠抗体(1/25000稀释度)作为二抗，用ECL溶液显色。
结果，发现E37抗体与6种肽：QEWRCVNDKTRTQRI(SEQ ID NO:32)、EWRCVNDKTRTQRIQ(SEQ ID NO:33)、WRCVNDKTRTQRIQL(SEQ ID NO:34)、RCVNDKTRTQRIQLQ(SEQ ID NO:35)、CVNDKTRTQRIQLQC(SEQ ID NO:36)和VNDKTRTQRIQLQCQ(SEQ ID NO:37)特异性结合。因此，氨基酸序列：VNDKTRTQRI(SEQ ID NO:31)(对应于包含信号肽的全长USAG-1氨基酸序列的134至143位)被鉴定为表位。
实施例10
抗体的体外试验-2
对于实施例8中分组的9种抗体中的8种，通过使用与实施例8中相同的基于Octet的BLI方法确定亲和力(KD值)。具体而言，将每种抗体固定在生物传感器上，加入三种不同浓度(10nM、30nM、100nM)的纯化的重组小鼠USAG-1蛋白，得到结合和解离曲线。通过使用附加到Octet设备的分析程序对获得的曲线进行全局拟合来计算亲和力。结果如表2所示。
[表2]
| 抗体 | KD(nM) |
| E12 | 3.86 |
| E16 | 7.15 |
| E37(中和抗体A) | 2.43 |
| E48 | 3.92 |
| E57(中和抗体B) | 2.44 |
| B14(中和抗体C) | 4.21 |
| B48(中和抗体D) | 3.26 |
| B103(中和抗体E) | 4.97 |
实施例11
抗体的体外试验-3
测定了实施例8中分类为第2组的抗体B14的BMP和Wnt信号传导抑制中和活性。以与实施例2相同的方式进行实验。具体而言，在WNT报告基因测定中，将导入了含有与启动子连接的萤光素酶基因的载体和用于表达Wnt1的载体(1μg)的细胞在添加了1μg的小鼠USAG-1重组蛋白和所述抗体的培养基中培养，抗体的量为1.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、15.0或30.0μg/ml培养基，并测定萤光素酶活性。在BMP ALP测定中，C2C12细胞与30ng/ml小鼠USAG-1重组蛋白和30ng/ml、150ng/ml、300ng/ml或1500ng/ml抗体在存在30ng/ml BMP7的情况下培养，测定ALP活性。结果示于图17中。在WNT报告基因测定中，显示抗体B14中和USAG-1的WNT信号传导抑制活性(高达42％的中和活性)。在BMP ALP测定中，抗体B14显示中和USAG-1的BMP信号传导抑制活性。
进一步地，为了获得抗体B14对USAG-1对BMP和Wnt信号传导的抑制作用的EC50值，计算50％抑制时的浓度，其中不添加抗体的中和活性定义为0％，最大中和活性定义为100％。结果，针对BMP和Wnt信号传导抑制的EC50值分别为298ng/ml和4.73μg/ml。
实施例12
抗体的体内施用试验-4(小鼠)
将实施例8中分类为第1组和第2组的六种抗体以单剂量腹膜内施用至怀有EDA纯合缺陷型先天性牙齿发育不全模型小鼠、EDA杂合缺陷型先天性牙齿发育不全模型小鼠或野生型小鼠的母鼠。结果如表3所示。发现所有六种抗体均能在EDA缺陷小鼠中诱导多生牙和/或融合牙的形成，并增加EDA缺陷小鼠中的牙齿数量。特别是，第1组的抗体恢复了EDA缺陷小鼠中缺失的牙齿。当施用第1组的抗体时，在野生型小鼠中未观察到多生牙和融合牙的形成。相反，第2组的抗体E57和B14在野生型小鼠中诱导了多生牙和融合牙的形成。发现抗体B14(抗体C)和抗体E57(抗体B)增加了所有EDA纯合缺陷小鼠、EDA杂合缺陷小鼠和野生型小鼠的牙齿数量。在这里，术语“恢复”是指出生的EDA缺陷小鼠在EDA缺陷小鼠通常会缺失牙齿的部位(不缺失M3)有牙齿。
[表3]
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实施例13
抗体的体内施用试验-5(犬)
将抗小鼠USAG-1中和抗体B14(50μg/g体重)在出生后立即以单剂量腹膜内施用至先天性牙齿发育不全模型犬。先天性牙齿发育不全模型犬是东洋比格犬系的患有先天性牙齿发育不全的个体，得自KITAYAMA LABES CO.,LTD.,Hongo农场。先天性牙齿发育不全模型犬包括缺乏上颌第三前臼齿的个体和缺乏下颌第四前臼齿的个体。施用十周后，通过牙科X射线照相评估牙胚的钙化。结果，发现缺失的牙齿恢复了(图18)。结果如表4所示。此外，在抗体施用后3天、1周、3周、5周和7周测量每个个体中施用的抗体的血液浓度。结果，虽然存在个体差异，但半衰期为1周，血液中的抗体维持至施用后7周。
[表4]
从表4中可以清楚地看出，先天性缺失的前臼齿是通过单次全身施用USAG-1中和抗体B14而恢复的。下颌前臼齿缺失恢复率低可能是由于不同的致病基因所致。
实施例14
抗体的体内施用试验-6(雪貂)
雪貂像人类一样是双套牙哺乳动物，牙齿的数量按照由三颗门牙、一颗犬齿、三颗前臼齿和两颗臼齿组成的牙齿公式，这与哺乳动物的基本牙齿公式相似。包括实施例1和7中制备的抗体的39种USAG-1中和抗体(16μg/g体重)在出生后1周和3周腹膜内施用于39只雪貂(每种抗体一只雪貂)。出生14周后，有38只雪貂存活了下来。施用包括实施例8中鉴定的第1组至第4组的抗体的4种抗体的4只雪貂，长期观察直到出生后30周。结果，在两只或更多只雪貂的上颌和下颌前牙和前臼齿的部位观察到许多大尺寸的牙齿。此外，在施用B14抗体的雪貂中，出生后14周，在舌侧的下颌第三前臼齿的部位观察到第三牙列的诱导(图19)。在施用B103抗体的雪貂中，出生后30周，在上颌舌(腭)侧出现一颗以上的前牙，并且在上颌前牙部位观察到第三牙列的诱导(图23)。前牙在恒牙发育后发育，形态与前恒牙相似。前牙具有短牙根。此外，在施用了抗体B103的雪貂中，在出生后30周，在下颌左前臼齿和右前臼齿的部位观察到第三牙列的诱导(图24)。
实施例15
抗体的体内施用试验-7(臭鼩属)
获得怀孕的家臭鼩(house musk shrews)(臭鼩属)，在怀孕第17天，腹膜内施用实施例1中制备的各种USAG-1中和抗体(16μg/g体重)。出生七周后，通过μCT成像进行评估。接受了USAG-1中和抗体的家臭鼩没有生育。然而，在接受抗体B(E57)或抗体C(B14)的4至8个月大的家臭鼩中，观察到牙根周围形成了新牙齿，其中牙釉质上皮干细胞局部诱导上皮间质转化。在接受抗体B的家臭鼩中，在颊侧的下颌第一和第二前臼齿之间观察到第三牙列的诱导(图20)。因此，显示本发明的USAG-1中和抗体诱导第三牙列的形成。
实施例16
抗体的体外试验-4
测定了实施例8中分类为第3组的抗体B48的BMP和Wnt信号传导抑制中和活性。以与实施例2相同的方式进行实验。具体地，在WNT报告基因测定中，将导入了含有与启动子连接的萤光素酶基因的载体和用于表达Wnt1(1μg)的载体的细胞在添加了1μg的小鼠USAG-1重组蛋白和抗体的培养基中培养，抗体的量为1、3、6、10或30μg/ml培养基，测量萤光素酶活性。在BMP ALP测定中，C2C12细胞与30ng/ml小鼠USAG-1重组蛋白和1倍(30ng/ml)、10倍(300ng/ml)或100倍(3μg/ml)量的抗体在存在30ng/ml BMP7的情况下培养，并测量ALP活性。结果示于图25中。在WNT报告基因测定中，显示抗体B48中和USAG-1的WNT信号传导抑制活性几乎达100％。
实施例17
抗体的体外测试-5(使用PA标记的USAG-1和E1E2用蛋白A琼脂糖凝胶的拉下测定)
Wnt与卷曲蛋白(Frizzled)及其辅助受体(一种低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)5/6受体)结合，以在细胞中传递信号。LRP6具有四个细胞外结构域(E1至E4)。在这些结构域中，已知E1E2参与了USAG-1的结合。具体而言，USAG-1与LRP6的E1E2区域结合以抑制Wnt信号传导。因此，使用实施例8中分组的9种小鼠抗USAG-1中和抗体(E12、E16、E37、E48、E57、B14、B48、B103、B108)来确定USAG-1与LRP6-E1E2的结合是否被抑制。
每种小鼠抗USAG-1中和抗体(1ml PBS中的5μg)在蛋白A琼脂糖凝胶(30μl)上捕获(室温，1.5小时)。将瞬时表达N末端PA标记的小鼠USAG-1重组蛋白的Expi293F细胞的培养上清液(1mL)添加到蛋白A琼脂糖凝胶中，然后孵育(室温，2小时)。然后，加入表达LRP6-E1E2(人LRP6的氨基酸编号1至629的区域，与His标签融合)的培养上清液(1mL)，并孵育(室温，2.5小时)。用PBS缓冲液(1mL)洗涤3次以去除未结合的蛋白质。与琼脂糖凝胶结合的所有蛋白质均被洗脱，通过SDS-PAGE电泳和Oriole凝胶荧光染色检测条带。结果示于图26中。在图26中，右图显示了当除小鼠抗-USAG-1中和抗体(无mAb)未被捕获作为阴性对照之外进行相同实验时，当小鼠USAG-1重组蛋白和LRP6-E1E2的复合物用PA标记的抗体NZ-1(WISE+E1E2，通过NZ1)免疫沉淀作为阳性对照，当LRP6-E1E2的表达水平仅用能够吸附组氨酸标签的Ni-NTA树脂沉淀时(E1E2，通过NiNTA)获得的结果。
结果，发现LRP6-E1E2不与一些抗体(特别是第3组和第4组的抗体B48、B103、B108)与USAG-1的复合物结合(图26)。因此，这些抗体的表位重叠或在空间上接近USAG-1的LRP6结合位点的区域，抗体与USAG-1结合以抑制USAG-1与LRP6的结合，从而USAG-1对Wnt信号传导的抑制被中和。
实施例18
抗体的体内施用试验-8(小鼠)
将实施例8中分类为第3组和第4组的三种抗体以单剂量腹膜内施用至怀有EDA纯合缺陷型先天性牙齿发育不全模型小鼠、EDA杂合缺陷型先天性牙齿发育不全模型小鼠或野生型小鼠的母鼠(16μg/g体重)。在出生的后代小鼠中，检查了多生牙和融合牙的存在以及缺失牙是否恢复。结果如表5所示。这三种抗体特别恢复了EDA缺陷小鼠的缺失牙齿。本文中，术语“恢复”是指出生的EDA缺陷型小鼠在EDA缺陷型小鼠的正常牙齿缺失的部位(不缺失M3)具有牙齿。
[表5]
实施例19
抗体的体内施用试验-9(小鼠)
将五种抗体(E57、B14、B48、B103、B108)单剂量腹膜内施用至怀有先天性牙齿发育不全模型小鼠Wnt10a纯合缺陷小鼠、先天性牙齿发育不全模型小鼠Wnt10a杂合缺陷小鼠或野生型小鼠的母鼠中(B103为2μg/g体重，其他抗体为16μg/g体重)。在出生的后代小鼠中，检查了多生牙和融合牙的存在以及缺失牙是否恢复。结果如表6所示。在第3组和第4组的抗体中，B48和B103在纯合缺陷小鼠中诱导了多生牙和融合牙的形成。
[表6]
工业适用性
本公开的抗体或其抗原结合片段可用于治疗先天性牙齿发育不全和后天性牙齿缺失。此外，本发明的抗体或其抗原结合片段对于第三牙列的形成是有效的。因此，本公开的抗体或其抗原结合片段导致在制药领域中用于牙齿再生的分子靶向药物的开发和基于第三牙列形成的牙齿再生疗法的建立。
序列表 自由文本
SEQ ID NO:32；用于表位作图的15个氨基酸肽
SEQ ID NO:33；用于表位作图的15个氨基酸肽
SEQ ID NO:34；用于表位作图的15个氨基酸肽
SEQ ID NO:35；用于表位作图的15个氨基酸肽
SEQ ID NO:36；用于表位作图的15个氨基酸肽
SEQ ID NO:37；用于表位作图的15个氨基酸肽
Claims (5)
1.抗体或其抗原结合片段，其特异性结合并中和USAG-1，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17，所述三个轻链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20；
(b)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27，所述三个轻链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30；
或
(c)三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54，所述三个轻链互补决定区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
(d)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:14；
(e)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:23，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:24；
或
(f)重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:50，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:51。
3.一种USAG-1的表位肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:31。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体为人源化抗体或嵌合抗体。
5.用于牙科再生治疗的药物组合物，其包含根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段。
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