BR112020017296A2 - Mutações de igm fc e de cadeia j que afetam a meia-vida sérica de igm - Google Patents

Mutações de igm fc e de cadeia j que afetam a meia-vida sérica de igm Download PDF

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Abstract

mutações de igm fc e de cadeia j que afetam a meia-vida sérica de igm. esta divulgação fornece um anticorpo igm ou anticorpo semelhante a igm compreendendo regiões constantes de cadeia j variante e/ou de cadeia pesada de igm variante que podem conferir meia-vida sérica aumentada ao anticorpo.

Description

“MUTAÇÕES DE IgM Fc E DE CADEIA J QUE AFETAM A MEIA-VIDA SÉRICA DE IgM”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório de Patente US nº de Série 62/637.186, depositado em 1º de março de 2018, que é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA ELETRONICAMENTE
[002] O conteúdo da listagem de sequências enviada eletronicamente no arquivo de texto ASCII (Nome “09789-012WO1-Sequence-Listing; Tamanho: 98.048 bytes; e Data de Criação: 28 de fevereiro de 2019”) depositado com o pedido é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[003] Anticorpos e moléculas semelhantes a anticorpos que podem multimerizar, como anticorpos IgA e IgM, surgiram como candidatos promissores a fármacos nos campos de, por exemplo, imuno-oncologia e doenças infecciosas, permitindo maior especificidade, maior avidez e capacidade de se ligar a vários alvos de ligação. Ver, por exemplo, as Patentes US nº 9.951.134 e 9.938.347 e as Publicações PCT nº WO 2016/141303, WO 2016/154593, WO 2016/168758, WO 2017/059387, WO 2017 059380, WO 2018/017888, WO 2018/017763, WO 2018/017889 e WO 2018/017761, cujos conteúdos são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.
[004] A farmacocinética (PK) e a farmacodinâmica (PD) dos anticorpos multivalentes são, no entanto, complexas e dependem tanto da estrutura do anticorpo monoclonal quanto do sistema fisiológico a que ele se destina. Além disso, diferentes classes de anticorpos são tipicamente processadas dentro de um sujeito através de diferentes sistemas celulares e fisiológicos. Por exemplo, a classe de anticorpos IgG tem uma meia-vida sérica de 20 dias, enquanto a meia-vida dos anticorpos IgM e IgA é de apenas 5–8 dias. Brekke, OH., e I. Sandlie, Nature Reviews Drug Discovery 2: 52-62 (2003).
[005] As moléculas de anticorpo in vivo podem se ligar a uma variedade de receptores em várias células do sangue ou em diferentes tecidos e órgãos. A ligação a esses receptores pode influenciar a biodisponibilidade e biodistribuição de anticorpos terapêuticos e sua capacidade de atingir os alvos de interesse. Por exemplo, sabe-se que os anticorpos do isotipo IgG têm meia-vida longa in vivo devido à ligação do receptor neonatal Fc de reciclagem (FcRn). No entanto, os anticorpos do isotipo IgA e IgM não se ligam a este receptor chave de reciclagem. Sabe-se que os anticorpos do isotipo IgM se ligam ao receptor Fc µ (FcμR), ao receptor Fc α/µ (FcαμR) e ao receptor de Ig polimérico (pIgR). Os anticorpos IgM com e sem cadeia J se ligam a FcμR (Kubagawa, H., et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 408:25-45 (2017)), mas os resíduos da cadeia J pelo menos contribuem para a ligação de anticorpos IgM ao FcαμR (Ghumra, A., et al., Eur. J. Immunol. 39:1147-1156 (2009)) e a ligação de IgM ao pIgR depende da cadeia J (Braathen R., et al. J. Immunol 178:1589-1597 (2007)). O pIgR é responsável pelo transporte de IgM e IgA para o lúmen das glândulas intestinais, salivares e lacrimais (ver, por exemplo, Braathen, R., et al., J. Biol. Chem.
277:42755-42762 (2002)). O FcαμR é responsável pela absorção de anticorpos ligados a corpos estranhos pelas células B e fagócitos (Akula, S., e Hellman, L., Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 408:1-23 (2017)). Os FcμR são importantes para o desenvolvimento de células B (Nguyen, T., et al., Nature Immunol. 18:321-333 (2017)).
Nossa hipótese foi que a interação da IgM com um ou mais desses receptores poderia afetar a PK/PD.
[006] A cadeia J é um polipeptídeo ácido de 15 kDa, que está associado à IgM pentamérica e à IgA dimérica através de ligações de dissulfeto envolvendo o penúltimo resíduo de cisteína na cauda (tailpiece) secretora de 18 aminoácidos (tp)
no C-terminal da cadeia pesada de IgM μ ou IgA α. A sequência de aminoácidos da cadeia J humana precursora é apresentada como SEQ ID NO: 1 e a sequência de aminoácidos da cadeia J humana madura é apresentada como SEQ ID NO: 2. Pensa- se que a montagem de unidades de ligação de IgM em uma estrutura pentamérica envolve os domínios Cµ4 e de cauda da região constante de IgM. Ver, por exemplo, Braathen, R., et al., J. Biol. Chem. 277:42755-42762 (2002).
[007] Apesar dos avanços feitos no projeto de anticorpos multiméricos, ainda é necessário poder manipular as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas dessas moléculas.
SUMÁRIO
[008] Esta divulgação fornece um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada, em que o anticorpo inclui cinco unidades de ligação a anticorpos bivalentes ou variantes ou fragmentos dos mesmos e uma cadeia J variante ou fragmento funcional desta. Cada unidade de ligação do anticorpo fornecido inclui duas regiões constantes da cadeia pesada de IgM ou fragmentos de multimerização ou subunidade destes, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno ou subunidade deste. Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta inclui uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma cadeia J de referência idêntica à cadeia J variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos. A cadeia J variante fornecida pode afetar a meia-vida sérica do anticorpo IgM fornecido ou anticorpo semelhante a IgM. Por exemplo, em certos aspectos, o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecido exibe uma meia- vida sérica aumentada após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou a um anticorpo semelhante a IgM que são idênticos, exceto pela uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos na cadeia J variante, e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais. Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta inclui uma, duas, três ou quatro substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma cadeia J de referência.
[009] Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta inclui uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia J humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Por exemplo, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina (A), serina (S) ou arginina (R). Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por alanina (A). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por serina (S). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por arginina (R). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta inclui uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Por exemplo, o aminoácido correspondente ao T103 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:
6. Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta inclui uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido N49 ou ao aminoácido S51 da cadeia J humana (SEQ ID NO: 2), em que o S51 não é substituído por treonina (T) ou em que a cadeia J inclui substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos N49 e S51 da cadeia J humana (SEQ ID NO: 2). Por exemplo, a posição correspondente ao
N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S) ou ácido aspártico (D). Em certos aspectos, a posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
Em outro exemplo, a posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A) ou glicina (G), por exemplo, a posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A). Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
[010] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que inclui uma cadeia J variante conforme fornecida acima, as regiões constantes da cadeia pesada IgM ou fragmentos de multimerização da mesma podem ser regiões constantes da cadeia pesada IgM variante, incluindo uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma região constante da cadeia pesada de IgM de referência idêntica às regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos. De acordo com esses aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante podem afetar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de modo que o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecidos exibam uma meia-vida sérica aumentada adicionalmente após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou a um anticorpo semelhante a IgM que são idênticos, exceto pela uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos na nas regiões constantes da cadeia pesada IgM, e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais. Em certos aspectos, o aumento adicional da meia-vida sérica é aditivo.
[011] Esta divulgação fornece ainda um anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada, em que o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM inclui cinco ou seis unidades de ligação de anticorpo bivalentes ou suas variantes ou fragmentos e em que cada unidade de ligação inclui duas variantes de regiões constantes da cadeia pesada de IgM ou seus fragmentos de multimerização, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno ou sua subunidade. De acordo com esses aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante ou seus fragmentos de multimerização incluem uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma região constante da cadeia pesada de IgM de referência idêntica às regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos. Além disso, de acordo com esses aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante podem afetar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM. Em certos aspectos, o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecido exibe uma meia-vida sérica aumentada após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou a um anticorpo semelhante a IgM que são idênticos, exceto pela uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos nas regiões constantes da cadeia pesada IgM, e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais. Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante incluem uma, duas, três ou quatro substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos, em relação à região constante da cadeia pesada IgM de referência.
[012] Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante incluem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido R344 da região constante de IgM humana do tipo selvagem SEQ ID NO: 12, por exemplo, o aminoácido correspondente ao R344 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante são regiões constantes da cadeia pesada
IgM humana variante e incluem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 31. Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante incluem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido E345 da região constante de IgM humana selvagem SEQ ID NO: 12, por exemplo, o aminoácido correspondente ao E345 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante são regiões constantes da cadeia pesada IgM humana variante e incluem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 32. Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante incluem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido S401 da região constante de IgM humana do tipo selvagem SEQ ID NO: 12, por exemplo, o aminoácido correspondente ao S401 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante são regiões constantes da cadeia pesada IgM humana variante e incluem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13. Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante incluem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido E402 da região constante de IgM humana selvagem SEQ ID NO: 12, por exemplo, o aminoácido correspondente ao E402 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante são regiões constantes da cadeia pesada IgM humana variante e incluem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14.
Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante incluem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido E403 da região constante de IgM humana do tipo selvagem SEQ ID NO: 12, por exemplo, o aminoácido correspondente ao E403 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante são regiões constantes da cadeia pesada IgM humana variante e incluem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 34.
[013] Em um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, a meia-vida sérica aumentada pode incluir uma meia-vida alfa aumentada (t1/2α), uma meia-vida beta aumentada (t1/2β), ou um aumento de t1/2α e um aumento de t1/2β. Da mesma forma, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode exibir ainda uma concentração plasmática de pico aumentada (Cmáx), uma área aumentada sob a curva (AUC), um tempo de depuração modificado ou qualquer combinação dos mesmos em relação ao anticorpo de referência.
[014] Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada de IgM ou fragmentos de multimerização ou variantes destas de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, cada um inclui um domínio Cµ4 e um domínio de cauda de IgM (tp) e pode incluir ainda um domínio Cµ3, um domínio Cµ2, um domínio Cµ1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[015] Em certos aspectos, o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode ser um fragmento Fv de cadeia única (ScFv) ou uma região variável de domínio único (VHH). Em certos aspectos, a subunidade do domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode ser uma região variável da cadeia pesada (VH).
[016] Em certos aspectos, cada unidade de ligação de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode incluir ainda duas regiões constantes da cadeia leve ou fragmentos ou variantes destas, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno ou subunidade deste, por exemplo, o domínio de ligação ao antígeno pode ser um fragmento scFv ou a subunidade do domínio de ligação ao antígeno pode ser uma VL.
[017] Em certos aspectos, a cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode incluir ainda um ou mais polipeptídeos heterólogos, direta ou indiretamente, fundidos à cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta. Em certos aspectos, o um ou mais polipeptídeos heterólogos podem ser fundidos à cadeia J ou fragmento da mesma via um ligante peptídico. Ligantes exemplificativos podem incluir pelo menos 5 aminoácidos, mas não mais que 25 aminoácidos, e podem consistir em GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28), ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29). Em certos aspectos, o um ou mais polipeptídeos heterólogos podem ser fundidos ao N-terminal da cadeia J ou fragmento ou variante deste, o C-terminal da cadeia J ou fragmento ou variante desta ou fundidos a tanto o N-terminal quanto C-terminal da cadeia J ou fragmento ou variante desta. Onde dois ou mais polipeptídeos heterólogos são fundidos à cadeia J, os polipeptídeos heterólogos podem ser iguais ou diferentes. Em certos aspectos, o pelo menos um polipeptídeo heterólogo pode ser um domínio de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fv ligado a dissulfeto (sdFv) ou qualquer combinação dos mesmos. Em certos aspectos, o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento scFv. Em certos aspectos, o pelo menos um polipeptídeo heterólogo pode se ligar especificamente a CD3ε. Em certos aspectos, a cadeia J pode ser uma variante da cadeia J modificada da SEQ ID NO: 9 (V15J), por exemplo, a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (V15J-Y102A), a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 (V15J-T103A) ou a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 (V15J-N49A).
[018] Esta divulgação fornece ainda uma composição que inclui o anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[019] Esta divulgação fornece ainda uma cadeia J ou um fragmento funcional desta que inclui uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma cadeia J de referência que é idêntica, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos, em que a cadeia J variante pode afetar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que inclui a cadeia J variante. Em certos aspectos, a cadeia J variante inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, ou qualquer combinação das mesmas.
[020] Esta divulgação fornece ainda um polinucleotídeo isolado incluindo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de subunidade de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, em que o polipeptídeo de subunidade inclui (a) uma região constante da cadeia pesada IgM ou semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização da mesma, (b) uma cadeia leve de anticorpo, ou (c) uma cadeia J, uma cadeia J modificada ou fragmento ou variante funcional da mesma, ou (d) qualquer combinação dos mesmos. Em certos aspectos, o polipeptídeo da subunidade inclui uma região constante da cadeia pesada IgM ou semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização da mesma, por exemplo, o polipeptídeo da subunidade pode incluir a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, ou SEQ ID NO: 34.
Em certos aspectos, o polipeptídeo da subunidade inclui uma cadeia leve de anticorpo. Em certos aspectos, o polipeptídeo da subunidade pode incluir uma cadeia J, uma cadeia J modificada ou qualquer fragmento ou variante funcional da mesma, conforme fornecido neste documento, por exemplo, o polipeptídeo da subunidade pode incluir a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ
ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23, ou SEQ ID NO: 24. O polinucleotídeo fornecido pode incluir uma, duas, três ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam dois, três ou mais dos polipeptídeos da subunidade. É ainda fornecido um vetor de expressão que inclui o polinucleotídeo fornecido. É ainda fornecida uma célula hospedeira que inclui o polinucleotídeo fornecido ou o vetor de expressão fornecido.
[021] Esta divulgação fornece ainda um método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia-vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que incluem as cadeias J variantes. O método inclui o teste de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que incluem cadeias J variantes ou fragmentos dos mesmos para aumentar a meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico, em que as cadeias J variantes ou fragmentos das mesmas incluem inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos, e em que o anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico inclui uma cadeia J ou fragmento da mesma idêntico às cadeias J variantes, exceto as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos; e recuperar as cadeias J variantes ou fragmentos das mesmas que conferem meia-vida sérica aumentada aos anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos em relação ao anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico.
[022] Esta divulgação fornece ainda um método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia-vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos, incluindo as cadeias J variantes. O método inclui o teste de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que incluem cadeias J variantes ou fragmentos das mesmas para o seu nível de ligação ao receptor Fc alfa-mu (FcαμR), ao receptor polimérico Ig (pIgR)
ou tanto o FcαμR quanto o pIgR, em que as cadeias J variantes ou fragmentos das mesmas incluem inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos; e recuperar as cadeias J variantes ou fragmentos das mesmas que conferem capacidade reduzida de ligação ao FcαµR, capacidade reduzida de ligação ao pIgR ou capacidade reduzida de ligação ao FcαµR e pIgR nos anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos em relação a um anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico que inclui uma cadeia J ou um fragmento da mesma idêntico às cadeias J variantes, exceto para as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos. Este método pode incluir ainda o teste de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que incluem cadeias J variantes recuperadas ou fragmentos das mesmas para aumentar a meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico, que inclui uma cadeia J ou fragmento da mesma idêntico às cadeias J variantes recuperadas ou fragmentos das mesmas, exceto as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos.
[023] Esta divulgação fornece ainda um método para identificar regiões constantes da cadeia pesada IgM variante que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que inclui as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante. O método inclui o teste de anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM que incluem regiões constantes da cadeia pesada IgM variante para aumentar a meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico de referência ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico, em que as regiões constantes da cadeia IgM variante incluem inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos, e em que o anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM inclui regiões constantes da cadeia pesada IgM idênticas às regiões constantes da cadeia pesada IgM variantes, exceto as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos; e recuperar esses anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM incluindo as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante que conferem meia-vida sérica aumentada aos anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM incluindo as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante em relação ao anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM.
[024] Esta divulgação fornece ainda um método para identificar regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM incluindo as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante. O método inclui o teste de anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM, incluindo regiões constantes da cadeia pesada IgM variante para o seu nível de ligação ao receptor Fc alfa-mu (FcαμR), receptor Fc mu (FcµR), ao receptor polimérico Ig (pIgR), qualquer combinação de dois dos receptores, ou dos três receptores, em que as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante incluem inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos; e recuperar esses anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM, incluindo regiões constantes de cadeia pesada IgM variante que conferem capacidade reduzida de ligação a FcαµR, capacidade reduzida de ligação a FcµR, capacidade reduzida de ligação a pIgR, capacidade reduzida de ligação a qualquer um dos dois receptores ou capacidade reduzida de ligação a todos os três receptores, sobre os anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM, incluindo as regiões constantes da cadeia pesada IgM em relação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM que inclui regiões constantes da cadeia pesada IgM idênticas às regiões constantes da cadeia pesada IgM variante, exceto para as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos. Este método pode incluir ainda o teste de anticorpos IgM recuperados ou anticorpos semelhantes a IgM que incluem regiões constantes da cadeia pesada IgM variante para aumentar a meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM, que inclui regiões constantes da cadeia pesada IgM variante idênticas às regiões constantes da cadeia pesada IgM variante, exceto as inserções, deleções ou substituições definidas de aminoácidos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS
[025] As Figuras 1A-1B mostra um alinhamento da sequência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada IgM humana (SEQ ID NO: 12) com a do camundongo (GenBank: CAC20701.1, SEQ ID NO: 16), macaco cynomolgus (GenBank: EHH62210.1, SEQ ID NO: 30), macaco rhesus (GenBank: AAD02420.1, SEQ ID NO: 17), chimpanzé (GenBank: PNI10622.1, SEQ ID NO: 18) e orangotango de Sumatra (GenBank: PNJ04968.1, SEQ ID NO: 19). Os aminoácidos correspondentes aos aminoácidos R345, E346, S401, E402 e E403 da SEQ ID NO: 12 estão em caixas.
[026] A Figura 2 é uma tabela que resume a ligação de receptores de imunoglobulina humana e de camundongo a IGMs biespecíficos anti-CD20/anti-CD3 compreendendo várias mutações na região constante da cadeia J e/ou na cadeia pesada IgM medida por ELISA. "WT" significa anticorpos anti-CD20 1.5.3 com as regiões constantes IgM e regiões V15J, conforme descrito na Publicação PCT nº WO 2016/141303 antes da introdução das substituições de alanina. As porcentagens indicam a extensão da ligação ao receptor em relação ao anticorpo inicial "WT". As porcentagens indicam o nível de ligação ao receptor em relação a um pentâmero IgM compreendendo regiões constantes da cadeia pesada IgM do tipo selvagem ("IgM", SEQ ID NO: 12) e uma cadeia J modificada compreendendo uma cadeia J humana do tipo selvagem fundida em seu N-terminal a um scFv que se liga ao CD3 ("VJ" ou "V15J", SEQ ID NO: 9), que é designado como 100%.
[027] As Figuras 3A-3E são gráficos que mostram a ligação de várias IgM biespecíficas anti-CD20/anti-CD3 com mutações de substituição de aminoácidos em uma posição na cadeia J correspondente ao aminoácido Y102 da SEQ ID NO: 2, ao pIgR. Cada gráfico compara um mutante único com o anticorpo IgM anti-CD20 1.5.3 "do tipo selvagem" 1.5.3VJ (quadrados fechados). Figura 3A: mutação Y102A (quadrados abertos); Figura 3B: mutação Y102F (triângulos fechados); Figura 3C: mutação Y102T (triângulos abertos); Figura 3D: mutação Y102S (losangos abertos); Figura 3E: mutação Y102R (losangos fechados).
[028] A Figura 4 é uma tabela que resume os dados farmacocinéticos em camundongos para IgMs monoespecíficas anti-CD3 e IGMs biespecíficos anti- CD20/anti-CD3 compreendendo várias mutações na região constante da cadeia J e/ou na cadeia pesada da IgM em comparação com os controles. "WT IgM" significa anticorpos anti-CD20 1.5.3 com as regiões constantes IgM, conforme descrito na Publicação PCT nº WO 2016/141303 antes da introdução das substituições de alanina. "WT J" e "WT VJ" são regiões de cadeias J do tipo selvagem ("J") ou cadeias J modificadas com anti-CD3 "VJ", conforme descrito na Publicação PCT nº WO 2016/141303 antes da introdução das substituições de alanina. "VJH" significa a cadeia J modificada com anti-CD3 "VJ" compreendendo ainda albumina de soro humano fundida ao C-terminal (apresentada neste documento como SEQ ID NO: 11). "A" é a concentração sérica de anticorpo medida em t1/2Alfa; "B" é a concentração sérica de anticorpo medida em t1/2Beta; “t1/2Alfa” é a meia-vida alfa (em horas); “t1/2Beta” é a meia-vida beta medida em horas, “C0” é a concentração sérica de anticorpos em μg/ml medida no tempo zero; AUC0-inf” é a área sob a curva do tempo zero ao infinito, medida em μg/ml*h; e “MRT” é o tempo médio de permanência no soro para o anticorpo medido em horas.
[029] A Figura 5 é uma curva que mostra o efeito da mutação Y102A da cadeia J isoladamente ou em combinação com as mutações S401A ou E401A da cadeia pesada IgM na meia-vida sérica geral de um anticorpo biespecífico IgM anti- CD20/anti-CD3 em comparação com um anticorpo IgG compreendendo as mesmas regiões de ligação anti-CD20 VH e VL (153 IgG). 153 IgG: círculos abertos; IgM 1.5.3
V15J: quadrados fechados; IgM 1.5.3 V15J-Y102A: quadrados abertos; IgM 1.5.3 S401A/V15J-Y102A: triângulos abertos; IgM 1.5.3 E402A/V15J-Y102A: triângulos invertidos fechados.
[030] A Figura 6 é uma tabela comparando parâmetros farmacocinéticos de IgM 1.5.3 V15J e IgM 1.5.3 V15J-N49A.
DESCRIÇÃO DETALHADA Definições
[031] É para ser notado que o termo "um" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "uma molécula de ligação," é entendida como representando uma ou mais moléculas de ligação. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados de forma intercambiável neste documento.
[032] Além disso, "e/ou", onde usado neste documento, deve ser tomado como a divulgação específica de cada uma das duas características ou componentes especificados com ou sem o outro. Assim, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A e/ou B" neste documento se destina a incluir "A e B", "A ou B", "A" (por si só) e "B" (por si só). Da mesma forma, o termo "e/ou" como usado em uma frase tal como "A, B e/ou C" se destina a abranger cada uma das seguintes modalidades: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (por si só); B (por si só); e C (por si só).
[033] A menos que definido de outra forma, termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como comumente compreendido por alguém ordinariamente versado na técnica ao qual é relatado esta divulgação. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2ª ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3ª ed., 1999, Academic Press; e o Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revisado, 2000, Oxford University Press, fornecem àquele versado na técnica um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.
[034] Unidades, prefixos e símbolos são denotados em sua forma aceita pelo Système International de Unites (Sistema Internacional de Unidades - SI). Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. A menos que indicado de outra forma, sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em orientação amino para carboxi. Os cabeçalhos fornecidos neste documento não são limitações dos vários aspectos ou aspectos da divulgação, os quais podem ser obtidos por referência no relatório descritivo como um todo. Consequentemente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamente definidos por referência ao relatório descritivo em sua totalidade.
[035] Conforme usado neste documento, o termo "polipeptídeo" destina-se a abranger um "polipeptídeo" no singular bem como no plural "polipeptídeos", e refere- se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácido", ou qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou várias cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos dentro da definição de "polipeptídeo", e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de, ou de forma permutável, com qualquer um desses termos. O termo "polipeptídeo" destina-se também a se referir aos produtos das modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, e derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modificação por aminoácidos de ocorrência não natural. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica ou produzido por tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer forma, incluindo por síntese química.
[036] Um polipeptídeo como divulgado neste documento pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais, ou 2.000 ou mais aminoácidos. Polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não tenham necessariamente essa estrutura. Os polipeptídeos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobrados, e os polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional definida, mas, em vez disso, podem adotar um grande número de diferentes conformações e são referidos como não dobrados.
Conforme usado neste documento, o termo glicoproteína refere-se a uma proteína acoplada a pelo menos uma fração de carboidrato que está anexada à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um aminoácido, por exemplo, uma serina ou uma asparagina.
[037] Por um polipeptídeo "isolado" ou fragmento, variante ou derivado deste, entende-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Nenhum nível específico de purificação é necessário. Por exemplo, um polipeptídeo isolado pode ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Os polipeptídeos produzidos de forma recombinante e as proteínas expressas em células hospedeiras são considerados isolados como divulgado neste documento, assim como os polipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou, parcialmente ou substancialmente, purificados por qualquer técnica adequada.
[038] Conforme usado neste documento, o termo "um polipeptídeo de ocorrência não natural" ou quaisquer variantes gramaticais do mesmo é uma definição condicional que exclui explicitamente, mas apenas exclui, as formas do polipeptídeo que são, ou podem ser, determinadas ou interpretadas por um juiz, ou um órgão administrativo ou judicial, para "ocorrer naturalmente".
[039] Outros polipeptídeos divulgados neste documento são fragmentos,
derivados, análogos ou variantes dos polipeptídeos anteriores e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento", "variante", "derivado" e "análogo", conforme divulgado neste documento, incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades do anticorpo ou polipeptídeo nativo correspondente, por exemplo, especificamente se ligando a um antígeno. Os fragmentos dos polipeptídeos incluem, por exemplo, fragmentos proteolíticos, bem como fragmentos de deleção, além de fragmentos de anticorpo específicos discutidos em outro lugar neste documento.
Variantes de, por exemplo, um polipeptídeo inclui fragmentos conforme descrito acima, e também polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas devido a substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Em certos aspectos, variantes podem ocorrer de forma não natural. Variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas usando técnicas de mutagênese conhecidas na técnica. Os polipeptídeos variantes podem compreender substituições, deleções ou adições de aminoácidos conservativas ou não conservativas. Derivados são polipeptídeos que foram alterados de modo a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo original.
Exemplos incluem as proteínas de fusão. Polipeptídeos variantes também são referidos neste documento como "análogos de polipeptídeo". Conforme usado neste documento, um "derivado" de um polipeptídeo também pode se referir a um polipeptídeo que possui um ou mais aminoácidos derivados quimicamente por reação de um grupo lateral funcional. Também incluído como "derivados" são aqueles peptídeos que contêm um ou mais derivados dos vinte aminoácidos padrões. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída pela prolina; a 5-hidroxilisina pode ser substituída pela lisina; a 3-metil-histidina pode ser substituída pela histidina; a homosserina pode ser substituída pela serina; e a ornitina pode ser substituída pela lisina.
[040] Uma "substituição conservativa de aminoácido" é aquela em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido com uma cadeia lateral semelhante.
Famílias de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por exemplo, a substituição de uma fenilalanina por uma tirosina é uma substituição conservativa. Em certas modalidades, as substituições conservativas nas sequências dos polipeptídeos e anticorpos da presente divulgação não revogam a ligação do polipeptídeo ou anticorpo contendo a sequência de aminoácidos ao antígeno ao qual o anticorpo se liga.
Métodos de identificação de nucleotídeos e substituições conservativas de aminoácido que não eliminam ligação de antígeno são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); e Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 94:.412- 417 (1997)).
[041] O termo "polinucleotídeo" destina-se a abranger um ácido nucleico no singular, bem como os ácidos nucleicos no plural, e se refere a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construto, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA), cDNA ou DNA plasmidial (pDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéster convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, como a encontrada em ácidos nucleicos de peptídeo (PNA)). Os termos "ácido nucleico" ou "sequência de ácido nucleico" se referem a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.
[042] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo "isolado" entende-se qualquer forma do ácido nucleico ou polinucleotídeo que é separada de seu ambiente nativo.
Por exemplo, um polinucleotídeo purificado em gel ou um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor seria considerado "isolado". Além disso, um segmento polinucleotídico, por exemplo, um produto de PCR, que foi projetado para ter locais de restrição para clonagem, é considerado "isolado". Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em uma solução não nativa, como um tampão ou solução salina. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA de polinucleotídeos in vivo ou in vitro, onde o transcrito não é um que seria encontrado na natureza. Os polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados descritos neste documento, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulatório, como um promotor, sítio de ligação ao ribossomo, ou um terminador de transcrição.
[043] Conforme usado neste documento, o termo "um polipeptídeo de ocorrência não natural" ou quaisquer variantes gramaticais do mesmo é uma definição condicional que exclui explicitamente, mas apenas exclui, as formas do ácido nucleico ou polipeptídeo que são, ou podem ser, determinadas ou interpretadas por um juiz, ou um órgão administrativo ou judicial, como "ocorridas naturalmente".
[044] Conforme usado neste documento, uma "região de codificação" é uma porção do ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos.
Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado como sendo parte de uma região de codificação, mas quaisquer sequências flanqueadoras, por exemplo, promotores, sítios de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons e similares, não são parte de uma região de codificação. Duas ou mais regiões de codificação podem estar presentes em um único construto de polinucleotídeo, por exemplo, em um único vetor, ou em construtos de polinucleotídeos separados, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação, ou compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um único vetor pode separadamente codificar uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina e uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nucleico podem incluir regiões codificadoras heterólogas, fundidas ou não fundidas a outra região codificadora. As regiões de codificação heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados de codificação, tais como um peptídeo sinal secretor ou um domínio funcional heterólogo.
[045] Em determinadas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é o DNA. No caso do DNA, um polinucleotídeo compreendendo um ácido nucleico o qual codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de controle de transcrição ou de tradução operacionalmente associados a uma ou mais regiões de codificação. Uma associação operável é quando uma região de codificação para um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, está associada a uma ou mais sequências regulatórias de tal forma a colocar a expressão do produto de gene sob a influência ou controle das sequências regulatórias. Dois fragmentos de DNA (como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associados a esta) estão "operacionalmente associados" se a indução da função do promotor resulta na transcrição do mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das sequências regulatórias de expressão de direcionar a expressão do produto do gene ou interferir com a capacidade do modelo de DNA de ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codificasse um polipeptídeo, se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor de célula específico que direciona a transcrição substancial do DNA nas células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, potenciadores, operadores, repressores e sinais de terminação da transcrição, podem ser operacionalmente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição célula-específica.
[046] Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida por aqueles versados na técnica. Estas incluem, sem limitação, regiões de controle de transcrição que funcionam nas células de vertebrados, tais como, mas não limitadas a, promotor e segmentos potenciadores de citomegalovírus (o primeiro promotor imediato, em conjunto com o íntron-A), vírus símio 40 (o primeiro promotor) e retrovírus (como o vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como a actina, proteínas de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e ß-globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. As regiões de controle de transcrição adicionais adequadas incluem promotores específicos de tecido e potenciadores, bem como promotores induzíveis por linfocinas (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).
[047] De forma semelhante, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados aos sítios de ligação ao ribossomo, códons de iniciação e de terminação da tradução e elementos derivados de picornavírus (particularmente um local interno de entrada do ribossomo, ou IRES, também referido como uma sequência CITE).
[048] Em outras modalidades, um polinucleotídeo pode ser RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA), RNA transportador ou RNA ribossômico.
[049] As regiões codificadoras de polinucleotídeo e ácido nucleico podem ser associadas a regiões codificadoras adicionais que codificam peptídeos secretores ou de sinal, os quais direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo, conforme divulgado neste documento. De acordo com a hipótese do sinal, as proteínas secretadas por células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou sequência líder secretora que é clivada a partir da proteína madura, uma vez que a exportação da cadeia da proteína em crescimento pelo retículo endoplasmático rugoso foi iniciada. Aqueles versados na técnica de forma ordinária estão cientes que os polipeptídeos secretados por células de vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido ao N-terminal do polipeptídeo, o qual é clivado a partir do polipeptídeo de "comprimento total" ou completo para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, uma cadeia pesada de imunoglobulina ou peptídeo sinal da cadeia leve é usado, ou um derivativo funcional dessa sequência que mantém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado a ele.
Alternativamente, um peptídeo sinal heterólogo de mamífero, ou um derivativo funcional deste, pode ser usado. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder ativador de plasminogênio tecidual humano (TPA) ou ß-glucuronidase de camundongo.
[050] Conforme usado neste documento, o termo "molécula de ligação" refere-se em seu sentido mais amplo a uma molécula que se liga especificamente a um receptor, por exemplo, um epítopo ou um determinante antigênico. Conforme descrito adicionalmente neste documento, uma molécula de ligação pode compreender um dos mais "domínios de ligação ao antígeno" descritos neste documento. Um exemplo não limitativo de uma molécula de ligação é um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, conforme descrito em detalhes neste documento que retém a ligação específica ao antígeno. Em certos aspectos, uma "molécula de ligação" compreende um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, conforme descrito em detalhes neste documento.
[051] Conforme usado neste documento, os termos "domínio de ligação" ou "domínio de ligação ao antígeno" (podem ser usados de forma intercambiável) referem-se a uma região de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, que é necessária e suficiente para se ligar especificamente a um epítopo. Por exemplo, um "Fv", por exemplo, uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável de um anticorpo, como duas subunidades polipeptídicas separadas ou como uma cadeia única, é considerado um "domínio de ligação". Outros domínios de ligação ao antígeno incluem, sem limitação, a cadeia pesada variável (VHH) de um anticorpo derivado de uma espécie de camelídeo ou seis regiões determinantes de complementaridade de imunoglobulina (CDRs) expressas em uma estrutura em andaime de fibronectina. Uma "molécula de ligação" ou "anticorpo", conforme descrito neste documento, pode incluir um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou mais "domínios de ligação ao antígeno".
[052] Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" podem ser usados neste documento de forma intercambiável. Um anticorpo (ou um fragmento, variante ou derivativo do mesmo, conforme divulgado neste documento) inclui pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada (para espécies de camelídeos) ou pelo menos os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As estruturas básicas de imunoglobulina nos sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas.
Ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988). Salvo quando indicado o contrário, o termo "anticorpo" abrange qualquer coisa que varia de um pequeno fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo a um anticorpo de tamanho completo, por exemplo, um anticorpo IgG que inclui duas cadeias pesadas completas e duas cadeias leves completas, um anticorpo IgA que inclui quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves completas e,
opcionalmente, inclui uma cadeia J e/ou um componente secretor, ou um anticorpo IgM que inclui dez ou doze cadeias pesadas completas e dez ou doze cadeias leves completas e, opcionalmente, inclui uma cadeia J ou fragmento funcional desta.
[053] O termo "imunoglobulina" compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica irão apreciar que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou épsilon, (, , , , ) com algumas subclasses entre elas (por exemplo, γ1- γ4 ou 1-2)). É a natureza desta cadeia que determina a "isotipo" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (subtipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, etc. são bem caracterizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. As versões modificadas de cada uma dessas imunoglobulinas são facilmente discerníveis para a pessoa versada na técnica, em vista da divulgação do momento e, nesse sentido, estão dentro do escopo desta divulgação.
[054] As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda (, ). Cada classe de cadeia pesada pode estar ligada a uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas estão ligadas umas às outras de forma covalente, e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por ligações dissulfeto covalentes ou ligações não-covalentes, quando as imunoglobulinas são expressas, por exemplo, por hibridomas, células B ou células hospedeiras manipuladas geneticamente. Na cadeia pesada, as sequências de aminoácidos correm de um N-terminal nas extremidades em forquilha da configuração em Y para o C-terminal na parte inferior de cada cadeia. A estrutura básica de certos anticorpos, por exemplo, anticorpos IgG, inclui duas subunidades da cadeia pesada e duas subunidades da cadeia leve conectadas de forma covalente por meio de ligações dissulfeto para formar uma estrutura "Y", também aqui referida como uma estrutura "H2L2" ou uma "unidade de ligação".
[055] O termo "unidade de ligação" é usado neste documento para se referir à porção de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, molécula semelhante a anticorpo, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo ou fragmento de multimerização do mesmo, que corresponde a uma estrutura de imunoglobulina "H2L2" padrão, ou seja, duas cadeias pesadas ou fragmentos das mesmas e duas cadeias leves ou fragmentos das mesmas. Em certos aspectos, por exemplo, em que a molécula de ligação é um anticorpo IgG bivalente ou um fragmento de ligação ao antígeno, os termos "molécula de ligação" e "unidade de ligação" são equivalentes.
Em outros aspectos, por exemplo, em que a molécula de ligação é multimérica, por exemplo, um anticorpo IgA dimérico ou anticorpo semelhante a IgA, um anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM ou um anticorpo IgM hexamérico ou anticorpo semelhante a IgM, a molécula de ligação compreende duas ou mais "unidades de ligação". Duas no caso de um dímero IgA, ou cinco ou seis no caso de um pentâmero ou hexâmero IgM, respectivamente. Uma unidade de ligação não precisa incluir cadeias pesadas e leves de anticorpo completos, mas normalmente será bivalente, ou seja, incluirá dois "domínios de ligação ao antígeno", conforme definido acima. Conforme usado neste documento, certas moléculas de ligação fornecidas nesta divulgação são "diméricas" e incluem duas unidades de ligação bivalentes que incluem regiões constantes IgA ou fragmentos de multimerização das mesmas. Certas moléculas de ligação fornecidas nesta divulgação são "pentaméricas" ou "hexaméricas" e incluem cinco ou seis unidades de ligação bivalentes que incluem regiões constantes IgM ou fragmentos de multimerização das mesmas. Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, compreendendo duas ou mais, por exemplo, duas, cinco ou seis unidades de ligação, é referida neste documento como "multimérica".
[056] Conforme usado neste documento, um "anticorpo semelhante a IgM" refere-se a um anticorpo variante que ainda retém a capacidade de formar hexâmeros ou, em associação com a cadeia J, formar pentâmeros. Um anticorpo semelhante a IgM inclui tipicamente pelo menos os domínios Cµ4-tp da região constante IgM, mas pode incluir domínios da região constante da cadeia pesada de outros isotipos de anticorpos, por exemplo, IgG, da mesma espécie ou de uma espécie diferente. Um anticorpo semelhante a IgM pode ser igualmente um fragmento de anticorpo no qual uma ou mais regiões constantes são deletadas, desde que o anticorpo semelhante a IgM seja capaz de formar hexâmeros e/ou pentâmeros. Assim, um anticorpo semelhante a IgM pode ser um anticorpo IgM/IgG híbrido ou pode ser um fragmento de multimerização de um anticorpo IgM.
[057] Os termos "valência", "bivalente", "multivalente" e equivalentes gramaticais, referem-se ao número de domínios de ligação ao antígeno em uma determinada molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo ou em uma determinada unidade de ligação. Como tal, os termos "bivalente", "tetravalente" e "hexavalente" em referência a uma determinada molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo IgM, anticorpo semelhante a IgM ou fragmento de multimerização do mesmo, denotam a presença de dois domínios de ligação ao antígeno, quatro domínios de ligação ao antígeno e seis domínios de ligação ao antígeno, respectivamente. Um anticorpo IgM típico ou anticorpo semelhante a IgM, em que cada unidade de ligação é bivalente, pode ter 10 ou 12 valências. Uma molécula de ligação bivalente ou multivalente, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, pode ser monoespecífica, ou seja, todos os domínios de ligação ao antígeno são os mesmos ou podem ser biespecíficos ou multiespecíficos, por exemplo, em que dois ou mais domínios de ligação ao antígeno são diferentes, por exemplo, se ligam a diferentes epítopos no mesmo antígeno ou se ligam a antígenos completamente diferentes.
[058] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante molecular capaz de ligação específica a um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo. Em certos aspectos, um epítopo pode incluir agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil ou sulfonil e, em certos aspectos, podem ter características estruturais tridimensionais e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um alvo que é ligada por um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo.
[059] O termo "alvo" é usado no sentido mais amplo para incluir substâncias que podem ser ligadas por uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo. Um alvo pode ser, por exemplo, um polipeptídeo, um ácido nucleico, um carboidrato, um lipídio ou outra molécula. Além disso, um "alvo" pode, por exemplo, ser uma célula, um órgão ou um organismo que compreende um epítopo ligado que pode ser ligado por uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo.
[060] Ambas as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são usados funcionalmente. A este respeito, será apreciado que os domínios variáveis das porções das cadeias leves (VL) e pesadas (VH) variáveis determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Por outro lado, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (por exemplo, CH1, CH2, CH3 ou CH4) conferem propriedades biológicas, como secreção, mobilidade transplacentária, ligação ao receptor Fc, ligação do complemento e similares. Por convenção, a numeração dos domínios da região constante aumenta conforme eles se tornam mais distais do sítio de ligação ao antígeno ou amino-terminal do anticorpo. A porção N- terminal é uma região variável e na porção C-terminal está uma região constante; as regiões CH3 (ou CH4 no caso do lgM) e CL compreendem, na verdade, o carboxi- terminal das cadeias pesada e leve, respectivamente.
[061] Um "anticorpo de cadeia pesada de IgM de comprimento total" é um polipeptídeo que inclui, em direção de N-terminal para C-terminal, um anticorpo de domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio constante 1 de cadeia pesada de anticorpo (CM1 ou Cμ1), um domínio constante 2 de cadeia pesada de anticorpo (CM2 ou Cμ2), um domínio constante 3 de cadeia pesada de anticorpo (CM3 ou Cμ3) e um domínio constante 4 de cadeia pesada de anticorpo (CM4 ou Cμ4) que pode incluir uma cauda.
[062] Conforme indicado acima, a(s) região(ões) variável(is) permite que uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, reconheça seletivamente e se ligue especificamente a epítopos em antígenos. Ou seja, o domínio VL e o domínio VH, ou subconjunto das regiões determinantes da complementaridade (CDRs), de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, combinam-se para formar o domínio de ligação ao antígeno. Mais especificamente, um domínio de ligação ao antígeno é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL. Certos anticorpos formam estruturas maiores. Por exemplo, o IgA pode formar uma molécula que inclui duas unidades de ligação de H2L2 e uma cadeia J conectadas de forma covalente por meio de ligações dissulfeto, que podem ser ainda mais associadas a um componente secretor, e a IgM pode formar uma molécula pentamérica ou hexamérica que inclui cinco ou seis unidades de ligação de H2L2 e, opcionalmente, uma cadeia J conectada de forma covalente via ligações dissulfeto.
[063] As seis "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em uma região de ligação a antígeno de anticorpo são sequências curtas e não contíguas de aminoácidos que são posicionadas especificamente para formar o domínio de ligação ao antígeno, pois o anticorpo assume sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos no domínio de ligação ao antígeno, referido como regiões de "framework", mostra menor variabilidade intermolecular. As regiões de framework adotam largamente uma conformação de folha- e as CDRs formam alças que se conectam, e, em alguns casos, formam parte da estrutura de folha-. Assim, as regiões de framework agem para formar uma estrutura em andaime que proporciona o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações intercadeias, não-covalentes. O domínio de ligação ao antígeno formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epítopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a ligação não-covalente de um anticorpo ao seu epítopo cognato. Os aminoácidos que compõem as CDRs e as regiões de framework, respectivamente, podem ser facilmente identificados para qualquer região variável da cadeia pesada ou leve por uma pessoa versada na técnica de forma ordinária, uma vez que foram definidos de várias maneiras diferentes (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), que são incorporados neste documento por referência na sua totalidade).
[064] No caso onde há duas ou mais definições de um termo que é usado e/ou aceito na técnica, a definição do termo conforme usado neste documento é destinada a incluir todos esses significados, a menos que explicitamente indicado o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever os sítios de combinação de antígeno não-contíguos, encontrados dentro da região variável dos polipeptídeos de cadeia leve e pesada. Estas regiões particulares foram descritas, por exemplo, por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são incorporados neste documento por referência. As definições de Kabat e Chothia incluem sobreposição ou subconjuntos de aminoácidos quando comparados entre si. No entanto, a aplicação de ambas as definições (ou outras definições conhecidas pelos versados na técnica) para se referir a uma CDR de um anticorpo ou uma variante deste deve estar dentro do escopo do termo conforme definido e usado neste documento, a menos que indicado de outra forma. Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs, conforme definido por cada uma das referências citadas acima, são apresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números de aminoácido exatos que abrangem uma CDR específica irão variar dependendo da sequência e do tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica determinam rotineiramente quais aminoácidos compreendem uma CDR específica, dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.
Tabela 1 Definições de CDRs* Kabat Chothia VH CDR1 31-35 26-32 VH CDR2 50-65 52-58 VH CDR3 95-102 95-102 VL CDR1 24-34 26-32 VL CDR2 50-56 50-52 VL CDR3 89-97 91-96 * A numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).
[065] Os domínios variáveis de anticorpos também podem ser analisados, por exemplo, usando o sistema de informações IMGT (imgt_ponto_cines_ponto_fr/) (IMGT®/V-Quest) para identificar segmentos de região variáveis, incluindo CDRs.
(Ver, por exemplo, Brochet et al., Nucl. Acids Res., 36:W503-508, 2008).
[066] Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as sequências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Uma pessoa versada na técnica pode atribuir sem ambiguidade este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência de domínio variável, sem dependência de quaisquer dados experimentais além da sequência em si. Conforme usado neste documento, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração apresentado por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). A menos que o uso do sistema de numeração de Kabat seja explicitamente observado, no entanto, a numeração consecutiva é usada para todas as sequências de aminoácidos nesta divulgação.
[067] O sistema de numeração de Kabat para o domínio constante de IgM humana pode ser encontrado em Kabat, et. al. “Tabulation and Analysis of Amino acid and nucleic acid Sequences of Precursors, V-Regions, C-Regions, J-Chain, T-Cell Receptors for Antigen, T-Cell Surface Antigens, β-2 Microglobulins, Major Histocompatibility Antigens, Thy-1, Complement, C-Reactive Protein, Thymopoietin, Integrins, Post-gamma Globulin, α-2 Macroglobulins, and Other Related Proteins,” U.S. Dept. of Health and Human Services (1991). As regiões constantes de IgM podem ser numeradas sequencialmente (ou seja, aminoácido #1 começando com o primeiro aminoácido da região constante ou usando o esquema de numeração de Kabat. Uma comparação da numeração da região constante de IgM humana sequencialmente (apresentada neste documento como SEQ ID NO: 12) e pelo sistema Kabat é definida abaixo. Os resíduos de aminoácidos sublinhados não são contabilizados no sistema Kabat: Chave de numeração sequencial (SEQ ID NO: 12)/KABAT para cadeia pesada de IgM 1/127 GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA QDFLPDSITF
SWKYKNNSDI 51/176 SSTRGFPSVL RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV
QHPNGNKEKN 101/226 VPLPVIAELP PKVSVFVPPR DGFFGNPRKS KLICQATGFS
PRQIQVSWLR 151/274 EGKQVGSGVT TDQVQAEAKE SGPTTYKVTS TLTIKESDWL
SQSMFTCRVD 201/324 HRGLTFQQNA SSMCVPDQDT AIRVFAIPPS FASIFLTKST
KLTCLVTDLT
251/374 TYDSVTISWT RQNGEAVKTH TNISESHPNA TFSAVGEASI
CEDDWNSGER 301/424 FTCTVTHTDL PSPLKQTISR PKGVALHRPD VYLLPPAREQ
LNLRESATIT 351/474 CLVTGFSPAD VFVQWMQRGQ PLSPEKYVTS APMPEPQAPG
RYFAHSILTV 401/524 SEEEWNTGET YTCVVAHEAL PNRVTERTVD KSTGKPTLYN
VSLVMSDTAG 451/574 TCY
[068] Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, moléculas semelhantes a anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados dos mesmos e/ou fragmentos de multimerização dos mesmos incluem, mas não estão limitados a, anticorpos policlonais, monoclonais, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de ligação ao epítopo, e.g., Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), fragmentos compreendendo um domínio VL ou VH, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão Fab. As moléculas de ScFv são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente US 5.892.019.
[069] Por "liga-se especificamente", entende-se geralmente que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, se liga a um epítopo via seu domínio de ligação ao antígeno, e que a ligação implica alguma complementaridade entre o domínio de ligação ao antígeno e o epítopo. De acordo com esta definição, uma molécula de ligação por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, é dita por "se ligar especificamente" a um epítopo quando este se liga a esse epítopo, através de seu domínio de ligação ao antígeno mais facilmente do que se ligaria a um epítopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é usado neste documento para qualificar a afinidade relativa pela qual uma determinada molécula de ligação se liga a um determinado epítopo.
Por exemplo, a molécula de ligação "A" pode ser considerada como tendo uma especificidade mais alta para um dado epítopo do que a molécula de ligação "B", ou a molécula de ligação "A" pode ser dita por se ligar ao epítopo "C" com uma especificidade mais alta do que para o epítopo relacionado "D."
[070] Pode-se dizer que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo divulgado neste documento, se liga a um antígeno alvo com uma taxa de dissociação (k(off)) menor ou igual a 5 X 10-2 seg- 1 , 10-2 seg-1, 5 X 10-3 seg-1, 10-3 seg-1, 5 X 10-4 seg-1, 10-4 seg-1, 5 X 10-5 seg-1, ou 10-5 seg-1 5 X 10-6 seg-1, 10-6 seg-1, 5 X 10-7 seg-1 ou 10-7 seg-1.
[071] Pode-se dizer que uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado de ligação ao antígeno divulgado neste documento, se liga a um antígeno alvo com uma taxa de associação (k(on)) maior ou igual a 103 M-1 seg-1, 5 X 103 M-1 seg-1, 104 M-1 seg-1, 5 X 104 M-1 seg-1, 105 M-1 seg-1, 5 X 105 M-1 seg-1, 106 M-1 seg-1, ou 5 X 106 M-1 seg-1 ou 107 M-1 seg-1.
[072] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo é dito por inibir competitivamente a ligação de um anticorpo de referência ou fragmento de ligação a antígeno a um dado epítopo se preferencialmente se liga a esse epítopo na medida em que bloqueia, até certo ponto, a ligação do anticorpo de referência ou fragmento de ligação ao antígeno ao epítopo.
A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, ensaios de ELISA de competição. Pode-se dizer que uma molécula de ligação inibe competitivamente a ligação do anticorpo de referência ou fragmento de ligação ao antígeno a um dado epítopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60% ou pelo menos 50%.
[073] Conforme usado neste documento, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epítopo individual com um ou mais domínios de ligação ao antígeno, por exemplo, de uma molécula de imunoglobulina. Ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. 1988) nas páginas 27-28. Conforme usado neste documento, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma população de domínios de ligação ao antígeno e um antígeno. Ver, por exemplo, Harlow nas páginas 29-34. A avidez está relacionada à afinidade dos domínios individuais de ligação ao antígeno na população com epítopos específicos, e também as valências das imunoglobulinas, e ao antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epítopo altamente repetitiva, tal como um polímero, seria uma de alta avidez. Uma interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um receptor presente em alta densidade na superfície celular também seria de alta avidez.
[074] Moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos, variantes ou derivados das mesmas, conforme divulgados neste documento, também podem ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Como utilizado neste documento, o termo "reatividade cruzada" refere-se à capacidade de uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, específico para um antígeno, para reagir com um segundo antígeno; uma medida de relação entre duas substâncias antigênicas diferentes. Assim, uma molécula de ligação é reativa de forma cruzada se esta se liga a um epítopo diferente daquele que induziu sua formação. O epítopo reativo de forma cruzada geralmente contém muitas das mesmas características estruturais complementares, como o epítopo de indução e, em alguns casos, pode realmente se adaptar melhor que o original.
[075] Uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo, também pode ser descrita ou especificada em termos de sua afinidade de ligação a um antígeno. Por exemplo, uma molécula de ligação pode se ligar a um antígeno com uma constante de dissociação ou KD não superior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, ou 10-15 M.
[076] Os "fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno", incluindo anticorpos de cadeia única ou outros domínios de ligação ao antígeno, podem existir sozinhos ou em combinação com um ou mais dos seguintes: região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 ou CH4, cadeia J ou componente secretor. Também estão incluídos fragmentos de ligação ao antígeno que podem incluir qualquer combinação de região(ões) variável(is) com um ou mais dentre uma região de dobradiça, domínios CH1, CH2, CH3 ou CH4, uma cadeia J ou um componente secretor. As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno destes, podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Os anticorpos podem ser anticorpos humanos, murinos, de burro, de coelho, de cabra, de porquinho-da-índia, de camelo, de lhama, de cavalo ou de frango. Em outra modalidade, a região variável pode ser condricte na origem (por exemplo, de tubarões). Conforme usado neste documento, anticorpos "humanos" que possuem anticorpos tendo a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de animais transgênicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que em alguns casos expressam imunoglobulinas endógenas e em alguns casos não, como descrito infra e, por exemplo na, US Pat. nº 5,939,598 por Kucherlapati et al. De acordo com aspectos da presente divulgação, um anticorpo IgM ou IgM conforme fornecido neste documento pode incluir um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, por exemplo, um fragmento scFv, desde que o anticorpo IgM ou IgM seja capaz de formar um multímero, por exemplo, um hexâmero ou um pentâmero.
[077] Conforme usado neste documento, o termo "subunidade de cadeia pesada" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglobulina, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo compreendendo uma subunidade de cadeia pesada pode incluir pelo menos um de: um domínio VH, um domínio CH1, um domínio de dobradiça (por exemplo, região de dobradiça superior, média e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3, um domínio CH4 ou uma variante ou fragmento dos mesmos. Por exemplo, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, uma molécula semelhante a anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo pode incluir, sem limitação, além de um domínio VH: um domínio CH1; um domínio CH1, uma dobradiça e um domínio CH2; um domínio CH1 e um domínio CH3; um domínio CH1, uma dobradiça e um domínio CH3; ou um domínio CH1, um domínio de dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em certos aspectos, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo, molécula semelhante a anticorpo ou fragmento, variante ou derivado do mesmo pode incluir, além de um domínio VH, um domínio CH3 e um domínio CH4; ou um domínio CH3, um domínio CH4 e uma cadeia J. Além disso, uma molécula de ligação, por exemplo, anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo, para uso na divulgação pode não ter certas porções de região constante, por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2. Será entendido por um versado na técnica que esses domínios (por exemplo, a subunidade da cadeia pesada) podem ser modificados de modo que variem na sequência de aminoácidos da molécula original de imunoglobulina. De acordo com aspectos da presente divulgação, um anticorpo IgM ou IgM conforme fornecido neste documento compreende porções suficientes de uma região constante da cadeia pesada IgM para permitir que o anticorpo IgM ou semelhante a IgM forme um multímero, por exemplo, um hexâmero ou um pentâmero.
[078] Conforme usado neste documento, o termo "subunidade de cadeia leve" inclui sequências de aminoácidos derivadas de uma cadeia leve de imunoglobulina. A subunidade da cadeia leve inclui pelo menos um VL e pode incluir ainda um domínio CL (por exemplo, Cκ ou Cλ).
[079] As moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, moléculas semelhantes a anticorpo, ou fragmentos de ligação ao antígeno, variantes ou derivados das mesmas, ou fragmentos de multimerização das mesmas podem ser descritas ou especificadas em termos de epítopo(s) ou porção(ões) de um antígeno que elas reconhecem ou se ligam especificamente. A porção de um antígeno alvo que interage especificamente com o domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo é um "epítopo" ou um "determinante antigênico". Um antígeno alvo pode compreender um único epítopo ou pelo menos dois epítopos e pode incluir qualquer número de epítopos, dependendo do tamanho, conformação e tipo de antígeno.
[080] Conforme indicado anteriormente, as estruturas de subunidade e a configuração tridimensional das regiões constantes a diversas classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Conforme usado neste documento, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável amino terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro domínio da região constante (mais amino terminal) de uma cadeia pesada de imunoglobulina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino terminal para a região de dobradiça de uma típica molécula da cadeia pesada IgG.
[081] Conforme usado neste documento, o termo "domínio CH2" inclui a porção de uma molécula de cadeia pesada que se estende, por exemplo, do aminoácido 244 ao aminoácido 360 de um anticorpo IgG usando esquemas de numeração convencionais (aminoácidos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat e aminoácidos 231-340, sistema de numeração da EU; ver Kabat EA et al., op. cit. O domínio CH3 se estende do domínio CH2 ao C-terminal da molécula de IgG e compreende aproximadamente 108 aminoácidos. Certas classes de imunoglobulinas, por exemplo, IgM, incluem ainda uma região CH4.
[082] Conforme usado neste documento, o termo "região de dobradiça" inclui a porção de uma molécula da cadeia pesada que junta o domínio CH1 ao domínio CH2 em cadeias pesadas IgG, IgA, e IgD. Esta região de dobradiça compreende aproximadamente 25 aminoácidos e é flexível, permitindo, assim, que as duas regiões de ligação ao antígeno N-terminal se movam independentemente.
[083] Conforme usado neste documento, o termo "ligação dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. O aminoácido cisteína compreende um grupo tiol que pode formar uma ligação ou ponte dissulfeto com um segundo grupo tiol.
[084] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo no qual a região ou o sítio imunorreativo é obtido ou derivado de uma primeira espécie e a região constante (que pode estar intacta, parcial ou modificada) é obtida de uma segunda espécie. Em algumas modalidades, a região ou o sítio de ligação ao alvo será de uma fonte não humana (por exemplo, camundongo ou primata) e a região constante é humana.
[085] Os termos "anticorpo multiespecífico" "anticorpo biespecífico" referem- se a um anticorpo ou molécula semelhante a anticorpo que tem domínios de ligação para dois ou mais epítopos diferentes dentro de uma única molécula de anticorpo.
Outras moléculas de ligação em adição à estrutura de anticorpo canônico podem ser construídas com duas especificidades de ligação. A ligação do epítopo por anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos pode ser simultânea ou sequencial. Triomas e hibridomas híbridos são dois exemplos de linhas celulares que podem secretar anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos também podem ser construídos por meios recombinantes. (Ströhlein e Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry e Snavely, IDrugs. 13:543-9 (2010)). Um anticorpo biespecífico também pode ser um diacorpo.
[086] Conforme usado neste documento, o termo "anticorpo manipulado"
refere-se a um anticorpo no qual o domínio variável na cadeia pesada e leve ou em ambas é alterado pela substituição pelo menos parcial de um ou mais aminoácidos nas regiões CDR ou de framework. Em certos aspectos, CDRs inteiras de um anticorpo de especificidade conhecida podem ser enxertadas nas regiões de framework de um anticorpo heterólogo. Embora CDRs alternativas possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesmo subclasse que o anticorpo do qual as regiões de framework são derivadas, as CDRs também podem ser derivadas de um anticorpo de classe diferente, por exemplo, de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo manipulado no qual uma ou mais CDRs "doadoras" de um anticorpo não humano de especificidade conhecida são enxertadas em uma framework da cadeia pesada ou leve humana é referida neste documento como um "anticorpo humanizado". Em certos aspectos, nem todas as CDRs são substituídas pelas CDRs completas da região variável doadora e, no entanto, a capacidade de ligação ao antígeno do doador ainda pode ser transferida para os domínios variáveis receptores. Dadas as explicações estabelecidas em, por exemplo, US Pat. nº
5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370, será bem dentro da competência daqueles versados na técnica, através da realização de experimentos de rotina ou por teste de tentativa e erro, para obter um anticorpo funcional manipulado ou humanizado.
[087] Conforme usado neste documento, o termo "manipulado" inclui manipulação de moléculas de ácido nucleico ou de polipeptídeo por meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese peptídica in vitro, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação dessas técnicas).
[088] Conforme usado neste documento, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" ou outros equivalentes gramaticais podem ser usados de forma intercambiável. Esses termos se referem à junção de dois ou mais elementos ou componentes, por quaisquer meios, incluindo conjugação química ou meios recombinantes. Uma "fusão in-frame" refere-se à junção de dois ou mais quadros de leitura aberta de polinucleotídeo (ORFs) para formar um ORF maior contínuo, de forma que mantém o quadro de leitura traducional dos ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma única proteína que contém dois ou mais segmentos que correspondem aos polipeptídeos codificados pelos ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente tão unidos na natureza). Embora o quadro de leitura seja assim feito contínuo por todos os segmentos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente separados, por exemplo, por uma sequência ligante in-frame. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imunoglobulina podem ser fundidos, in-frame, mas ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de framework de imunoglobulina ou regiões CDR adicionais, desde que as CDRs "fundidas" sejam cotraduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.
[089] No contexto de polipeptídeos, uma "sequência linear" ou uma "sequência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em um sentido terminal amino para carboxila na qual aminoácidos vizinhos um ao outro na sequência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo. Uma porção de um polipeptídeo que é "amino-terminal" ou "N-terminal" para outra porção de um polipeptídeo é aquela porção que vem mais cedo na cadeia polipeptídica sequencial. Da mesma forma, uma porção de um polipeptídeo que é "carboxi terminal" ou "C-terminal" para outra porção de um polipeptídeo é aquela porção que vem posteriormente na cadeia sequencial de polipeptídeo. Por exemplo, em um anticorpo típico, o domínio variável é "N-terminal" para a região constante e a região constante é "C-terminal" para o domínio variável.
[090] O termo "expressão", conforme usado neste documento, refere-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da presença funcional do gene dentro da célula, incluindo, sem limitação, knockdown do gene, bem como a expressão transiente e expressão estável. Inclui, sem limitação, a transcrição do gene em RNA, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e a tradução desse mRNA no(s) polipeptídeo(s). Se o produto desejado final for um produto bioquímico, a expressão inclui a criação desse produto bioquímicos e quaisquer precursores. A expressão de um gene produz um "produto de gene". Conforme usado neste documento, um produto de gene pode ser tanto um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene ou um polipeptídeo que é traduzido a partir de um transcrito. Os produtos de gene descritos neste documento incluem ainda ácidos nucleicos com modificações pós transcricionais, por exemplo, poliadenilação, ou polipeptídeos com modificações pós traducionais, por exemplo, metilação, glicosilação, a adição de lipídios, associação com outras subunidades de proteína, clivagem proteolítica e similares.
[091] Termos como "tratando" ou "tratamento" ou "para tratar" ou "aliviando" ou "aliviar" referem-se às medidas terapêuticas que curam, reduzem, diminuem os sintomas de, e/ou interrompem ou reduzem a progressão de uma condição ou desordem patológica diagnosticada existente. Termos como "prevenir", "prevenção", "evitar", "impedimento" e similares referem-se a medidas profiláticas ou preventivas que impedem o desenvolvimento de uma condição ou distúrbio patológico alvo não diagnosticado. Assim, "aqueles em necessidade de tratamento" podem incluir os que já têm o distúrbio; aqueles mais propensos a terem o distúrbio; e aqueles em quem a doença deve ser prevenida.
[092] Conforme usado neste documento, os termos "meia-vida sérica" ou "meia-vida plasmática" referem-se ao tempo que leva (por exemplo, em minutos, horas ou dias) após a administração para a concentração sérica ou plasmática de um medicamento, por exemplo, uma molécula de ligação, tal como um anticorpo, molécula semelhante a anticorpo ou fragmento do mesmo, conforme descrito neste documento, a ser reduzida em 50%. Duas meias-vidas podem ser descritas: a meia-
vida alfa, meia-vida α ou t1/2α, que é a taxa de declínio nas concentrações plasmáticas devido ao processo de redistribuição de fármaco do compartimento central, por exemplo, o sangue no caso de administração intravenosa em um compartimento periférico (por exemplo, um tecido ou órgão) e a meia-vida beta, meia-vida β ou t1/2β, que é a taxa de declínio devido aos processos de excreção ou metabolismo.
[093] Conforme usado neste documento, o termo "área sob a curva de concentração-tempo de fármaco no plasma" ou "AUC" reflete a exposição real do corpo ao fármaco após a administração de uma dose do fármaco e é expresso em mg*h/L. Essa área sob a curva é medida desde o tempo 0 (t0) até o infinito (∞) e depende da taxa de eliminação do fármaco do corpo e da dose administrada.
[094] Conforme usado neste documento, o termo "tempo médio de permanência" ou "MRT" refere-se ao período médio de tempo que o fármaco permanece no corpo.
[095] Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "paciente" ou "mamífero" é compreendido qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual é desejada diagnóstico, prognóstico ou terapia. Os mamíferos incluem seres humanos, animais domésticos, animais de fazenda e zoológico, esportes ou animais de estimação, como cães, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, suínos, vacas, ursos e assim por diante.
[096] Conforme usado neste documento, frases como "um sujeito que se beneficiaria com a terapia" e "um animal que precisa de tratamento" refere-se a um subconjunto de sujeitos, dentre todos os sujeitos em potencial, que se beneficiariam da administração de um determinado agente terapêutico, por exemplo, uma molécula de ligação, tal como um anticorpo, compreendendo um ou mais domínios de ligação ao antígeno. Tais moléculas de ligação, por exemplo, anticorpos, podem ser usadas, por exemplo, para procedimentos de diagnóstico e/ou para tratamento ou prevenção de uma doença.
Anticorpos IgM ou semelhantes a IgM
[097] A IgM é a primeira imunoglobulina produzida por células B em resposta a um estímulo de um antígeno e está presente naturalmente em cerca de 1,5 mg/ml em soro com uma meia-vida de cerca de 5 dias. A IgM é uma molécula pentamérica ou hexamérica e, portanto, inclui cinco ou seis unidades de ligação. Uma unidade de ligação a IgM inclui tipicamente duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Embora uma região constante da cadeia pesada IgG contenha três domínios constantes da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3), a região constante pesada (µ) da IgM contém adicionalmente um quarto domínio constante (CH4) e inclui uma “cauda” C-terminal.
A região constante IgM humana compreende tipicamente a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12 (idêntica, por exemplo, aos Números de Acesso GenBank pir||S37768, CAA47708.1, e . CAA47714.1). A região Cµ1 humana varia de cerca do aminoácido 5 a por volta do aminoácido 102 da SEQ ID NO: 12; a região Cµ2 humana varia de cerca do aminoácido 114 a por volta do aminoácido 205 da SEQ ID NO: 12, a região Cµ3 humana varia de cerca do aminoácido 224 a por volta do aminoácido 319 da SEQ ID NO: 12, a região Cµ4 varia de cerca do aminoácido 329 a por volta do aminoácido 430 da SEQ ID NO: 12, e a cauda varia de por volta do aminoácido 431 a por volta do aminoácido 453 da SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 12 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 12:
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[098] Existem outras formas da região constante IgM humana com pequenas variações de sequência, incluindo, sem limitação, os Números de Acesso GenBank.
P01871.4, CAB37838.1 e pir||MHHU. As substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos nas posições correspondentes à SEQ ID NO: 12 descritas e reivindicadas em outras partes desta divulgação podem igualmente ser incorporadas em sequências de IgM humanas alternativas, bem como em sequências de aminoácidos de região constante IgM de outras espécies, por exemplo, as mostradas na FIG. 1.
[099] Cada região constante da cadeia pesada IgM pode ser associada a um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, um scFv ou VHH, ou uma subunidade de um domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, uma região VH.
[0100] Cinco unidades de ligação a IgM podem formar um complexo com uma pequena cadeia polipeptídica adicional (a cadeia J) para formar um anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM. A forma precursora da cadeia J humana, SEQ ID NO: 1, é apresentada abaixo. O peptídeo sinal (sublinhado) se estende do aminoácido 1 a por volta do aminoácido 22 da SEQ ID NO: 1, e a cadeia J humana madura se estende de cerca do aminoácido 23 ao aminoácido 159 da SEQ ID NO: 1.
A cadeia J humana madura inclui a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 1:
MKNHLLFWGVLAVFIKAVHVKAQEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNE DIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNI
CDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD SEQ ID NO: 2 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 2:
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0101] Sem a cadeia J, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM geralmente se reúne em um hexâmero, compreendendo até doze domínios de ligação ao antígeno. Com uma cadeia J, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM geralmente se reúne em um pentâmero, compreendendo até dez domínios de ligação ao antígeno, ou mais, se a cadeia J for uma cadeia J modificada que compreende polipeptídeos heterólogos que compreendem domínio(s) adicional(is) de ligação ao antígeno. Pensa-se que a montagem de cinco ou seis unidades de ligação a IgM em um anticorpo IgM pentamérico ou hexamérico ou anticorpo semelhante a IgM envolva os domínios Cµ4 e de cauda. Ver, por exemplo, Braathen, R., et al., J. Biol. Chem.
277:42755-42762 (2002). Por conseguinte, um anticorpo IgM pentamérico ou hexamérico fornecido nesta divulgação inclui tipicamente pelo menos os domínios Cµ4 e/ou de cauda (também referidos neste documento coletivamente como Cµ4-tp).
Um "fragmento de multimerização" de uma região constante da cadeia pesada IgM inclui, portanto, pelo menos os domínios Cµ4-tp. Uma região constante da cadeia pesada IgM pode incluir adicionalmente um domínio Cµ3 ou um fragmento deste, um domínio Cµ2 ou um fragmento deste, um domínio Cµ1 ou um fragmento do mesmo e/ou outros domínios da cadeia pesada IgM. Em certos aspectos, uma molécula de ligação, por exemplo, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode incluir um domínio constante da cadeia pesada (µ) de IgM completo, por exemplo, SEQ ID NO: 12 ou uma variante, derivado ou análogo do mesmo.
[0102] Em certos aspectos, a divulgação fornece um anticorpo IgM ou semelhante a IgM pentamérico compreendendo cinco unidades de ligação bivalentes, em que cada unidade de ligação inclui duas regiões constantes da cadeia pesada IgM ou fragmentos de multimerização ou subunidade destes, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno ou subunidade deste. Em certos aspectos, as duas regiões constantes da cadeia pesada IgM são regiões constantes da cadeia pesada humana.
[0103] Onde o anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido neste documento é pentamérico, o anticorpo IgM ou semelhante a IgM tipicamente compreende ainda uma cadeia J, ou fragmento funcional ou variante deste. Em certos aspectos, a cadeia J é uma cadeia J modificada ou uma variante desta que compreende ainda uma ou mais porções heterólogas ligadas a ela, conforme descrito em outra parte deste documento. Em certos aspectos, a cadeia J pode ser mutada para afetar, por exemplo, melhorar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido neste documento, conforme discutido em outras partes deste documento.
[0104] Uma região constante da cadeia pesada IgM pode incluir um ou mais dentre um domínio Cµ1 ou fragmento ou variante deste, um domínio Cµ2 ou fragmento ou variante deste, um domínio Cµ3 ou fragmento ou variante deste e/ou um domínio Cµ4 ou fragmento ou variante deste, desde que a região constante possa servir uma função desejada no anticorpo IgM ou semelhante a IgM, por exemplo, associar-se à segunda região constante de IgM para formar um domínio de ligação ao antígeno e/ou associar-se a outras unidades de ligação (e no caso de um pentâmero, uma cadeia J) para formar um hexâmero ou um pentâmero. Em certos aspectos, as duas regiões constantes da cadeia pesada IgM ou fragmentos ou variantes destas dentro de uma unidade de ligação individual, cada uma, compreende um domínio Cµ4 ou fragmento ou variante deste, uma cauda (tp) ou fragmento ou variante deste, ou uma combinação de um domínio Cµ4 e um TP ou fragmento ou variante dos mesmos. Em certos aspectos, as duas regiões constantes da cadeia pesada IgM ou fragmentos ou variantes destas dentro de uma unidade de ligação individual compreendem ainda um domínio Cµ3 ou fragmento ou variante deste, um domínio Cµ2 ou fragmento ou variante deste, um domínio Cµ1 ou fragmento ou variante deste, ou qualquer combinação destes.
Cadeias J modificadas
[0105] Em certos aspectos, a cadeia J de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM pentamérico, conforme fornecido neste documento, pode ser modificada, por exemplo, pela introdução de uma fração heteróloga, ou duas ou mais frações heterólogas, por exemplo, polipeptídeos, sem interferir na capacidade do anticorpo IgM ou semelhante IgM para montar e se ligar ao(s) seu(s) alvo(s) de ligação. Ver Patente US nº 9.951.134, Publicação PCT nº WO 2017/059387 e Publicação PCT nº WO 2017/059380, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Por conseguinte, os anticorpos IgM ou semelhantes a IgM, conforme fornecido neste documento, incluindo anticorpos multiespecíficos IgM ou IgM, conforme descrito em outra parte deste documento, podem compreender uma cadeia J modificada ou fragmento funcional ou variante desta compreendendo uma fração heteróloga, por exemplo, um polipeptídeo heterólogo, introduzido na cadeia J ou fragmento ou variante desta. Em certos aspectos, a fração heteróloga pode ser uma sequência peptídica ou polipeptídica fundida em estrutura à cadeia J ou conjugada quimicamente à cadeia J ou fragmento ou variante desta, em que o polipeptídeo heterólogo é direta ou indiretamente fundido à cadeia J variante ou fragmento funcional desta. Em certos aspectos, o polipeptídeo heterólogo é fundido à cadeia J ou fragmento funcional desta via um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico consistindo em pelo menos 5 aminoácidos, mas não mais do que 25 aminoácidos. Em certos aspectos, o ligante peptídico consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28), ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29). Em certos aspectos, a porção heteróloga pode ser uma fração química conjugada à cadeia J. As porções heterólogas a serem ligadas a uma cadeia J podem incluir, sem limitação, uma porção de ligação, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, uma molécula de cadeia única Fv (ScFv), um peptídeo estabilizador que pode aumentar a metade-vida do anticorpo IgM ou semelhante a IgM, ou uma fração química tal como um polímero ou uma citotoxina.
[0106] Em algumas modalidades, uma cadeia J modificada pode compreender um domínio de ligação ao antígeno que pode incluir, sem limitação, um polipeptídeo (incluindo peptídeos pequenos) capaz de se ligar especificamente a um antígeno alvo. Em certos aspectos, um domínio de ligação ao antígeno associado a uma cadeia J modificada pode ser um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, conforme descrito em outra parte deste documento. Em certos aspectos, o domínio de ligação ao antígeno pode ser um domínio de ligação ao antígeno scFv ou um domínio de ligação ao antígeno de cadeia única derivado, por exemplo, de um anticorpo camelídeo ou condricte. O domínio de ligação ao antígeno pode ser introduzido na cadeia J em qualquer local que permita a ligação do domínio de ligação ao antígeno ao seu alvo de ligação sem interferir na função da cadeia J ou na função de um anticorpo IgM ou IgA associado. Os locais de inserção incluem, mas não estão limitados a, no ou próximo ao C-terminal, no ou próximo ao N-terminal ou no local interno que, com base na estrutura tridimensional da cadeia J, esteja acessível. Em certos aspectos, o domínio de ligação ao antígeno pode ser introduzido na cadeia J humana madura da SEQ ID NO: 2 entre os resíduos de cisteína 92 e 101 da SEQ ID NO: 2. Em um aspecto adicional, o domínio de ligação ao antígeno pode ser introduzido na cadeia J humana da SEQ ID NO: 2 em ou próximo a um sítio de glicosilação. Em um aspecto adicional, o domínio de ligação ao antígeno pode ser introduzido na cadeia J humana da SEQ ID NO: 2 dentro de cerca de 10 resíduos de aminoácidos do C-terminal ou dentro de cerca de 10 aminoácidos do N-terminal.
[0107] Anticorpos IgM ou semelhantes a IgM pentaméricos com mutações na cadeia J que alteram a meia-vida sérica
[0108] Esta divulgação fornece um anticorpo IgM ou fragmento de multimerização do mesmo, por exemplo, um anticorpo pentamérico semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização do mesmo, com meia-vida sérica aumentada.
Em certos aspectos, o anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido neste documento compreende cinco unidades ou variantes de ligação a anticorpos bivalentes ou fragmentos de multimerização das mesmas e uma variante de uma cadeia J ou fragmento funcional desta.
Por "fragmento funcional" de uma cadeia J entende-se um fragmento da cadeia J (ou um fragmento de uma cadeia J variante ou uma cadeia J modificada, conforme fornecido neste documento) que permanece capaz de se associar a cinco unidades de ligação a IgM para formar um pentâmero ou se associar a duas unidades de ligação a IgA para formar um dímero.
Cada unidade de ligação do anticorpo IgM fornecido ou anticorpo semelhante a IgM compreende duas regiões constantes da cadeia pesada IgM ou fragmentos ou variantes destas (em que os fragmentos ou variantes são capazes de multimerização), onde cada região constante está associada a um domínio de ligação ao antígeno ou subunidade deste.
Conforme fornecido neste documento, uma "cadeia J variante ou fragmento funcional desta"
pode incluir uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação à cadeia J de referência ou fragmento funcional desta, em que a cadeia J de referência é idêntica à cadeia J variante, exceto por uma ou mais substituições,
deleções ou inserções de aminoácidos únicos.
Em certos aspectos, a cadeia J de referência é uma cadeia J do tipo selvagem.
Uma cadeia J variante ou fragmento funcional desta, conforme fornecido neste documento, pode afetar, por exemplo,
melhorar, a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante ou fragmento funcional desta.
Uma cadeia J variante ou fragmento funcional desta, conforme fornecido neste documento, pode afetar, por exemplo, inibir, a capacidade de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante ou fragmento funcional desta para se ligar a um receptor cognato, por exemplo, um receptor Fcαμ (FcαμR) ou um receptor polimérico Ig (pIgR). O termo "uma ou mais substituições, inserções e deleções de aminoácido único" significa que cada aminoácido da sequência de aminoácidos da cadeia J variante ou fragmento funcional desta pode ser individualmente substituído, deletado ou ter um único aminoácido inserido adjacente ao mesmo em relação à cadeia J de referência, mas a cadeia J variante ou o fragmento funcional desta ainda devem ser capazes de servir a função de montagem com as cadeias pesadas IgM ou cadeias pesadas semelhantes a IgM e cadeias leves de anticorpo para formar um pentâmero IgM ou pentâmero semelhante a IgM.
[0109] Em certos aspectos, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional, conforme fornecido neste documento, pode ter uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido único, uma combinação de duas substituições, inserções ou deleções de aminoácido único (por exemplo, duas substituições de aminoácido único ou uma substituição de aminoácido único e uma única inserção ou deleção de aminoácido único), uma combinação de três substituições, inserções ou deleções de aminoácido único, uma combinação de quatro substituições, inserções ou deleções de aminoácido único ou mais, em que um, dois, três, quatro ou mais substituições, inserções ou deleções aminoácido único podem afetar, por exemplo, melhorar, a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante ou seu fragmento funcional. Por conseguinte, um anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido pode exibir uma meia-vida sérica aumentada após a administração a um sujeito animal, por exemplo, um modelo de camundongo, em relação a um anticorpo IgM ou semelhante a IgM de referência que é idêntico, exceto por uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácido único na cadeia J variante ou fragmento funcional desta, em que o anticorpo fornecido e o anticorpo de referência são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais.
[0110] Em certos aspectos, a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido, compreendendo a cadeia J variante, por exemplo, a meia-vida α (t1/2α), a meia-vida β (t1/2β), tanto t1/2α quanto t1/2β, ou a meia-vida geral, podem ser aumentadas em pelo menos 0,1 vez, pelo menos 0,5 vez, pelo menos 1 vez, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais sobre o anticorpo de referência.
Em certos aspectos, a elevação da meia-vida sérica se aproxima da de um anticorpo IgG que compreende os mesmos domínios de ligação ao antígeno.
[0111] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que compreende uma cadeia J variante, conforme fornecido neste documento, exibe ainda outros parâmetros farmacocinéticos modificados, por exemplo, um pico de concentração plasmática de pico aumentado (Cmáx), uma área aumentada sob a curva de T0 a ∞ (AUC), por exemplo, um tempo de depuração modificado, um tempo médio de permanência (MRT) aumentado ou qualquer combinação destes em relação ao anticorpo de referência. Em certos aspectos, a AUC pode ser aumentada em pelo menos 0,1 vezes, pelo menos 0,5 vezes, pelo menos 1 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais do que um anticorpo IgM ou semelhante a IgM de referência que é idêntico, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único na cadeia J variante ou seu fragmento funcional, em que o anticorpo fornecido e o anticorpo de referência são administrados da mesma maneira às mesmas espécies animais.
[0112] Em certos aspectos, a cadeia J do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia J humana de tipo selvagem madura (SEQ ID NO: 2). "Um aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia J humana de tipo selvagem madura" significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie que seja homóloga ao Y102 na cadeia J humana. A posição correspondente a Y102 na SEQ ID NO: 2 é conservada nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 43 outras espécies. Ver a FIG. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Conforme demonstrado nos Exemplos, certas mutações na posição correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 podem inibir a ligação de certos receptores de imunoglobulina, por exemplo, o receptor Fcαµ humano ou murino, o receptor Fcµ murino e/ou receptor Ig polimérico (receptor de pIg) humano ou murino a um pentâmero IgM compreendendo a cadeia J mutante. Ver, por exemplo, a FIG. 2. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina (A), serina (S) ou arginina (R). Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina. Em um aspecto particular, a cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 3 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 3:
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCATYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0113] Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por serina. Em um aspecto particular, a cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 4 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 4
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCSTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0114] Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por arginina. Em um aspecto particular, a cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 5 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 5
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCRTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0115] Em certos aspectos, a cadeia J do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana madura de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). "Um aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana madura de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie que seja homóloga ao T103 na cadeia J humana. A posição correspondente a T103 na SEQ ID NO: 2 é conservada nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 37 outras espécies. Ver a Fig. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Conforme demonstrado nos Exemplos, certas mutações na posição correspondente a T103 na SEQ ID NO: 2 podem inibir a ligação do receptor Fcαµ humano a um pentâmero IgM compreendendo a cadeia J mutante.
Ver, FIG. 2. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao T103 da SEQ ID
NO: 2 pode ser substituído por qualquer aminoácido. Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao T103 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina. Em um aspecto particular, a cadeia J ou fragmento funcional ou variante desta é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 6 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 6:
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYAYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0116] Em certos aspectos, a cadeia J variante isolada ou fragmento funcional desta do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM conforme fornecido neste documento compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido N49 ou ao aminoácido S51 da cadeia J humana de tipo selvagem madura (SEQ ID NO: 2), desde que o S51 não seja substituído por treonina (T), ou em que a cadeia J compreenda substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos N49 e S51 da cadeia J humana madura de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2). Novamente, "um aminoácido correspondente ao aminoácido N49 da SEQ ID NO: 2 ou um aminoácido correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 da cadeia J humana madura do tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie homóloga a N49 e/ou S51 na cadeia J humana. As posições correspondentes a N49 e S51 na SEQ ID NO: 2 são conservadas nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 43 outras espécies. Ver a Fig. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Os aminoácidos correspondentes ao N49 e S51 da SEQ ID NO: 2, juntamente com o aminoácido correspondente o I50 da SEQ ID NO: 2, compreendem um motivo de N-glicosilação ligada na cadeia J. Por conseguinte, as mutações em N49 e/ou S51 (com exceção de uma única substituição de treonina em S51) podem impedir a glicosilação nesse motivo. Em certos aspectos, a asparagina na posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, a asparagina na posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S) ou ácido aspártico (D). Em um aspecto particular, a posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A). Em um aspecto particular, a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7. A SEQ ID NO: 7 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 7:
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNREAISDPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0117] Em certos aspectos, a serina na posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por qualquer aminoácido, exceto treonina. Em certos aspectos, a serina na posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A) ou glicina (G). Em um aspecto particular, a posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A). Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8. SEQ ID NO: 8 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 8:
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENIADPTS PLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTA VVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
[0118] Em certos aspectos, a cadeia J variante ou fragmento funcional desta do anticorpo IgM fornecido ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, é uma cadeia J modificada, por exemplo, conforme fornecido na Patente
US nº 9.951.134. Em certos aspectos, a cadeia J modificada compreende ainda um polipeptídeo heterólogo, em que o polipeptídeo heterólogo é direta ou indiretamente fundido à cadeia J variante ou fragmento funcional desta.
Em certos aspectos, o polipeptídeo heterólogo é fundido à cadeia J variante ou fragmento funcional desta via um ligante peptídico, por exemplo, um ligante peptídico consistindo em pelo menos 5 aminoácidos, mas não mais do que 25 aminoácidos.
Em certos aspectos, o ligante peptídico consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26),
GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ
ID NO: 28), ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29). O polipeptídeo heterólogo pode ser fundido ao N-terminal da cadeia J variante ou fragmento funcional desta, ao C-terminal da cadeia J variante ou fragmento funcional desta, polipeptídeos heterólogos podem ser fundidos ao N-terminal e C-terminal da cadeia J variante ou fragmento funcional desta.
Em certos aspectos, o polipeptídeo heterólogo compreende um domínio de ligação ao antígeno.
Em certos aspectos, o domínio de ligação do polipeptídeo heterólogo é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fv ligado a dissulfeto (sdFv) ou qualquer combinação dos mesmos.
Em certos aspectos, o polipeptídeo heterólogo pode se ligar especificamente a CD3ε, por exemplo, a cadeia J variante modificada ou fragmento funcional desta que pode aumentar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou semelhante a IgM fornecido é uma variante da cadeia J modificada “V15J” (SEQ ID NO: 9) e pode compreender, por exemplo, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10 (V15J-
Y102A), ou SEQ ID NO: 23 (V15J-T103A), ou SEQ ID NO: 24 (V15J-N49A). Em certos aspectos, a cadeia J modificada pode compreender um polipeptídeo heterólogo fundido ao N-terminal da cadeia J, por exemplo, um fragmento de anticorpo scFv, que se liga especificamente a CD3ε, e pode compreender ainda um polipeptídeo heterólogo adicional que afeta a meia-vida sérica de um anticorpo IgM compreendendo a cadeia J modificada fundida ao C-terminal da cadeia J, por exemplo, albumina do soro humana. Em um aspecto específico, a cadeia J modificada compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 (VJH) ou uma variante desta com uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos que podem afetar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J, por exemplo, em uma posição correspondente a Y102 ou T103 da SEQ ID NO: 2.
[0119] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreende uma cadeia J variante ou fragmento funcional desta, conforme fornecido neste documento, compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0120] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou semelhante a IgM compreendendo uma cadeia J variante, conforme fornecido neste documento, compreende ainda regiões constantes da cadeia pesada IgM compreendendo uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos, em relação a uma região constante da cadeia pesada IgM de referência idênticas às regiões constantes da cadeia pesada IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos, em que as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante podem afetar da mesma forma a meia-vida sérica do anticorpo IgM fornecido ou anticorpo semelhante a IgM. Esse anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM pode, em certos aspectos, exibir uma meia-vida sérica aumentada adicionalmente após a administração a um animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou a um anticorpo semelhante a IgM que são idênticos, exceto pela uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos nas regiões constantes da cadeia pesada IgM, e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais. De acordo com este aspecto, o anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM pode ser um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo uma cadeia J variante conforme fornecido neste documento, por exemplo, uma cadeia J variante compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, ou qualquer combinação dos mesmos. Em certos aspectos, o aumento da meia-vida sérica pode ser aditivo, mais que aditivo ou menos que aditivo. As regiões constantes da cadeia pesada IgM variante exemplificativas são fornecidas em outras partes deste documento e incluem, sem limitação, regiões constantes da cadeia pesada IgM humana variante compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34.
[0121] Em certos aspectos, a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou semelhante a IgM compreendendo uma cadeia J variante conforme fornecido neste documento e as regiões constantes da cadeia pesada IgM variante conforme fornecidas neste documento compreendem um aumento na meia-vida sérica em relação a um anticorpo de referência que compreende apenas a cadeia J variante ou apenas as regiões constantes IgM variantes que são aditivas do indivíduo aumentam a meia-vida sérica, são mais que aditivas ou menos que aditivas.
[0122] Variantes da Cadeia J que Afetam a Meia-vida Sérica de IgM
[0123] Esta divulgação fornece uma cadeia J variante isolada ou fragmento funcional desta que, como parte de um anticorpo IgM pentamérico ou um anticorpo semelhante a IgM pentamérico, pode aumentar a meia-vida sérica desse anticorpo. A cadeia J variante fornecida ou fragmento funcional desta pode ser de qualquer espécie e compreende uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma cadeia J de referência idêntica à cadeia J variante, exceto por uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos únicos. O termo "uma ou mais substituições, inserções e deleções de aminoácido único" significa que cada aminoácido da sequência de aminoácidos da cadeia J variante pode ser individualmente substituído, deletado ou ter um único aminoácido inserido adjacente ao mesmo, mas a cadeia J variante ou o fragmento funcional desta ainda devem ser capazes de servir a função de montagem com as cadeias pesadas IgM ou cadeias pesadas semelhantes a IgM e cadeias leves de anticorpo para formar um pentâmero IgM ou pentâmero semelhante a IgM. Em certos aspectos, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional, conforme fornecido neste documento, pode ter uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido único, uma combinação de duas substituições, inserções ou deleções de aminoácido único (por exemplo, duas substituições de aminoácidos único ou uma substituição de aminoácido único e uma única inserção ou deleção de aminoácido único), uma combinação de três substituições, inserções ou deleções de aminoácido único, uma combinação de quatro substituições, inserções ou deleções de aminoácido único ou mais, em que um, dois, três, quatro ou mais substituições, inserções ou deleções aminoácido único podem afetar individual ou coletivamente a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante ou seu fragmento funcional.
Em certos aspectos, as uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido único inibem a interação de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que compreende a cadeia J variante, por exemplo, ligação a um receptor, por exemplo, um FcαµR ou um pIgR.
[0124] Em certos aspectos, a meia-vida sérica, por exemplo, a meia-vida α, a meia-vida β ou a meia-vida geral de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante fornecida ou seu fragmento funcional conforme fornecido este documento pode ser aumentada em pelo menos 0,1 vezes, pelo menos
0,5 vezes, pelo menos 1 vez, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 ou mais do que o anticorpo de referência. Em certos aspectos, a elevação da meia-vida sérica se aproxima da de um anticorpo IgG que compreende os mesmos domínios de ligação ao antígeno.
[0125] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que compreende uma cadeia J variante fornecida exibe ainda outros parâmetros farmacocinéticos modificados, por exemplo, um pico de concentração plasmática de pico aumentado (Cmáx), uma área aumentada sob a curva de T0 a ∞ (AUC), um tempo de depuração modificado, um tempo médio de permanência (MRT) aumentado ou qualquer combinação destes em relação ao anticorpo de referência. Em certos aspectos, a AUC pode ser aumentada em pelo menos 0,1 vezes, pelo menos 0,5 vezes, pelo menos 1 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes ou mais do que um anticorpo IgM ou semelhante a IgM de referência que é idêntico, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único na cadeia J variante ou seu fragmento funcional, em que o anticorpo fornecido e o anticorpo de referência são administrados da mesma maneira às mesmas espécies animais.
[0126] Em certos aspectos, a cadeia J variante isolada ou seu fragmento funcional, conforme fornecido neste documento, compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia J humana de tipo selvagem madura (SEQ ID NO: 2). "Um aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia J humana de tipo selvagem madura"
significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie que seja homóloga ao Y102 na cadeia J humana. A posição correspondente a Y102 na SEQ ID NO: 2 é conservada nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 43 outras espécies. Ver a Fig. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Conforme descrito nos Exemplos abaixo, certas substituições de aminoácidos na posição correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 inibem a cadeia J variante de se ligar ao receptor Fc alfa-mu (Fcαµ) e ao receptor de Ig polimérico (receptor pIg ou pIgR). Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina (A), serina (S) ou arginina (R). Em um aspecto particular, o Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina. Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por serina. Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4. Em um aspecto particular, o aminoácido correspondente ao Y102 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por arginina. Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5.
[0127] Em certos aspectos, a cadeia J variante isolada ou seu fragmento funcional, conforme fornecido neste documento, compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana de tipo selvagem madura (SEQ ID NO: 2). "Um aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana de tipo selvagem madura" significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie que seja homóloga ao T103 na cadeia J humana. A posição correspondente a T103 na SEQ ID NO: 2 é conservada nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 37 outras espécies. Ver a Fig. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Conforme descrito nos Exemplos abaixo, as substituições de aminoácidos na posição correspondente ao T103 da SEQ ID NO: 2 inibem a cadeia J variante de se ligar ao receptor Fcαµ de imunoglobulina. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao T103 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, o aminoácido correspondente ao T103 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituído por alanina (A). Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
[0128] Em certos aspectos, esta divulgação fornece uma cadeia J variante isolada ou seu fragmento funcional compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido N49 ou ao aminoácido S51 da cadeia J humana madura (SEQ ID NO: 2), desde que o S51 não seja substituído por treonina (T) ou em que a cadeia J compreenda substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos N49 e S51 da cadeia J humana de tipo selvagem madura (SEQ ID NO: 2). Novamente, "um aminoácido correspondente ao aminoácido N49 da SEQ ID NO: 2 de um aminoácido correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 da cadeia J humana do tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da cadeia J de qualquer espécie homóloga a N49 e/ou S51 na cadeia J humana. As posições correspondentes a N49 e S51 na SEQ ID NO: 2 são conservadas nas sequências de aminoácidos da cadeia J de pelo menos 43 outras espécies. Ver a Fig. 4 da Patente US nº 9.951.134, que é incorporada por referência neste documento. Os aminoácidos correspondentes a N49 e S51 da SEQ ID NO: 2, juntamente com o aminoácido correspondente a I50 da SEQ ID NO: 2, compreendem um motivo de glicosilação ligado a N na cadeia J, e mutações em N49 e/ou S51 (com excepção de uma substituição de treonina em S51) podem assim impedir uma possível glicosilação neste motivo. Em certos aspectos, a asparagina na posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, a asparagina na posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S) ou ácido aspártico (D). Em um aspecto particular, a posição correspondente ao N49 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A). Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7. Em certos aspectos, a serina na posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por qualquer aminoácido (exceto treonina). Em certos aspectos, a serina na posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A) ou glicina (G). Em um aspecto particular, a posição correspondente ao S51 da SEQ ID NO: 2 pode ser substituída por alanina (A). Em um aspecto particular, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
[0129] Em certos aspectos, a cadeia J variante ou seu fragmento funcional, conforme fornecido neste documento, compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 ou qualquer combinação destas.
[0130] Regiões Constantes de IgM Variantes que Conferem Meia-Vida Sérica Aumentada
[0131] Esta divulgação fornece ainda um anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada, em que o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM compreende cinco ou seis unidades de ligação de anticorpo bivalentes ou suas variantes ou fragmentos, em que cada unidade de ligação compreende duas variantes de regiões constantes da cadeia pesada de IgM ou seus fragmentos multimerizantes, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno ou sua subunidade.
As regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante ou seus fragmentos de multimerização, conforme fornecidos, compreendem uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos em relação a uma região constante da cadeia pesada de IgM de referência idêntica às regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições,
deleções ou inserções de aminoácidos únicos.
Em certos aspectos, as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante podem afetar, por exemplo, aumentar,
a meia-vida sérica do anticorpo IgM fornecido ou do anticorpo semelhante a IgM isoladamente ou em combinação com uma cadeia J variante, uma cadeia J modificada variante ou seu fragmento funcional, conforme fornecido em outra parte nesta divulgação. "Uma região constante de cadeia pesada de IgM de referência" significa uma região constante de cadeia pesada de IgM que é idêntica à região constante de cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único.
Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta, quando expressos como parte de um anticorpo IgM pentamérico ou hexamérico ou um anticorpo semelhante a IgM,
conforme fornecido neste documento, conferem meia-vida sérica aumentada ao anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM quando administrados a um sujeito animal em comparação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a
IgM administrado da mesma maneira para o mesmo sujeito animal, em que o anticorpo
IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM são idênticos, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos únicos nas regiões constantes de cadeia pesada de IgM, e são administrado da mesma maneira às mesmas espécies animais.
Em certos aspectos, a região constante de IgM variante inclui uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos, por exemplo,
no domínio Cµ4, em relação à região constante de IgM de referência.
Ensaios para medir a meia-vida sérica são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, e ensaios exemplares são descritos neste documento e, por exemplo, no Pedido de Patente US nº US-2018-0265596-A1, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
[0132] Em certos aspectos, uma região constante da cadeia pesada de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta que conferem meia-vida sérica aumentada a um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecidos neste documento, podem aumentar ainda mais a meia-vida sérica de um anticorpo IgM pentamérico fornecido ou de um anticorpo semelhante a IgM com uma cadeia J variante que também aumenta a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou do anticorpo semelhante a IgM, como as cadeias J variantes fornecidas em outra parte deste documento. Em certos aspectos, o aumento da meia-vida sérica é aditivo. Em certos aspectos, o aumento da meia-vida sérica é mais que aditivo ou menos que aditivo.
[0133] Conforme fornecido neste documento, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta podem incluir uma ou mais substituições, deleções ou inserções aminoácido único que afetam a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM compreendendo a região ou fragmento constante de IgM variante. O termo "uma ou mais substituições, inserções e deleções de aminoácido único" significa que cada aminoácido da região constante de IgM variante ou do fragmento de multimerização desta pode ser individualmente substituído, deletado ou ter um único aminoácido inserido adjacente ao mesmo, mas a região constante de IgM variante ou o fragmento de multimerização desta ainda devem ser capazes de servir a função dentro de uma molécula de ligação de IgM ou semelhante a IgM, por exemplo, anticorpo, para formar um pentâmero ou hexâmero de IgM ou pentâmero ou hexâmero semelhante a IgM. Em certos aspectos, a região constante de IgM variante ou o fragmento de multimerização desta, conforme fornecido neste documento, pode ter uma substituição, inserção ou exclusão de aminoácido único, uma combinação de duas substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido único (por exemplo, duas substituições de aminoácidos único ou uma substituição de aminoácido único e uma inserção ou exclusão de aminoácido único), uma combinação de três substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido único, uma combinação de quatro substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido único ou mais, em que as uma, duas, três, quatro ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácidos único isoladas podem afetar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM compreendendo a região constante de IgM variante ou o fragmento de multimerização desta. Por conseguinte, o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecido exibe uma meia-vida sérica aumentada após a administração a um animal em relação a um anticorpo IgM ou a um anticorpo semelhante a IgM de referência que são idênticos, exceto por uma ou mais substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido único na região constante de IgM variante ou no fragmento de multimerização desta, em que o anticorpo fornecido e o anticorpo de referência são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais.
[0134] Em certos aspectos, a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou do anticorpo semelhante a IgM, por exemplo, a meia-vida α, a meia-vida β ou a meia-vida geral, pode ser aumentada em pelo menos 0,1 vezes, pelo menos 0,5 vezes, pelo menos 1 vez, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 20 vezes, pelo menos 30 vezes, pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 60 vezes, pelo menos 70 vezes, pelo menos 80 vezes, pelo menos 90 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 ou mais do que o anticorpo de referência. Em certos aspectos, a elevação da meia-vida sérica se aproxima da de um anticorpo IgG que compreende os mesmos domínios de ligação ao antígeno. Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta podem ser combinados com outras modificações de anticorpo
IgM ou de anticorpo semelhante a IgM para aumentar ainda mais a meia-vida sérica, por exemplo, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta conforme fornecidos neste documento podem ser combinados com uma cadeia J compreendendo substituições, deleções e/ou inserções de aminoácido, conforme descrito em outra parte deste documento, para fornecer um aumento aditivo ou mais que aditivo, por exemplo, sinérgico, na meia-vida sérica.
[0135] Em certos aspectos, um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM que compreende uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta, conforme fornecido neste documento, exibe ainda outros parâmetros farmacocinéticos modificados, por exemplo, um pico de concentração plasmática de pico aumentado (Cmáx), uma área aumentada sob a curva de T0 a ∞ (AUC), um tempo de depuração modificado, um tempo médio de permanência (MRT) aumentado ou qualquer combinação destes em relação ao anticorpo de referência.
[0136] Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido S401 da região constante de IgM humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), que por sua vez corresponde ao aminoácido S524 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. "Um aminoácido correspondente ao aminoácido S401 da região constante de IgM humana de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da região constante de IgM de qualquer espécie que seja homóloga ao S401 na região constante de IgM humana. A posição correspondente ao S401 na SEQ ID NO: 12 é conservada nas sequências de aminoácidos de região constante de IgM de algumas espécies, por exemplo, primatas não humanos, mas não em outras espécies, por exemplo, camundongo. Ver FIG. 1. Em certos aspectos, o S401 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por qualquer aminoácido. Em certos aspectos, o S401 da SEQ
ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A). Em um aspecto particular, a região constante de IgM variante é uma região constante de IgM humana variante compreendendo uma mutação S401A, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 13. A SEQ ID NO: 13 é apresentada abaixo, com a mutação S401A sublinhada em negrito: SEQ ID NO: 13
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVAEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0137] Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E402 da região constante de IgM humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), que por sua vez corresponde ao aminoácido E525 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. "Um aminoácido correspondente ao aminoácido E402 da região constante de IgM humana de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da região constante de IgM de qualquer espécie que seja homóloga ao E402 na região constante de IgM humana. A posição correspondente ao E402 na SEQ ID NO: 12 é conservada nas sequências de aminoácidos de região constante de IgM de algumas espécies, por exemplo, primatas não humanos e camundongo. Ver FIG. 1. Em certos aspectos, o E402 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por qualquer aminoácido.
Em certos aspectos, o E402 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A).
Em um aspecto particular, a região constante de IgM variante é uma região constante de IgM humana variante compreendendo uma mutação E402A, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 14. A SEQ ID NO: 14 é apresentada abaixo com a mutação E402A sublinhada em negrito: SEQ ID NO: 14:
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSAEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0138] Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E403 da região constante de IgM humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), que por sua vez corresponde ao aminoácido E526 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. "Um aminoácido correspondente ao aminoácido E403 da região constante de IgM humana de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da região constante de IgM de qualquer espécie que seja homóloga ao E403 na região constante de IgM humana. A posição correspondente ao E403 na SEQ ID NO: 12 é conservada nas sequências de aminoácidos de região constante de IgM de algumas espécies, por exemplo, primatas não humanos e camundongo. Ver FIG. 1. Em certos aspectos, o E403 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por qualquer aminoácido.
Em certos aspectos, o E403 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A).
Em um aspecto particular, a região constante de IgM variante é uma região constante de IgM humana variante compreendendo uma mutação E403A, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 34. A SEQ ID NO: 34 é apresentada abaixo com a mutação E403A sublinhada em negrito: SEQ ID NO: 34:
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSEAEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0139] Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido R344 da região constante de IgM humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), que por sua vez corresponde ao aminoácido R467 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. "Um aminoácido correspondente ao aminoácido R344 da região constante de IgM humana de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da região constante de IgM de qualquer espécie que seja homóloga ao R344 na região constante de IgM humana. A posição correspondente ao R344 na SEQ ID NO: 12 é conservada nas sequências de aminoácidos de região constante de IgM de algumas espécies, por exemplo, primatas não humanos e camundongo. Ver FIG. 1. Em certos aspectos, o R344 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por qualquer aminoácido.
Em certos aspectos, o R344 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A).
Em um aspecto particular, a região constante de IgM variante é uma região constante de IgM humana variante compreendendo uma mutação R344A, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 31. A SEQ ID NO: 31 é apresentada abaixo com a mutação R344A sublinhada em negrito: SEQ ID NO: 31
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLAESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0140] Em certos aspectos, uma região constante de IgM variante ou um fragmento de multimerização desta de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E345 da região constante de IgM humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 12), que por sua vez corresponde ao aminoácido E468 de acordo com o sistema de numeração de Kabat. "Um aminoácido correspondente ao aminoácido E345 da região constante de IgM humana de tipo selvagem" significa o aminoácido na sequência da região constante de IgM de qualquer espécie que seja homóloga ao E345 na região constante de IgM humana. A posição correspondente ao E345 na SEQ ID NO: 12 é conservada nas sequências de aminoácidos de região constante de IgM de algumas espécies, por exemplo, primatas não humanos e camundongo. Ver FIG. 1. Em certos aspectos, o E345 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por qualquer aminoácido.
Em certos aspectos, o E345 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituído por alanina (A).
Em um aspecto particular, a região constante de IgM variante é uma região constante de IgM humana variante compreendendo uma mutação E345A, apresentada neste documento como SEQ ID NO: 32. A SEQ ID NO: 32 é apresentada abaixo com a mutação E345A sublinhada em negrito: SEQ ID NO: 32
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRASATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0141] Regiões Constantes de IgM Humana Variantes com Atividade de CDC Reduzida
[0142] Em certos aspectos, uma região constante de IgM humana variante, quando expressa como parte de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecido neste documento, pode exibir adicionalmente atividade de citotoxicidade dependente de complemento (CDC) reduzida para células na presença de complemento em relação a um anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM de referência com uma região constante de IgM humana de referência correspondente idêntica, exceto para as mutações que conferem atividade de CDC reduzida. Estas mutações de CDC podem ser combinadas com qualquer uma das mutações que conferem meia-vida sérica aumentada, conforme fornecidas neste documento. Por "região constante de IgM humana de referência correspondente" entende-se uma região constante de IgM humana ou uma porção desta, por exemplo, um domínio Cµ3, que é idêntica à região constante de IgM variante, exceto pela modificação ou modificações na região constante que afeta(m) a atividade de CDC. Em certos aspectos, a região constante de IgM humana variante inclui uma ou mais substituições de aminoácido, por exemplo, no domínio Cµ3, em relação a uma região constante de IgM humana de tipo selvagem, conforme descrito, por exemplo, no Pedido de Patente PCT nº PCT/US2018/026474, que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade. Ensaios para medir a CDC são bem conhecidos por aqueles versados na técnica, e ensaios exemplificativos são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente PCT nº PCT/US2018/026474.
[0143] Em certos aspectos, uma região constante de IgM humana variante que confere atividade de CDC reduzida inclui uma substituição de aminoácido correspondente à região constante de IgM humana de tipo selvagem na posição P311 da SEQ ID NO: 12. Em outros aspectos, a região constante de IgM variante, conforme fornecida neste documento, contém uma substituição de aminoácido correspondente à região constante de IgM humana de tipo selvagem na posição P313 da SEQ ID NO:
12. Em outros aspectos, a região constante de IgM variante, conforme fornecida neste documento, contém uma combinação de substituições correspondentes à região constante de IgM humana de tipo selvagem nas posições P311 da SEQ ID NO: 12 e P313 da SEQ ID NO: 12. A região constante de IgM variante na posição de aminoácido P311 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituída, por exemplo, por alanina (P311A), serina (P311S) ou glicina (P311G). A região constante de IgM variante na posição de aminoácido P313 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituída, por exemplo, por alanina
(P313A), serina (P313S) ou glicina (P313G). A região constante de IgM variante nas posições de aminoácido P311 e P313 da SEQ ID NO: 12 pode ser substituída por alanina (P311A) e serina (P313S) respectivamente (SEQ ID NO: 15) ou qualquer combinação de alanina, serina e/ou glicina. A SEQ ID NO: 15 é apresentada abaixo com as mutações P311A e P313S sublinhadas em negrito: SEQ ID NO: 15
GSASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISS TRGFPSVLRGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIA ELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQ VQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQ DTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESH PNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLASSLKQTISRPKGVALHRPDVYLL PPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAP GRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVM SDTAGTCY
[0144] Em um aspecto, um anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM, conforme fornecidos neste documento, que incluem uma região constante de IgM humana variante que compreende substituições de aminoácidos em P311 e/ou P313, por exemplo, P311A, P311S, P311G, P313A, P313S e/ou P313G ou qualquer combinação destas, possuem uma CDC máxima alcançada em um ensaio de dose- resposta reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% em relação a uma molécula de ligação que inclui uma região constante de IgM de tipo selvagem correspondente.
Polinucleotídeos, Vetores e Células Hospedeiras
[0145] A divulgação fornece ainda um polinucleotídeo, por exemplo, um polinucleotídeo isolado, recombinante e/ou de ocorrência não natural, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma subunidade polipeptídica de anticorpo IgM ou semelhante IgM, conforme fornecido neste documento. Por "subunidade polipeptídica" entende-se uma porção de uma molécula de ligação, unidade de ligação, anticorpo IgM, anticorpo semelhante a IgM ou domínio de ligação ao antígeno que pode ser traduzida independentemente. Os exemplos incluem, sem limitação, um domínio variável de anticorpo, por exemplo, uma VH ou uma VL, uma cadeia J, um componente secretório, uma Fv de cadeia única, uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo, uma região constante de cadeia pesada de anticorpo, uma região constante de cadeia leve de anticorpo e/ou qualquer fragmento, variante ou derivado destes.
[0146] Em certos aspectos, a subunidade polipeptídica pode compreender uma região constante de cadeia pesada de IgM ou uma região constante de cadeia pesada semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização destas, que pode ser fundido a um domínio de ligação ao antígeno ou a uma subunidade deste, por exemplo, à porção VH de um domínio de ligação ao antígeno, tudo conforme fornecido neste documento. Em certos aspectos, o polinucleotídeo pode codificar uma subunidade polipeptídica compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgM humana, uma região constante da cadeia pesada semelhante a IgM humana ou um fragmento de multimerização destas, por exemplo, SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34, qualquer um dos quais pode ser fundido a um domínio de ligação ao antígeno ou a uma subunidade deste, por exemplo, a extremidade C-terminal de uma VH.
[0147] Em certos aspectos, a subunidade polipeptídica pode compreender uma porção VL de anticorpo de um domínio de ligação ao antígeno, conforme descrito em outra parte deste documento. Em certos aspectos, a subunidade polipeptídica pode compreender uma região constante de cadeia leve de anticorpo, por exemplo, uma região constante de cadeia leve de anticorpo humano ou um fragmento desta, que pode ser fundida à extremidade C-terminal de uma VL.
[0148] Em certos aspectos, a subunidade polipeptídica pode compreender uma cadeia J, uma cadeia J modificada ou qualquer fragmento ou variante funcional destas, conforme fornecido neste documento. Em certos aspectos, a subunidade polipeptídica pode compreender uma cadeia J humana ou um fragmento ou variante funcional desta, incluindo cadeias J modificadas. Em certos aspectos, a cadeia J pode compreender a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.
[0149] Em certos aspectos, um polinucleotídeo conforme fornecido neste documento, por exemplo, um vetor de expressão como um plasmídeo, pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma subunidade polipeptídica, por exemplo, uma cadeia pesada de IgM ou uma cadeia pesada semelhante a IgM, uma cadeia leve ou uma cadeia J, ou pode incluir duas ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam duas ou mais ou todas as três subunidades polipeptídicas de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM conforme fornecidos neste documento. Alternativamente, as sequências de ácidos nucleicos que codificam as três subunidades polipeptídicas podem estar em polinucleotídeos separados, por exemplo, vetores de expressão separados. A divulgação fornece esses vetores de expressão única ou múltipla. A divulgação também fornece uma ou mais células hospedeiras que codificam o(s) polinucleotídeo(s) ou vetor(es) de expressão fornecido(s).
[0150] Assim, para formar os domínios de ligação ao antígeno, as sequências de ácidos nucleicos que codificam as regiões variáveis de anticorpos podem ser inseridas em modelos de vetor de expressão para estruturas de IgM ou semelhantes a IgM, em particular aquelas que codificam regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, conforme fornecidas neste documento, tais como SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34, e pode ainda ser combinado um polinucleotídeo que codifica uma cadeia J ou fragmento ou variante funcional desta, conforme fornecido neste documento, por exemplo, codificando SEQ
ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 ou
SEQ ID NO: 24, codificando mais especificamente uma cadeia J variante que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ
ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24, criando assim anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM com cinco ou seis unidades de ligação, e possuindo uma meia-vida sérica aumentada em relação a um anticorpo IgM ou semelhante a IgM de estrutura idêntica,
exceto por uma ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácido único na região constante de cadeia pesada de IgM e/ou na cadeia J conforme descrito em outra parte deste documento.
Em resumo, as sequências de ácidos nucleicos que codificam as sequências de domínio variável de cadeias pesada e leve podem ser sintetizadas ou amplificadas a partir de moléculas existentes e inseridas em um ou mais vetores na orientação adequada e na estrutura tal que, mediante expressão, o vetor produzirá a cadeia pesada ou leve de comprimento total desejada.
Os vetores úteis para esses fins são conhecidos na técnica.
Tais vetores também podem compreender potencializadores e outras sequências necessárias para alcançar a expressão das cadeias desejadas.
Múltiplos vetores ou vetores únicos podem ser utilizados e podem codificar ainda mais a cadeia J variante ou o fragmento funcional desta.
Este vetor ou esses vetores podem ser transfectados em células hospedeiras e, em seguida, as cadeias pesadas e/ou leves e a cadeia J variante ou o fragmento funcional desta são expressos, os anticorpos IgM ou semelhantes a IgM são montados e purificados.
Após a expressão, as cadeias formam anticorpos IgM ou semelhantes a IgM multiméricos totalmente funcionais possuindo meia-vida sérica aumentada.
Os anticorpos IgM ou semelhantes a IgM multiméricos totalmente montados podem então ser purificados por métodos padrão. Os processos de expressão e purificação podem ser realizados em escala comercial, se necessário.
[0151] A divulgação fornece ainda uma composição compreendendo dois ou mais polinucleotídeos, em que os dois ou mais polinucleotídeos coletivamente podem codificar um anticorpo IgM ou semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada conforme descrito acima. Em certos aspectos, a composição pode incluir um polinucleotídeo que codifica uma cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM de tipo selvagem ou variante, ou um fragmento de multimerização desta, por exemplo, uma cadeia pesada de IgM humana de tipo selvagem ou variante que compreende uma sequência de aminoácidos de região constante de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34, conforme descrito acima, onde a cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM compreende ainda um domínio de ligação ao antígeno ou uma subunidade deste, por exemplo, um domínio VH. A composição pode incluir ainda um polinucleotídeo que codifica uma cadeia leve ou um fragmento desta, por exemplo, uma cadeia leve kappa ou lambda humana que compreende pelo menos uma VL de um domínio de ligação ao antígeno. Uma composição polinucleotídica conforme fornecida pode ainda incluir um polinucleotídeo que codifica uma cadeia J, por exemplo, uma cadeia J variante ou um fragmento funcional desta com pelo menos uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido único que pode potencializar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou semelhante a IgM, por exemplo, uma cadeia J variante e/ou modificada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24. Em certos aspectos, os polinucleotídeos que fazem parte de uma composição conforme fornecida neste documento podem estar situados em dois, três ou mais vetores separados, por exemplo, vetores de expressão. Tais vetores são fornecidos pela divulgação. Em certos aspectos, dois ou mais dos polinucleotídeos que fazem parte de uma composição conforme fornecida neste documento podem estar situados em um único vetor, por exemplo, um vetor de expressão. Esse vetor é fornecido pela divulgação.
[0152] A divulgação fornece ainda uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira procariota ou eucariota, compreendendo um polinucleotídeo ou dois ou mais polinucleotídeos que codificam um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecidos neste documento ou qualquer subunidade destes, uma composição polinucleotídica conforme fornecida neste documento ou um vetor ou dois, três ou mais vetores que codificam coletivamente o anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecidos neste documento ou qualquer subunidade destes.
[0153] Em um aspecto relacionado, a divulgação fornece um método de produção de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada, conforme fornecido por esta divulgação, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira conforme fornecida neste documento e a recuperação do anticorpo IgM ou semelhante a IgM.
[0154] Métodos de Identificação de Cadeias J Variantes e/ou regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que Podem Conferir Meia-Vida Sérica Aumentada
[0155] Esta divulgação fornece ainda vários métodos para identificar subunidades de anticorpos variantes que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM, compreendendo a subunidade. Estes métodos utilizam métodos padrão de biologia molecular e mutagênese dirigida a locais que serão familiares para os versados na técnica. Metodologias exemplificativas são fornecidas na seção Exemplos.
[0156] Em certos aspectos, esta divulgação fornece um método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia-vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos, anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos, anticorpos IgA diméricos e/ou anticorpos semelhantes a IgA diméricos compreendendo as cadeias J variantes.
O método inclui testar anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos ou, alternativamente, anticorpos IgA diméricos ou anticorpos semelhantes a IgA diméricos montados para incluir cadeias J variantes ou fragmentos destas para aumentar a meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência é idêntico aos anticorpos de teste, exceto pelas cadeias J variantes.
De acordo com esses aspectos,
uma série de cadeias J variantes ou fragmentos destas compreendendo inserções,
deleções ou substituições de aminoácidos definidas são construídos e testados em relação a uma cadeia J de referência, por exemplo, uma cadeia J, uma cadeia J modificada e/ou um fragmento funcional destas idêntico às cadeias J variantes, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
Em certos aspectos, as cadeias J variantes podem incluir uma, duas, três, quatro ou mais substituições, inserções ou deleções de aminoácidos único definidas conforme descrito em outra parte deste documento.
Em certos aspectos, regiões limitadas da cadeia J são direcionadas para mutagênese, por exemplo, aquelas regiões necessárias ou que contribuem para a ligação a determinados receptores de imunoglobulina, por exemplo, o receptor Fc alfa-mu (FcαµR), o receptor polimérico Ig
(pIgR), o receptor Fc-mu (FcµR), dois ou mais dos receptores ou todos os três receptores, conforme descritos em mais detalhes nos Exemplos 1 e 2. Em certos aspectos, todo o comprimento da cadeia J pode ser sujeito a mutagênese, por exemplo, ao substituir individualmente o aminoácido em cada posição de uma cadeia
J, por exemplo, SEQ ID NO: 2, por outro aminoácido, por exemplo, alanina, serina ou treonina.
As cadeias J mutadas podem então ser coexpressas, por exemplo, com uma cadeia pesada de IgM de referência e uma cadeia leve de anticorpo, e os anticorpos
IgM pentaméricos resultantes analisados para montagem adequada, ligação ao antígeno e quaisquer outras funções desejadas.
Os anticorpos IgM resultantes ou anticorpos semelhantes a IgM podem então ser avaliados quanto à meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal, por exemplo, em um modelo de camundongo conforme descrito nos Exemplos. As cadeias J que conferem meia-vida sérica aumentada aos respectivos anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM são então recuperadas e caracterizadas adicionalmente conforme necessário. Este método também pode ser aplicado para identificar cadeias J variantes que podem conferir meia-vida sérica aumentada a um anticorpo IgA dimérico ou um anticorpo semelhante a IgA compreendendo as cadeias J variantes usando métodos semelhantes.
[0157] Em certos aspectos, esta divulgação fornece um método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia-vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos, anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos, anticorpos IgA diméricos e/ou anticorpos semelhantes a IgA diméricos compreendendo as cadeias J variantes. O método inclui testar anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos ou, alternativamente, anticorpos IgA diméricos ou anticorpos semelhantes a IgA diméricos montados para incluir cadeias J variantes ou fragmentos destas para ligação reduzida a certos receptores de imunoglobulina, por exemplo, o receptor Fc alfa-mu (FcαμR), o receptor Ig polimérico (pIgR), o receptor Fc-mu (FcµR), dois ou mais receptores ou todos os três receptores. Regiões da cadeia J a serem sujeitas a mutagênese podem ser direcionadas ao determinar aquelas regiões necessárias ou que contribuem para a ligação ao receptor, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 1. Alternativamente, os aminoácidos ao longo de todo o comprimento da cadeia J podem ser submetidos a mutagênese, e os anticorpos resultantes compreendendo as cadeias J variantes podem ser testados quanto à ligação ao receptor. A ligação ao receptor reduzida pode ser medida por qualquer ensaio adequado, por exemplo, através dos ensaios ELISA descritos no Exemplo 2.
As cadeias J variantes ou fragmentos destas são construídos para incluir inserções,
deleções ou substituições de aminoácidos definidas, conforme descrito acima e em outras partes deste documento. As cadeias J variantes que conferem ligação reduzida ao anticorpo a um ou mais dos receptores podem então ser recuperadas e caracterizadas adicionalmente conforme necessário. O método pode ainda incluir testar anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos, ou anticorpos IgA diméricos ou anticorpos semelhantes a IgA diméricos compreendendo as cadeias J variantes ou fragmentos desta para aumentar a meia- vida sérica em um sujeito animal, por exemplo, em um modelo de camundongo conforme descrito nos Exemplos, em relação a anticorpos de referência idênticos, exceto pelas substituições, deleções ou inserções de aminoácido definidas nas cadeias J variantes ou fragmentos destas. Este método também pode ser aplicado para identificar cadeias J variantes que podem conferir meia-vida sérica aumentada a um anticorpo IgA dimérico ou um anticorpo semelhante a IgA compreendendo as cadeias J variantes usando métodos semelhantes.
[0158] A divulgação fornece ainda um método para identificar regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante (ou regiões constantes de cadeia pesada de IgA variante) que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM (ou anticorpo IgA ou anticorpo semelhante a IgA) compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM (ou IgA) variantes. O método para IgM inclui testar anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante para meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas e em que o anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM idênticas às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
O método inclui ainda recuperar os anticorpos IgM ou os anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que conferem meia-vida sérica aumentada aos anticorpos IgM ou aos anticorpos semelhantes a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante em relação aos anticorpos
IgM de referência ou aos anticorpos semelhantes a IgM.
Qualquer quantidade de regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM variante compreendendo, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições,
inserções ou deleções de aminoácido único definidas, podem ser testadas.
As regiões das regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou semelhantes a IgM a serem submetidas a mutagênese podem ser determinadas empiricamente, por exemplo, ao identificar as regiões, por exemplo, no domínio Cµ4, que são necessárias ou que contribuem para a ligação a vários receptores de imunoglobulina, como o receptor Fc alfa-mu (FcαμR), receptor Fc mu (FcµR), o receptor polimérico Ig (pIgR), qualquer combinação de dois dos receptores ou todos os três receptores, conforme descrito nos Exemplos.
Alternativamente, todo o comprimento dos domínios Cµ selecionados ou toda a região constante de cadeia pesada de IgM podem ser sujeitos a mutagênese, por exemplo, através da substituição de aminoácidos em cada posição por um aminoácido diferente, por exemplo, alanina, serina ou treonina.
As regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são então montadas com outras subunidades de anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo e,
opcionalmente, uma cadeia J, e o conjunto apropriado e a ligação ao antígeno são testados.
Os anticorpos de teste podem então ser avaliados quanto à meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal, por exemplo, um modelo de camundongo conforme descrito nos Exemplos.
Este método também pode ser aplicado para identificar regiões constantes de cadeia pesada IgA ou semelhantes a IgA variantes que podem conferir meia-vida sérica aumentada a um anticorpo IgA dimérico ou a um anticorpo semelhante a IgA compreendendo as regiões constantes variantes, usando métodos semelhantes.
[0159] A divulgação fornece ainda um método para identificar regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante (ou, alternativamente, regiões constantes de cadeia pesada de IgA variante) que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou de um anticorpo semelhante a IgM (ou um anticorpo IgA ou um anticorpo semelhante a IgA) compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada variante. O método para IgM inclui testar anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante para ligação reduzida ao receptor Fc alfa-mu (FcαμR), receptor Fc mu (FcµR), receptor polimérico Ig (pIgR), qualquer combinação de dois dos receptores ou todos os três receptores em relação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas e em que o anticorpo IgM de referência ou o anticorpo semelhante a IgM compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM idênticas às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas. O método inclui ainda recuperar os anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que conferem capacidade de ligação a FcαµR reduzida, capacidade de ligação a FcµR reduzida, capacidade de ligação a pIgR reduzida, capacidade de ligação a quaisquer dois receptores reduzida ou capacidade de ligação a todos os três receptores reduzida nos anticorpos IgM ou nos anticorpos semelhantes a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante em relação ao anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência. Qualquer quantidade de regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM variante compreendendo, por exemplo, uma, duas, três, quatro ou mais substituições,
inserções ou deleções de aminoácido único definidas, podem ser testadas. As regiões das regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou semelhantes a IgM a serem submetidas a mutagênese podem ser determinadas empiricamente, por exemplo, ao identificar as regiões, por exemplo, no domínio Cµ4, que são necessárias ou que contribuem para a ligação a vários receptores de imunoglobulina, como o receptor Fc alfa-mu (FcαμR), receptor Fc mu (FcµR), o receptor polimérico Ig (pIgR), qualquer combinação de dois dos receptores ou todos os três receptores, conforme descrito nos Exemplos. Alternativamente, todo o comprimento dos domínios Cµ selecionados ou toda a região constante de cadeia pesada de IgM podem ser sujeitos a mutagênese, por exemplo, através da substituição de aminoácidos em cada posição por um aminoácido diferente, por exemplo, alanina, serina ou treonina. As regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são então montadas com outras subunidades de anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo e, opcionalmente, uma cadeia J, e o conjunto apropriado e a ligação ao antígeno são testados. As regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são então montadas com outras subunidades de anticorpo, por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo e, opcionalmente, uma cadeia J, e o conjunto apropriado e a ligação ao antígeno são testados. Ligação ao receptor reduzida pode ser medida por qualquer ensaio adequado, por exemplo, através dos ensaios ELISA descritos no Exemplo 2.
Os anticorpos de teste compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou semelhantes a IgM variante recuperadas podem então ser avaliados quanto à meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal, por exemplo, um modelo de camundongo conforme descrito nos Exemplos. Este método também pode ser aplicado para identificar regiões constantes de cadeia pesada IgA ou semelhantes a IgA variante que podem conferir meia-vida sérica aumentada a um anticorpo IgA dimérico ou a um anticorpo semelhante a IgA compreendendo as regiões constantes variantes, usando métodos semelhantes.
Métodos de Uso
[0160] A divulgação fornece ainda um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um sujeito em necessidade de tratamento compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento. Por "dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz", entende-se uma quantidade de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM, que quando administrada causa uma resposta imunoterapêutica positiva em relação ao tratamento do sujeito.
[0161] Doses eficazes de composições para tratamento de câncer variam dependendo de diversos fatores, incluindo os meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do sujeito, se o sujeito é humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico.
Geralmente, o sujeito é um ser humano, mas mamíferos não humanos, incluindo os mamíferos transgênicos, também podem ser tratados. As doses de tratamento podem ser tituladas usando métodos de rotina conhecidos por aqueles versados na técnica para otimizar a segurança e a eficácia.
[0162] O sujeito a ser tratado pode ser qualquer animal, por exemplo, mamífero, em necessidade de tratamento; em certos aspectos, o sujeito é um sujeito humano.
[0163] Em sua forma mais simples, uma preparação a ser administrada a um sujeito é um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento, ou um fragmento de ligação ao antígeno multimérico deste administrado na forma de dosagem convencional, o qual pode ser combinado com um excipiente, carreador ou diluente farmacêutico conforme descrito em outra parte deste documento.
[0164] As composições da divulgação podem ser administradas por qualquer método adequado, por exemplo, de forma parentérica, intraventricular ou oral, por spray de inalação, de forma tópica, retal, nasal, bucal ou vaginal, ou por meio de um reservatório implantado. O termo "parentérico", conforme usado neste documento, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, endovenosa, intramuscular, intra- articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, colestase, intralesional e intracraniana.
Composições Farmacêuticas e Métodos de Administração
[0165] Os métodos de preparação e administração de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento a um sujeito em necessidade deste são bem conhecidos ou são prontamente determinados por aqueles versados na técnica tendo em vista esta divulgação. A via de administração pode ser, por exemplo, intratumoral, oral, parentérica, por inalação ou tópica. O termo "parentérica", tal como usado neste documento, inclui por exemplo, administração intravenosa, intra- arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, retal ou vaginal. Embora essas formas de administração sejam contempladas como formas adequadas, outro exemplo de uma forma de administração seria uma solução injetável, em particular para injeção ou gotejamento intratumorais, intravenosos ou intra-arteriais. Uma composição farmacêutica apropriada pode compreender um tampão (por exemplo, tampão de acetato, fosfato ou citrato), um surfactante (por exemplo , polissorbato), opcionalmente um agente estabilizador (por exemplo, albumina humana), etc.
[0166] Conforme fornecido neste documento, um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento pode ser administrado em uma quantidade farmaceuticamente eficaz para o tratamento de um sujeito em necessidade. A este respeito, será apreciado que os anticorpos IgM ou semelhantes a IgM divulgados podem ser formulados de modo a facilitar a administração e promover a estabilidade do agente ativo. As composições farmacêuticas podem compreender um carreador estéril, atóxico, farmaceuticamente aceitável tal como solução salina fisiológica, tampões atóxicos, conservantes e similares. Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento significa uma quantidade suficiente para obter a ligação eficaz a um alvo e obter um benefício terapêutico. As formulações adequadas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, por exemplo, 21a Edição (Lippincott Williams & Wilkins) (2005).
[0167] Certas composições farmacêuticas fornecidas neste documento podem ser administradas por via oral numa forma de dosagem aceitável incluindo, por exemplo, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Certas composições farmacêuticas também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para potencializar a biodisponibilidade e/ou outros agentes convencionais de solubilização ou dispersão.
[0168] A quantidade de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM que pode ser combinada com materiais carreadores para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo, por exemplo, do sujeito tratado e do modo particular de administração. A composição pode ser administrada como uma dose única, doses múltiplas ou durante um período de tempo estabelecido em uma infusão. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejada ideal (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática).
[0169] De acordo com o escopo da presente divulgação, um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento pode ser administrado a um sujeito em necessidade de terapia em uma quantidade suficiente para produzir um efeito terapêutico. Um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento pode ser administrado ao sujeito em uma forma de dosagem convencional preparada combinando o anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno, variante ou derivado multiméricos deste, de acordo com a divulgação, com um carreador ou diluente convencionais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com técnicas conhecidas. A forma e as características do carreador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis podem ser ditados pela quantidade de ingrediente ativo com o qual vão ser combinados, a via de administração e outras variáveis bem conhecidas.
[0170] Esta divulgação também fornece para o uso de um anticorpo IgM ou semelhante a IgM conforme fornecido neste documento na fabricação de um medicamento para tratamento, prevenção ou controle de câncer.
[0171] Esta divulgação emprega, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, que estão dentro das capacidades da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Green e Sambrook, ed. (2012) Molecular Cloning A Laboratory Manual (4ª ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover e B.D. Hames, eds., (1995) DNA Cloning 2ª Edição (IRL Press), Volumes 1-4; Gait, ed.
(1990) Oligonucleotide Synthesis (IRL Press); Mullis et al. A Pat. US nº 4.683.195; Hames e Higgins, eds. (1985) Nucleic Acid Hybridization (IRL Press); Hames e Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation (IRL Press); Freshney (2016) Culture Of Animal Cells, 7ª Edição (Wiley-Blackwell); Woodward, J., Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1985); Perbal (1988) A Practical Guide To Molecular Cloning; 2ª Edição (Wiley-Interscience); Miller e Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); S.C. Makrides (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Elsevier Science); Methods in Enzymology, Vols. 151-155 (Academic Press, Inc., N.Y.); Mayer e Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Weir e Blackwell, eds.; e em Ausubel et al. (1995) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons).
[0172] Os princípios gerais de manipulação de anticorpos são apresentados,
por exemplo, em Strohl, W.R. e L.M. Strohl (2012), Therapeutic Antibody Engineering (Woodhead Publishing). Os princípios gerais de manipulação de proteínas são apresentados, por exemplo, em Park e Cochran, eds. (2009), Protein Engineering and Design (CDC Press). Os princípios gerais de imunologia são apresentados, por exemplo, em: Abbas e Lichtman (2017) Cellular and Molecular Immunology 9ª Edição (Elsevier). Além disso, métodos padrão em imunologia conhecidos na técnica podem ser seguidos, por exemplo, em Current Protocols in Immunology (Biblioteca Online Wiley); Wild, D. (2013), The Immunoassay Handbook 4ª Edição (Elsevier Science); Greenfield, ed. (2013), Antibodies, a Laboratory Manual, 2ª Edição (Cold Spring Harbor Press); e Ossipow e Fischer, eds., (2014), Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Humana Press).
[0173] Todas as referências citadas acima, bem como todas as referências citadas neste documento, são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[0174] Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não a título de limitação. Exemplos
[0175] Nossa hipótese foi de que a interação entre IgM e um ou mais de seus receptores de Ig, o receptor Fc µ (FcμR), o receptor Fc α/µ (FcαμR) e/ou o receptor polimérico de Ig (pIgR) contribuiu para a farmacocinética específica e farmacodinâmica observada para anticorpos IgM in vivo. Por conseguinte, propusemos identificar regiões específicas de IgM envolvidas na ligação a esses receptores e perguntamos se as alterações nessas regiões, por exemplo, substituições de aminoácido, poderiam modular, por exemplo, inibir a ligação ao receptor para um anticorpo IgM compreendendo as alterações. Em seguida, testamos se algumas dessas alterações afetaram a disponibilidade plasmática in vivo dos anticorpos IgM compreendendo as alterações.
[0176] Exemplo 1: Triagem de Arranjos de Cadeia J e Peptídeo Fcµ Quanto à Ligação ao Receptor
[0177] Para identificar as regiões nas regiões constantes de IgM e na cadeia J em que FcμR, FcαμR e/ou pIgR se ligam, usamos uma tecnologia baseada em matriz de peptídeos (PEPperPRINT; WWW_dot_pepperprint_dot_com). Um conjunto completo de peptídeos com base na sequência de aminoácidos da cadeia J humana (SEQ ID NO: 2) e nos domínios Cµ3 e Cµ4 de IgM humana (por volta do aminoácido 224 até por volta do aminoácido 430 da SEQ ID NO: 12) foram sintetizados e imobilizados em suportes sólidos, como se segue. As sequências de cadeia µ3, µ4 e J de IgM foram alongadas com ligantes GSGSGSG neutros (SEQ ID NO: 33) nos terminais N e C para evitar peptídeos truncados. As sequências proteicas alongadas foram traduzidas como 9 e 13 peptídeos de aminoácidos com sobreposições peptídeo-peptídeo de 8 e 12 aminoácidos, respectivamente. Após a síntese de peptídeo, todos os peptídeos foram ciclizados através de uma ligação tioéter entre um grupo tiol da cadeia lateral de cisteína C-terminal e um N-terminal modificado de forma apropriada. Os microarranjos de peptídeos de IgM resultantes continham 844 peptídeos diferentes impressos em duplicado (1.688 manchas peptídicas), juntamente com peptídeos de controle. Os peptídeos restritos com incrementos de um resíduo foram analisados com 1, 10 ou 100 µg/mL de pIgR humano recombinante (aminoácidos 19-638 da SEQ ID NO: 20, disponível em R&D Systems), FcμR humano (aminoácidos 18-251 da SEQ ID NO: 21, disponível em R&D Systems) e FcαμR humano (aminoácidos 17 a 450 da SEQ ID NO: 22, disponível em R&D Systems), cada um com uma tag 6X HIS em tampão de incubação (PBS, pH 7,4 com 0,005% de Tween 20 e 10% de tampão de bloqueio de Rockland (MB-070)) foi seguido por coloração com anticorpo secundário de camundongo anti-6x-His Epitope Tag DyLight680 e com os anticorpos de controle, bem como leitura nas intensidades de varredura de 7/7 (vermelho verde).
[0178] A quantificação das intensidades de mancha e a anotação de peptídeos foram baseadas nos arquivos tiff em escala de cinza de 16 bits em intensidades de varredura de 7/7 que exibem um intervalo dinâmico mais alto do que os arquivos tiff coloridos de 24 bits; a análise de imagem por microarranjo foi realizada com o PEPSLIDE® Analyzer. Um algoritmo de software divide as intensidades de fluorescência de cada mancha em sinal bruto, sinal de primeiro plano e sinal de fundo (ver as guias "Dados Brutos") e calcula as intensidades médias em primeiro plano e os desvios mancha-a-mancha das duplicatas de mancha. Com base nas intensidades em primeiro plano médias calculadas, foi gerado um mapa de intensidade.
[0179] As intensidades de mancha médias dos ensaios foram plotadas com as proteínas alvo contra a sequência proteica do N-terminal da cadeia µ3 de IgM ao C-terminal da cadeia J de IgM para visualizar as intensidades de mancha gerais e as relações sinal-ruído. As plotagens de intensidade foram correlacionadas com mapas de peptídeos e de intensidade, bem como com a inspeção visual das varreduras de microarranjos para identificar as principais interações das proteínas alvo.
[0180] Utilizando os dados brutos, foram identificadas regiões-chave da cadeia J, bem como regiões constantes de HC de IgM que se ligaram aos receptores na plataforma PEPperPRINT.
[0181] FcαμR humano ligado às seguintes regiões sublinhadas da cadeia J madura, SEQ ID NO: 2: 1 QEDERIVLVD NKCKCARITS RIIRSSEDPN EDIVERNIRI IVPLNNRENI 51 SDPTSPLRTR FVYHLSDLCK KCDPTEVELD NQIVTATQSN
ICDEDSATET 101 CYTYDRNKCY TAVVPLVYGG ETKMVETALT PDACYPD
[0182] Por conseguinte, as regiões da cadeia J humana madura que contribuem para a ligação do FcαμR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo,
consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 1 a 10 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 87 a 105 da SEQ ID NO: 2, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 125 a 137 da SEQ ID NO: 2. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que compreendem cadeias J variantes com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de cadeia J de outra espécie), podem ser testados quanto à inibição de ligação de FcαμR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia-vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0183] pIgR humano ligado às seguintes regiões duplamente sublinhadas da cadeia J madura, SEQ ID NO: 2: 1 QEDERIVLVD NKCKCARITS RIIRSSEDPN EDIVERNIRI IVPLNNRENI 51 SDPTSPLRTR FVYHLSDLCK KCDPTEVELD NQIVTATQSN
ICDEDSATET 101 CYTYDRNKCY TAVVPLVYGG ETKMVETALT PDACYPD
[0184] Por conseguinte, as regiões da cadeia J humana madura que contribuem para a ligação do plgR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 12 a 24 da SEQ ID NO: 2, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 93 a 105 da SEQ ID NO: 2. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que compreendem cadeias J variantes com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de cadeia J de outra espécie), podem ser testados quanto à inibição de ligação de pIgR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia- vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0185] FcμR humano ligado às seguintes regiões onduladas da cadeia J madura, SEQ ID NO: 2: 1 QEDERIVLVD NKCKCARITS RIIRSSEDPN EDIVERNIRI IVPLNNRENI 51 SDPTSPLRTR FVYHLSDLCK KCDPTEVELD NQIVTATQSN
ICDEDSATET 101 CYTYDRNKCY TAVVPLVYGG ETKMVETALT PDACYPD
[0186] Por conseguinte, as regiões da cadeia J humana madura que contribuem para a ligação do FcμR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 1 a 4 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 87 a 105 da SEQ ID NO: 2, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 125 a 137 da SEQ ID NO: 2. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que compreendem cadeias J variantes com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de cadeia J de outra espécie), podem ser testados quanto à inibição de ligação de FcμR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia-vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0187] FcαμR humano ligado às seguintes regiões sublinhadas de Cμ3 e Cμ4 da região constante de IgM humana, SEQ ID NO: 12 (numeração para SEQ ID NO: 12/KABAT fornecida):
[0188] Chave de numeração sequencial (SEQ ID NO: 12)/KABAT para cadeia pesada de IgM 1/127 GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA QDFLPDSITF
SWKYKNNSDI 51/176 SSTRGFPSVL RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV
QHPNGNKEKN 101/226 VPLPVIAELP PKVSVFVPPR DGFFGNPRKS KLICQATGFS
PRQIQVSWLR 151/274 EGKQVGSGVT TDQVQAEAKE SGPTTYKVTS TLTIKESDWL
SQSMFTCRVD 201/324 HRGLTFQQNA SSMCVPDQDT AIRVFAIPPS FASIFLTKST
KLTCLVTDLT 251/374 TYDSVTISWT RQNGEAVKTH TNISESHPNA TFSAVGEASI
CEDDWNSGER 301/424 FTCTVTHTDL PSPLKQTISR PKGVALHRPD VYLLPPAREQ
LNLRESATIT 351/474 CLVTGFSPAD VFVQWMQRGQ PLSPEKYVTS APMPEPQAPG
RYFAHSILTV 401/524 SEEEWNTGET YTCVVAHEAL PNRVTERTVD KSTGKPTLYN
VSLVMSDTAG 451/574 TCY
[0189] Por conseguinte, as regiões da região constante de IgM humana que contribuem para a ligação do FcαμR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 241 a 253 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 282 a 294 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 342 a 354 da SEQ ID NO: 12, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 393 a 415 da SEQ ID NO: 12. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM que compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgM de outra espécie, como as mostradas na FIG. 1), podem ser testados quanto à inibição de ligação de FcαμR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia-vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0190] pIgR humano ligado às seguintes regiões duplamente sublinhadas de Cμ3 e Cμ4 da região constante de IgM humana, SEQ ID NO: 12 (numeração para SEQ ID NO: 12/KABAT fornecida): 1/127 GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA QDFLPDSITF
SWKYKNNSDI 51/176 SSTRGFPSVL RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV
QHPNGNKEKN 101/226 VPLPVIAELP PKVSVFVPPR DGFFGNPRKS KLICQATGFS
PRQIQVSWLR
151/274 EGKQVGSGVT TDQVQAEAKE SGPTTYKVTS TLTIKESDWL
SQSMFTCRVD 201/324 HRGLTFQQNA SSMCVPDQDT AIRVFAIPPS FASIFLTKST
KLTCLVTDLT 251/374 TYDSVTISWT RQNGEAVKTH TNISESHPNA TFSAVGEASI
CEDDWNSGER 301/424 FTCTVTHTDL PSPLKQTISR PKGVALHRPD VYLLPPAREQ
LNLRESATIT 351/474 CLVTGFSPAD VFVQWMQRGQ PLSPEKYVTS APMPEPQAPG
RYFAHSILTV 401/524 SEEEWNTGET YTCVVAHEAL PNRVTERTVD KSTGKPTLYN
VSLVMSDTAG 451/574 TCY
[0191] Por conseguinte, as regiões da região constante de IgM humana que contribuem para a ligação do plgR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 232 a 244 da SEQ ID NO: 12, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 287 a 304 da SEQ ID NO: 12, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 397 a 413 da SEQ ID NO: 12. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM que compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgM de outra espécie, como as mostradas na FIG. 1), podem ser testados quanto à inibição de ligação de plgR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia-vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0192] FcμR humano ligado às seguintes regiões sublinhadas onduladas de Cμ3 e Cμ4 da região constante de IgM humana, SEQ ID NO: 12 (numeração para SEQ ID NO: 12/KABAT fornecida): 1/127 GSASAPTLFP LVSCENSPSD TSSVAVGCLA QDFLPDSITF
SWKYKNNSDI 51/176 SSTRGFPSVL RGGKYAATSQ VLLPSKDVMQ GTDEHVVCKV
QHPNGNKEKN 101/226 VPLPVIAELP PKVSVFVPPR DGFFGNPRKS KLICQATGFS
PRQIQVSWLR 151/274 EGKQVGSGVT TDQVQAEAKE SGPTTYKVTS TLTIKESDWL
SQSMFTCRVD 201/324 HRGLTFQQNA SSMCVPDQDT AIRVFAIPPS FASIFLTKST
KLTCLVTDLT 251/374 TYDSVTISWT RQNGEAVKTH TNISESHPNA TFSAVGEASI
CEDDWNSGER 301/424 FTCTVTHTDL PSPLKQTISR PKGVALHRPD VYLLPPAREQ
LNLRESATIT 351/474 CLVTGFSPAD VFVQWMQRGQ PLSPEKYVTS APMPEPQAPG
RYFAHSILTV 401/524 SEEEWNTGET YTCVVAHEAL PNRVTERTVD KSTGKPTLYN
VSLVMSDTAG 451/574 TCY
[0193] Por conseguinte, as regiões da região constante de IgM humana que contribuem para a ligação do FcμR humano podem incluir, por exemplo, aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 282 a 305 da SEQ ID NO: 12, e/ou aminoácidos dentro e/ou aminoácidos sobrepostos a e/ou aminoácidos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente nos aminoácidos 393 a 417 da SEQ ID NO: 12. Como aqueles comumente versados na técnica apreciarão, anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM que compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM com mutações, por exemplo, inserções, deleções e/ou substituições de aminoácidos nessas regiões, sobrepostos a essas regiões e/ou correspondentes a essas regiões (por exemplo, em uma sequência de aminoácidos de região constante de cadeia pesada de IgM de outra espécie, como as mostradas na FIG. 1), podem ser testados quanto à inibição de ligação de FcμR, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 2, e/ou quanto ao aumento da meia-vida sérica, por exemplo, conforme descrito no Exemplo 3.
[0194] Exemplo 2: Construção da varredura de alanina de mutantes de cadeia J de IgM e Fc e triagem quanto à inibição da ligação ao receptor por ELISA
[0195] As regiões constantes de cadeias J e de IgM do anticorpo IgM anti- CD20 monoespecífico 1.5.3 como um pentâmero monoespecífico (com a cadeia J humana madura de SEQ ID NO: 2) e o anticorpo IgM anti-CD20 biespecífico 1.5.3 IgM como um pentâmero biespecífico (com a cadeia J “V15J”, SEQ ID NO: 9), ambos conforme descrito em PCT Publ. nº WO 2016/141303, foram submetidos a varredura de alanina de mutagênese para determinar se certas regiões identificadas por meio da análise PEPperPRINT (Exemplo 1) poderiam ser modificadas para reduzir ou inibir a ligação de FcαμR, FcμR e/ou pIgR. Os mutantes testados incluíram substituições de alanina de cadeia J em posições correspondentes às posições Y102 e T103 da cadeia J madura humana da SEQ ID NO: 2 (Y102A e T103A). A cadeia J "V15J" modificada que compreende a mutação Y102A é apresentada como SEQ ID NO: 10, a cadeia J "V15J" modificada que compreende a mutação T103A é apresentada como
SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 23 são apresentadas abaixo.
SEQ ID NO: 9:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMG YINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYD GFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCS ASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKC KCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCD PTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALT
PDACYPD SEQ ID NO: 10:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMG YINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYD GFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCS ASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKC KCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCD PTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCATYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALT
PDACYPD SEQ ID NO: 23:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMG YINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYD GFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCS ASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKC KCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCD PTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYAYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALT PDACYPD
[0196] Os mutantes testados na região constante de IgM humana incluíram mutações de alanina nas posições correspondentes a R344, E345, S401 e E402 da SEQ ID NO: 12 (R344A, SEQ ID NO: 31, E345A, SEQ ID NO: 32, S401A, SEQ ID NO: 13, E402A, SEQ ID NO: 14 e E403A, SEQ ID NO: 34). Duas mutações na região constante de IgM variante, SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14, foram testadas quanto ao seu efeito na meia-vida in vivo de IgMs compreendendo as mutações, com a cadeia J V15J de "tipo selvagem" (SEQ ID NO: 9) e com a cadeia J V15J compreendendo a mutação Y102A (SEQ ID NO: 10), ver o Exemplo 3).
[0197] Os fragmentos de DNA que codificam as cadeias pesada, leve e J dos mutantes selecionados foram sintetizados por um fornecedor comercial. Os construtos de DNA foram transformados em bactérias competentes e plaqueados em placas LB com múltiplos antibióticos seletivos. Várias colônias bacterianas foram escolhidas, e preparações de DNA foram feitas através de técnicas padrão de biologia molecular.
Os construtos que codificam a cadeia pesada e cadeias leves foram verificados por sequenciamento. Os construtos de plasmídeo que codificam as cadeias pesadas, as cadeias leves e a cadeia J foram cotransfectados em células HEK293/Expi293/CHO, e as células que expressaram os anticorpos IgM CD20 foram selecionadas, tudo de acordo com métodos padrão. Os anticorpos presentes nos sobrenadantes celulares foram recuperados usando Capture Select IgM (Catálogo 2890.05, BAC, Thermo Fisher) de acordo com o protocolo do fabricante. Os anticorpos foram avaliados em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida sob condições não redutoras para mostrar a montagem conforme descrito anteriormente, por exemplo, na Publicação PCT nº WO 2016/141303. Cada um dos mutantes foi verificado quanto à expressão e montagem, e os construtos biespecíficos foram verificados para manter sua capacidade de facilitar a citotoxicidade mediada por células T.
[0198] A ligação ao receptor para alguns dos mutantes de IgM e para os correspondentes controles de IgM e IgG foram medidas por ELISA como se segue.
Placas ELISA opacas brancas de 96 poços de poliestireno foram revestidas com 1 µg/mL de receptor polimérico de imunoglobulina (PIGR de camundongo: sistemas de R&D, Cat# 2800-PG; PIGR de humano: Cat# 2717-PG), receptor Fc alfa/mu de humano (sistemas de R&D, Cat# 9278-FC-050) ou receptor/proteína Fc mu de humano (Sino Biological, Cat# 13556-H02H ou sistemas de R&D, Cat# 9494-MU-050) em 100 µL de PBS durante a noite a 4 °C. As placas foram então lavadas 5 vezes com PBS-Tween a 0,05% e bloqueadas com BSA-PBS a 2% em temperatura ambiente por 2 horas. Após o bloqueio e 5 lavagens, 100 µL de proteínas IgM ou IgG diluídas em série em BSA-PBS a 2% foram adicionados aos poços e incubados em temperatura ambiente por 2 horas. As placas foram então lavadas 5 vezes e incubadas com Kappa anti-humano de camundongo conjugado com HRP (SouthernBiotech, Cat# 9230-05. Diluída a 1:6000 em BSA-PBS a 2%) por 30 min.
Após a incubação secundária, as placas foram lavadas 10 vezes antes da adição de 100 µL de substrato quimioluminescente SuperSignal (ThermoFisher, Cat# 37070) a cada poço. Os sinais luminescentes foram medidos, e os dados foram plotados e analisados com GraphPad Prism usando um modelo logístico de 4 parâmetros.
[0199] A ligação de várias IgMs mutantes aos receptores humanos e de camundongos está resumida na FIG. 2. A mutação T103A na cadeia J inibiu a ligação ao FcαμR humano, mas não ao pIgR humano nem ao FcμR humano (dados não mostrados).
[0200] Anticorpos biespecíficos anti-CD20/anti-CD3 com substituições adicionais de aminoácidos na cadeia J modificada V15J na posição de aminoácido correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 também foram avaliados quanto ao seu efeito na ligação ao receptor pIgR. A tirosina na posição 102 foi substituída por ácido aspártico (Y102D), fenilalanina (Y102F), arginina (Y102R), serina (Y102S) e treonina
(Y102T). As mutações foram incorporadas em anticorpos biespecíficos anti- CD20/anti-CD3 conforme descrito acima. Exceto pela IgM compreendendo a mutação Y102D que exibiu expressão reduzida, todas as IgMs mutantes expressaram e montaram como esperado. Os resultados da ligação a pIgR são mostrados nas FIG.
3A-3E. As mutações Y102F e Y102T permitiram a ligação a pIgR, enquanto, assim como a mutação Y102A, as mutações Y102S e Y102R interromperam a ligação a pIgR.
[0201] Exemplo 3: Análise farmacocinética de anticorpos anti-CD20 compreendendo mutações selecionadas que afetam a ligação ao receptor
[0202] Este exemplo demonstra que certas substituições de aminoácidos na cadeia J ou na região constante de IgM de anticorpos monoespecíficos ou biespecíficos de IgM pentaméricos podem aumentar a meia-vida sérica desses anticorpos. As regiões constantes de cadeias J e de IgM do anticorpo IgM anti-CD20 monoespecífico 1.5.3 como um pentâmero monoespecífico (com a cadeia J madura de SEQ ID NO: 2) e o anticorpo IgM anti-CD20 biespecífico 1.5.3 como um pentâmero biespecífico (com a cadeia J “V15J”, SEQ ID NO: 9), ambos conforme descrito em PCT Publ. nº WO 2016/141303, foram submetidos a mutagênese de varredura de alanina e testados quanto a alterações nos parâmetros farmacocinéticos em camundongos. Os mutantes testados incluíram substituições de alanina de cadeia J em posições correspondentes às posições Y102 e T103 da cadeia J madura humana da SEQ ID NO: 2 (Y102A e T103A). A cadeia J "V15J" modificada que compreende a mutação Y102A é apresentada como SEQ ID NO: 10.
[0203] Os parâmetros farmacocinéticos foram medidos para vários anticorpos IgM em um modelo de camundongo in vivo conforme se segue. Camundongos Balb/c foram injetados com 100 µg de cada anticorpo por infusão intravenosa.
Aproximadamente zero tempo e em cada momento foram coletados 500 µL de sangue por punção cardíaca terminal, com 3 camundongos por momento e 8 ou 15 momentos no total para cada anticorpo. Um ensaio ELISA padrão foi usado para medir a concentração sérica de cada anticorpo no sangue em cada momento. As métricas de qualidade foram verificadas em todos os parâmetros ELISA e PK, incluindo T1/2-alfa, T1/2-beta, e a área sob a curva de concentração do tempo zero ao infinito (AUC0-∞, medida em μg/ml*h) foram derivados usando técnicas de ajuste de curva padrão (Win Non Lin, Phoenix Software). Os resultados PK, incluindo meia-vidas alfa e beta e AUC, são apresentados na FIG. 4. Os resultados mostram que a mutação correspondente a Y102 na cadeia J humana madura SEQ ID NO: 2, bem como as mutações correspondentes a S401 e E401 na região constante de IgM humana, isoladamente ou em combinação, poderiam melhorar os parâmetros PK dos anticorpos IgM resultantes.
[0204] A FIG. 5 mostra as concentrações séricas ao longo do tempo de alguns dos anticorpos IgM mutantes biespecíficos em comparação com um anticorpo IgG compreendendo as mesmas regiões VH e VL. Conforme mostrado por esses resultados, a meia-vida sérica de IgMs com uma única mutação Y102A na cadeia J ou com a mutação Y102A mais uma mutação adicional na cadeia pesada de IgM se aproxima da de um anticorpo IgG comparável.
[0205] Exemplo 4: Extensão da meia-vida da molécula de anticorpo IgM compreendendo a cadeia J humana de variante N49A.
[0206] Este exemplo demonstra que outra substituição de aminoácido único na cadeia J humana pode aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM compreendendo a cadeia J variante. Uma cadeia J modificada descrita anteriormente compreendendo uma cadeia J humana madura com um domínio de ligação ao antígeno heterólogo que se liga ao CD3 fundido ao seu N-terminal por meio de um ligante de 15 aminoácidos ("V15J", SEQ ID NO: 9, ver a Patente US 9.951.134) foi mutada usando técnicas padrão para introduzir uma substituição de alanina na posição correspondente a N49 da cadeia J humana madura do tipo selvagem (SEQ
ID NO: 2), para produzir a cadeia J modificada “V15J- N49A” (SEQ ID NO: 24). A SEQ ID NO: 24 é apresentada abaixo.
SEQ ID NO: 24:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISYTMHWVRQAPGQGLEWMG YINPRSGYTHYNQKLKDKATLTADKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSAYYDYD GFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCS ASSSVSYMNWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPE DFATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQEDERIVLVDNKC KCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNREAISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCD PTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALT PDACYPD
[0207] Este construto da cadeia J foi utilizada para produzir 1.5.3 V15J e 1.5.3 V15J-N49A, anticorpos IgM pentaméricos exemplificativos que se ligam a CD20. O domínio de ligação ao antígeno CD20 e os métodos para produzir o anticorpo IgM foram descritos em PCT Publ. nº WO 2016/141303. Os anticorpos foram testados quanto a montagem adequada, ligação ao antígeno e capacidade dos ligantes de CD3 de ativar as células T.
[0208] Foram realizados estudos farmacocinéticos (PK) em camundongos Balb/c, conforme descrito no Exemplo 3, para avaliar a depuração dos anticorpos IgM.
As métricas de qualidade foram verificadas em todos os parâmetros ELISA e PK, incluindo T1/2-alfa, T1/2-beta, e a área sob a curva de concentração do tempo zero ao infinito (AUC0-∞, medida em μg/ml*h) foram derivados usando técnicas de ajuste de curva padrão (Win Non Lin, Phoenix Software).
[0209] Os resultados são mostrados na FIG. 6. Conforme mostrado, a IgM
1.5.3 V15J-N49A mostrou um aumento de T1/2-alfa de quase 50%, e a área sob a curva de concentração foi 1,6 vezes maior.
[0210] A abrangência e o escopo da presente divulgação não devem ser limitados por qualquer um dos exemplos de modalidades descritos acima, mas devem ser definidos somente em conformidade com as reivindicações a seguir e seus equivalentes.

Claims (79)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo IgM ou um anticorpo semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cinco unidades de ligação a anticorpos bivalentes ou variantes ou fragmentos destes e uma cadeia J variante ou um fragmento funcional desta, em que cada unidade de ligação compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou fragmentos de multimerização ou variantes destas, cada uma associada a um domínio de ligação ao antígeno ou a uma subunidade deste, em que a cadeia J variante ou um fragmento funcional desta compreende uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação a uma cadeia J de referência idêntica à cadeia J variante, exceto por uma ou mais substituições ou inserções de aminoácido único, e em que a cadeia J variante pode afetar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM; e em que o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecido exibe uma meia-vida sérica aumentada após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM ou a um anticorpo semelhante a IgM de referência que são idênticos exceto por uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos na cadeia J variante e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais.
2. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J variante ou um fragmento funcional desta compreendem uma, duas, três ou quatro substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação à cadeia J de referência.
3. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J variante ou um fragmento funcional desta compreende uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido Y102 da cadeia
J humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2).
4. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por alanina (A), serina (S) ou arginina (R).
5. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por alanina (A).
6. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3.
7. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por serina (S).
8. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.
9. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a Y102 da SEQ ID NO: 2 é substituído por arginina (R).
10. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5.
11. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J variante ou um fragmento funcional desta compreende uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido T103 da cadeia J humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2).
12. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a T103 da SEQ ID NO: 2 é substituído por alanina (A).
13. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
14. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J variante ou fragmento funcional desta compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácidos correspondente ao aminoácido N49 ou ao aminoácido S51 da cadeia J humana (SEQ ID NO: 2), em que o S51 não é substituído por treonina (T) ou em que a cadeia J variante compreende substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos N49 e S51 da cadeia J humana (SEQ ID NO: 2).
15. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição correspondente a N49 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A), glicina (G), treonina (T), serina (S) ou ácido aspártico (D).
16. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição correspondente a N49 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A).
17. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
18. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição correspondente a S51 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A) ou glicina (G).
19. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a posição correspondente a S51 da SEQ ID NO: 2 é substituída por alanina (A).
20. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma cadeia J humana variante e compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
21. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes da cadeia pesada de IgM ou seus fragmentos de multimerização são regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que compreendem uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação a uma região constante de cadeia pesada de IgM de referência idêntica às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante podem afetar a meia-vida sérica do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, e em que o anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM exibe uma meia-vida sérica adicionalmente aumentada após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência que é idêntico, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único nas regiões constantes de cadeia pesada de IgM e é administrado da mesma maneira às mesmas espécies animais.
22. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o aumento adicional na meia- vida sérica é aditivo.
23. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM com meia-vida sérica aumentada CARACTERIZADO pelo fato de que compreende cinco ou seis unidades de ligação de anticorpo bivalentes ou variantes ou fragmentos destas,
em que cada unidade de ligação compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante ou fragmentos de multimerização destas, cada uma associada a um domínio de ligação ao antígeno ou uma subunidade deste, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante ou seus fragmentos de multimerização compreendem uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação a uma região constante de cadeia pesada de IgM de referência idêntica às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto por uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único, e em que as regiões constantes da cadeia pesada de IgM variante podem afetar a meia- vida sérica do anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM; e em que o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM fornecido exibe uma meia-vida sérica aumentada após a administração a um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência que são idênticos, exceto por uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de aminoácidos únicos nas regiões constantes da cadeia pesada de IgM, e são administrados da mesma maneira às mesmas espécies de animais.
24. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma, duas, três ou quatro substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação à região constante de cadeia pesada de IgM de referência.
25. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido R344 da região constante de IgM humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 12
26. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a R344 da SEQ ID NO: 12 é substituído por alanina (A).
27. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são regiões constantes de cadeia pesada de IgM humana variante e compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 31.
28. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E345 da região constante de IgM humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 12.
29. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a E345 da SEQ ID NO: 12 é substituído por alanina (A).
30. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 29, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são regiões constantes de cadeia pesada de IgM humana variante e compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 32.
31. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido S401 da região constante de IgM humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 12.
32. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a S401 da SEQ ID NO: 12 é substituído por alanina (A).
33. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são regiões constantes de cadeia pesada de IgM humana variante e compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 13.
34. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E402 da região constante de IgM humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 12.
35. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a E402 da SEQ ID NO: 12 é substituído por alanina (A).
36. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são regiões constantes de cadeia pesada de IgM humana variante e compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 14.
37. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 24, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao aminoácido E403 da região constante de IgM humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 12.
38. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido correspondente a E403 da SEQ ID NO: 12 é substituído por alanina (A).
39. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante são regiões constantes de cadeia pesada de IgM humana variante e compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 34.
40. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a meia-vida sérica aumentada compreende uma meia-vida alfa aumentada (t1/2α), uma meia-vida beta aumentada (t1/2β) ou uma t1/2α aumentada e uma t1/2β aumentada.
41. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 40, CARACTERIZADO pelo fato de que exibe ainda um pico de concentração plasmática aumentado (Cmáx), uma área sob a curva aumentada (AUC), um tempo de depuração modificado ou qualquer combinação destes em relação ao anticorpo de referência.
42. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 41, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou fragmentos de multimerização ou variantes destas compreendem um domínio Cµ4 e uma cauda (tp) de IgM.
43. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM ou fragmentos de multimerização ou variantes destas compreendem ainda um domínio Cµ3, um domínio Cµ2, um domínio Cµ1 ou qualquer combinação destes.
44. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento Fv de cadeia única (ScFv) ou uma região variável de domínio único (VHH).
45. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, CARACTERIZADO pelo fato de que a subunidade do domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada (VH).
46. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 45, CARACTERIZADO pelo fato de que cada unidade de ligação compreende ainda duas regiões constantes de cadeia leve ou fragmentos ou variantes destas, cada um associado a um domínio de ligação ao antígeno uma subunidade deste.
47. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que as regiões constantes de cadeia leve são regiões constantes de cadeia leve kappa ou lambda ou fragmentos ou variantes desta, e em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento ScFv ou a subunidade do domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve (VL).
48. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J ou um fragmento funcional ou uma variante desta compreende ainda um ou mais polipeptídeos heterólogos direta ou indiretamente fundidos à cadeia J ou a um fragmento funcional ou variante desta.
49. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais polipeptídeos heterólogos são fundidos à cadeia J ou a um fragmento desta via um ligante peptídico.
50. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 49, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante peptídico compreende pelo menos 5 aminoácidos, mas não mais que 25 aminoácidos.
51. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante peptídico consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 28) ou GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29).
52. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com as reivindicações de 48 a 51, CARACTERIZADO pelo fato de que os um ou mais polipeptídeos heterólogos são fundidos ao N-terminal da cadeia J ou a um fragmento ou uma variante desta, ao C-terminal da cadeia J ou a um fragmento ou uma variante desta, ou em que os polipeptídeos heterólogos são fundidos ao N-terminal e ao C- terminal da cadeia J ou a um fragmento ou uma variante desta, em que os polipeptídeos heterólogos podem ser iguais ou diferentes.
53. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com as reivindicações de 48 a 52, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um polipeptídeo heterólogo compreende um domínio de ligação.
54. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de ligação do polipeptídeo heterólogo é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.
55. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno compreende um fragmento Fab, um fragmento Fab', um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento Fv ligado a dissulfeto (sdFv) ou qualquer combinação destes.
56. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento de ligação ao antígeno é um fragmento scFv.
57. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 53 a 56, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um polipeptídeo heterólogo pode se ligar especificamente a CD3ε.
58. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J é uma variante da cadeia J modificada da SEQ ID NO: 9 (V15J).
59. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J modificada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 (V15J-Y102A).
60. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J modificada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 (V15J-T103A).
61. Anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia J modificada compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 (V15J-N49A).
62. Composição CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o anticorpo IgM ou o anticorpo semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 61, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
63. Cadeia J variante ou um fragmento funcional desta, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido único em relação a uma cadeia J de referência idêntica à cadeia J variante, exceto por uma ou mais substituições ou inserções de aminoácido único, em que a cadeia J variante pode afetar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo a cadeia J variante.
64. Cadeia J variante, de acordo com a reivindicação 63, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 ou qualquer combinação destas.
65. Polinucleotídeo isolado CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de subunidade do anticorpo IgM ou semelhante a IgM, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 61, em que o polipeptídeo de subunidade compreende (a) uma região constante da cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização da mesma, (b) uma cadeia leve de anticorpo, ou (c) uma cadeia J, uma cadeia J modificada ou fragmento ou variante funcional da mesma, ou (d) qualquer combinação dos mesmos.
66. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de subunidade compreende uma região constante de cadeia pesada de IgM ou semelhante a IgM ou um fragmento de multimerização desta.
67. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 66, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de subunidade compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 34.
68. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de subunidade compreende uma cadeia leve de anticorpo.
69. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 65, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de subunidade compreende uma cadeia J, uma cadeia J modificada ou qualquer fragmento funcional ou variante destas.
70. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 69, CARACTERIZADO pelo fato de que a subunidade compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 23 ou SEQ ID NO: 24.
71. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 65 a 70, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende duas, três ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam dois, três ou mais dos polipeptídeos de subunidade.
72. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 65 a 71.
73. Célula hospedeira CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 65 a 71, ou o vetor de expressão, de acordo com a reivindicação 72.
74. Método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia- vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos compreendendo as cadeias J variantes, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) testar anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos compreendendo cadeias J variantes ou fragmentos destas quanto à meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência, em que as cadeias J variantes ou fragmentos destas compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas, e em que o anticorpo IgM pentamérico ou o anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência compreendem uma cadeia J ou um fragmento destas idêntico às cadeias J variantes, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas; e (b) recuperar as cadeias J variantes ou fragmentos destas que conferem meia-vida sérica aumentada aos anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos em relação ao anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência.
75. Método para identificar cadeias J variantes que podem aumentar a meia- vida sérica de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos compreendendo as cadeias J variantes, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) testar anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos compreendendo cadeias J variantes ou fragmentos destas quanto ao seu nível de ligação ao receptor Fc alfa-mu (FcαμR), ao receptor polimérico Ig (pIgR) ou ao FcαμR e ao pIgR, em que as cadeias J variantes ou fragmentos destas compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas; e (b) recuperar as cadeias J variantes ou fragmentos destas que conferem capacidade reduzida de ligação ao FcαµR, capacidade reduzida de ligação ao pIgR ou capacidade reduzida de ligação ao FcαµR e ao pIgR nos anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos em relação a um anticorpo IgM pentamérico ou a um anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência compreendendo uma cadeia J ou um fragmento desta idêntico às cadeias J variantes, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
76. Método, de acordo com a reivindicação 75, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda o teste de anticorpos IgM pentaméricos ou anticorpos semelhantes a IgM pentaméricos que incluem cadeias J variantes recuperadas ou fragmentos destas quanto ao aumento da meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico ou um anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência compreendendo uma cadeia J ou um fragmento desta idêntico às cadeias J variantes recuperadas ou fragmentos destas, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
77. Método para identificar regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) testar anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante para meia-vida sérica aumentada em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM pentamérico ou anticorpo semelhante a IgM pentamérico de referência, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas e em que o anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência compreendem regiões constantes de cadeia pesada de IgM idênticas às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto pelas inserções,
deleções ou substituições de aminoácidos definidas; e (b) recuperar os anticorpos IgM ou os anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que conferem meia-vida sérica aumentada aos anticorpos IgM ou aos anticorpos semelhantes a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante em relação ao anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência.
78. Método para identificar regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que podem aumentar a meia-vida sérica de um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) testar anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante para o seu nível de ligação ao receptor Fc alfa-mu (FcαμR), receptor Fc mu (FcµR), receptor polimérico de Ig (pIgR), qualquer combinação de dois dos receptores ou todos os três receptores, em que as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante compreendem inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas; e (b) recuperar os anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante que conferem capacidade de ligação a FcαµR reduzida, capacidade de ligação a FcµR reduzida, capacidade de ligação a pIgR reduzida, capacidade de ligação a qualquer um dos dois receptores reduzida ou capacidade de ligação a todos os três receptores reduzida, nos anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM compreendendo as regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante em relação a um anticorpo IgM de referência ou anticorpo semelhante a IgM compreendendo regiões constantes de cadeia pesada de IgM idênticas às regiões constantes de cadeia pesada de IgM variante, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda o teste de anticorpos IgM ou anticorpos semelhantes a IgM recuperados compreendendo regiões constantes de cadeia pesada IgM variante quanto ao aumento da meia-vida sérica em um sujeito animal em relação a um anticorpo IgM ou anticorpo semelhante a IgM de referência compreendendo regiões constantes de cadeia pesada IgM variante idênticas às regiões constantes de cadeia pesada IgM variante, exceto pelas inserções, deleções ou substituições de aminoácidos definidas.
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