ES2946160T3 - Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan métodos para el tratamiento en un sujeto de anemia, anemia que requiere transfusión de glóbulos rojos, síndromes mielodisplásicos (MDS) de riesgo bajo o intermedio 1 y/o leucemia mielomonocítica crónica no proliferativa (CMML) en cualquier mamífero en el que los métodos comprenden administración de inhibidores de señalización de Activin-ActRII a un sujeto que necesita el tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Antagonistas de activina-ActRII y usos para tratar síndrome mielodisplásico
3. CAMPO
En el presente documento se desvelan métodos para el tratamiento a largo plazo en un sujeto de (i) anemia; (ii) anemia que requiere transfusión de RBC; (iii) síndromes mielodisplásicos (SMD); y/o (iv) leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) no proliferativa, en donde los métodos comprenden la administración de un inhibidor de la señalización de activina-ActRII a un sujeto en necesidad del tratamiento a largo plazo. Dicho inhibidor de la señalización de activina-ActRII puede ser inhibidores de la señalización de señalización de ActRIIA y/o ActRIIB. En el presente documento se desvelan métodos de tratamiento a largo plazo en un sujeto de (i) anemia; (ii) anemia que requiere transfusión de glóbulos rojos (RBC); (iii) SMD; y/o (iv) LMMC no proliferativa, en donde el sujeto tiene sideroblastos en anillo.
4. ANTECEDENTES
La anemia es una disminución en el número de glóbulos rojos o cantidad inferior a la normal de hemoglobina en la sangre. La anemia también puede ser causada por una disminución en la capacidad de unión al oxígeno de la hemoglobina. La anemia es el trastorno de la sangre más común. La anemia puede ser causada por eritropoyesis ineficaz. La eritropoyesis ineficaz está presente si la eritropoyesis activa tiene lugar, pero los glóbulos rojos maduros dejan de desarrollarse en la tasa adecuada. Las células progenitoras experimentan apoptosis antes de que se alcance el estadio de glóbulos rojos maduros. El SMD comprende trastornos de las células madre hematopoyéticas caracterizados por hematopoyesis ineficaz. Además, los trastornos del SMD incluyen trastornos caracterizados por sideroblastos en anillo. Los sideroblastos en anillo son eritroblastos anormales. Además, ciertas mutaciones somáticas asociadas al SMD provocan la formación de sideroblastos en anillo y eritropoyesis ineficaz. Las mutaciones dominantes en el factor 3B1 de corte y empalme (SF3B1) están asociadas con la formación de sideroblastos en anillo. Los sideroblastos en anillo son eritroblastos en los que existe un mínimo de cinco gránulos (sideróticos) que contienen hierro que cubren al menos un tercio de la circunferencia del núcleo. Véase, por ejemplo, Mufti et al., 2008, Haematologica, 93(11):1712-7. Los sideroblastos en anillo contienen mitocondrias cargadas de hierro. La presencia de sideroblastos en anillo se puede detectar por tinción con azul de Prusia y visualización. Los sideroblastos en anillo se pueden detectar en sangre periférica y/o frotis de médula ósea.
Se han identificado dos receptores de tipo II relacionados, ActRIIA y ActRIIB, como los receptores de tipo II para activinas (Mathews y Vale, 1991, Cell 65:973-982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Además de las activinas, ActRIIA y ActRIIB pueden interactuar bioquímicamente con varias otras proteínas de la familia TGF-beta, que incluyen BMP7, Nodal, GDF8 y GDF11 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee y McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo y Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 es el receptor de tipo I principal para activinas, particularmente para la activina A, y ALK-7 puede servir de receptor para activinas también, particularmente para la activina B.
Una proteína de fusión humanizada que consiste en el dominio extracelular (ECD) del receptor de tipo IIA de activina (ActRIIA) y el dominio Fc de IgG1 humana se une con alta afinidad a la activina-A bloqueando la señalización mediante el receptor endógeno ActRIIA. La activina-A es un factor de diferenciación eritroide que afecta a los estadios tardíos de la maduración de RBC (Murata M, Onomichi K, Eto Y, Shibai H. y Muramatsu M. Expression of erythroid differentiation factor in Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun 1988; 151: 230-5). Se han descrito inhibidores de la señalización de ActRII que aumentan los niveles de RBC (por ejemplo, publicaciones de solicitud de patente N.° 20110038831;20100204092;20100068215;20100028332; 20100028331; y 20090163417).
El documento de patente US 2012/028276A1 se refiere a métodos y kits para diagnosticar y determinar la evolución clínica de enfermedades asociadas a síndromes mielodisplásicos (SMD).
El documento de patente US 2009/047281A1 se refiere a composiciones y métodos de aumento de los niveles de glóbulos rojos y/o hemoglobina en vertebrados, que incluyen roedores y primates, y particularmente en seres humanos.
El documento de patente WO 2011/020045A1 desvela que se pueden usar trampas de GDF en combinación con activadores del receptor de eritropoyetina para aumentar los niveles de glóbulos rojos o tratar anemia en pacientes en necesidad de los mismos.
5. SUMARIO
En el presente documento se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, que comprende (a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización de ActRII de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg al sujeto si al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. El trastorno relacionado con la sangre puede ser anemia, síndromes mielodisplásicos (SMD) o leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) no proliferativa. El porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se puede determinar en un primer momento. Además, la primera vez puede ser en 1 día, 2 días 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses desde la administración de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto.
En el presente documento se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y/o (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. El trastorno relacionado con la sangre puede ser anemia, SMD o LMMC no proliferativa. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de anemia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y/o (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de SMD en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de la señalización de ActRII en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y/o (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de LMMC no proliferativa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de la señalización de ActRII en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y/o (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%.
La invención proporciona un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) para su uso en un método de tratamiento de síndromes mielodisplásicos (SMD) en un sujeto, en donde el método comprende:
(a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo;
y
(b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg al sujeto si al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende:
(i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:7;
(ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;
(v) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vi) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:25;
(viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; o
(ix) un fragmento del dominio extracelular de ActRIIB, en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; un conector; y un Fc de una IgG.
En lo sucesivo, referencia a un inhibidor de la señalización de ActRII en el contexto de la invención significa un polipéptido como se ha definido anteriormente.
En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII es 1,2, 3, 4, 5 o 6 meses. En ciertas realizaciones, el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se mantiene durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 o 10,0 veces inferior al porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el nivel inicial de hemoglobina en el sujeto es el nivel de hemoglobina en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del
inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el nivel inicial de hemoglobina en dicho sujeto es inferior a aproximadamente 11 g/dl. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto se mantiene durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto es un nivel de hemoglobina de entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el sujeto no requiere transfusión de glóbulos rojos durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por vía subcutánea.
En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un porcentaje adicional de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina por tinción con azul de Prusia. En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un nivel adicional de hemoglobina en el sujeto 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar un primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) (i) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un corto periodo de tiempo si el primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%, o (ii) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un largo periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es inferior a 10%. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia, anemia que requiere transfusión, SMD o LMMC no proliferativa. En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de anemia en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar un primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) (i) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un corto periodo de tiempo si el primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%, o (ii) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un largo periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es inferior a 10%. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusiones de sangre. En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de SMD en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar un primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) (i) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un corto periodo de tiempo si el primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%, o (ii) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un largo periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es inferior a 10%. En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de LMMC no proliferativa en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar un primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) (i) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un corto periodo de tiempo si el primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%, o (ii) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un largo periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es inferior a 10%.
En ciertas realizaciones de la invención, el primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en el sujeto al que se administró el inhibidor de la señalización de ActRII durante un corto periodo de tiempo se reduce a menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o menos del 1% durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después del corto periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina en el sujeto es menos del aproximadamente 11 g/dl. En ciertas realizaciones, un nivel de hemoglobina en el sujeto al que se administró el inhibidor de la señalización de ActRII durante un corto periodo de tiempo es entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el corto periodo de tiempo es 1,2, 3, 4 o 5 meses. En ciertas realizaciones, el largo periodo de tiempo es al menos 6, 12, 18 o 24 meses. En ciertas realizaciones, el sujeto no requiere transfusión de glóbulos rojos durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por vía subcutánea.
En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina por tinción con azul de Prusia. En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar que el sujeto tiene un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo de al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (b) administrar al sujeto una dosis inicial de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII; (c) determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo después de un periodo de tiempo; y (d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia, anemia que requiere transfusión, SMD o LMMC no proliferativa. En el presente documento también se desvela un método de tratamiento de anemia en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar que el sujeto tiene un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo de al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (b) administrar al sujeto una dosis inicial de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII; (c) determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo después de un periodo de tiempo; y (d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusiones de sangre. En el presente documento se proporciona un inhibidor de la señalización de ActRII para su uso en un método de tratamiento de SMD en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar que el sujeto tiene un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo de al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (b) administrar al sujeto una dosis inicial de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII; (c) determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo después de un periodo de tiempo; y (d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) no proliferativa en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar que el sujeto tiene un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo de al menos 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (b) administrar al sujeto una dosis inicial de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII; (c) determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo después de un periodo de tiempo; y (d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo es 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra por inyección. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra por vía subcutánea. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días.
En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra al sujeto inmediatamente después de la determinación del primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo o en como máximo 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses de la misma. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra al sujeto inmediatamente después de la determinación del segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo o en como máximo 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses de la misma. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es mayor que la dosis inicial si el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada es aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg, aproximadamente 0,25 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,35 mg/kg, aproximadamente 0,4 mg/kg, o aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,5 mg/kg, o aproximadamente 1,75 mg/kg superior a la dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra más frecuentemente que la dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra cada 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35 o 40 días. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra por inyección. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra por vía subcutánea. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada no se administra al sujeto si el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o menos del 1 %. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra durante como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses.
En ciertas realizaciones, el sujeto no requiere transfusión de glóbulos rojos durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina por tinción con azul de Prusia.
En el presente documento se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en el sujeto es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (c) determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto después de que inhibidor de la señalización de ActRII se administre al sujeto; y (d) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el nivel de hemoglobina en el sujeto es al menos 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia, anemia que requiere transfusión, SMD o LMMC no proliferativa. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de anemia en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en el sujeto es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (c) determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto después de que inhibidor de la señalización de ActRII se administre al sujeto; y (d) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el nivel de hemoglobina en el sujeto es al menos 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto requiere transfusiones de RBC. En el presente documento se proporciona un inhibidor de la señalización de ActRII para su uso en un método de tratamiento de SMD en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (c) determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto después de que inhibidor de la señalización de ActRII se administre al sujeto; y (d) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el nivel de hemoglobina en el sujeto es al menos 11 g/dl. En el presente documento se desvela un método de tratamiento de LMMC no proliferativa en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%; (c) determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto después de que inhibidor de la señalización de ActRII se administre al sujeto; y (d) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el nivel de hemoglobina en el sujeto es al menos 11 g/dl.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra al sujeto una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por vía subcutánea.
En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina se determina en 6, 12, 18 y/o 24 meses después de que se administra el inhibidor de la señalización de ActRII.
En el presente documento también se desvela un método de promoción de la eritropoyesis en un sujeto que tiene un trastorno relacionado con la sangre, comprendiendo el método: (a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto durante un primer periodo de tiempo; (c) después del primer periodo de tiempo, si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en la etapa (a) habían estado por encima de 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, reducir la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII administrada al sujeto, reducir la frecuencia de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto, o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia, anemia que requiere transfusión, SMD o LMMC no proliferativa. En ciertas realizaciones, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) reducir o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza. En ciertos ejemplos, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) reducir la dosis de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza. En ciertos ejemplos, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) reducir la frecuencia de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza. En ciertos ejemplos, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático normalizado en el sujeto es un nivel del parámetro hemático en una población de referencia. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático normalizado en el sujeto es una mejora en el parámetro hemático en el sujeto en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% en comparación con el parámetro hemático en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es al menos 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el nivel de hemoglobina, hematocrito, número de eritrocitos o porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra al sujeto una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por vía subcutánea.
En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una elevada probabilidad de lograr la normalización de uno o más parámetros hemáticos si al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el nivel de hemoglobina, hematocrito, número de eritrocitos, o porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo.
En ciertas realizaciones, el parámetro hemático normalizado es un nivel del parámetro hemático en una población de referencia. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático normalizado es una mejora en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% en comparación con el parámetro hemático en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses.
En el presente documento se desvela un método para el tratamiento a largo plazo de anemia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de tipo II del receptor de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en una relación entre eritroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto en comparación con una relación inicial entre eritroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto; y (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto antes de administrar al sujeto el inhibidor de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde la relación inicial entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto es al menos 1:10, al menos 1:7, o al menos 1:5. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión.
En el presente documento se desvela un método para el tratamiento a largo plazo de síndromes mielodisplásicos (SMD) de riesgo bajo o intermedio-1 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de tipo II del receptor de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en una relación entre eritroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto en comparación con una relación inicial entre eritroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto; y (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto antes de administrar al sujeto el inhibidor de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde la relación inicial entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto es al menos 1:10, al menos 1:7, o al menos 1:5.
En el presente documento se desvela un método para el tratamiento a largo plazo de leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) no proliferativa en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de tipo II del receptor de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en una relación entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto en comparación con una relación inicial entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto; y (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto antes de administrar al sujeto el inhibidor de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde la relación inicial entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales en el sujeto es al menos 1:10, al menos 1:7, o al menos 1:5.
En el presente documento también se desvela un método de aumento del nivel de neutrófilos en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII).
En el presente documento también se desvela un método de aumento del nivel de plaquetas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII).
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) 90% idéntica a SEQ ID NO:2; (b) 95% idéntica a SEQ ID NO:2; (c) 98% idéntica a SEQ ID NO:2; (d) SEQ ID NO:2; (e) 90% idéntica a SEQ ID NO:3; (f) 95% idéntica a SEQ ID NO:3; (g) 98% idéntica a SEQ ID NO:3; (h) SEQ ID NO:3; (i) 90% idéntica a SEQ ID NO:6; (j) 95% idéntica a SEQ ID NO:6; (k) 98% idéntica a SEQ ID NO:6; (l) s EQ ID NO:6; (m) 90% idéntica a SEQ ID NO:7; (n) 95% idéntica a SEQ ID NO:7; (o) 98% idéntica a SEQ ID NO:7; (p) SEQ ID NO:7; (q) 90% idéntica a SEQ ID NO:12; (r) 95% idéntica a SEQ ID NO: 12; (s) 98% idéntica a SEQ ID NO:12; (t) SEQ ID NO:12; (u) 90% idéntica a SEQ ID NO: 17; (v) 95% idéntica a SEQ ID NO:17; (w) 98% idéntica a SEQ ID NO:17; (x) SEQ ID NO:17; (y) 90% idéntica a SEQ ID NO:20; (z) 95% idéntica a SEQ ID NO:20; (aa) 98% idéntica a SEQ ID NO:20; (bb) SEQ ID n O:20; (cc) 90% idéntica a SEQ ID NO:21; (dd) 95% idéntica a SEQ ID NO:21; (ee) 98% idéntica a SEQ ID NO:21; (ff) SEQ ID No :21 ; (gg) 90% idéntica a SEQ ID NO:25; (hh) 95% idéntica a SEQ ID NO:25; (ii) 98% idéntica a SEQ ID NO:25; y (jj) SEQ ID NO:25.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) 90% idéntica a SEQ ID NO:2; (b) 95% idéntica a SEQ ID NO:2; (c) 98% idéntica a SEQ ID n O:2; (d) SEQ ID NO:2; (e) 90% idéntica a SEQ ID NO:3; (f) 95% idéntica a SEQ ID NO:3; (g) 98% idéntica a SEQ ID NO:3; (h) SEQ ID NO:3; (i) 90% idéntica a SEQ ID NO:6; (j) 95% idéntica a SEQ ID NO:6; (k) 98% idéntica a SEQ ID NO:6; (l) SEQ ID NO:6; (m) 90% idéntica a SEQ ID NO:7; (n) 95% idéntica a SEQ ID NO:7; (o) 98% idéntica a SEQ ID NO:7; y (p) SEQ ID NO:7.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es una proteína de fusión humanizada que consiste en el dominio extracelular de ActRIIA y el dominio Fc de IgG1 humana.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) 90% idéntica a SEQ ID NO:17; (b) 95% idéntica a SEQ ID NO:17; (c) 98% idéntica a SEQ ID NO:17; (d) SEQ ID NO:17; (e) 90% idéntica a SEQ ID NO:20; (f) 95% idéntica a SEQ ID NO:20; (g) 98% idéntica a SEQ ID NO:20; (h) SEQ ID NO:20; (i) 90% idéntica a SEQ ID NO:21; (j) 95% idéntica a SEQ ID NO:21; (k) 98% idéntica a SEQ ID NO:21; (l) SEQ ID NO:21; (m) 90% idéntica a SEQ ID NO:25; (n) 95% idéntica a SEQ ID NO:25; (o) 98% idéntica a SEQ ID NO:25; y (p) SEQ ID NO:25.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es una proteína de fusión humanizada que consiste en el dominio extracelular de ActRIIA y el dominio Fc de IgG1 humana.
En ciertas realizaciones, el sujeto es humano.
En ciertos ejemplos, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 y 2,25 mg/kg. Según la invención, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,7 y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,125 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,7 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,25 mg/kg, 1,33 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,75 mg/kg, 2,0 mg/kg, o 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 0,5 mg/kg, entre 0,3 mg/kg y 0,7 mg/kg, entre 0,5 mg/kg y 1,0 mg/kg, entre 0,7 mg/kg y 1,25 mg/kg, o entre 1,0 mg/kg y 2,0 mg/kg.
6. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 describe la pauta posológica y el diseño del estudio para el Ejemplo 2. Véase la Sección 8.2. ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7).
La Figura 2 describe la proporción de sujetos que logran independencia de la transfusión de RBC (RBC-TI) mayor o igual que 56 días para sujetos de alta carga de transfusión (HTB) o RBC-TI durante mayor o igual que 56 días con aumento medio de hemoglobina (Hb) mayor o igual que 1,5 g/dl durante un periodo sin transfusión de 8 semanas para sujetos de baja carga de transfusión (LTB). ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID n O:7).
La Figura 3 representa el nivel de hemoglobina (Hb, g/dl) y el número de unidades de transfusión de RBC recibidas por un sujeto de HTB a modo de ejemplo que recibió una dosis de 1,0 mg/kg de ActRIIA (SEQ ID NO:7). La Figura 3 demuestra que el sujeto de HTB a modo de ejemplo logra RBC-TI durante más de 56 días.
La Figura 4 demuestra la máxima duración de la respuesta a la carga de transfusión entre respondedores de HTB (n=19) después del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO: 7) a las dosis indicadas. ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7).
La Figura 5 demuestra la máxima duración de la respuesta de RBC-TI entre sujetos de HTB que lograron RBC-TI durante mayor o igual que 56 días (n=5) después del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO: 7) a las dosis indicadas. ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7).
La Figura 6 demuestra la proporción de sujetos de LTB que lograron RBC-TI durante mayor o igual que 56 días y un aumento de Hb medio mayor o igual que 1,5 g/dl (n=9) después del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7) a las dosis indicadas. ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7). La Figura 7 demuestra la máxima duración de la respuesta de RBC-TI entre sujetos de LTB que logran RBC-TI durante mayor o igual que 56 días y un aumento medio de Hb mayor o igual que 1,5 g/dl (n=5) después del tratamiento con ActRIIA (SEQ ID NO:7) a las dosis indicadas. ActRIIA-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIA (SEQ ID NO:7). La Figura 8 describe la pauta posológica y el diseño del estudio para el Ejemplo 2. Véase la Sección 8.3. BL = nivel basal. ActRIIB-I se refiere al inhibidor de la señalización de ActRIIB (s Eq ID n O:25).
La Figura 9 describe el máximo aumento de hemoglobina en sujetos de LTB después del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas.
La Figura 10 describe el aumento en reticulocitos en sujetos de LTB después del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas.
La Figura 11 describe los niveles de hemoglobina en un sujeto de LTB a modo de ejemplo al que se administra un inhibidor de la señalización de ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas y según la pauta de tratamiento indicada. BL=nivel basal.
La Figura 12 describe los niveles de hemoglobina en un sujeto de LTB a modo de ejemplo al que se administra un inhibidor de la señalización de ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas y según la pauta de tratamiento indicada. BL=nivel basal.
La Figura 13 describe los niveles de hemoglobina en un sujeto de HTB a modo de ejemplo al que se administra un inhibidor de la señalización de ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas y según la pauta de tratamiento indicada. BL=nivel basal.
La Figura 14 representa el nivel de hemoglobina (Hb, g/dl) y número de unidades de transfusión de RBC recibidas por un sujeto de HTB a modo de ejemplo que recibió una dosis de 1,0 mg/kg de un ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). La Figura 14 demuestra que el sujeto de HTB a modo de ejemplo logra RBC-TI durante al menos 337 días después del inicio de tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).
La Figura 15 representa el nivel de hemoglobina (Hb, g/dl) y número de unidades de transfusión de RBC recibidas por un sujeto de LTB a modo de ejemplo que recibió una dosis de 1,0 mg/kg de un ActRIIA (SEQ ID NO:7). La Figura 15 demuestra que el sujeto de LTB a modo de ejemplo logra un aumento sostenido en los niveles de Hb durante al menos 337 días después del inicio de tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).
La Figura 16 representa la carga de transfusión en sujetos que cumplen los requisitos para obtener independencia de la transfusión. Los sujetos se trataron con entre 0,75 mg/kg y 1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc.
La Figura 17 describe la proporción de sujetos que logran independencia de la transfusión de RBC (RBC-TI) con un aumento medio de hemoglobina igual o superior a 1,5 g/dl para pacientes de LTB durante cualquier periodo de 8 semanas en pacientes que recibieron la fusión ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). El sombreado gris oscuro indica HTB y el sombreado gris claro indica pacientes de LTB.
La Figura 18 ilustra la respuesta de hemoglobina de un sujeto de HTB a modo de ejemplo en el transcurso del estudio de extensión del tratamiento de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 meses. La primera y última dosis del tratamiento se indican por flechas. Los acontecimientos de transfusión de sangre se indican por barras. Los resultados de hemoglobina (Hgb) (en g/dl) se representan frente al tiempo (en días).
La Figura 19 ilustra la respuesta de hemoglobina de un sujeto de LTB a modo de ejemplo en el transcurso del estudio de extensión del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 meses. El cambio medio en Hgb (en g/l) se representa frente al tiempo (en meses).
La Figura 20 ilustra las respuestas de independencia de la transfusión observadas en seis sujetos en el transcurso del estudio de extensión del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) de 12 meses, mientras se recibían los tratamientos de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a dosis de 1,0 mg/kg (sujetos representados por las cuatro barras inferiores) y 1,75 mg/kg (sujeto representado por la barra superior). Cuatro pacientes experimentaron una independencia de transfusiones continuada durante todo el estudio (4 barras centrales). Un paciente adquirió independencia de la transfusión después de aproximadamente un mes de los tratamientos de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) (barra superior). Un paciente experimentó independencia de la transfusión intermitentemente durante aproximadamente 2 meses (barra inferior).
7. DESCRIPCIÓN DETALLADA
7.1 VISIÓN GENERAL
Se descubrió inesperadamente que los niveles de sideroblastos en anillo en pacientes con un trastorno relacionado con la sangre se podían usar para identificar pacientes sensibles al tratamiento con un inhibidor de la señalización de activina-ActRII. Dichos trastornos relacionados con la sangre pueden ser (i) anemia; (ii) anemia que requiere transfusión de RBC; (iii) SMD; y/o (iv) LMMC no proliferativa. Véase la Sección 7.8. Sin desear quedar ligado a teoría, aproximadamente 15% o más sideroblastos en anillo de eritroblastos en un paciente con un trastorno relacionado con la sangre es predictivo de una respuesta clínica mejorada a un inhibidor de la señalización de activina-ActRII en el paciente, con respecto a un paciente con el mismo trastorno relacionado con la sangre pero con menos de aproximadamente 15% de sideroblastos en anillo de eritroblastos. Dicha respuesta clínica mejorada puede ser un aumento de la respuesta de un parámetro hemático (tal como los niveles de hemoglobina, niveles de glóbulos rojos y hematocrito). Dicha respuesta clínica mejorada se puede manifestar ella misma en una reducida carga de transfusión. Además, dicha respuesta clínica mejorada puede dar como resultado un beneficio a largo plazo para el paciente sin administración continuada del inhibidor de la señalización de activina-ActRII. En otras palabras, los métodos proporcionados en el presente documento pueden dar como resultado la mejora de uno o más parámetros hemáticos en un paciente durante un periodo de tiempo después de que se haya interrumpido la administración del inhibidor de la señalización de activina-ActRII.
Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos de tratamiento de un paciente con un trastorno relacionado con la sangre, en donde el método comprende (a) determinar el porcentaje de sideroblastos en anillo entre eritroblastos; y (b) administrar un inhibidor de la señalización de activina-ActRII al paciente si aproximadamente 15% o más de eritroblastos son sideroblastos en anillo. Más específicamente, en el presente documento se proporcionan métodos de tratamiento de un paciente con un trastorno relacionado con la sangre, en donde el método comprende (a) determinar el porcentaje de sideroblastos en anillo entre eritroblastos en el paciente; (b) administrar un inhibidor de la señalización de activina-ActRII al paciente; y (c) si al menos aproximadamente 15% de los eritroblastos son sideroblastos en anillo, entonces (i) reducir la dosis de o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de activina-ActRII después de un periodo de tiempo y/o (ii) disminuir la frecuencia de administración del inhibidor de la señalización de activina-ActRII después de un periodo de tiempo. Una descripción detallada de estos métodos se puede encontrar en las Secciones 7.3 y 7.4.
La invención proporciona un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) para su uso en un método de tratamiento de síndromes mielodisplásicos (SMD) en un sujeto, en donde el método comprende:
(a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y
(b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg al sujeto si al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende:
(i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:7;
(ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;
(v) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vi) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:25;
(viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; o
(ix) un fragmento del dominio extracelular de ActRIIB, en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; un conector; y un Fc de una IgG.
7.2 TÉRMINOS Y ABREVIATURAS
Como se usa en el presente documento, "ActRII" se refiere a receptor de tipo II de activina. Como se usa en el presente documento, "ActRIIA" se refiere a receptor de tipo IIA de activina. Véase, por ejemplo, Mathews y Vale, 1991, Cell 65:973-982. El número de acceso NM_001278579.1 de GenBank™ proporciona una secuencia del ácido nucleico de ActRIIA humano a modo de ejemplo. El número de acceso NP_001265508.1 de GenBank™ proporciona una secuencia de aminoácidos de ActRIIA humano a modo de ejemplo. Como se usa en el presente documento, "ActRIIB" se refiere a receptor de tipo IIB de activina. Véase, por ejemplo, Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108. El número de acceso NM_001106.3 de GenBank™ proporciona una secuencia del ácido nucleico de ActRIIB humano a modo de ejemplo. El número de acceso NP_001097.2 de GenBank™ proporciona una secuencia de aminoácidos de ActRIIB humano a modo de ejemplo.
Como se usa en el presente documento, "ActRIIA-mFc" o "mActRIIA-Fc" se refiere a una proteína de fusión de receptor de tipo IIA de activina-IgG1 de ratón. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.173.601. Como se usa en el presente documento, "mActRIIB-Fc" o "ActRIIB-mFc" se refiere a una proteína de fusión de receptor de tipo IIB de activina-IgG1 de ratón. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.173.601. Como se usa en el presente documento, "hActRIIA-Fc" o "ActRIIA-hFc" se refiere a una proteína de fusión de receptor de tipo IIA de activina-IgG1 humana. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.173.601. En una realización específica, hActRIIA-Fc es sotatercept (SEQ ID n O: 7). Como se usa en el presente documento, "hActRIIB-Fc" o "ActRIIB-hFc" se refiere a una proteína de fusión de receptor de tipo IIB de activina-IgG1 humana. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.173.601. En una realización específica, hActRIIB-Fc es luspatercept (SEQ ID NO: 25).
Como se usa en el presente documento, "ALK" se refiere a cinasa de linfoma anaplásico.
Como se usa en el presente documento, "BL" se refiere a nivel basal.
Como se usa en el presente documento, "BMP7" se refiere a proteína morfogenética ósea 7.
Como se usa en el presente documento, "LMMC" se refiere a leucemia mielomonocítica crónica.
Como se usa en el presente documento, "DEXA" se refiere a absorciometría con rayos X de doble energía.
Como se usa en el presente documento, "DNMT3A" se refiere a ADN (citosina-5)-metiltransferasa 3A. Los números de acceso NM_153759.3, NM_022552.4, NM_175629.2 y NM_175630.1 de GenBank™ proporcionan secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo para DNMT3A humano. Los números de acceso NP_715640.2, NP_783329.1, NP_783328.1 y NP_072046.2 de GenBank™ proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo para DNMT3A humano. Como se usa en el presente documento, "ECD" se refiere a dominio extracelular.
Como se usa en el presente documento, "EPO" se refiere a eritropoyetina.
Como se usa en el presente documento, "ESA" se refiere a agente estimulante de la eritropoyesis.
Como se usa en el presente documento, "G-CSF" se refiere a factor estimulante de colonias de granulocitos.
Como se usa en el presente documento, "GM-CSG" se refiere a factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos.
Como se usa en el presente documento, "Hb" se refiere a hemoglobina.
Como se usa en el presente documento, "HBML" se refiere a melitina de abeja melífera.
Como se usa en el presente documento, "HI-E" se refiere a mejora hemática eritroide. En ciertas realizaciones, la HI-E es como se define por IWG. En ciertas realizaciones, la HI-E es como se define por 2006 IWG modificado. En ciertas realizaciones, la HI-E para un paciente de baja carga de transfusión es un aumento en la concentración de hemoglobina en el paciente de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. En ciertas realizaciones, la HI-E para un paciente de alta carga de transfusión es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas.
Como se usa en el presente documento, "HTB" se refiere a alta carga de transfusión. En ciertas realizaciones, un sujeto de HTB recibe mayor o igual que 4 unidades de RBC durante el transcurso de 8 semanas.
Como se usa en el presente documento, "IgG" se refiere a inmunoglobulina G.
Como se usa en el presente documento, "Int-1" se refiere al puntaje de IPSS de intermedio 1. Véase la Sección 7.8. Como se usa en el presente documento, "IPSS" se refiere al Sistema Internacional de Puntaje Pronóstico. Véase la Sección 7.8.
Como se usa en el presente documento, "IWG" se refiere al Grupo de Trabajo Internacional. Véase, por ejemplo, Cheson et al. Blood 200096:3671-3674. En ciertas realizaciones, IWG se refiere a los criterios modificados de 2006. Véase, por ejemplo, Cheson et al., 2006, Blood, 108(2).
Como se usa en el presente documento, "LTB" se refiere a baja carga de transfusión. En ciertas realizaciones, un sujeto de LTB recibe menos de 4 unidades de RBC durante el transcurso de 8 semanas.
Como se usa en el presente documento, "SMD" se refiere a síndromes mielodisplásicos.
Como se usa en el presente documento, "FD" se refiere a farmacodinámica.
Como se usa en el presente documento, "FC" se refiere a farmacocinética.
Como se usa en el presente documento, "qCT" se refiere a tomografía computarizada cuantitativa.
Como se usa en el presente documento, "PARS" se refiere a anemia refractaria con sideroblastos en anillo.
Como se usa en el presente documento, "RBC" se refiere a glóbulos rojos.
Como se usa en el presente documento, "RBC-TI" se refiere a independiente de la transfusión de glóbulos rojos.
Como se usa en el presente documento, "RCMD-RS" se refiere a citopenia refractaria con displasia multilinaje con sideroblastos en anillo.
Como se usa en el presente documento, "RS" se refiere a sideroblasto en anillo.
Como se usa en el presente documento, "SC" se refiere a subcutánea.
Como se usa en el presente documento, "SETBP1" se refiere a la proteína 1 de unión a SET. Los números de acceso NM_015559.2 y NM_001130110.1 de GenBank™ proporcionan secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo para SETBP1 humana. Los números de acceso NP_056374.2 y NP_001123582.1 de GenBank™ proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo para SETBP1 humana.
Como se usa en el presente documento, "SF3B1" se refiere al factor 3B1 de corte y empalme. Los números de acceso NM_012433.3, NM_001005523.2, y NM_001308824.1 de GenBank™ proporcionan secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo para SF3B1 humana. Los números de acceso NP_001295753.1, NP_001005526.1 y NP_036565.2 de GenBank™ proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo para SF3B1 humana.
Como se usa en el presente documento, "SPR" se refiere a resonancia de plasmones superficiales.
Como se usa en el presente documento, "SRSF2" se refiere al factor 2 de corte y empalme rico en serina/arginina. Los números de acceso NM_003016.4 y NM_001195427.1 de GenBank™ proporcionan secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo para SRSF2 humana. Los números de acceso NP_001182356.1 y NP_003007.2 de GenBank™ proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo para SRSF2 humana.
Como se usa en el presente documento, "TET2" se refiere a tet metilcitosina dioxigenasa 2. Los números de acceso NM_001127208.2 y NM_017628.4 de GenBank™ proporcionan secuencias del ácido nucleico a modo de ejemplo para TET2 humana. Los números de acceso NP_001120680.1 y NP_060098.3 de GenBank™ proporcionan secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo para TET2 humana.
Como se usa en el presente documento, "TGF" se refiere a factor de crecimiento transformante.
Como se usa en el presente documento, "TPA" se refiere a activador tisular del plasminógeno.
7.3 MÉTODOS DE TRATAMIENTO
En el presente documento se describe un método de tratamiento de un sujeto con un trastorno relacionado con la sangre, en donde el método comprende (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el inhibidor de señalización de ActRII se administra al sujeto si al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina en un primer momento. En ciertos ejemplos, el primer momento es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses desde la administración de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene anemia. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. Según la invención, el sujeto tiene SMD. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene LMMc no proliferativa. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene una elevada probabilidad de lograr la normalización de uno o más parámetros hemáticos si al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una elevada probabilidad de lograr una normalización de uno o más parámetros hemáticos si al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el nivel de hemoglobina. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el hematocrito. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el número de eritrocitos. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático es el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el parámetro hemático normalizado es un nivel del parámetro hemático en una población de referencia. En ciertas realizaciones, la población de referencia es una población de referencia como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, la normalización de uno o más parámetros hemáticos es una mejora en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% en comparación con el parámetro hemático en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según tinción con azul de Prusia. En ciertas realizaciones, los eritroblastos se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina en el sujeto se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertas realizaciones, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
En el presente documento se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) en una dosis farmacéuticamente eficaz y durante un periodo de tiempo para lograr (i) una reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (ii) un aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg, y en donde al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. Según la invención, el trastorno es SMD, y al menos 15% de los eritroblastos en los sujetos son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. Como se usa en el presente documento, "sideroblastos en anillo" y "RS" se usan indistintamente. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra durante como máximo 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses. En ciertas realizaciones, el porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se mantiene durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se mantiene durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 o 10,0 veces inferior al porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto se mantiene durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto es un nivel de hemoglobina de entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el sujeto no requiere transfusión de RBC durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método elimina el requisito de la transfusión de RBC en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 o 10,0 veces menos del porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto se mantiene durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto es un nivel de hemoglobina de entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el sujeto no requiere transfusión de RBC durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método elimina el requisito de la transfusión de RBC en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un porcentaje adicional de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un nivel adicional de hemoglobina en el sujeto 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según tinción con azul de Prusia. En ciertas realizaciones, los eritroblastos se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina en el sujeto se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertas realizaciones, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. Según la invención, el sujeto tiene SMD. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene anemia. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LMMC no proliferativa.
En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertas realizaciones, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7.
El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
En el presente documento se desvela un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (b) (i) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un corto periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%, o (ii) administrar un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto en una dosis farmacéuticamente eficaz de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg durante un largo periodo de tiempo si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es inferior a 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. El trastorno relacionado con la sangre se describe en la Sección 7.8. El sujeto se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, el corto periodo de tiempo de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto es 1, 2, 3, 4 o 5 meses. En ciertas realizaciones, el largo periodo de tiempo de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto es al menos 6, 12, 18 o 24 meses. En una realización específica, el corto periodo de tiempo de administración va seguido por niveles de prueba de sideroblastos en anillo al menos 0, 3, 4, 5, 6, 12, 28, 24 o 48 meses después de una última administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un porcentaje adicional de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un nivel adicional de hemoglobina en el sujeto 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar un porcentaje adicional de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método comprende además determinar el nivel de hemoglobina en el sujeto 6, 12, 18 y/o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método elimina el requisito de la transfusión de glóbulos rojos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el método elimina el requisito de la transfusión de glóbulos rojos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de que se administre la última dosis del inhibidor de la señalización de ActRII y sin administración adicional del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, los sideroblastos en anillo se identifican según tinción con azul de Prusia. En ciertas realizaciones, los eritroblastos se identifican según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina en el sujeto se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el nivel de hemoglobina en el sujeto se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. Según la invención, al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertas realizaciones, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. Según la invención, el sujeto tiene SMD. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene anemia. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LMMC no proliferativa.
En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertas realizaciones, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7.
El inhibidor de la señalización de ActRII se describe en la Sección 7.9. El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
En el presente documento se describen métodos de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII), y en donde el sujeto expresa SF3B1 que comprende una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, la una o más mutaciones están en una región no codificante. En ciertos ejemplos, la una o más mutaciones están en una región codificante. En ciertos ejemplos, SF3B1 es la proteína SF3B1. En ciertas realizaciones, SF3B1 es el gen que codifica SF3B1. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, la una o más mutaciones en SF3B1 son como se describen en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene anemia. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene SMD. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene LMMc no proliferativa. En ciertos ejemplos, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene trombocitopenia. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertos ejemplos, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertos ejemplos, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertos ejemplos, la composición se administra a una la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25). El sujeto en necesidad de aumentar los niveles de neutrófilos puede ser un sujeto con sideroblastos en anillo, anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, LMMC no proliferativa y/o SMD.
7.3.1 Marcadores genéticos
En el presente documento se desvelan métodos de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII), y en donde el sujeto expresa SF3B1 que comprende una o más mutaciones. En ciertos ejemplos, la una o más mutaciones están en una la una o más mutaciones están en una región no codificante. En ciertos ejemplos, la una o más mutaciones están en una región codificante. En ciertos ejemplos, SF3B1 es la proteína SF3B1. En ciertos ejemplos, SF3B1 es el gen que codifica SF3B1. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, la una o más mutaciones en SF3B1 son como se describen en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene anemia. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene SMD. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene LMMC no proliferativa. En ciertos ejemplos, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene trombocitopenia. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertos ejemplos, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertos ejemplos, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertos ejemplos, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25). El sujeto en necesidad de aumentar los niveles de neutrófilos puede ser un sujeto con sideroblastos en anillo, anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, LMMC no proliferativa y/o SMD.
7.4 MÉTODOS DE DOSIS AJUSTADA
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona un inhibidor de la señalización de ActRII para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con la sangre en un sujeto, en donde el método comprende: (a) determinar que al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo; (b) administrar al sujeto una dosis inicial de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg de un inhibidor de la señalización de ActRII; (c) después de un periodo de tiempo, determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y (d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII. Según la invención, el trastorno relacionado con la sangre es SMD. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, la dosis inicial es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, la dosis inicial se administra al sujeto inmediatamente después de la determinación del primer porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo o en como máximo 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses de la misma. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo entre administrar al sujeto la dosis inicial y determinar el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, o 12 meses. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada se administra al sujeto inmediatamente después de la determinación del segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo o en como máximo 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses o 12 meses de la misma. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es menos de la dosis inicial si el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. En ciertas realizaciones, el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 15%. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada no se administra al sujeto si el segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o 1%. En ciertas realizaciones, el método elimina el requisito de la transfusión de glóbulos rojos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertas realizaciones, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene anemia. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene LMMC no proliferativa. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis ajustada como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertas realizaciones, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
En el presente documento se desvela un método de promoción de la eritropoyesis en un sujeto que tiene un trastorno relacionado con la sangre, comprendiendo el método: (a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; (b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto durante un primer periodo de tiempo; y (c) después del primer periodo de tiempo, si el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en la etapa (a) habían estado por encima de 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20%, reducir la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII administrada al sujeto, reducir la frecuencia de administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto, o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) reducir (por ejemplo, reducir la dosis o reducir la frecuencia) o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza, por ejemplo, si el parámetro hemático en el sujeto es al menos al nivel del parámetro hemático en una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es la población de referencia como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el método comprende además (i) monitorizar un parámetro hemático en el sujeto durante el primer periodo de tiempo; y (ii) reducir (por ejemplo, reducir la dosis o reducir la frecuencia) o interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto si el parámetro hemático en el sujeto se normaliza, por ejemplo, si el parámetro hemático en el sujeto mejora en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or 100% en comparación con el parámetro hemático en el sujeto un segundo periodo de tiempo, en donde el segundo periodo de tiempo es un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el primer periodo de tiempo es al menos 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, o 1 año. En ciertos ejemplos, el segundo periodo de tiempo es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático es los niveles de hemoglobina. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático es el hematocrito. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático es el número de eritrocitos. En ciertos ejemplos, el parámetro hemático es el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, la dosis reducida del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la frecuencia reducida de administración del inhibidor de la señalización de ActRII es una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis es una dosis ajustada como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertos ejemplos, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
7.5 MÉTODOS DE AUMENTO DE LOS NIVELES DE NEUTRÓFILOS
En el presente documento se desvelan métodos para aumentar el nivel de neutrófilos en un sujeto en necesidad de aumentar el nivel de neutrófilos, que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII). En ciertos ejemplos, los niveles de neutrófilos son cifras absolutas de neutrófilos. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta en al menos 0,1 x 109 por litro, 0,5 x 109 por litro, 1,0 x 109 por litro, 5 x 109 por litro, 1,0 x 1010 por litro, 5 x 1010 por litro, o 1,0 x 1011 en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta en al menos 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta en como máximo 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3.5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta durante al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 meses después de la administración al sujeto de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta durante al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 meses después de que se haya terminado la administración de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto. Véase, por lo tanto, la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos se mide como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, la cifra absoluta de neutrófilos se mide como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene anemia. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene SMD. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene LMMC no proliferativa. En ciertos ejemplos, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene trombocitopenia. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertos ejemplos, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertos ejemplos, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertos ejemplos, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25). El sujeto en necesidad de aumentar los niveles de neutrófilos puede ser un sujeto con sideroblastos en anillo, anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, LMMC no proliferativa y/o SMD.
7.6 MÉTODOS DE AUMENTO DE LOS NIVELES DE PLAQUETAS
En el presente documento se desvelan métodos de aumento del nivel de plaquetas en un sujeto en necesidad de aumentar el nivel de plaquetas, que comprende administrar al sujeto una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII). En ciertos ejemplos, el nivel de plaquetas en el sujeto aumenta en al menos 1 x 1010 por litro, 3 x 1010 por litro, 5 x 1010 por litro, 1 x 1011 por litro, 5 x 1011 por litro, o al menos 1 x 1012 por litro en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de plaquetas en el sujeto aumenta en al menos 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de plaquetas en el sujeto aumenta en como máximo 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertos ejemplos, el nivel de plaquetas en el sujeto aumenta durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses después de la administración al sujeto de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertos ejemplos, el nivel de neutrófilos en el sujeto aumenta durante al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 meses después de que se haya terminado la administración de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto. Véase, por lo tanto, la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, el nivel de plaquetas se mide como se describe en la Sección 7.10.
En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto como se describe en la Sección 7.8. En ciertos ejemplos, al menos 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles de hemoglobina de menos de 11 g/dl. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene niveles reducidos de hemoglobina en comparación con una población de referencia. En ciertos ejemplos, la población de referencia es como se describe en la Sección 7.10. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene anemia. En ciertos ejemplos, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene SMD. En ciertos ejemplos, el sujeto tiene LMMC no proliferativa. En ciertos ejemplos, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene neutropenia.
En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz se administra como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis inicial. En ciertos ejemplos, la dosis inicial se administra según un método como se describe en la Sección 7.4. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz es una dosis ajustada. En ciertos ejemplos, la dosis ajustada se administra según un método como se describe en la Sección 7.4.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra como una composición como se describe en la Sección 7.11. En ciertos ejemplos, la composición se administra a una frecuencia como se describe en la Sección 7.7. En ciertos ejemplos, la composición se administra como se describe en la Sección 7.7.
En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en la Sección 7.9. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIA. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIA se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRIIA-Fc, tal como ActRIIA-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:7). En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRIIB se administra por vía subcutánea una vez cada 21 días. En ciertos ejemplos, el inhibidor de la señalización de ActRII es un ActRII-Fc, tal como ActRIIB-hFc (por ejemplo, SEQ ID NO:25).
El sujeto en necesidad de aumentar los niveles de neutrófilos puede ser un sujeto con sideroblastos en anillo, anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, LMMC no proliferativa y/o SMD.
7.7 DOSIS
En el presente documento se proporciona un inhibidor de la señalización de ActRII para su uso en métodos para el tratamiento en un sujeto de SMD, en donde los métodos comprenden administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una dosis farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de la señalización de ActRII (véase, la Sección 7.9). El inhibidor de la señalización de ActRII puede ser un inhibidor de la señalización de ActRIIA como se expone en la Sección 7.9.1, o un inhibidor de la señalización de ActRIIB como se expone en la Sección 7.9.2. En ciertos ejemplos, un inhibidor de la señalización de ActRII es una combinación de un inhibidor de la señalización de ActRIIA y un inhibidor de la señalización de ActRIIB. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es SEQ ID NO:7. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es SEQ ID NO:25.
La dosis proporcionada en el presente documento se puede usar en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la sangre, tales como, por ejemplo, anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, SMD y/o LMMC no proliferativa. En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis farmacéuticamente eficaz.
En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para mejorar uno o más síntomas de la anemia. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para prevenir que empeore al menos un síntoma de la anemia. Los ejemplos no limitantes de anemia incluyen cansancio, pérdida de energía, latidos rápidos, disnea, cefaleas, dificultad para concentrarse, mareos, piel pálida, calambres en las piernas e insomnio.
En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para mejorar uno o más síntomas de LMMC no proliferativa. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para prevenir que empeoren uno o más síntomas de LMMC no proliferativa. Los ejemplos no limitantes de síntomas de LMMC incluyen esplenomegalia, hepatomegalia, anemia, cansancio, disnea, leucopenia, infecciones frecuentes, trombocitopenia, fácil aparición de hematomas o sangrado, fiebre, pérdida de peso, piel pálida y pérdida del apetito.
En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para mejorar uno o más síntomas de SMD. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis suficiente para prevenir que empeoren uno o más síntomas de SMD. Los ejemplos no limitantes de síntomas de SMD incluyen anemia, disnea, cansancio, piel pálida, leucopenia, infecciones frecuentes, neutropenia, trombocitopenia, fácil aparición de hematomas o sangrado, pérdida de peso, fiebre, pérdida de apetito, debilidad y dolor de huesos.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se administra en intervalos y cantidades suficientes para lograr concentraciones en suero de 0,2 microgramos/kg o mayores, por ejemplo, niveles en suero de 1 microgramo/kg o 2 microgramos/kg o mayores. Las pautas posológicas se pueden diseñar para alcanzar concentraciones en suero de entre 0,2 y 15 microgramos/kg, y opcionalmente entre 1 y 5 microgramos/kg. En seres humanos, los niveles en suero de 0,2 microgramos/kg se pueden lograr con una dosis única de 0,1 mg/kg o mayor y los niveles en suero de 1 microgramo/kg se pueden lograr con una dosis única de 0,3 mg/kg o mayor. La semivida en suero observada de la molécula es entre aproximadamente 20 y 30 días, sustancialmente más larga que la mayoría de las proteínas de fusión de Fc, y así se puede lograr un nivel en suero eficaz sostenido, por ejemplo, por administración de 0,2-0,4 mg/kg semanalmente o cada dos semanas, o se pueden usar dosis más altas con intervalos más largos entre administraciones. Por ejemplo, dosis de 1-3 mg/kg se podrían usar mensualmente o cada dos meses, y el efecto sobre el hueso puede ser suficientemente duradero de forma que la administración sea necesaria solo una vez cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 o más meses. Los niveles en suero del inhibidor de la señalización de ActRII se pueden medir mediante cualquier medio conocido por el experto. Por ejemplo, los anticuerpos contra el inhibidor de la señalización de ActRII se pueden usar para determinar niveles en suero del inhibidor de la señalización de ActRII usando, por ejemplo, un ELISA. En una realización específica, el método proporcionado en el presente documento también logra efectos significativos sobre la densidad ósea y la resistencia.
En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 1.25 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,75 mg/kg o aproximadamente 2,0 mg/kg. En ciertos ejemplos, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 1 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,3 mg/kg y 1,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,5 mg/kg y 1,5 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,75 mg/kg y 1,0 mg/kg, entre 1,0 mg/kg y 1,25 mg/kg, entre 1,25 mg/kg y 1,5 mg/kg, entre 1,5 mg/kg y 1,75 mg/kg, 0 entre 1,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis farmacéuticamente eficaz. Cuando se usa junto con una dosis proporcionada en el presente documento (por ejemplo, una dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII o una dosis de un segundo agente activo), la palabra "aproximadamente" se refiere a cualquier número dentro de 1,5 o 10% del número referenciado.
Según la invención, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis farmacéuticamente eficaz. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 1.25 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,75 mg/kg o aproximadamente 2,0 mg/kg. En ciertos ejemplos, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 1 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,3 mg/kg y 1,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,5 mg/kg y 1,5 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,75 mg/kg y 1,0 mg/kg, entre 1,0 mg/kg y 1,25 mg/kg, entre 1,25 mg/kg y 1.5 mg/kg, entre 1,5 mg/kg y 1,75 mg/kg, o entre 1,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII es una dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 1,25 mg/kg, aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 1,75 mg/kg o aproximadamente 2,0 mg/kg. En ciertos ejemplos, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 1 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,3 mg/kg y 1,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,5 mg/kg y 1,5 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,75 mg/kg y 1,0 mg/kg, entre 1,0 mg/kg y 1,25 mg/kg, entre 1,25 mg/kg y 1,5 mg/kg, entre 1.5 mg/kg y 1,75 mg/kg, o entre 1,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada tres semanas.
En ciertas realizaciones, la dosis es una dosis ajustada. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, aproximadamente 1,0 mg/kg, aproximadamente 1,25 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,75 mg/kg, aproximadamente 2,0 mg/kg o aproximadamente 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 1 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,3 mg/kg y 1,25 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,5 mg/kg y 1,5 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es entre 0,75 mg/kg y 1,0 mg/kg, entre 1,0 mg/kg y 1,25 mg/kg, entre 1,25 mg/kg y 1,5 mg/kg, entre 1,5 mg/kg y 1,75 mg/kg, o entre 1,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra (i) una vez cada 28 días; o (ii) una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada tres semanas.
En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es mayor que la dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 2,5 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg, o aproximadamente 35 mg superior a la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII, o aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg, aproximadamente 0,25 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,35 mg/kg, aproximadamente 0,4 mg/kg, o aproximadamente 0,5 mg/kg superior a la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra más frecuentemente que la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra cada 5, 10, 15, 20, 25, 28, 30, 35 o 40 días. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra cada 1 o 2 semanas.
En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es menos de la dosis inicial. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII es aproximadamente 2,5 mg, aproximadamente 5 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 15 mg, aproximadamente 20 mg o aproximadamente 35 mg menos de la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII, o aproximadamente 0,05 mg/kg, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,15 mg/kg, aproximadamente 0,25 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,35 mg/kg, aproximadamente 0,4 mg/kg o aproximadamente 0,5 mg/kg menos de la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra menos frecuentemente que la dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra cada 30, 35, 40, 42, 50, 60, 70, 80 o 90 días. En ciertas realizaciones, la dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII se administra cada 4, 5, 6, 7 u 8 semanas.
En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada 28 días o una vez cada 42 días. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada 21 días. En ciertas realizaciones el inhibidor de la señalización de ActRII es SEQ ID NO:7.
En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra por vía subcutánea. En ciertas realizaciones, la dosis del inhibidor de la señalización de ActRII se administra una vez cada 3 semanas. En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII es SEQ ID NO:25.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o al menos 100% en comparación con el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o como máximo 100% en comparación con el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de administrar al sujeto el inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de sideroblastos en anillo en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o al menos 100% en comparación con los niveles de sideroblastos en anillo en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de sideroblastos en anillo en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o como máximo 100% en comparación con el nivel de sideroblastos en anillo en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el nivel de sideroblastos en anillo en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir el nivel de sideroblastos en anillo en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, el nivel de sideroblastos en anillo en el sujeto se determina según un ensayo como se describe en la Sección 7.10.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o al menos 500% en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o como máximo 500% en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, o al menos 60% en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, , o como máximo 60% en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en al menos 0,5 g/dl, 1,0 g/dl, 1,1 g/dl, 1,3 g/dl, 1,5 g/dl, 1,8 g g/dl, 2,0 g/dl, 2,2 g/dl, 2,4 g/dl, 2,6 g/dl, 2,8 g/dl, 3,0 g/dl, 3.2 g/dl, 3,4 g/dl, 3,6 g/dl, 3,8 g/dl, 4,0 g/dl, 4,2 g/dl, 4,4 g/dl, o al menos 4,6 g/dl en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina por como máximo 0,5 g/dl, 1,0 g/dl, 1,1 g/dl, 1,3 g/dl, 1,5 g/dl, 1,8 g g/dl, 2,0 g/dl, 2,2 g/dl, 2,4 g/dl, 2,6 g/dl, 2,8 g/dl, 3,0 g/dl, 3.2 g/dl, 3,4 g/dl, 3,6 g/dl, 3,8 g/dl, 4,0 g/dl, 4,2 g/dl, 4,4 g/dl o como máximo 4,6 g/dl en comparación con el nivel de hemoglobina en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de hemoglobina en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de reticulocitos en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% en comparación con el nivel de reticulocitos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de reticulocitos en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o como máximo 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o como máximo 500% en comparación con el nivel de reticulocitos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de reticulocitos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de reticulocitos en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la dependencia de la transfusión de glóbulos rojos en el sujeto en comparación con la dependencia de la transfusión de glóbulos rojos un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la frecuencia de transfusiones de glóbulos rojos en el sujeto en comparación con la frecuencia de transfusiones de glóbulos rojos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir las transfusiones de glóbulos rojos en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o en al menos 100%. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir las transfusiones de glóbulos rojos en como máximo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,, o en como máximo 100%. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir las unidades de glóbulos rojos transfundidas en el sujeto en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 o 13 unidades en comparación con las unidades de glóbulos rojos transfundidas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la frecuencia de transfusiones de glóbulos rojos en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,, o en 100%. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la frecuencia de transfusiones de glóbulos rojos en como máximo 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%,, o en 100%. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para suprimir la necesidad de transfusión de glóbulos rojos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para suprimir la necesidad de transfusión de glóbulos rojos en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, una unidad de r Bc se refiere a aproximadamente 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 100-200 ml, 150-250 ml, 200-300 ml o 250-350 ml de RBC.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o al menos 100% en comparación con la carga de transfusión en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o como máximo 100% en comparación con la carga de transfusión en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto en al menos 33% en comparación con la carga de transfusión en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto en al menos 50% en comparación con la carga de transfusión en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la carga de transfusión en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o al menos 100% en comparación con la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o como máximo 100% en comparación con la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir la terapia de quelación del hierro (por ejemplo, dosis o frecuencia) en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2.0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de ferritina en suero en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, o al menos 50% en comparación con los niveles de ferritina en suero en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de ferritina en suero en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% en comparación con los niveles de ferritina en suero en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de ferritina en suero en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para reducir los niveles de ferritina en suero en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para producir una mejora hemática eritroide en el sujeto en al menos 1,5 g/dl, 1,8 g/dl, 2,0 g/dl, 2,2 g/dl, 2,4 g/dl, 2,6 g/dl, 2,8 g/dl, 3,0 g/dl, 3,2 g/dl, 3,4 g/dl, 3,6 g/dl, 3,8 g/dl, o al menos 4.0 g/dl en comparación con la mejora hemática eritroide en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para producir una mejora hemática eritroide en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para producir una mejora hemática eritroide en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la mejora hemática eritroide para una paciente de baja carga de transfusión es un aumento en la concentración de hemoglobina en el paciente de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. En ciertas realizaciones, la mejora hemática eritroide para un paciente de alta carga de transfusión es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de neutrófilos en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o al menos 500% en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de neutrófilos en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, , o como máximo 500% en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de neutrófilos en al menos 0,1 x 109 por litro, 0,5 x 109 por litro, 1,0 x 109 por litro, 5 x 109 por litro, 1,0 x 1010 por litro, 5 x 1010 por litro, o 1,0 x 1011 por litro en comparación con el nivel de neutrófilos en el sujeto un periodo de tiempo antes de administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de neutrófilos en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de neutrófilos en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de plaquetas en el sujeto en al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, o como máximo 500% en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de plaquetas en el sujeto en como máximo 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400%, , o como máximo 500% en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de plaquetas en al menos 1 x 1010 por litro, 3 x 1010 por litro, 5 x 1010 por litro, 1 x 1011 por litro, 5 x 1011 por litro, o al menos 1 x 1012 por litro en comparación con el nivel de plaquetas en el sujeto un periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, el periodo de tiempo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII es 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de plaquetas en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 o 48 meses después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII administrada a un sujeto según los métodos proporcionados en el presente documento es suficiente para aumentar el nivel de plaquetas en el sujeto indefinidamente después de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg. En ciertas realizaciones, la dosis es entre 0,75 mg/kg y 2,0 mg/kg.
Cuando se usa junto con una dosis proporcionada en el presente documento (por ejemplo, una dosis de un inhibidor de la señalización de ActRII o una dosis de un segundo agente activo), la palabra "aproximadamente" se refiere a cualquier número dentro de 1, 5 o 10% del número referenciado.
En ciertas realizaciones, un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en el presente documento se administra por vía subcutánea o por vía intravenosa. En ciertas realizaciones, un inhibidor de la señalización de ActRII como se describe en el presente documento se administra por vía subcutánea una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, ActRIIA-hFC (SEQ ID NO: 7; también denominado sotatercept) se administra a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento por vía subcutánea una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, ActRIIB-hFC (SEQ ID NO: 25; también denominado luspatercept) se administra a un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento por vía subcutánea una vez cada tres semanas.
7.8 POBLACIONES DE PACIENTES
Los sujetos tratados según los métodos descritos en el presente documento pueden ser cualquier mamífero, tales como roedores y primates, y en una realización preferida, seres humanos. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, SMD y/o LMMC no proliferativa en cualquier mamífero, tal como roedores y primates, y en una realización preferida, en sujetos humanos. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para aumentar los niveles de neutrófilos en cualquier mamífero, tal como roedores y primates, y en una realización preferida, en sujetos humanos. En ciertas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento se pueden usar para aumentar los niveles de plaquetas en cualquier mamífero, tal como roedores y primates, y en una realización preferida, en sujetos humanos.
Según la invención, el porcentaje de eritroblastos en un sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20%. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento que son sideroblastos en anillo es al menos 15%. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento que son sideroblastos en anillo es aproximadamente 15%. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento que son sideroblastos en anillo es aproximadamente 20%. En ciertas realizaciones, el porcentaje de eritroblastos en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento que son sideroblastos en anillo es aproximadamente 17%. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una relación entre sideroblastos en anillo y eritroblastos normales de al menos 1:10, al menos 1:7, o al menos 1:5.
En ciertos ejemplos, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene un trastorno relacionado con la sangre. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es anemia que requiere transfusión. Según la invención, el trastorno relacionado con la sangre es SMD. En ciertos ejemplos, el trastorno relacionado con la sangre es LMMC no proliferativa.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con anemia. En algunos aspectos, los sujetos anémicos tienen un nivel de Hb inferior o igual a 9,0 g/dl. En algunos aspectos, los sujetos anémicos requieren 2 o más unidades de transfusiones de RBC en los 84 días antes del tratamiento según los métodos proporcionados en el presente documento. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una alta carga de transfusión (HTB). Los HTB de sujetos requieren al menos 4 unidades de transfusiones de RBC en 56 días. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene una baja carga de transfusión (LTB). Los sujetos de LTB requieren menos de 4 unidades de transfusiones de RBC en 56 días. En ciertas realizaciones, el sujeto es un sujeto que requiere transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una anemia sideroblástica, tal como, por ejemplo, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X, anemia sideroblástica autosómica recesiva refractaria a la piridoxina, anemia sideroblástica ligada al cromosoma X y ataxia espinocerebelosa, miopatía, acidosis láctica y anemia sideroblástica, miopatía, acidosis láctica y anemia sideroblástica, anemia megaloblástica sensible a la tiamina, síndrome médula ósea-páncreas de Pearson, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con sideroblastos en anillo y marcada trombocitosis, y anemias sideroblásticas inducidas por etanol e inducidas por fármacos. En ciertos ejemplos, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con anemia y al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con SMD definido por IPSS. En ciertos ejemplos, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con SMD definido por IPSS y al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo.
IPSS se refiere al Sistema Internacional de Puntaje Pronóstico, que se utiliza en la evaluación del pronóstico en síndromes mielodisplásicos. Véase, por ejemplo, Greenberg et al., Blood, 1997; 89(6):2079-2088, y Erratum in Blood, 1998; 91:1100. El IPSS utiliza un sistema de puntos de criterios para caracterizar los desenlaces de pacientes con síndrome mielodisplásico como riesgo bajo (0 puntos; mediana de la supervivencia de 5,7 años), intermedio 1 (0,5-1 punto; mediana de la supervivencia de 3,5 años); riesgo intermedio 2 (1,5-2,0 puntos; mediana de la supervivencia de 1,2 años); o riesgo alto (2,5-3,5 puntos; mediana de la supervivencia de 0,4 años). El sistema de puntos evalúa (i) el porcentaje de blastos de la médula ósea en el sujeto; (ii) el cariotipo del sujeto; y (iii) y citopenias en el sujeto (definidas como concentración de hemoglobina de menos del 10 g/dl, cifra absoluta de neutrófilos de menos del 1.800/μl y número de plaquetas de menos del 100.000/ μl).
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con SMD definido por IPSS-R. En ciertos ejemplos, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con SMD definido por IPSS-R y al menos 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo.
IPSS-R se refiere al Sistema International de Puntaje pronóstico-Revisado, que se utiliza en la evaluación del pronóstico en síndromes mielodisplásicos. Véase, por ejemplo, Greenberg et al., Blood, 2012; 120(12):2454-2465, y Erratum in Blood, 1998; 91:1100. El IPSS-R utiliza sistema de puntos de criterios para caracterizar los desenlaces de pacientes con síndrome mielodisplásico como riesgo muy bajo (inferior o igual a 1,5 puntos; mediana de la supervivencia de 8,8 años), riesgo bajo (superior a 1,5 puntos, inferior o igual a 3 puntos; mediana de la supervivencia de 5,3 años); riesgo intermedio (superior a 3 puntos, inferior o igual a 4,5 puntos; mediana de la supervivencia de 3 años); riesgo alto (superior a 4,5 puntos, inferior o igual a 6 puntos; mediana de la supervivencia de 1,6 años); o muy alto (superior a 6 puntos; mediana de la supervivencia de 0,8 años). El punto sistema evalúa, entre otros, (i) el porcentaje de blastos de la médula ósea en el sujeto; (ii) el cariotipo del sujeto; y (iii) y citopenias en el sujeto (definidas como la concentración de hemoglobina de menos de 10 g/dl, cifra absoluta de neutrófilos de menos de 1.800/|ul y número de plaquetas de menos del 100.000/ |ul).
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con LMMC no proliferativa. En ciertos ejemplos, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha sido diagnosticado con LMMC no proliferativa y al menos 10%, 11 %, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o al menos 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo.
Según la invención, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene SMD. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo bajo definido por IPSS. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo intermedio-1 definido por IPSS. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo intermedio-2 definido por IPSS. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo alto definido por IPSS. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo muy bajo definido por IPSS-R. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo bajo definido por IPSS-R. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo intermedio definido por IPSS-R. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo alto definido por IPSS-R. En ciertas realizaciones, el SMD es SMD de riesgo muy alto definido por IPSS-R. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD y (ii) tiene RARS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD y (ii) tiene RCMD-RS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, y (iii) tiene RCMD-RS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, y (ii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, y (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RCMD-RS, y (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-RS, y (iv) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RCMD-RS, y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-RS, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RCMD-RS, (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene SMD, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-Rs , (iv) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (v) expresa SF3B1 con una o más mutaciones.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene LMMC no proliferativa. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa y (ii) tiene RARS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa y (ii) tiene RCMD-RS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, y (iii) tiene RCMD-RS. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, y (ii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, y (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RCMD-RS, y (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-RS, y (iv) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, y (ii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARs , y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RCMD-RS, y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-RS, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iii) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RCMD-RS, (iii) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (iv) expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento (i) tiene LMMC no proliferativa, (ii) tiene RARS, (iii) tiene RCMD-RS, (iv) al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo, y (v) expresa SF3B1 con una o más mutaciones.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa un gen con una mutación asociados a eritropoyesis ineficaz. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa uno o más genes del factor de corte y empalme que comprenden una o más mutaciones. En una realización específica, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa SF3B1 con una o más mutaciones. En ciertas realizaciones, la una o más mutaciones están en una región no codificante. En ciertas realizaciones, SF3B1 es el gen que codifica SB3B1. En ciertas realizaciones, la una o más mutaciones están en una región codificante. En ciertas realizaciones, SF3B1 es la proteína SF3B1. En ciertas realizaciones, la una o más mutaciones en la proteína SF3B1 se seleccionan del grupo que consiste en E622D, R625C, H662Q, H662D, K66N, K666T, K666Q, K666E, A672D, K700E, I704N. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación E622D. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación R625C. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación H662Q. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación H662D. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación K66N. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación K666T. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación K666Q. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación K666E. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación A672D. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa SF3B1 con la mutación K700E. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa la proteína SF3B1 con la mutación I704N. En una realización específica, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa SRSF2 con una o más mutaciones. En una realización específica, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa DNMT3A con una o más mutaciones. En una realización específica, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa TET2 con una o más mutaciones. En una realización específica, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento expresa SETBP1 con una o más mutaciones.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene trombocitopenia. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene menos del 1 x 1011 plaquetas por litro. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene neutropenia. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una cifra absoluta de neutrófilos de menos del 1 x 109 por litro.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene menos de 13.000 glóbulos blancos por gl, menos de 12.000 glóbulos blancos por gl, menos de 11.000 glóbulos blancos por gl, menos de 10.000 glóbulos blancos por gl, menos de 7,500 glóbulos blancos por gl o menos de 500 glóbulos blancos por gl.
En ciertas realizaciones, los niveles de hemoglobina en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento son menos de 10 g/dl, 9 g/dl, 8 g/dl o 7 g/dl. En ciertas realizaciones, los niveles de hemoglobina en un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento son entre 7 g/dl y 7,5 g/dl, entre 7,5 g/dl y 8 g/dl, entre 8 g/dl y 8,5 g/dl, entre 8,5 g/dl y 9,0 g/dl, entre 9,0 g/dl y 9,5 g/dl, o entre 9,5 g/dl y 10,0 g/dl.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una baja carga de transfusión. En ciertas realizaciones, el sujeto con una baja carga de transfusión tratado según los métodos proporcionados en el presente documento requiere como máximo 0, 1,2 o 3 unidades de glóbulos rojos cada 8 semanas.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una alta carga de transfusión. En ciertas realizaciones, el sujeto con una alta carga de transfusión tratado según los métodos proporcionados en el presente documento requiere al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 unidades de glóbulos rojos cada 8 semanas.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento no tiene respuesta, una pérdida de respuesta, o baja probabilidad de respuesta a uno o más ESA.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha recibido tratamiento anterior con uno o más ESA o está actualmente recibiendo tratamiento con uno o más ESA. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha recibido tratamiento anterior con agentes hipometilantes. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento ha recibido tratamiento anterior con lenalidomida. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento no ha recibido tratamiento con azacitidina, decitabina, ESA, G-CSF, GM-CSG o lenalidomida. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento no responde al tratamiento con uno o más ESA. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es insensible al tratamiento con uno o más ESA. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento se vuelve insensible al tratamiento con uno o más ESA. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es insensible al tratamiento con ESA previo. En ciertas realizaciones, un sujeto que es insensible al tratamiento con ESA previo tiene una no respuesta o respuesta documentada que ya no se mantiene al régimen que contiene ESA previo, ya sea como un agente individual o combinación (por ejemplo, con G-CSF); el régimen de ESA debe haber sido o (a) eritropoyetina humana recombinante superior a 40.000 UI/semana durante al menos 8 dosis o equivalente, o (b) darbepoetina alfa superior a 500 μg una vez cada tres semanas durante al menos 4 dosis o equivalente. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento es intolerante al tratamiento con ESA previo. En ciertas realizaciones, un sujeto que es intolerante al tratamiento con ESA previo tiene interrupción documentada del régimen que contiene ESA previo, ya sea como agente individual o combinación (por ejemplo, con G-CSF), en cualquier momento después de la introducción debido a intolerancia o un acontecimiento adverso. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento no cumple los requisitos de ESA. En ciertas realizaciones, un sujeto que incumple los requisitos de ESA tiene una baja probabilidad de respuesta a ESA basándose en un nivel de eritropoyetina endógena en suero superior a 200 U/l para sujetos no previamente tratados con ESA.
En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos descritos aquí puede ser de cualquier edad. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene menos de 18 años. En una realización específica, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene menos de 13 años. En otra realización específica, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene menos de 12, menos de 11, menos de 10, menos de 9, menos de 8, menos de 7, menos de 6 o menos de 5 años. En otra realización específica, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene 1 -3 años, 3-5 años, 5-7 años, 7­ 9 años, 9-11 años, 11-13 años, 13-15 años, 15-20 años, 20-25 años, 25-30 años o más de 30 años. En otra realización específica, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene 30-35 años, 35-40 años, 40-45 años, 45-50 años, 50-55 años, 55-60 años o más de 60 años. En otra realización específica, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene 60-65 años, 65-70 años, 70-75 años, 75-80 años o más de 80 años.
Según la invención, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene SMD. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene SMD y cromosoma 5q intacto. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene SMD, cromosoma 5q intacto y no tiene fracaso terapéutico documentado con lenalidomida. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene SMD, cromosoma 5q intacto y fracaso terapéutico documentado con lenalidomida. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos descritos en el presente documento tiene SMD con deleción del cromosoma 5q. SMD con deleción del cromosoma 5q comprende una deleción del brazo largo del cromosoma 5 y se caracteriza, entre otras cosas, por anemia macrocítica con macrocitos ovalados, números de leucocitos de normales a ligeramente reducidos, números de plaquetas de normales a elevados y menos de 5% de blastos en la médula ósea y la sangre. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene SMD con deleción del cromosoma 5q y no tiene fracaso terapéutico documentado con lenalidomida. En ciertas realizaciones, el sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene SMD con deleción del cromosoma 5q y fracaso terapéutico documentado con lenalidomida. En ciertas realizaciones, el fracaso terapéutico con lenalidomida comprende pérdida de respuesta a lenalidomida, ninguna respuesta a lenalidomida después de 4 meses de tratamiento con lenalidomida, intolerancia al tratamiento con lenalidomida, o citopenia que impide el tratamiento con lenalidomida.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene menos de 5% de blastos en la médula ósea y sangre.
En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una concentración de EPO en suero superior a 500 mUI/ml. En ciertas realizaciones, un sujeto tratado según los métodos proporcionados en el presente documento tiene una concentración de EPO en suero superior a 200 mUI/ml.
7.9 INHIBIDORES DE LA SEÑALIZACIÓN DE RECEPTORES ActRII
Los inhibidores de los receptores ActRII incluyen inhibidores de la señalización de ActRIIA e inhibidores de la señalización de ActRIIB (véase más adelante). En ciertos ejemplos, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII es específico de ActRIIA. En otros ejemplos, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII es específico de ActRIIB. En ciertos ejemplos, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII inhibe preferentemente ActRIIA. En otros ejemplos, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII inhibe preferentemente ActRIIB. En ciertos ejemplos, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII inhibe tanto ActRIIA como ActRIIB.
Los inhibidores de la señalización de receptores ActRII puede ser polipéptidos que comprenden dominios de unión a activina de ActRII. Sin desear quedar ligado a teoría, dichos polipéptidos que comprenden dominios de unión a activina secuestran activina y así previenen la señalización de la activina. Estos polipéptidos que comprenden dominios de unión a activina pueden comprender toda o una porción del dominio extracelular de un receptor de ActRII (es decir, toda o una porción del dominio extracelular de ActRIIA o toda o una porción del dominio extracelular de ActRIIB). En realizaciones específicas, el dominio extracelular de un receptor de ActRII es soluble.
Los polipéptidos que comprenden dominios de unión a activina se pueden unir a una porción Fc de un anticuerpo (es decir, se genera un conjugado que comprende un polipéptido que comprende dominios de unión a activina de un receptor ActRII y una porción Fc de un anticuerpo). Sin desear quedar ligado a teoría, la porción de anticuerpo confiere elevada estabilidad al conjugado. En ciertas realizaciones, el dominio de unión a activina se une a una porción Fc de un anticuerpo por un conector, por ejemplo, un conector peptídico.
Los inhibidores de la señalización de receptores ActRII usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden moléculas que inhiben ActRIIA y/o ActRIIB, directamente o indirectamente, ya sea extracelularmente o intracelularmente. En algunas realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA y/o ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento inhiben ActRIIA y/o ActRIIB por interacciones con el (los) receptor(es) en sí. En otras realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA y/o ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento inhiben ActRIIA y/o ActRIIB por interacciones con un ligando de ActRIIA y/o ActRIIB, por ejemplo, activina.
7.9.1 INHIBIDORES DE LA SEÑALIZACIÓN DE ActRIIA
Como se usa en el presente documento, el término "ActRIIA" se refiere a una familia de proteínas de tipo IIa de receptores de activina (ActRIIA) de cualquier especie y variante derivada de dichas proteínas ActRIIA por mutagénesis u otra modificación. La referencia a ActRIIA en el presente documento se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas actualmente identificadas. Los miembros de la familia de ActRIIA son, en general, proteínas transmembranarias, compuestas de un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa predicha.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIA que se van a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, polipéptidos ActRIIA solubles que se unen a activina; anticuerpos que se unen a activina (particularmente las subunidades A o B de activina, también denominadas pA o pB) y alteran la unión a ActRIIA; anticuerpos que se unen a ActRIIA y alteran la unión a activina; proteínas no de anticuerpo seleccionadas para unión a activina o ActRIIA (véanse por ejemplo, los documentos de patente WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939, y US 2005/0238646, para ejemplos de dichas proteínas y métodos de diseño y selección de los mismos); y péptidos aleatorizados seleccionados para unión a activina o ActRIIA, que se pueden conjugar con un dominio Fc.
En ciertas realizaciones, dos o más proteínas diferentes (u otro restos) con actividad de unión a activina o ActRIIA, especialmente ligantes de activina que bloquean los sitios de unión de tipo I (por ejemplo, un receptor de activina de tipo I soluble) y tipo II (por ejemplo, un receptor de activina de tipo II soluble), respectivamente, se pueden unir juntas para crear una molécula de unión bifuncional o multifuncional que inhibe ActRIIA y así se puede usar en las composiciones y métodos descritos e incluidos en el presente documento. En ciertas realizaciones, los antagonistas del eje de señalización de activina-ActRIIA que inhiben ActRIIA incluyen aptámeros de ácido nucleico, moléculas pequeñas e incluyen otros agentes que se usan en las composiciones y métodos descritos en el presente documento.
(a) Inhibidores de la señalización de ActRIIA que comprenden polipéptidos ActRIIA
El término "polipéptido ActRIIA" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido que exista de forma natural de un miembro de la familia de ActRIIA, así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas de peptidomimético) que retienen una actividad útil. Por ejemplo, los polipéptidos ActRIIA incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier ActRIIA conocido que tienen una secuencia al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido ActRIIA, y opcionalmente al menos 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIA puede unirse a e inhibir la función de una proteína ActRIIA y/o activina. Un polipéptido ActRIIB se puede seleccionar por su capacidad para promover el crecimiento óseo y la mineralización ósea. Los ejemplos de polipéptidos ActRIIA incluyen polipéptido precursor de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 1) y polipéptidos ActRIIA solubles humanos (por ejemplo, SEQ Id NO: 2, 3, 7 y 12). Con respecto al polipéptido precursor de ActRIIA cuya secuencia de aminoácidos se representa en SEQ ID NO:1, el péptido señalizador del polipéptido precursor de ActRIIA humano situado en las posiciones de aminoácidos 1 a 20; el dominio extracelular se localiza en las posiciones de aminoácidos 21 a 135 y los sitios de glucosilación unidos en N del polipéptido precursor de ActRIIA humano (SEQ ID NO: 1) se localizan en las posiciones de aminoácidos 43 y 56 de SEQ ID NO:1. La secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido precursor de ActRIIB humano de SEQ ID NO:1 se desvela como SEQ ID NO:4 (nucleótidos 164-1705 de la entrada de Genbank NM_001616). La secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido ActRIIA soluble humano de SEQ ID NO:2 se desvela como SEQ ID NO:5. Véase la Tabla 21 para una descripción de las secuencias.
En realizaciones específicas, los polipéptidos ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son polipéptidos ActRIIA solubles. Un dominio extracelular de una proteína ActRIIA puede unirse a activina y, en general, es soluble, y así se puede denominar un polipéptido ActRIIA soluble de unión a activina. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "polipéptido ActRIIA soluble" se refiere, en general, a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de una proteína ActRIIA, que incluye cualquier dominio extracelular que existe de forma natural de una proteína ActRIIA, así como cualquier variante de la misma (incluyendo mutantes, fragmentos y formas de peptidomimético). Los polipéptidos ActRIIA solubles pueden unirse a activina; sin embargo, la proteína ActRIIA natural no presenta selectividad significativa en la unión a activina frente a GDF8/11. A las proteínas ActRIIA nativas o alteradas se les puede dar especificidad añadida por la activina acoplándolas con un segundo agente ligante selectivo por activina. Los ejemplos de polipéptidos ActRIIA solubles de unión a activina incluyen los polipéptidos solubles ilustrados en SEQ ID NO: 2, 3, 7, 12 y 13. Otros ejemplos de polipéptidos ActRIIA solubles de unión a activina comprenden una secuencia señal, además del dominio extracelular de una proteína ActRIIA, por ejemplo, la secuencia conductora de la melitina de abeja melífera (SEQ ID NO: 8), el conductor del activador tisular del plasminógeno (TPA) (SEQ ID NO: 9) o el conductor nativo de ActRIIA (SEQ ID NO: 10). El polipéptido ActRIIA-hFc ilustrado en SEQ ID NO:13 usa un conductor de TPA.
En ciertas realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden un conjugado/proteína de fusión que comprende un dominio de unión a activina de ActRIIA unido a una porción Fc de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, el dominio de unión a activina se une a una porción Fc de un anticuerpo por un conector, por ejemplo, un conector peptídico. Opcionalmente, el dominio Fc tiene una o más mutaciones en restos tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, una mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida para unirse al receptor de Fcy con respecto a un dominio Fc no mutante. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, una mutación de Asn-434) tiene un aumento de la capacidad para unirse al receptor de Fc relacionado con la clase I del MHC (FcRN) con respecto a un dominio Fc no mutante. Las proteínas de fusión a modo de ejemplo que comprenden un dominio extracelular soluble de ActRIIA fusionado con un dominio Fc se exponen en SEQ ID NO:6, 7, 12 y 13.
En algunos ejemplos, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden el dominio extracelular de ActRIIA, o una porción del mismo, unido a una porción Fc de un anticuerpo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:6, 7, 12 y 13. En otro ejemplo, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden el dominio extracelular de ActRIIA, o una porción del mismo, unido a una porción Fc de un anticuerpo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:6, 7, 12, y 13.
En ciertas realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden una forma truncada de un dominio extracelular de ActRIIA. La truncación puede ser en el extremo carboxi y/o el extremo amino del polipéptido ActRIIA. En ciertas realizaciones, la truncación puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, or 25 aminoácidos de longitud con respecto al dominio extracelular del polipéptido ActRIIA maduro. En ciertas realizaciones, la truncación puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, or 25 aminoácidos aminoterminales del dominio extracelular del polipéptido ActRIIA maduro. En ciertas realizaciones, la truncación puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 aminoácidos carboxiterminales del dominio extracelular del polipéptido ActRIIA maduro Por ejemplo, formas truncadas de ActRIIA incluyen polipéptidos con aminoácidos 20-119; 20-128; 20­ 129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21 -131; 22-131; 23-131; 24-131; y 25-131, en donde las posiciones de aminoácidos se refieren a las posiciones de aminoácidos en SEQ ID NO:1.
En ciertas realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden un dominio extracelular de ActRIIA con una o más sustituciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, los inhibidores de la señalización de ActRIIA usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento comprenden una forma truncada de un dominio extracelular de ActRIIA que también lleva una sustitución de aminoácidos.
En una realización específica, el inhibidor de la señalización de ActRIIA que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es una proteína de fusión entre el dominio extracelular del receptor ActRIIA humano y la porción Fc de IgG1. En otra realización específica, el inhibidor de la señalización de ActRIIA que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es una proteína de fusión entre un dominio extracelular truncado del receptor ActRIIA humano y la porción Fc de IgG1. En otra realización específica, el inhibidor de la señalización de ActRIIA que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es una proteína de fusión entre un dominio extracelular truncado del receptor ActRIIA humano y la porción Fc de IgG1, en donde el dominio extracelular truncado del receptor ActRIIA humano posee una o más sustituciones de aminoácidos.
Los fragmentos funcionalmente activos de polipéptidos ActRIIA se pueden obtener, por ejemplo, cribando polipéptidos producidos recombinantemente a partir del fragmento del ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido ActRIIA. Además, los fragmentos pueden ser sintetizados químicamente usando técnicas conocidas en la técnica, tales como química de f-Moc o t-Boc en fase sólida convencional de Merrifield. Los fragmentos se pueden producir (recombinantemente o por síntesis química) y probar para identificar los fragmentos de peptidilo que pueden servir de antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIA o señalización mediada por activina.
Además, se pueden obtener variantes funcionalmente activas de polipéptidos ActRIIA, por ejemplo, por cribado de bibliotecas de polipéptidos modificados recombinantemente producidos a partir de los ácidos nucleicos mutagenizados correspondientes que codifican un polipéptido ActRIIA. Las variantes se pueden producir y probar para identificar aquellas que pueden servir de antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIA o señalización mediada por activina. En ciertos ejemplos, una variante funcional de los polipéptidos ActRIIA comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o 3. En ciertos casos, la variante funcional tiene una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 o 3.
Se pueden generar variantes funcionales, por ejemplo, modificando la estructura de un polipéptido ActRIIA para fines tales como potenciar la eficacia terapéutica, o estabilidad (por ejemplo, vida útil ex vivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Dichos polipéptidos ActRIIA modificados, cuando se seleccionan para retener la unión de activina, se consideran equivalentes funcionales de los polipéptidos ActRIIA que existen de forma natural. Los polipéptidos ActRIIA modificados también se pueden producir, por ejemplo, por sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado (por ejemplo, mutaciones conservativas), no tendrán un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ActRIIA da como resultado un homólogo funcional, se puede determinar fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido ActRIIA de variante para producir una respuesta en células en un modo similar al polipéptido ActRIIA no mutante.
Mutaciones específicas de los polipéptidos ActRIIA pueden alterar la glucosilación del polipéptido. Dichas mutaciones se pueden seleccionar para introducir o eliminar uno o más sitios de glucosilación, tales como sitios de glucosilación unidos a O o unidos a N. Los sitios de reconocimiento de la glucosilación asociada a asparagina comprenden, en general, una secuencia de tripéptidos, asparagina-X-treonina (o asparaginas-X-serina) (donde "X" es cualquier aminoácido) que es reconocida específicamente por enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido ActRIIA no mutante (para sitios de glucosilación unidos a O). Una variedad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de la glucosilación (y/o deleción de aminoácidos en la segunda posición) produce la no glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Otro medio de aumentar el número de restos de hidrato de carbono en un polipéptido ActRIIA es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con el polipéptido ActRIIA. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) se pueden unir a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) restos aromáticos, tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento de patente WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp.
259-306. La retirada de uno o más restos de hidrato de carbono presentes en un polipéptido ActRIIA se puede llevar a cabo química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición del polipéptido ActRIIA al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la escisión de la mayoría o todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacta la secuencia de aminoácidos. La desglucosilación química se describe además por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en polipéptidos ActRIIA se puede lograr usando una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. La secuencia de un polipéptido ActRIIA se puede ajustar, según convenga, dependiendo del tipo de sistema de expresión usado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto y vegetales pueden todas introducir patrones de glucosilación diferentes que se pueden afectar por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, las proteínas ActRIIA para su uso en seres humanos se expresarán en una estirpe celular de mamífero que proporciona glucosilación adecuada, tal como estirpes celulares HEK293 o CHO, aunque se espera que también sean útiles otros sistemas de expresión, tales como otras estirpes celulares de expresión de mamífero, estirpes celulares de levadura con enzimas de glucosilación manipuladas y células de insecto.
En el presente documento se proporcionan además métodos de generación de mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido ActRIIA, así como mutantes de truncación; las agrupaciones de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de variantes funcionales. El fin del cribado de dichas bibliotecas combinatorias puede ser generar, por ejemplo, variantes de polipéptidos ActRIIA que pueden actuar o de agonistas o antagonista, o alternativamente, que poseen actividades novedosas en conjunto. A continuación se proporciona una variedad de ensayos de cribado, y dichos ensayos se pueden usar para evaluar variantes. Por ejemplo, se puede cribar una variante de polipéptido ActRIIA para su capacidad para unirse a un ligando de ActRIIA, para prevenir la unión de un ligando de ActRIIA a un polipéptido ActRIIA, o para interferir con la señalización causada por un ligando de ActRIIA.
Se pueden generar variantes derivadas de forma combinatoria que tienen una potencia selectiva o, en general, elevada con respecto a un polipéptido ActRIIA que existe de forma natural. Asimismo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares espectacularmente diferentes a las del polipéptido ActRIIA no mutante correspondiente. Por ejemplo, la proteína alterada se puede hacer más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que producen la destrucción de, o inactivación de otro modo de un polipéptido ActRIIA nativo. Dichas variantes, y los genes que las codifican, se pueden utilizar para alterar los niveles de polipéptidos ActRIIA modulando la semivida de los polipéptidos ActRIIA. Por ejemplo, una corta semivida puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y puede permitir un control más estricto de los niveles de polipéptidos ActRIIA recombinantes en el sujeto. En una proteína de fusión Fc, las mutaciones se pueden hacer en el conector (si lo hay) y/o la porción Fc para alterar la semivida de la proteína.
Se puede producir una biblioteca combinatoria a modo de una biblioteca degenerada de genes que codifica una biblioteca de polipéptidos que incluye cada una al menos una porción de posibles secuencias de polipéptidos ActRIIA. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ser unida enzimáticamente en secuencias de genes de forma que el conjunto degenerado de posibles secuencias de nucleótidos del polipéptido ActRIIA sea expresable como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para la presentación en fagos).
Existen muchas formas por las que la biblioteca de posibles homólogos se puede generar a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos se unen entonces en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Ámsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véanse, por ejemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las patentes de EE. UU. N.25.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).
Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, se pueden generar variantes de polipéptidos ActRIIA y aislar de una biblioteca por cribado usando, por ejemplo, mutagénesis por cribado de alanina y similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mutagénesis por barrido de conectores (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagénesis de saturación (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagénesis por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); o por mutagénesis al azar, que incluye mutagénesis química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). La mutagénesis por barrido de conectores, particularmente en un ámbito combinatorio, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos ActRIIA.
Se conoce en la técnica un amplio intervalo de técnicas para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas por mutaciones puntuales y truncaciones, y, en este caso, para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas serán adaptables, en general, para el rápido cribado de bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de polipéptidos ActRIIA. Las técnicas más ampliamente usadas para cribar grandes bibliotecas de genes comprenden normalmente clonar las bibliotecas de genes en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita de forma relativamente fácil el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de unión a activina y ensayos de señalización de células mediada por activina.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIA pueden comprender además modificaciones postraduccionales, además de cualquiera que esté naturalmente presente en los polipéptidos ActRIIA. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los polipéptidos ActRIIA modificados pueden contener elementos no de aminoácido, tales como polietilenglicoles, lípidos, poli- o monosacáridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no de aminoácido sobre la funcionalidad de un polipéptido ActRIIA se pueden probar por cualquier método conocido por el experto. Cuando un polipéptido ActRIIA se produce en células por escisión de una forma naciente del polipéptido ActRIIA, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el correcto plegamiento y/o función de la proteína. Células diferentes (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y se pueden elegir para garantizar la correcta modificación y procesamiento de los polipéptidos ActRIIA.
En ciertos aspectos, variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos ActRIIA incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción de los polipéptidos ActRIIA y uno o más dominios de fusión. Ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina de suero humano. Se puede seleccionar un dominio de fusión para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión por cromatografía de afinidad. Con el fin de purificación por afinidad, se usan matrices relevantes para la cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de dichas matrices están disponibles en forma de "kit", tales como el sistema de purificación de Pharmacia GST y el sistema QIAexpressTM (Qiagen) útil con componentes de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos ActRIIA. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) así como "marcas de epítopes," que son secuencias de péptidos normalmente cortas para las que un anticuerpo específico está disponible. Las marcas de epítopes bien conocidas para las que los anticuerpos monoclonales específicos están fácilmente disponibles incluyen marcas FLAG, hemaglutinina del virus de la gripe (HA) y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de la proteasa, tales como para el factor Xa o trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y así libere las proteínas recombinantes de las mismas. Las proteínas liberadas se pueden aislar entonces del dominio de fusión por separación cromatográfica posterior. En ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido ActRIIA se fusiona con un dominio que estabiliza el polipéptido ActRIIA in vivo (un dominio "estabilizador"). Por "estabilización" se indica algo que aumenta la semivida en suero, independientemente de si esto es debido a una reducción de la destrucción, una depuración reducida por el riñón, u otro efecto farmacocinético. Se conoce que las fusiones con la porción Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocinéticas deseables en un amplio intervalo de proteínas. Asimismo, las fusiones con la albúmina de suero humano pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que se pueden seleccionar incluyen dominios de multimerización (por ejemplo, dimerización, tetramerización) y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional, tal como estimulación adicional del crecimiento óseo o crecimiento muscular, según se desee).
Se entiende que diferentes elementos de las proteínas de fusión se pueden disponer en cualquier modo que esté de acuerdo con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIA se puede poner carboxiterminal a un dominio heterólogo, o, alternativamente, un dominio heterólogo se puede poner carboxiterminal a un polipéptido ActRIIA. El dominio del polipéptido ActRIIA y el dominio heterólogo no necesitan estar adyacentes en una proteína de fusión, y dominios o secuencias de aminoácidos adicionales se pueden incluir carboxi- o aminoterminales a cualquier dominio o entre los dominios.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIA descritos en el presente documento contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos ActRIIA. Por ejemplo, dichas modificaciones potencian la semivida in v itro de los polipéptidos ActRIIA, potencian la semivida circulatoria de los polipéptidos ActRIIA o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos ActRIIA. Dichas modificaciones estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido ActRIIA y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, adición de un sitio de glucosilación a un polipéptido ActRIIA) y modificaciones del resto de hidrato de carbono (incluyendo, por ejemplo, retirada de restos de hidrato de carbono de un polipéptido ActRIIA). En el caso de proteínas de fusión, un polipéptido ActRIIA se fusiona con un dominio estabilizador, tal como una molécula de IgG (por ejemplo, un dominio Fc). Como se usa en el presente documento, el término "dominio estabilizador" no solo se refiere a un dominio de fusión (por ejemplo, Fc), como en el caso de proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteináceas, tales como un resto de hidrato de carbono, o polímero no proteináceo, tal como polietilenglicol.
En ciertas realizaciones, formas aisladas y/o purificadas de los polipéptidos ActRIIA, que se aíslan de, o están de otro modo sustancialmente libres de, otras proteínas se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Los polipéptidos ActRIIA se producirán, en general, por expresión de ácidos nucleicos recombinantes.
En ciertos aspectos, en el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos ActRIIA (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA solubles), que incluyen fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión desveladas en el presente documento. Por ejemplo, SEQ ID NO: 4 codifica el polipéptido precursor de ActRIIA humano que existen de forma natural, mientras que SEQ ID NO: 5 codifica el dominio extracelular de ActRIIA procesado. Los ácidos nucleicos objeto pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos se pueden usar, por ejemplo, en métodos de preparación de polipéptidos ActRIIA o como agentes terapéuticos directos (por ejemplo, en un enfoque de terapia génica).
En ciertos aspectos, se entiende además que los ácidos nucleicos objeto que codifican polipéptidos ActRIIA incluyen ácidos nucleicos que son variantes de SEQ ID NO: 4 o 5. Las secuencias de nucleótidos de variante incluyen secuencias que se diferencian en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas.
En ciertos ejemplos, en el presente documento se proporcionan secuencias del ácido nucleico aisladas o recombinantes que son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a SEQ ID NO: 4 o 5. Un experto habitual en la técnica apreciará que las secuencias del ácido nucleico complementarias a SEQ ID NO: 4 o 5, y variantes de SEQ ID NO: 4 o 5, también están englobadas en el presente documento. En ejemplos adicionales, las secuencias del ácido nucleico proporcionadas en el presente documento pueden ser aisladas, recombinantes y/o fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.
En otros ejemplos, los ácidos nucleicos también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones altamente rigurosas con la secuencia de nucleótidos diseñada en SEQ ID NO: 4 o 5, secuencia del complemento de SEQ ID NO: 4 o 5, o fragmentos de las mismas. Como se trata anteriormente, un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN. Un experto habitual en la técnica entenderá que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN. Por ejemplo, se puede realizar la hibridación en 6,0 veces cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de un lavado de 2,0 veces SSC a 50 grados Celsius. Por ejemplo, la concentración de sales en la etapa de lavado se puede seleccionar de una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 veces SSC a 50 grados Celsius a una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 veces SSC a 50 grados Celsius. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede aumentar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 grado Celsius, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 grados Celsius. Se pueden variar tanto la temperatura como la sal, o se puede mantener constante la temperatura o concentración de sales mientras se cambia la otra variable. En una realización, los ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 veces SSC a temperatura ambiente seguido por un lavado a 2 veces SSC a temperatura ambiente se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento.
Los ácidos nucleicos aislados que se diferencian de los ácidos nucleicos como se exponen en SEQ ID NO: 4 o 5 debido a degeneración en el código genético también están englobados en el presente documento. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos de histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silenciosas" que no afectan la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objeto existan entre las células de mamífero. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Todas y cada una de dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes están englobadas en el presente documento.
En ciertos ejemplos, los ácidos nucleicos recombinantes pueden estar unidos operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán, en general, apropiadas para la célula hospedadora usada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células hospedadoras. Normalmente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias conductoras o señal, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias traduccionales de inicio y terminación y secuencias potenciadoras o activadoras. Se contemplan en el presente documento promotores constitutivos o inducibles como se conoce en la técnica. Los promotores pueden ser o promotores que existen de forma natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión se puede insertar en un cromosoma. En una realización preferida, el vector de expresión contiene un gen marcador de selección para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de marcadores de selección se conocen bien en la técnica y variarán con la célula hospedadora usada.
En ciertos aspectos, el ácido nucleico objeto se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ActRIIA y operativamente unido a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son conocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido ActRIIA. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Las secuencias reguladoras a modo de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Por ejemplo, se puede usar cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se une operativamente en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRIIA. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío del SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato del adenovirus o citomegalovirus, promotores del VSR, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la ARN polimerasa T7, el operador mayor y regiones promotoras de fago lambda, las regiones de control para la proteína de la envoltura fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de la levadura, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Se debe entender que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también se debería considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibiótico.
Se puede producir un ácido nucleico recombinante uniendo el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en cualquier célula procariota, célula eucariota (levadura, aviar, insecto o mamífero), o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ActRIIA recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coIí .
Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariota que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, μMSG, pSVT7, pkoneo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y resistencia a la selección de fármacos en tanto células procariotas como eucariotas. Alternativamente, derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (VPB-1) o virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) se pueden usar para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (incluyendo retrovíricos) se pueden encontrar en la siguiente descripción de sistemas de administración de genoterapia. Se conocen bien en la técnica diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos hospedadores. Para otros sistemas de expresión adecuados para tanto células procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, se puede desear expresar los polipéptidos recombinantes usando un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene .beta.-gal).
En una realización preferida, se diseñará un vector para la producción de polipéptidos ActRIIA objeto en células CHO, tales como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores de pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores de pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). Como será evidente, las construcciones génicas objeto se pueden usar para causar la expresión de polipéptidos ActRIIA objeto en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, que incluyen proteínas de fusión o proteínas de variante, para la purificación.
La presente divulgación también se refiere a una célula hospedadora transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante (por ejemplo, SEQ ID NO: 4 o 5) para uno o más de los polipéptidos ActRIIA objeto. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIA se puede expresar en células bacterianas, tales como E. coIí , células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero. Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.
Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos de producción de los polipéptidos ActRIIA. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRIIA se puede cultivar en condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido ActRIIA. El polipéptido ActRIIA se puede secretar y aislar de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido ActRIIA. Alternativamente, el polipéptido ActRIIA puede ser retenido citoplásmicamente o en una fracción de membrana y las células se recogen, lisan y se aísla la proteína. Un cultivo celular incluye células hospedadoras, medios y otros subproductos. Se conocen bien en la técnica medios adecuados para el cultivo celular. Los polipéptidos ActRIIA objeto se pueden aislar del medio de cultivo celular, células hospedadoras, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, inmunopurificación por afinidad con anticuerpos específicos contra epítopes particulares de los polipéptidos ActRIIA y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado con el polipéptido ActRIIA (por ejemplo, se puede usar una columna de proteína A para purificar una fusión ActRIIA-Fc). En un ejemplo preferido, el polipéptido ActRIIA es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. En un ejemplo preferido, la purificación se logra por una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía en proteína A, cromatografía en QSepharose, cromatografía en Phenyl Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación podría ser completada con filtración vírica e intercambio de tampón. Como se demuestra en el presente documento, se purificó la proteína ActRIIA-hFc hasta una pureza de >98% como se ha determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y >95% como se ha determinado por SDS-PAGE. Este nivel de pureza fue suficiente para lograr efectos deseables sobre el hueso en ratones y un perfil de seguridad aceptable en ratones, ratas y primates no humanos.
Un gen de fusión que codifica una secuencia conductora de la purificación, tal como una secuencia del sitio de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido ActRIIA recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada por cromatografía de afinidad usando una resina de metal Ni2+. La secuencia conductora de la purificación se pueden retirar entonces posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRIIA purificado (por ejemplo, véase Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al., p Na S USA 88:8972).
Se conocen bien las técnicas de preparación de genes de fusión. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza según técnicas convencionales, empleando extremos romos o de terminación escalonada para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según convenga, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión no deseable y unión enzimática. El gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a nucleótidos protuberantes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente ser hibridados para generar una secuencia de genes quiméricos (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
La proteína de fusión ActRIIA-Fc se puede expresar en células CHO-DUKX Bl 1 establemente transfectadas de un vector pAID4 (ori/potenciador del SV40, promotor del CMV), usando una secuencia conductora de plasminógeno tisular de SEQ ID NO:9. La porción Fc es una secuencia de Fc de IgG1 humana, como se muestra en SEQ ID NO:7. En ciertos ejemplos, tras la expresión, la proteína contenida tiene, en promedio, entre aproximadamente 1,5 y 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusión ActRIIA-Fc.
La larga semivida en suero de una fusión ActRIIA-Fc puede ser 25-32 días en sujetos humanos. Además, el material expresado en células CHO puede tener una mayor afinidad por el ligando de activina B que el informado para una proteína de fusión ActRIIA-hFc expresada en células 293 humanas (del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35). Además, sin desear quedar ligado a teoría, el uso de la secuencia conductora de TPA proporcionó mayor producción que otras secuencias conductoras y, a diferencia de ActRIIA-Fc expresada con un conductor nativo, puede proporcionar una secuencia aminoterminal altamente pura. El uso de la secuencia conductora nativa puede producir dos especies importantes de ActRIIA-Fc, cada una de las cuales tiene una secuencia aminoterminal diferente.
7.9.2 INHIBIDORES DE LA SEÑALIZACIÓN DE ActRIIB
Como se usa en el presente documento, el término "ActRIIB" se refiere a una familia de proteínas de tipo IIB del receptor de activina (ActRIIB) de cualquier especie y variante derivada de dichas proteínas ActRIIB por mutagénesis u otra modificación. Referencia a ActRIIB en el presente documento se entiende que es una referencia a una cualquiera de las formas actualmente identificadas del receptor. Miembros de la familia ActRIIB son, en general, proteínas transmembranarias, compuestas de un dominio extracelular de unión a ligando con una región rica en cisteína, un dominio transmembranario y un dominio citoplásmico con actividad de serina/treonina cinasa predicha.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB incluyen, sin limitación, polipéptidos ActRIIB solubles que se unen a activina; anticuerpos que se unen a activina (particularmente las subunidades A o B de activina, también denominadas pA o pB) y alteran la unión de ActRIIB; anticuerpos que se unen a ActRIIB y alteran la unión a activina; proteínas no de anticuerpo seleccionadas para la unión a activina o ActRIIB; y péptidos aleatorizados seleccionados para la unión a activina o ActRIIB, que se pueden conjugar con un dominio Fc.
En ciertos ejemplos, dos o más proteínas diferentes (u otros restos) con actividad de unión de activina o ActRIIB, especialmente ligantes de activina que bloquean los sitios de unión de tipo I (por ejemplo, un receptor de activina de tipo I soluble) y tipo II (por ejemplo, un receptor de activina de tipo II soluble), respectivamente, se pueden unir juntas para crear una molécula de unión bifuncional o multifuncional que inhibe ActRIIB y así se puede usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento. En ciertos ejemplos, los agonistas del eje de señalización de activina-ActRIIB que inhiben ActRIIB incluyen aptámeros de ácido nucleico, moléculas pequeñas e incluyen otros agentes que se usan en las composiciones y métodos descritos en el presente documento.
(a) Inhibidores de la señalización de ActRIIB que comprenden polipéptidos ActRIIB
Como se usa en el presente documento, el término "polipéptido ActRIIB" se refiere a polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido que existe de forma natural de un miembro de la familia de ActRIIB, así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas de peptidomimético) que retienen una actividad útil. Por ejemplo, los polipéptidos ActRIIB incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier receptor ActRIIB conocido que tenga una secuencia al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido ActRIIB, y opcionalmente al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB puede unirse a e inhibir la función de una proteína ActRIIB y/o activina. Un ejemplo de un polipéptido ActRIIB incluye el polipéptido precursor de ActRIIB humano (SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28). Con respecto al polipéptido precursor de ActRIIB cuya secuencia de aminoácidos se representa como SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (es decir, el polipéptido precursor de ActRIIB humano), el péptido señalizador del polipéptido precursor de ActRIIB se sitúa en los aminoácidos 1 a 18; el dominio extracelular se sitúa en los aminoácidos 19 a 134 y los posibles sitios de glucosilación unidos a N se sitúan en las posiciones de aminoácidos 42 y 65. La secuencia del ácido nucleico que codifica el polipéptido precursor de ActRIIB humano de SEQ ID NO:16 se desvela como SEQ ID NO:19 (SEQ ID NO:19 proporciona una alanina en el codón correspondiente a la posición de aminoácido 64, pero en su lugar podría ser fácilmente modificado por un experto en la técnica usando métodos conocidos en la técnica para proporcionar una arginina en el codón correspondiente a la posición de aminoácido 64). Véase la Tabla 21 para una descripción de las secuencias.
La numeración de aminoácidos para todos los polipéptidos relacionados con ActRIIB descritos en el presente documento se basa en la numeración de aminoácidos para SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:28 (que solo se diferencian en el aminoácido expresado en la posición 64), a menos que se designe específicamente de otro modo. Por ejemplo, si se describe un polipéptido ActRIIB que tiene una sustitución/mutación en la posición de aminoácido 79, entonces se debe entender que la posición 79 se refiere al 79° aminoácido en SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, del que deriva el polipéptido ActRIIB. Asimismo, si se describe que un polipéptido ActRIIB tiene una alanina o una arginina en la posición de aminoácido 64, entonces se debe entender que posición 64 se refiere al aminoácido 64° en SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, del que deriva el polipéptido ActRIIB.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender polipéptidos que comprenden un dominio de unión a activina de ActRIIB. Los dominios de unión a activina de ActRIIB pueden comprender el dominio extracelular de ActRIIB, o una porción del mismo. En realizaciones específicas, el dominio extracelular o porción del mismo de ActRIIB es soluble. Formas modificadas ilustrativas de polipéptidos ActRIIB se desvelan en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 20090005308 y 20100068215.
Los polipéptidos ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden ser polipéptidos ActRIIB solubles. El término "polipéptido ActRIIB soluble" se refiere, en general, a polipéptidos que comprenden un dominio extracelular de una proteína ActRIIB, que incluye cualquier dominio extracelular que existe de forma natural de una proteína ActRIIB, así como cualquier variante de la misma (incluyendo mutantes, fragmentos y formas de peptidomimético). Los polipéptidos ActRIIB solubles se pueden unir a activina; sin embargo, la proteína ActRIIB natural no presenta selectividad significativa en la unión a activina frente a GDF8/11. Por ejemplos, formas alteradas de ActRIIB con diferentes propiedades de unión se pueden usar en los métodos proporcionados en el presente documento. Dichas formas alteradas se desvelan en, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente internacional N.° WO 2006/012627 y WO 2010/019261. A las proteínas ActRIIB nativas o alteradas se les puede dar especificidad adicional por activina acoplándolas a un segundo agente de unión selectivo por activina. Los polipéptidos ActRIIB solubles a modo de ejemplo incluyen el dominio extracelular de un polipéptido ActRIIB humano (por ejemplo, SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43).
Se ha mostrado que una proteína de fusión de Fc que tiene la secuencia extracelular de ActRIIB desvelada por Hilden et al. (Blood, 1994, 83(8):2163-70), que tiene una alanina en la posición correspondiente al aminoácido 64 de la secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB, es decir, SEQ ID NO: 16 (denominada en el presente documento "A64") posee una afinidad relativamente baja por la activina y GDF-11. Por el contrario, una proteína de fusión de Fc con una arginina en la posición 64 de la secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB (denominada en el presente documento "R64") tiene una afinidad por activina y GDF-11 en el intervalo de nanomolar bajo a picomolar alto (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. N.° 20100068215). Una secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB con una arginina en la posición 64 se presenta en SEQ ID NO:28. Como tal, los polipéptidos ActRIIB usados según las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender o (i) una alanina en la posición correspondiente al aminoácido 64 de la secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB, es decir, SEQ ID NO: 16; o (ii) una arginina en la posición 64 de la secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB, es decir, SEQ ID NO:28. Alternativamente, los polipéptidos ActRIIB usados según las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender un aminoácido que no es alanina ni arginina en la posición correspondiente al aminoácido 64 de la secuencia de aminoácidos precursora de ActRIIB, es decir, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO:28.
Se ha mostrado que una deleción del nudo de prolina en el extremo C del dominio extracelular de ActRIIB reduce la afinidad del receptor por activina (véase, por ejemplo, Attisano et al., Cell, 1992, 68(1 ):97-108). Una proteína de fusión de ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20-119 de SEQ ID NO: 28 (es decir, SEQ ID NO:32), "ActRIIB(20-119)-Fc", tiene unión reducida a GDF-11 y activina con respecto a una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20­ 134 de SEQ ID NO: 28 (es decir, SEQ ID No :31), "ActRIIB(20-134)-Fc", que incluye la región del nudo de prolina y el dominio yuxtamembranario completo. Sin embargo, una proteína de fusión ActRIIB-Fc que contiene los aminoácidos 20­ 129 de SEQ ID NO: 28, "ActRMB(20-129)-Fc", retiene actividad similar, pero algo reducida, con respecto al dominio extracelular no truncado de ActRIIB, aún cuando la región de nudo de prolina se altere. Por lo tanto, se espera que todos los polipéptidos ActRIIB que comprenden dominios extracelulares que paran en el aminoácido 134, 133, 132, 131, 130 y 129 de SEQ ID NO: 28 (o SEQ ID NO:16) sean activos, pero las construcciones que paran en el aminoácido 134 o 133 pueden ser más activas. Similarmente, no se espera que las mutaciones en cualquiera de los restos 129-134 alteren la afinidad de unión al ligando en grandes márgenes, como se indica por el hecho de que las mutaciones de P129 y P130 de SEQ ID NO: 28 no disminuyen sustancialmente la unión al ligando. Por lo tanto, los polipéptidos ActRIIB usados según los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden terminar tan pronto como en el aminoácido 109 (es decir, la cisteína final) de SEQ ID NO:28 (o SEQ ID NO:16); sin embargo, se espera que las formas que terminan en o entre las posiciones de aminoácidos 109 y 119 de SEQ ID NO:28 (o SEQ ID NO:16) tenga capacidad de unión al ligando reducida.
El aminoácido 29 de SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:28 representa la cisteína inicial en la secuencia precursora de ActRIIB. Se espera que un polipéptido ActRIIB que empieza en el aminoácido 29 del extremo N de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, o antes de estas posiciones de aminoácidos, retenga la actividad de unión al ligando. Una mutación de alanina a asparagina en la posición 24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 introduce una secuencia de glucosilación unida a N sin afectar sustancialmente la unión al ligando. Esto confirma que las mutaciones en la región entre el péptido de escisión señal y la región de reticulación de cisteína, correspondientes a los aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, son bien tolerados. En particular, los polipéptidos ActRIIB que empiezan en la posición de aminoácido 20, 21,22, 23 y 24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 retendrán actividad, y los polipéptidos ActRIIB que empiezan en las posiciones de aminoácidos 25, 26, 27, 28 y 29 de SEQ ID NO:16 o SEQ iD NO:28 también se espera que retengan actividad. Un polipéptido ActRIIB que empieza en la posición de aminoácido 22, 23, 24 o 25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 tendrá la mayor actividad.
Tomados conjuntamente, las porciones activas (es decir, los polipéptidos ActRIIB) de la proteína precursora ActRIIB (es decir, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28) que se van a usar según los métodos y composiciones descritos en el presente documento comprenderán, en general, los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, y dichos polipéptidos ActRIIB pueden empezar, por ejemplo, en un resto correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 19-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y terminar en una posición correspondiente a uno cualquiera de los aminoácidos 109-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. Los ejemplos específicos de polipéptidos ActRIIB englobados en el presente documento incluyen los que empiezan en una posición de aminoácido desde 19-29, 20-29 o 21-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y terminan en una posición de aminoácido desde 119-134, 119-133 o 129-134, 129-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. Otros ejemplos específicos de polipéptidos ActRIIB englobados en el presente documento incluyen los que empiezan en una posición de aminoácido desde 20-24 (o 21-24, o 22-25) de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y terminan en una posición de aminoácido desde 109-134 (o 109-133), 119-134 (o 119-133) o 129-134 (o 129-133) de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. También se contemplan los polipéptidos ActRIIB de variante que se encuentran dentro de estos intervalos, particularmente los que tienen al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia u homología de secuencias con la porción correspondiente de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender una forma truncada de un dominio extracelular de ActRIIB. La truncación puede ser en el extremo carboxi y/o el extremo amino del polipéptido ActRIIB. La truncación puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, or 25 aminoácidos de longitud con respecto al dominio extracelular del polipéptido ActRIIB maduro. La truncación puede ser de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, or 25 aminoácidos aminoterminales del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB maduro. La truncación puede ser de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, or 25 aminoácidos carboxiterminales del dominio extracelular del polipéptido ActRIIB maduro. Por ejemplo, formas truncadas de ActRIIB incluyen polipéptidos con los aminoácidos 20-119; 20-128; 20-129; 20-130; 20-131; 20-132; 20-133; 20-134; 20-131; 21-131; 22-131; 23-131; 24-131; y 25-131, en donde las posiciones de aminoácidos se refieren a las posiciones de aminoácidos en SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28.
Formas truncadas adicionales a modo de ejemplo de ActRIIB incluyen (i) polipéptidos que empiezan en los aminoácidos en cualquiera de los aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (opcionalmente que empiezan en 22-25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28) y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 109-134 de SEQ Id NO:16 o SEQ ID NO:28; (ii) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (opcionalmente que empiezan en 22-25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28) y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 109-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (iii) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (opcionalmente que empiezan en 22-25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28) y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 109-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (iv) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 21-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 109-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (v) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 118-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (vi) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 21-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 118-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (vii) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 128-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (viii) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 128-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (ix) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 118-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (x) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 118-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; (xi) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 21-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 128-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28; y (xii) polipéptidos que empiezan en cualquiera de los aminoácidos 20-29 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en cualquiera de los aminoácidos 128-133 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. Específicamente, un polipéptido ActRIIB puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, una secuencia de aminoácidos que empieza en la posición de aminoácido 25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que termina en la posición de aminoácido 131 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. Más específicamente, un polipéptido ActRIIB puede consistir en, o consistir esencialmente en, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 o 43.
Cualquiera de los polipéptidos ActRIIB desvelados en el presente documento se puede producir como un homodímero. Cualquiera de los polipéptidos ActRIIB desvelados en el presente documento se puede formular como una proteína de fusión que tiene una porción heteróloga que comprende una región constante de una cadena pesada de IgG, tal como un dominio Fc. Cualquiera de los polipéptidos ActRIIB desvelados en el presente documento puede comprender un aminoácido ácido en la posición correspondiente a la posición 79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, opcionalmente en combinación con una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos adicionales con respecto a SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender un dominio extracelular de ActRIIB con una o más sustituciones/mutaciones de aminoácidos. Dicha sustitución/mutación de aminoácido puede ser, por ejemplo, un intercambio de la leucina en la posición de aminoácido 79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 a un aminoácido ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. Por ejemplo, la posición L79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 se puede alterar en los polipéptidos del dominio extracelular de ActRIIB para conferir propiedades de unión alteradas a activina-miostatina (GDF-11). Las mutaciones L79A y L79P reducen la unión a GDF-11 a un grado mayor que la unión a activina. Las mutaciones L79E y L79D retienen la unión a GDF-11, mientras que se demuestra una unión a activina enormemente reducida.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender una forma truncada de un dominio extracelular de ActRIIB que también lleva una sustitución de aminoácidos, por ejemplo, un intercambio de la leucina en la posición de aminoácido 79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 a un aminoácido ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. En una realización específica, la forma truncada de un dominio extracelular de polipéptido ActRIIB que también lleva una sustitución de aminoácidos usada en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es SEQ ID NO:23. Las formas de ActRIIB que están truncadas y/o llevan una o más sustituciones de aminoácidos se pueden unir a un dominio Fc de un anticuerpo como se trata anteriormente.
Se pueden obtener fragmentos funcionalmente activos de polipéptidos ActRIIB, por ejemplo, por cribado de polipéptidos producidos recombinantemente a partir del fragmento correspondiente del ácido nucleico que codifica un polipéptido ActRIIB. Además, los fragmentos pueden ser sintetizados químicamente usando técnicas conocidas en la técnica, tales como química de f-Moc o t-Boc en fase sólida convencional de Merrifield. Los fragmentos se pueden producir (recombinantemente o por síntesis química) y probar para identificar los fragmentos de peptidilo que pueden servir de antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIB o señalización mediada por activina.
Además, se pueden obtener variantes funcionalmente activas de polipéptidos ActRIIB, por ejemplo, cribando bibliotecas de polipéptidos modificados recombinantemente producidos a partir de los ácidos nucleicos correspondientes mutagenizados que codifican un polipéptido ActRIIB. Las variantes se pueden producir y probar para identificar aquellas que pueden servir de antagonistas (inhibidores) de la proteína ActRIIB o señalización mediada por activina. Una variante funcional de los polipéptidos ActRIIB puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 y 43. La variante funcional puede tener una secuencia de aminoácidos al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43.
Se pueden generar variantes funcionales, por ejemplo, modificando la estructura de un polipéptido ActRIIB para fines tales como potenciar la eficacia terapéutica, o estabilidad (por ejemplo, vida útil e x v ivo y resistencia a la degradación proteolítica in vivo). Dichos polipéptidos ActRIIB modificados, cuando se seleccionan para retener la unión a activina, son considerados equivalentes funcionales de los polipéptidos ActRIIB que existen de forma natural. Los polipéptidos ActRIIB modificados también se pueden producir, por ejemplo, por sustitución, deleción o adición de aminoácidos. Por ejemplo, es razonable esperar que una sustitución aislada de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o una sustitución similar de un aminoácido con un aminoácido relacionado estructuralmente (por ejemplo, mutaciones conservativas) no tenga un efecto importante sobre la actividad biológica de la molécula resultante. Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido ActRIIB da como resultado un homólogo funcional, se puede determinar fácilmente evaluando la capacidad del polipéptido ActRIIB de variante para producir una respuesta en células en un modo similar al polipéptido ActRIIB no mutante.
En el presente documento se desvelan métodos de generación de mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combinatorios de un polipéptido ActRIIB, así como los mutantes de truncación; los conjuntos de mutantes combinatorios son especialmente útiles para identificar secuencias de variante funcional. El fin de cribar dichas bibliotecas combinatorias puede ser para generar, por ejemplo, variantes de polipéptidos ActRIIB que pueden servir o de agonistas o antagonistas, o alternativamente, poseer actividades novedosas en conjunto.
Se ha demostrado que el sitio de unión al ligando de ActRIIB se define por los restos Y31, N33, N35, L38 a T41, E47, E50, Q53 a K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 a N83, Y85, R87, A92 y E94 a F101 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. En estas posiciones, se espera que las mutaciones conservativas sean toleradas, aunque una mutación K74A es bien tolerada, ya que son R40A, K55A, F82A y mutaciones en la posición L79. R40 es K en Xenopus, que indica que los aminoácidos básicos en esta posición serán tolerados. Q53 es R en ActRIIB bovino y K en ActRIIB de Xenopus, y por lo tanto los aminoácidos que incluyen R, K, Q, N y H serán tolerados en esta posición. Por lo tanto, una fórmula general para un polipéptido ActRIIB para su uso en los métodos y composiciones descritos en el presente documento es una que comprende los aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, pero opcionalmente que empiezan en una posición de aminoácido que varía desde 20-24 o 22-25 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 y que terminan en una posición de aminoácido que varía desde 129-134 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28, y que comprende no más de 1, 2, 5 o 15 cambios conservativos de aminoácidos en el sitio de unión a ligando, y cero, una o más alteraciones no conservativas en las posiciones de aminoácidos 40, 53, 55, 74, 79 y/o 82 de SEQ ID n O:16 o SEQ ID NO:28 en el sitio de unión a ligando. Dicho polipéptido ActRIIB puede retener más de 80%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia u homología de secuencias con la secuencia de aminoácidos 29-109 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. Los sitios fuera del sitio de unión, en los que la variabilidad puede ser particularmente bien tolerada, incluyen los extremos amino y carboxi del dominio extracelular de ActRIIB, y las posiciones 42-46 y 65-73. Una alteración de asparagina a alanina en la posición 65 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (N65A) mejora en realidad la unión a ligando en el acervo de A64, y así se espera que no tenga efecto perjudicial sobre la unión a ligando en el acervo de R64. Este cambio elimina probablemente la glucosilación en N65 en el acervo de A64, demostrándose así que es probable que sea tolerado un cambio significativo en esta región. Mientras que un cambio de R64A es mal tolerado, R64K es bien tolerado, y así otro resto básico, tal como H, puede ser tolerado en la posición 64.
Como un ejemplo específico de un polipéptido ActRIIB con una mutación en el dominio de unión a ligando, el resto de aminoácido cargado positivamente Asp (D80) del dominio de unión a ligando de ActRIIB se puede mutar a un resto de aminoácido diferente de forma que el polipéptido ActRIIB de variante se una preferentemente a GDF8, pero no a activina. En una realización específica, el resto D80 se cambia a un resto de aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: un resto de aminoácido sin carga, un resto de aminoácido negativo y un resto de aminoácido hidrófobo. Como un ejemplo específico adicional, el resto hidrófobo L79 se puede alterar a los aminoácidos ácidos ácido aspártico o ácido glutámico para reducir enormemente la unión a activina, mientras que se retiene la unión a GDF1 1. Como reconocerá un experto en la técnica, la mayoría de las mutaciones, variantes o modificaciones descritas se pueden hacer al nivel del ácido nucleico o, en algunos casos, por modificación postraduccional o síntesis química. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender un conjugado/proteína de fusión que comprende un dominio extracelular (por ejemplo, un dominio de unión a activina) de un receptor ActRIIB unido a una porción Fc de un anticuerpo. Dicho conjugado/proteínas de fusión pueden comprender cualquiera de los polipéptidos ActRIIB desvelados en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de SEQ ID NO:17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 o 43), cualquier polipéptido ActRIIB conocido en la técnica, o cualquier polipéptido ActRIIB generado usando métodos conocidos en la técnica y/o proporcionados en el presente documento.
El dominio extracelular se puede unir a una porción Fc de un anticuerpo por un conector, por ejemplo, un conector peptídico. Los conectores a modo de ejemplo incluyen secuencias de polipéptidos cortas, tales como 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 restos de aminoácidos (por ejemplo, restos de glicina), tales como, por ejemplo, un conector Gly-Gly-Gly. En una realización específica, el conector comprende la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Gly (GGG). En otra realización específica, el conector comprende la secuencia de aminoácidos Thr-Gly-Gly-Gly (TGGG). Opcionalmente, el dominio Fc tiene una o más mutaciones en restos tales como Asp-265, lisina 322 y Asn-434. En ciertos casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, una mutación Asp-265) tiene una capacidad reducida para unirse al receptor de Fcy con respecto a un dominio Fc no mutante. En otros casos, el dominio Fc mutante que tiene una o más de estas mutaciones (por ejemplo, una mutación Asn-434) tiene un aumento de la capacidad para unirse al receptor de Fc (FcRN) relacionado con la clase I de MHC con respecto a un dominio Fc no mutante. Las proteínas de fusión a modo de ejemplo que comprenden un dominio extracelular soluble de ActRIIB fusionado con un dominio Fc se exponen en SEQ ID NO:20, 21,24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41,44, 46 y 47.
Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender el dominio extracelular de ActRIIB, o una porción del mismo, unido a una porción Fc de un anticuerpo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:20, 21,24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41,44, 46 y 47. Los inhibidores de la señalización de ActRIIB usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento pueden comprender el dominio extracelular de ActRIIB, o una porción del mismo, unido a una porción Fc de un anticuerpo, en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRIIB comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO:20, 21, 24, 25, 34, 35, 38, 39, 40, 41,44, 46 y 47.
El inhibidor de la señalización de ActRIIB que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede ser una proteína de fusión entre el dominio extracelular del receptor de ActRIIB humano y la porción Fc de IgG1. El inhibidor de la señalización de ActRIIB que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede ser una proteína de fusión entre un dominio extracelular truncado del receptor de ActRIIB humano y la porción Fc de IgG1. El inhibidor de la señalización de ActRIIB que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede ser una proteína de fusión entre un dominio extracelular truncado del receptor de ActRIIB humano y la porción Fc de IgG1, en donde el dominio extracelular truncado del receptor de ActRIIB humano posee una sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido correspondiente al aminoácido 79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28. La sustitución de aminoácidos en la posición de aminoácido correspondiente al aminoácido 79 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 puede ser una sustitución de leucina por ácido aspártico (es decir, una mutación L79D).
El inhibidor de la señalización de ActRIIB que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede ser SEQ ID NO:24 o 25, que representa una proteína de fusión entre el dominio extracelular del receptor de ActRIIB humano y la porción Fc de IgG1, en donde dicho dominio extracelular de ActRIIB comprende los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO:28 con una mutación L79D. La secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de fusión ActRIIB-Fc de SEQ ID NO:24 se presenta en SEQ ID NO:45.
El inhibidor de la señalización de ActRIIB que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento puede ser SEQ ID NO:34 o 35, que representa una proteína de fusión entre el dominio extracelular del receptor de ActRIIB humano y la porción Fc de IgG1, en donde dicho dominio extracelular de ActRIIB comprende los aminoácidos 25-131 de SEQ ID NO:16 con una mutación L79D.
Los sitios de reconocimiento de la glucosilación unidos a asparagina comprenden, en general, una secuencia tripeptídica, asparagina-X-treonina (o asparagina-X-serina) (donde "X" es cualquier aminoácido) que es reconocida específicamente por enzimas de glucosilación celular apropiadas. La alteración también se puede hacer mediante la adición de, o sustitución por, uno o más de restos de serina o treonina a la secuencia del polipéptido ActRIIB no mutante (para sitios de glucosilación unidos a O). Una variedad de sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones de aminoácidos de un sitio de reconocimiento de la glucosilación (y/o deleción de aminoácidos en la segunda posición) produce la no glucosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Otro medio de aumentar el número de restos de hidrato de carbono en un polipéptido ActRIIB es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos con el polipéptido ActRIIB. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el (los) azúcar(es) se pueden unir a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres, tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres, tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) restos aromáticos, tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en la solicitud de patente internacional N.° WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306. La retirada de uno o más restos de hidrato de carbono presentes en un polipéptido ActRIIB se puede llevar a cabo química y/o enzimáticamente. La desglucosilación química puede implicar, por ejemplo, la exposición del polipéptido ActRIIB al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la escisión de la mayoría o todos los azúcares, excepto el azúcar de enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que deja intacta la secuencia de aminoácidos. La desglucosilación química se describe además por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos de hidrato de carbono en polipéptidos ActRIIB se puede lograr usando una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describe por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. La secuencia de un polipéptido ActRIIB se puede ajustar, según convenga, dependiendo del tipo de sistema de expresión usado, ya que las células de mamífero, levadura, insecto y vegetales pueden todas introducir diferentes patrones de glucosilación que se pueden afectar por la secuencia de aminoácidos del péptido. En general, las proteínas ActRIIB para su uso en seres humanos se expresarán en una estirpe celular de mamífero que proporciona la glucosilación apropiada, tales como las estirpes celulares HEK293 o CHO, aunque también se espera que sean útiles otros sistemas de expresión, tales como otras estirpes celulares de expresión en mamífero, estirpes celulares de levadura con enzimas de glucosilación manipuladas y células de insecto.
En ejemplos específicos, en el presente documento se engloban polipéptidos ActRIIB mutados que comprenden la adición de un sitio de glucosilación unido a N adicional (N-X-S/T) que aumenta la semivida en suero de una proteína de fusión ActRIIB-Fc, con respecto a la forma ActRIIB(R64)-Fc. En un ejemplo específico, la introducción de una asparagina en la posición 24 de SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28 (A24N) produce la creación de una secuencia NXT que confiere una semivida más larga. Otras secuencias NX(T/S) se pueden encontrar en 42-44 (NQS) y 65-67 (NSS), aunque la última puede no estar eficientemente glucosilada con R en la posición 64 (es decir, en polipéptidos R64). Las secuencias N-X-S/T pueden ser introducidas, en general, en las posiciones fuera del sitio de unión al ligando de ActRIIB, que se detalla anteriormente. Los sitios particularmente adecuados para la introducción de secuencias N-X-S/T no endógenas incluyen los aminoácidos 20-29, 20-24, 22-25, 109-134, 120-134 o 129-134 de SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO:28. Las secuencias N-X-S/T también se pueden introducir en el conector entre la secuencia ActRIIB y el componente de fusión Fc u otro. Dicho sitio se puede introducir con esfuerzo mínimo introduciendo un N en la posición correcta con respecto a un S o T preexistente, o introduciendo un S o T en una posición correspondiente a un N preexistente. Por lo tanto, alteraciones deseables que crearían un sitio de glucosilación unido al N son: A24N, R64N, S67N (posiblemente combinadas con una alteración N65A), E106N, R112N, G120N, E123N, P129N, A132N, R112S y R112T (pudiéndose encontrar todas las posiciones de aminoácidos correspondientes a las posiciones en SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:28). Cualquier S que se prediga que está glucosilado se puede alterar a un T sin crear un sitio inmunogénico, debido a la protección proporcionada por la glucosilación. Asimismo, cualquier T que se prediga que está glucosilado se puede alterar a un S. Así, las alteraciones S67T y S44T están englobadas en el presente documento. Asimismo, en una variante de A24N, se puede usar una alteración de S26T. Por consiguiente, un polipéptido ActRIIB puede incluir una o más secuencias consenso de glucosilación unidas a N no endógenas adicionales.
Se puede usar una variedad de ensayos de cribado para evaluar las variantes de polipéptidos ActRIIB. Por ejemplo, se puede cribar una variante de polipéptido ActRIIB para la capacidad para unirse a un ligando de ActRIIB, para prevenir la unión de un ligando de ActRIIB a un polipéptido ActRIIB, o para interferir con la señalización causada por un ligando de ActRIIB. La actividad de un polipéptido ActRIIB o sus variantes también se pueden probar en un ensayo basado en células o in vivo.
Se pueden generar variantes derivadas de forma combinatoria que tienen una potencia selectiva o, en general, elevada con respecto a un polipéptido ActRIIB que existe de forma natural. Asimismo, la mutagénesis puede dar lugar a variantes que tienen semividas intracelulares espectacularmente diferentes a las del polipéptido ActRIIB no mutante correspondiente. Por ejemplo, la proteína alterada se puede hacer más estable o menos estable a la degradación proteolítica u otros procesos celulares que producen la destrucción de, o inactivación de otro modo de un polipéptido ActRIIB nativo. Dichas variantes, y los genes que las codifican, se pueden utilizar para alterar los niveles de polipéptidos ActRIIB modulando la semivida de los polipéptidos ActRIIB. Por ejemplo, una corta semivida puede dar lugar a efectos biológicos más transitorios y puede permitir un control más estricto de los niveles de polipéptidos ActRIIB recombinante en el sujeto. En una proteína de fusión Fc, las mutaciones se pueden hacer en el conector (si lo hay) y/o la porción Fc para alterar la semivida de la proteína.
Se puede producir una biblioteca combinatoria a modo de una biblioteca de genes degenerada que codifica una biblioteca de polipéptidos que incluye cada una al menos una porción de posibles secuencias de polipéptidos ActRIIB. Por ejemplo, una mezcla de oligonucleótidos sintéticos puede ser unida enzimáticamente en secuencias de genes de forma que el conjunto degenerado de posibles secuencias de nucleótidos del polipéptido ActRIIB sea expresable como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo, para presentación en fagos).
Existen muchas formas por las que la biblioteca de posibles homólogos se puede generar a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia de genes degenerada se puede llevar a cabo en un sintetizador de ADN automático, y los genes sintéticos se unen entonces en un vector apropiado para la expresión. La síntesis de oligonucleótidos degenerados se conoce bien en la técnica (véanse, por ejemplo, Narang, S A (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Ámsterdam: Elsevier pp 273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Dichas técnicas se han empleado en la evolución dirigida de otras proteínas (véanse, por ejemplo, Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; así como las patentes de EE. UU. N.25.223.409, 5.198.346 y 5.096.815).
Alternativamente, se pueden utilizar otras formas de mutagénesis para generar una biblioteca combinatoria. Por ejemplo, se pueden generar variantes de polipéptidos ActRIIB y aislar de una biblioteca por cribado usando, por ejemplo, mutagénesis por cribado de alanina y similares (Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; y Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mutagénesis por barrido de conectores (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); por mutagénesis de saturación (Meyers et al., (1986) Science 232:613); por mutagénesis por PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); o por mutagénesis al azar, que incluye mutagénesis química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; y Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Las mutagénesis por barrido de conectores, particularmente en un ámbito combinatorio, es un método atractivo para identificar formas truncadas (bioactivas) de polipéptidos ActRIIB.
Se conoce en la técnica un amplio intervalo de técnicas para cribar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparadas por mutaciones puntuales y truncaciones, y, en este caso, para cribar bibliotecas de ADNc para productos génicos que tienen una cierta propiedad. Dichas técnicas serán adaptables, en general, para el rápido cribado de bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de polipéptidos ActRIIB. Las técnicas más ampliamente usadas para cribar grandes bibliotecas de genes comprenden normalmente clonar las bibliotecas de genes en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita de forma relativamente fácil el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. Los ensayos preferidos incluyen ensayos de unión a activina y ensayos de señalización de células mediada por activina.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIB pueden comprender además modificaciones postraduccionales, además de cualquiera que esté naturalmente presente en los polipéptidos ActRIIB. Dichas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. Como resultado, los polipéptidos ActRIIB modificados pueden contener elementos no de aminoácido, tales como polietilenglicoles, lípidos, poli- o monosacáridos y fosfatos. Los efectos de dichos elementos no de aminoácido sobre la funcionalidad de un polipéptido ActRIIB se pueden probar por cualquier método conocido por el experto. Cuando un polipéptido ActRIIB se produce en células por escisión de una forma naciente del polipéptido ActRIIB, el procesamiento postraduccional también puede ser importante para el correcto plegamiento y/o función de la proteína. Células diferentes (tales como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3 o HEK293) tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades postraduccionales y se pueden elegir para garantizar la correcta modificación y procesamiento de los polipéptidos ActRIIB.
En ciertos aspectos, variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos ActRIIB incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción de los polipéptidos ActRIIB y uno o más dominios de fusión. Ejemplos bien conocidos de dichos dominios de fusión incluyen, pero no se limitan a, polihistidina, Glu-Glu, glutatión S transferasa (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina (Fc), proteína de unión a maltosa (MBP) o albúmina de suero humano. Se puede seleccionar un dominio de fusión para conferir una propiedad deseada. Por ejemplo, algunos dominios de fusión son particularmente útiles para el aislamiento de las proteínas de fusión por cromatografía de afinidad. Con el fin de purificación por afinidad, se usan matrices relevantes para la cromatografía de afinidad, tales como resinas conjugadas con glutatión, amilasa y níquel o cobalto. Muchas de dichas matrices están disponibles en forma de "kit", tales como el sistema de purificación de Pharmacia GST y el sistema QIAexpressTM (Qiagen) útil con componentes de fusión (HIS6). Como otro ejemplo, se puede seleccionar un dominio de fusión para facilitar la detección de los polipéptidos ActRIIB. Los ejemplos de dichos dominios de detección incluyen las diversas proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP) así como "marcas de epítopes," que son secuencias de péptidos normalmente cortas para las que un anticuerpo específico está disponible. Las marcas de epítopes bien conocidas para las que los anticuerpos monoclonales específicos están fácilmente disponibles incluyen marcas FLAG, hemaglutinina del virus de la gripe (HA) y c-myc. En algunos casos, los dominios de fusión tienen un sitio de escisión de la proteasa, tales como para el factor Xa o trombina, que permite que la proteasa relevante digiera parcialmente las proteínas de fusión y así libere las proteínas recombinantes de las mismas. Las proteínas liberadas se pueden aislar entonces del dominio de fusión por separación cromatográfica posterior. En ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido ActRIIB se fusiona con un dominio que estabiliza el polipéptido ActRIIB in v ivo (un dominio "estabilizador"). Por "estabilización" se indica algo que aumenta la semivida en suero, independientemente de si esto es debido a una reducción de la destrucción, una depuración reducida por el riñón, u otro efecto farmacocinético. Se conoce que las fusiones con la porción Fc de una inmunoglobulina confieren propiedades farmacocinéticas deseables en un amplio intervalo de proteínas. Asimismo, las fusiones con la albúmina de suero humano pueden conferir propiedades deseables. Otros tipos de dominios de fusión que se pueden seleccionar incluyen dominios de multimerización (por ejemplo, dimerización, tetramerización) y dominios funcionales (que confieren una función biológica adicional, tal como estimulación adicional del crecimiento óseo o crecimiento muscular, según se desee).
Se entiende que diferentes elementos de las proteínas de fusión se pueden disponer en cualquier modo que esté de acuerdo con la funcionalidad deseada. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB se puede poner carboxiterminal a un dominio heterólogo, o, alternativamente, un dominio heterólogo se puede poner carboxiterminal a un polipéptido ActRIIB. El dominio del polipéptido ActRIIB y el dominio heterólogo no necesitan estar adyacentes en una proteína de fusión, y dominios o secuencias de aminoácidos adicionales se pueden incluir carboxi- o aminoterminales a cualquier dominio o entre los dominios.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos ActRIIB contienen una o más modificaciones que son capaces de estabilizar los polipéptidos ActRIIB. Por ejemplo, dichas modificaciones potencian la semivida in v itro de los polipéptidos ActRIIB, potencian la semivida circulatoria de los polipéptidos ActRIIB o reducen la degradación proteolítica de los polipéptidos ActRIIB. Dichas modificaciones estabilizantes incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (incluyendo, por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden un polipéptido ActRIIB y un dominio estabilizador), modificaciones de un sitio de glucosilación (incluyendo, por ejemplo, adición de un sitio de glucosilación a un polipéptido ActRIIB) y modificaciones del resto de hidrato de carbono (incluyendo, por ejemplo, retirada de restos de hidrato de carbono de un polipéptido ActRIIB). En el caso de proteínas de fusión, un polipéptido ActRIIB se fusiona con un dominio estabilizador, tal como una molécula de IgG (por ejemplo, un dominio Fc). Como se usa en el presente documento, el término "dominio estabilizador" no solo se refiere a un dominio de fusión (por ejemplo, Fc), como en el caso de proteínas de fusión, sino que también incluye modificaciones no proteináceas, tales como un resto de hidrato de carbono, o polímero no proteináceo, tal como polietilenglicol.
En ciertas realizaciones, formas aisladas y/o purificadas de los polipéptidos ActRIIB, que se aíslan de, o están de otro modo sustancialmente libres de, otras proteínas se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Los polipéptidos ActRIIB se producirán, en general, por expresión de ácidos nucleicos recombinantes.
En ciertos aspectos, en el presente documento se describen ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican cualquiera de los polipéptidos ActRIIB (por ejemplo, polipéptidos ActRIIB solubles), que incluyen fragmentos, variantes funcionales y proteínas de fusión desveladas en el presente documento. Por ejemplo, SEQ ID NO: 19 codifica el polipéptido precursor de ActRIIB humano que existen de forma natural. Los ácidos nucleicos objeto pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Dichos ácidos nucleicos pueden ser moléculas de ADN o ARN. Estos ácidos nucleicos se pueden usar, por ejemplo, en métodos de preparación de polipéptidos ActRIIB o como agentes terapéuticos directos (por ejemplo, en un enfoque de terapia génica).
En ciertos aspectos, se entiende además que los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos ActRIIB incluyen ácidos nucleicos que son variantes de SEQ ID NO: 19, además de todas las variantes de aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB soluble (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43). Las secuencias de nucleótidos de variante incluyen secuencias que se diferencian en una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos, tales como variantes alélicas.
En ciertos ejemplos, las secuencias del ácido nucleico aisladas o recombinantes que se pueden usar son al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticas a SEQ ID NO: 19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43). Un experto en la técnica apreciará que las secuencias del ácido nucleico complementarias a SEQ ID NO:19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43), y variantes de SEQ ID NO: 19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 y 43) se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento. En ejemplos adicionales, las secuencias del ácido nucleico pueden ser aisladas, recombinantes y/o fusionadas con una secuencia de nucleótidos heteróloga, o en una biblioteca de ADN.
En otros ejemplos, los ácidos nucleicos que se pueden usar también incluyen secuencias de nucleótidos que se hibridan en condiciones altamente rigurosas con la secuencia de nucleótidos diseñada en SEQ ID NO: 19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43), complementan la secuencia de SEQ ID NO:19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 y 43), o fragmentos de las mismas. Como se trata anteriormente, un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación de ADN. Un experto habitual en la técnica entenderá que se pueden variar las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN. Por ejemplo, se puede realizar la hibridación en 6,0 veces cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de un lavado de 2,0 veces SSC a 50 grados Celsius. Por ejemplo, la concentración de sales en la etapa de lavado se puede seleccionar de una baja rigurosidad de aproximadamente 2,0 veces SSC a 50 grados Celsius a una alta rigurosidad de aproximadamente 0,2 veces SSC a 50 grados Celsius. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede aumentar desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22 grado Celsius, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 grados Celsius. Se pueden variar tanto la temperatura como la sal, o se puede mantener constante la temperatura o concentración de sales mientras se cambia la otra variable. En un ejemplo, los ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones de baja rigurosidad de 6 veces SSC a temperatura ambiente seguido por un lavado a 2 veces SSC a temperatura ambiente se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento.
También se pueden usar ácidos nucleicos aislados que se diferencian de los ácidos nucleicos como se exponen en SEQ ID NO: 19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB solubles (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31, 32, 33, 36, 37, 42 y 43) debido a degeneración en el código genético. Por ejemplo, varios aminoácidos se designan por más de un triplete. Los codones que especifican el mismo aminoácido, o sinónimos (por ejemplo, CAU y CAC son sinónimos de histidina) pueden dar como resultado mutaciones "silenciosas" que no afectan la secuencia de aminoácidos de la proteína. Sin embargo, se espera que los polimorfismos de secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de las proteínas objeto existan entre las células de mamífero. Un experto en la técnica apreciará que estas variaciones en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican una proteína particular pueden existir entre individuos de una especie dada debido a la variación alélica natural. Todas y cada una de dichas variaciones de nucleótidos y polimorfismos de aminoácidos resultantes se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en el presente documento.
Los ácidos nucleicos recombinantes pueden estar unidos operativamente a una o más secuencias de nucleótidos reguladoras en una construcción de expresión. Las secuencias de nucleótidos reguladoras serán, en general, apropiadas para la célula hospedadora usada para la expresión. Se conocen en la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados y secuencias reguladoras adecuadas para una variedad de células hospedadoras. Normalmente, dicha una o más secuencias de nucleótidos reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias promotoras, secuencias conductoras o señal, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y terminación de la transcripción, secuencias traduccionales de inicio y terminación y secuencias potenciadoras o activadoras. En el presente documento se pueden usar promotores constitutivos o inducibles como se conoce en la técnica con los métodos y composiciones descritos. Los promotores pueden ser o promotores que existen de forma natural, o promotores híbridos que combinan elementos de más de un promotor. Una construcción de expresión puede estar presente en una célula en un episoma, tal como un plásmido, o la construcción de expresión se puede insertar en un cromosoma. El vector de expresión puede contener un gen marcador de selección para permitir la selección de células hospedadoras transformadas. Los genes de marcadores de selección se conocen bien en la técnica y variarán con la célula hospedadora usada.
En ciertos aspectos, el ácido nucleico objeto se proporciona en un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ActRIIB y operativamente unido a al menos una secuencia reguladora. Las secuencias reguladoras son conocidas en la técnica y se seleccionan para dirigir la expresión del polipéptido ActRIIB. Por consiguiente, el término secuencia reguladora incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión. Las secuencias reguladoras a modo de ejemplo se describen en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Por ejemplo, se puede usar cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión que controlan la expresión de una secuencia de ADN cuando se une operativamente en estos vectores para expresar secuencias de ADN que codifican un polipéptido ActRIIB. Dichas secuencias de control de la expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores temprano y tardío del SV40, promotor tet, promotor temprano inmediato del adenovirus o citomegalovirus, promotores del VSR, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el promotor T7 cuya expresión es dirigida por la ARN polimerasa T7, el operador mayor y regiones promotoras de fago lambda, las regiones de control para la proteína de la envoltura fd, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticas, los promotores de fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de la levadura, el promotor poliédrico del sistema de baculovirus y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos. Se debe entender que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar y/o el tipo de proteína que se desea expresar. Además, también se debería considerar el número de copias del vector, la capacidad para controlar ese número de copias y la expresión de cualquier otra proteína codificada por el vector, tal como marcadores de antibiótico.
Se puede producir un ácido nucleico recombinante uniendo el gen clonado, o una porción del mismo, en un vector adecuado para la expresión en cualquier célula procariota, célula eucariota (levadura, aviar, insecto o mamífero), o ambas. Los vehículos de expresión para la producción de un polipéptido ActRIIB recombinante incluyen plásmidos y otros vectores. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac y plásmidos derivados de pUC para la expresión en células procariotas, tales como E. coIí .
Algunos vectores de expresión de mamífero contienen tanto secuencias procariotas para facilitar la propagación del vector en bacterias, como una o más unidades de transcripción eucariota que se expresan en células eucariotas. Los vectores derivados de pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, μMSG, pSVT7, pkoneo y pHyg son ejemplos de vectores de expresión de mamífero adecuados para la transfección de células eucariotas. Algunos de estos vectores se modifican con secuencias de plásmidos bacterianos, tales como pBR322, para facilitar la replicación y resistencia a la selección de fármacos en tanto células procariotas como eucariotas. Alternativamente, derivados de virus tales como el virus del papiloma bovino (VPB-1) o virus de Epstein-Barr (pHEBo, derivado de pREP y p205) se pueden usar para la expresión transitoria de proteínas en células eucariotas. Los ejemplos de otros sistemas de expresión víricos (incluyendo retrovíricos) se pueden encontrar en la siguiente descripción de sistemas de administración de genoterapia. Se conocen bien en la técnica diversos métodos empleados en la preparación de los plásmidos y en la transformación de organismos hospedadores. Para otros sistemas de expresión adecuados para tanto células procariotas como eucariotas, así como procedimientos recombinantes generales, véase Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3a ed., ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). En algunos casos, se puede desear expresar los polipéptidos recombinantes usando un sistema de expresión de baculovirus. Los ejemplos de dichos sistemas de expresión de baculovirus incluyen vectores derivados de pVL (tales como pVL1392, pVL1393 y pVL941), vectores derivados de pAcUW (tales como pAcUW1) y vectores derivados de pBlueBac (tales como pBlueBac III que contiene .beta.-gal).
Se puede diseñar un vector para la producción de polipéptidos ActRIIB objeto en células CHO, tales como un vector Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), vectores de pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) y vectores de pCI-neo (Promega, Madison, Wis.). Como será evidente, las construcciones génicas objeto se pueden usar para causar la expresión de polipéptidos ActRIIB objeto en células propagadas en cultivo, por ejemplo, para producir proteínas, que incluyen proteínas de fusión o proteínas de variante, para la purificación.
La presente divulgación también se refiere a una célula hospedadora transfectada con un gen recombinante que incluye una secuencia codificante (por ejemplo, SEQ ID NO: 19 o aquellas secuencias del ácido nucleico que codifican polipéptidos ActRIIB soluble (por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican SEQ ID NO: 17, 18, 23, 26, 27, 29, 30, 31,32, 33, 36, 37, 42 y 43)) para uno o más de los polipéptidos ActRIIB objeto. La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, un polipéptido ActRIIB se puede expresar en células bacterianas, tales como E. coIí , células de insecto (por ejemplo, usando un sistema de expresión de baculovirus), levadura o células de mamífero. Los expertos en la técnica conocen otras células hospedadoras adecuadas.
Por consiguiente, en el presente documento se describen métodos de producción de los polipéptidos ActRIIB. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de expresión que codifica un polipéptido ActRIIB se puede cultivar en condiciones apropiadas para permitir que ocurra la expresión del polipéptido ActRIIB. El polipéptido ActRIIB se puede secretar y aislar de una mezcla de células y medio que contiene el polipéptido ActRIIB. Alternativamente, el polipéptido ActRIIB puede ser retenido citoplásmicamente o en una fracción de membrana y las células se recogen, lisan y se aísla la proteína. Un cultivo celular incluye células hospedadoras, medios y otros subproductos. Se conocen bien en la técnica medios adecuados para el cultivo celular. Los polipéptidos ActRIIB objeto se pueden aislar del medio de cultivo celular, células hospedadoras, o ambos, usando técnicas conocidas en la técnica para purificar proteínas, que incluyen cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, ultrafiltración, electroforesis, inmunopurificación por afinidad con anticuerpos específicos contra epítopes particulares de los polipéptidos ActRIIB y purificación por afinidad con un agente que se une a un dominio fusionado con el polipéptido ActRIIB (por ejemplo, se puede usar una columna de proteína A para purificar una fusión ActRIIB-Fc). En una realización preferida, el polipéptido ActRIIB es una proteína de fusión que contiene un dominio que facilita su purificación. En una realización preferida, la purificación se logra por una serie de etapas de cromatografía en columna, que incluyen, por ejemplo, tres o más de los siguientes, en cualquier orden: cromatografía en proteína A, cromatografía en QSepharose, cromatografía en Phenyl Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio catiónico. La purificación podría ser completada con filtración vírica e intercambio de tampón. Como se demuestra en el presente documento, se purificó la proteína ActRIIB-hFc hasta una pureza de >98% como se ha determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y >95% como se ha determinado por SDS-PAGE. Este nivel de pureza fue suficiente para lograr efectos deseables sobre el hueso en ratones y un perfil de seguridad aceptable en ratones, ratas y primates no humanos.
Un gen de fusión que codifica una secuencia conductora de la purificación, tal como una secuencia del sitio de escisión de poli-(His)/enterocinasa en el extremo N de la porción deseada del polipéptido ActRIIB recombinante, puede permitir la purificación de la proteína de fusión expresada por cromatografía de afinidad usando una resina de metal Ni2+. La secuencia conductora de la purificación se pueden retirar entonces posteriormente mediante tratamiento con enterocinasa para proporcionar el polipéptido ActRIIB purificado (por ejemplo, véase Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; y Janknecht et al., p Na S USA 88:8972).
Se conocen bien las técnicas de preparación de genes de fusión. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias de polipéptidos se realiza según técnicas convencionales, empleando extremos romos o de terminación escalonada para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, relleno de extremos cohesivos según convenga, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión no deseable y unión enzimática. El gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo usando cebadores de anclaje que dan lugar a nucleótidos protuberantes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente ser hibridados para generar una secuencia de genes quiméricos (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
La proteína de fusión ActRIIB-Fc se puede expresar en células CHO-DUKX Bl 1 establemente transfectadas de un vector pAID4 (ori/potenciador del SV40, promotor del CMV), usando una secuencia conductora de plasminógeno tisular de SEQ ID NO:8. La porción Fc puede comprender una secuencia de Fc de IgG1 humana, como se muestra en SEQ ID NO:7. En ciertas realizaciones, tras la expresión, la proteína contenida tiene, en promedio, entre aproximadamente 1,5 y 2,5 moles de ácido siálico por molécula de proteína de fusión ActRIIB-Fc.
En ciertas realizaciones, la larga semivida en suero de una fusión ActRIIB-Fc puede ser 25-32 días en sujetos humanos. Además, el material expresado en células CHO puede tener una mayor afinidad por el ligando de activina B que el informado para una proteína de fusión ActRIIB-hFc expresada en células 293 humanas (del Re et al., J Biol Chem. 2004 Dec 17;279(51):53126-35). Además, sin desear quedar ligado a teoría, el uso de la secuencia conductora de TPA proporcionó mayor producción que otras secuencias conductoras y, a diferencia de ActRIIB-Fc expresada con un conductor nativo, puede proporcionar una secuencia aminoterminal altamente pura. El uso de la secuencia conductora nativa puede producir dos especies importantes de ActRIIB-Fc, cada una de las cuales tiene una secuencia aminoterminal diferente.
7.9.3 OTROS INHIBIDORES DE LA SEÑALIZACIÓN DE RECEPTORES ActRII
En ciertos ejemplos, los inhibidores de la señalización de receptores ActRII usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son compuestos de ácido nucleico.
Ejemplos de categorías de compuestos de ácido nucleico que inhiben los receptores ActRII incluyen ácidos nucleicos antisentido, construcciones de ARNip o iARN y construcciones catalíticas de ácidos nucleicos. Un compuesto de ácido nucleico puede ser mono- o bicatenario. Un compuesto bicatenario también puede incluir regiones de nucleótidos protuberantes o de no complementariedad, donde una o la otra de las cadenas es monocatenaria. Un compuesto monocatenario puede incluir regiones de autocomplementariedad, que significa que el compuesto puede formar una denominada estructura de "horquilla" o "tallo-bucle", con una región de estructura helicoidal doble.
En ciertos ejemplos, los compuestos de ácido nucleico que inhiben los receptores ActRII pueden comprender una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región que consiste en no más de 1000, no más de 500, no más de 250, no más de 100 o no más de 50, 35, 30, 25, 22, 20 o 18 nucleótidos de la secuencia del ácido nucleico de receptor ActRII de longitud completa o secuencia del ácido nucleico de activina (por ejemplo, la secuencia del ácido nucleico de una subunidad de activina A o activina B, también denominada pA o pB). En ejemplos específicos, la región de complementariedad será al menos de 8 nucleótidos, y opcionalmente al menos de 10 o al menos 15 nucleótidos, y opcionalmente entre 15 y 25 nucleótidos. Una región de complementariedad puede entrar dentro de un intrón, una secuencia codificante o una secuencia no codificante del transcrito diana, tal como la porción de la secuencia codificante. En general, un compuesto de ácido nucleico que inhibe un receptor ActRII tendrá una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 500 nucleótidos o pares de bases de longitud, y opcionalmente la longitud será aproximadamente 14 a aproximadamente 50 nucleótidos. Un compuesto de ácido nucleico que inhibe un receptor ActRII puede ser un ADN (particularmente para su uso como un antisentido), un ARN, o un híbrido ARN:ADN. Una cadena cualquiera puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no se pueden clasificar fácilmente como cualquiera de ADN o ARN. Asimismo, un compuesto de ácido nucleico bicatenario puede ser ADN:ADN, ADN:ARN o ARN:ARN, y una cadena cualquiera también puede incluir una mezcla de ADN y ARN, así como formas modificadas que no se pueden clasificar fácilmente como cualquiera de ADN o ARN.
Los compuestos de ácido nucleico que inhiben un receptor de ActRII pueden incluir cualquiera de una variedad de modificaciones, que incluyen una o modificaciones al esqueleto (la porción del fosfato de azúcar en un ácido nucleico natural, que incluye enlaces internucleotídicos) o la porción de base (la porción de purina o pirimidina de un ácido nucleico natural). En ciertos ejemplos, un compuesto de ácido nucleico antisentido tendrá una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos y contendrá frecuentemente una o más modificaciones para mejorar ciertas características, tales como estabilidad en el suero, estabilidad en una célula o estabilidad en un lugar donde el compuesto es probable que se administre, tal como, por ejemplo, el estómago en el caso de compuestos administrados por vía oral y el pulmón para compuestos inhalados. En el caso de una construcción de iARN, la cadena complementaria al transcrito diana será, en general, ARN o modificaciones del mismo. La otra cadena puede ser ARN, ADN, o cualquier otra variación. La porción de dúplex de construcción bicatenaria o monocatenaria de iARN de "horquilla" puede tener, en ciertos ejemplos, una longitud de 18 a 40 nucleótidos de longitud y opcionalmente aproximadamente 21 a 23 nucleótidos de longitud, mientras que sirva de un sustrato de Dicer. Los ácidos nucleicos catalíticos o enzimáticos pueden ser ribozimas o enzimas de ADN y también pueden contener formas modificadas. En ciertos ejemplos, los compuestos de ácido nucleico que inhiben a los receptores ActRII pueden inhibir la expresión de su diana en aproximadamente 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, o más, en condiciones fisiológicas y a una concentración donde un control no sentido o sentido tiene poco o ningún efecto. Las concentraciones para probar el efecto de los compuestos de ácido nucleico incluyen 1, 5, 10 micromolar, o más.
En otros ejemplos, los inhibidores de la señalización de receptores ActRII usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son anticuerpos. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos que se unen a activina (particularmente las subunidades de activina A o B, también denominadas pA o pB) y alteran la unión al receptor ActRII; y anticuerpos que se unen a polipéptidos del receptor ActRII (por ejemplo, un polipéptido ActRIIA soluble o ActRIIB soluble) y alteran la unión a activina.
Usando inmunógenos derivados de un polipéptido receptor de ActRII o un polipéptido de activina, se pueden preparar antisueros anti-proteína/anti-péptido o anticuerpos monoclonales por protocolos convencionales (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. por Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo se puede inmunizar con una forma inmunogénica del polipéptido receptor ActRII, un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de anticuerpos, o una proteína de fusión. Las técnicas para conferir inmunogenicidad a una proteína o péptido incluyen conjugación con vehículos u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Una porción inmunogénica de un receptor ActRII o polipéptido de activina se puede administrar en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización se puede monitorizar por detección de títulos de anticuerpos en plasma o suero. Se pueden usar ELISA convencional u otros inmunoensayos con el inmunogén como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos.
Tras la inmunización de un animal con una preparación antigénica de un polipéptido receptor ActRII, se pueden obtener antisueros y, si se desea, se pueden aislar anticuerpos policlonales del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden recoger células productoras de anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionar por procedimientos habituales de fusión de células somáticas con células inmortalizantes, tales como células de mieloma para dar células de hibridoma. Dichas técnicas se conocen bien en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridomas (originalmente desarrollada por Kohler y Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), la técnica de hibridomas de linfocitos B humanos (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) y la técnica VEB-hibridomas para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96). Se pueden cribar inmunoquímicamente células de hibridoma para la producción de anticuerpos reactivos específicamente con un polipéptido receptor ActRII y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que comprende dichas células de hibridoma.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende incluir fragmentos del mismo que también son específicamente reactivos con un polipéptido objeto. Los anticuerpos pueden ser fragmentados usando técnicas convencionales y los fragmentos se criban para su utilidad del mismo modo que se ha descrito anteriormente para anticuerpos completos. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab)2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante se puede tratar para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. Se pretende además que un anticuerpo incluya moléculas biespecíficas, monocatenarias, quiméricas, humanizadas y completamente humanas que tienen afinidad por un receptor ActRII o polipéptido de activina conferido por al menos una región CDR del anticuerpo. Un anticuerpo puede comprender además una marca unida al mismo y capaz de ser detectada (por ejemplo, la marca puede ser un radioisótopo, compuesto fluorescente, enzima o cofactor de enzima).
En ciertos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, término que engloba cualquier anticuerpo generado en parte por técnicas de biología molecular, que incluyen anticuerpos injertados en CDR o quiméricos, anticuerpos humanos u otros ensamblados de dominios de anticuerpo seleccionados de bibliotecas, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos de un solo dominio (por ejemplo, proteínas VH humanas o proteínas VHH de camélido). En ciertos ejemplos, un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, un método para generar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un polipéptido receptor ActRII o polipéptido de activina puede comprender administrar a un ratón una cantidad de una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de antígeno eficaz para estimular una respuesta inmunitaria detectable, obtener células productoras de anticuerpo (por ejemplo, células del bazo) del ratón y fusionar las células productoras de anticuerpo con células de mieloma para obtener hibridomas productores de anticuerpos, y probar los hibridomas productores de anticuerpos para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno. Una vez obtenido, un hibridoma se puede propagar en un cultivo celular, opcionalmente en condiciones de cultivo, donde las células derivadas de hibridoma producen el anticuerpo monoclonal que se une específicamente al antígeno. El anticuerpo monoclonal se puede purificar del cultivo celular.
El adjetivo "reactivo específicamente con", como se usa en referencia a un anticuerpo, pretende significar, como se entiende, en general, en la técnica, que el anticuerpo es suficientemente selectivo entre el antígeno de interés (por ejemplo, un polipéptido receptor ActRII) y otros antígenos que no son de interés para los que el anticuerpo es útil, como mínimo, para detectar la presencia del antígeno de interés en un tipo particular de muestra biológica. En ciertos métodos que emplean el anticuerpo, tales como aplicaciones terapéuticas, puede ser conveniente un mayor grado de especificidad en la unión. Los anticuerpos monoclonales tienen, en general, una mayor tendencia (en comparación con los anticuerpos policlonales) para discriminar eficazmente entre los antígenos deseados y los polipéptidos que reaccionan de forma cruzada. Una característica que influye en la especificidad de una interacción anticuerpo: antígeno es la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Aunque la especificidad deseada se puede alcanzar con un intervalo de afinidades diferentes, en general, los anticuerpos preferidos tendrán una afinidad (una constante de disociación) de aproximadamente 10-6, 10­ 7, 10-8, 10-9 o menos. Dada la unión extraordinariamente fuerte entre la activina y un receptor ActRII, se espera que un anticuerpo neutralizante anti-activina o anti-receptor ActRII tenga, en general, una constante de disociación de 10-10 o menos.
Además, las técnicas usadas para cribar anticuerpos para identificar un anticuerpo deseable pueden influir en las propiedades del anticuerpo obtenido. Por ejemplo, si un anticuerpo se va a usar para la unión de un antígeno en disolución, se puede desear probar la unión en disolución. Están disponibles una variedad de diferentes técnicas para probar la interacción entre anticuerpos y antígenos para identificar anticuerpos particularmente deseables. Dichas técnicas incluyen ELISA, ensayos de unión de resonancia de plasmones superficiales (por ejemplo, el ensayo de unión Biacore.TM., Biacore AB, Uppsala, Suecia), ensayos de sándwich (por ejemplo, el sistema de perlas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Md.), transferencias Western, ensayos de inmunoprecipitación e inmunohistoquímica.
En ciertos ejemplos, los inhibidores de la señalización de receptores ActRII que se van a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen formas alternativas de activina, particularmente aquellas con alteraciones en el dominio de unión de receptor de tipo I que pueden unirse a receptores de tipo II y dejan de formar un complejo ternario activo. En ciertos ejemplos, los ácidos nucleicos, tales como las moléculas antisentido, ARNip o ribozimas que inhiben activina A, B, C o E, o, particularmente, la expresión del receptor ActRII, se pueden usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento. En ciertos ejemplos, los inhibidores de la señalización de receptores ActRII que se van a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento presentan selectividad por la inhibición de la señalización mediada por activina frente a otros miembros de la familia de TGF-beta, particularmente con respecto a GDF8 y GDF11.
En otros ejemplos, los inhibidores de la señalización de receptores ActRII usados en las composiciones y métodos descritos en el presente documento son proteínas distintas de anticuerpo con actividad de antagonista del receptor ActRII, que incluyen inhibina (es decir, subunidad de inhibina alfa), folistatina (por ejemplo, folistatina-288 y folistatina-315), Cerberus, proteína relacionada con folistatina ("FSRP"), endoglina, activina C, alfa(2)-macroglobulina y una activina A mutante M108A (cambio de metionina a alanina en la posición 108).
En un ejemplo específico, el inhibidor de la señalización de receptores de ActRII que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es un polipéptido de folistatina que antagoniza la bioactividad de activina y/o se une a activina. El término "polipéptido de folistatina" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de folistatina que existe de forma natural, así como cualquier variante del mismo (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas de peptidomimético) que retiene una actividad útil, e incluye además cualquier monómero o multímero funcional de folistatina. Las variantes de polipéptidos de folistatina que retienen propiedades de unión a activina se pueden identificar basándose en estudios previos que implican interacciones de folistatina y activina. Por ejemplo, el documento de patente WO2008/030367 desvela dominios específicos de folistatina ("FSD") que se muestra que son importantes para la unión de activina. Los polipéptidos de folistatina incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier folistatina conocida que tienen una secuencia al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido de folistatina, y opcionalmente al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad. Los ejemplos de polipéptidos de folistatina incluyen el polipéptido de folistatina maduro o isoformas más cortas u otras variantes del polipéptido precursor de folistatina humano como se describen, por ejemplo, en el documento de patente WO2005/025601.
En ejemplos específicos, el inhibidor de la señalización de receptores de ActRII que se va a usar en las composiciones y métodos descritos en el presente documento es un gen relacionado de tipo folistatina (FLRG) que antagoniza la bioactividad de activina y/o se une a activina. El término "polipéptido de FLRG" incluye polipéptidos que comprenden cualquier polipéptido de FLRG que existe de forma natural, así como cualquier variante de los mismos (incluyendo mutantes, fragmentos, fusiones y formas de peptidomimético) que retienen una actividad útil. Las variantes de polipéptidos FLRG que retienen propiedades de unión a activina se pueden identificar usando métodos rutinarios para ensayar interacciones de FLRG y activina. Véanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 6.537.96. Los polipéptidos de FLRG incluyen polipéptidos derivados de la secuencia de cualquier FLRG conocido que tienen una secuencia al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de un polipéptido FLRG, y opcionalmente al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor identidad.
En ciertos ejemplos, variantes funcionales o formas modificadas de los polipéptidos de folistatina y polipéptidos FLRG incluyen proteínas de fusión que tienen al menos una porción de los polipéptidos de folistatina o polipéptidos FLRG y uno o más dominios de fusión, tales como, por ejemplo, dominios que facilitan el aislamiento, la detección, la estabilización o la multimerización del polipéptido. Los dominios de fusión adecuados se tratan con detalle anteriormente con referencia a los polipéptidos ActRIIA y ActRIIB. En un ejemplo, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido de folistatina fusionado con un dominio Fc. En otro ejemplo, un inhibidor de la señalización de receptores ActRII es una proteína de fusión que comprende una porción de unión a activina de un polipéptido FLRG fusionado con un dominio Fc.
7.10 ENSAYOS
Se pueden probar diversas variantes de polipéptidos ActRII, o variantes de polipéptidos ActRII solubles, para su capacidad para inhibir ActRII. Además, se pueden probar compuestos para su capacidad para inhibir ActRII. Una vez se confirman los inhibidores de la actividad de señalización de ActRII, estos compuestos se pueden usar con los métodos de la descripción. ActRII puede ser ActRIIA o ActRIIB. Los ensayos que siguen se describen para ActRIIA, pero se pueden realizar análogamente para ActRIIB. Estos ensayos se pueden usar para (i) identificar en un sujeto anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, subpoblaciones de sujetos con SMD y/o LMMC no proliferativa; (ii) diagnosticar en un sujeto anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, sujetos con SMD y/o LMMC no proliferativa; (iii) monitorizar en un sujeto anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, continuación y/o progresión de la enfermedad de SMD y/o LMMC no proliferativa; (iv) monitorizar en un sujeto la eficacia de los métodos proporcionados en el presente documento para el tratamiento en un sujeto de anemia, anemia que requiere transfusión de RBC, SMD y/o LMMC no proliferativa; y/o (v) monitorizar en un sujeto la eficacia de inhibidores de la señalización de ActRII descritos en el presente documento.
7.10.1 POBLACIÓN DE REFERENCIA
En ciertas realizaciones, el tamaño de la población de referencia puede ser aproximadamente 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200, 250, 300, 400, 500 o 1000 individuos. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en voluntarios aleatorios. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sanas. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas de la misma edad, peso y/o sexo que la población de pacientes como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sin un trastorno relacionado con la sangre. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas con un trastorno relacionado con la sangre, en donde las personas en la población de referencia no tienen sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas con un trastorno relacionado con la sangre, en donde menos del 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, or 1% de los eritroblastos en las personas son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas con un trastorno relacionado con la sangre, en donde menos del 15% de los eritroblastos en las personas son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el trastorno relacionado con la sangre es un trastorno relacionado con la sangre como se describe en la Sección 7.8. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sin anemia. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sin anemia que requieren transfusión de RBC. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sin SMD. En ciertas realizaciones, la población de referencia consiste en personas sin LMMC no proliferativa.
7.10.2 SIDEROBLASTOS EN ANILLO
Los sideroblastos en anillo son eritroblastos anormales. Además, ciertas mutaciones somáticas asociadas al SMD provocan la formación de sideroblastos en anillo y eritropoyesis ineficaz. Las mutaciones dominantes en el factor 3B1 de corte y empalme (SF3B1) están asociadas con la formación de sideroblastos en anillo. Como se usa en el presente documento, "RS+" se refiere a un sujeto en el que al menos 15% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el porcentaje de sideroblastos en anillo es el porcentaje de eritroblastos que son sideroblastos en anillo. En ciertas realizaciones, el porcentaje de sideroblastos en anillo es el porcentaje de precursores eritroides que son sideroblastos en anillo. Los sideroblastos en anillo son eritroblastos en los que existe un mínimo de cinco gránulos (sideróticos) que contienen hierro que cubren al menos un tercio de la circunferencia del núcleo. Véase Mufti et al., 2008, Haematologica, 93(11):1712-7 para una descripción de la identificación de sideroblastos en anillo en una muestra. En sideroblastos en anillo, las mitocondrias cargadas de hierro se visualizan como un anillo perinuclear de gránulos azules cuando se tiñen con azul de Prusia. Los sideroblastos en anillo se pueden detectar en sangre periférica y/o frotis de médula ósea. En aspectos particulares de los métodos proporcionados en el presente documento, los sideroblastos en anillo están en aspirador de la médula ósea.
7.10.3 ENSAYOS DE CRIBADO
Se pueden probar diversas variantes de polipéptidos ActRII, o variantes de polipéptidos ActRII solubles, para su capacidad para inhibir ActRII. Además, se pueden probar compuestos para su capacidad para inhibir ActRII. Una vez se confirman los inhibidores de señalización de la actividad de ActRII, estos compuestos se pueden usar con los métodos proporcionados en el presente documento. ActRII puede ser ActRIIA o ActRIIB. Los ensayos que siguen se describen para ActRIIA, pero se pueden realizar análogamente para ActRIIB.
Por ejemplo, se puede evaluar el efecto de una variante de polipéptido ActRIIA sobre la expresión de genes implicados en la producción de hueso o destrucción de hueso. Esto se puede realizar, según se necesite, en presencia de una o más proteínas de ligando de ActRIIA recombinante (por ejemplo, activina), y las células se pueden transfectar para producir un polipéptido ActRIIA y/o variantes del mismo, y opcionalmente, un ligando de ActRIIA. Asimismo, un polipéptido ActRIIA se puede administrar a un ratón u otro animal, y se pueden evaluar una o más propiedades del hueso, tales como densidad o volumen. También se puede evaluar la tasa de consolidación de las fracturas óseas. La absorciometría con rayos X de doble energía (DEXA) es una técnica bien establecida, no invasiva y cuantitativa para evaluar la densidad ósea en un animal. En seres humanos se pueden usar sistemas de DEXA centrales para evaluar la densidad ósea en la columna vertebral y la pelvis. Estos son los mejores factores pronósticos de la densidad ósea global. Se pueden usar sistemas de DEXA periféricos para evaluar la densidad ósea en huesos periféricos, que incluyen, por ejemplo, los huesos de la mano, la muñeca, el tobillo y el pie. Se pueden usar sistemas de obtención de imágenes por rayos X tradicionales, que incluyen TAC, para evaluar el crecimiento de hueso y la consolidación de la fractura. Además, la densidad ósea se puede medir usando tomografía computrizada cuantitativa (qCT). También se puede evaluar la resistencia mecánica del hueso.
En ciertos aspectos, en el presente documento se describe el uso de polipéptidos ActRIIA (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA solubles) y polipéptidos de activina para identificar compuestos (agentes) que son agonistas o antagonistas de la vía de señalización de activina-ActRIIA. Los compuestos identificados mediante esta selección se pueden probar para evaluar su capacidad para modular el crecimiento o la mineralización óseos in vitro. Opcionalmente, estos compuestos se pueden probar además en modelos animales para evaluar su capacidad para modular el crecimiento de tejido in vivo.
Existen numerosos enfoques para cribar agentes terapéuticos para modular el crecimiento de tejido por direccionamiento de activina y polipéptidos ActRIIA. En ciertos ejemplos, el cribado de alta resolución de compuestos se puede llevar a cabo identificando agentes que perturban los efectos mediados por activina o ActRIIA sobre el hueso. En ciertos ejemplos, el ensayo se lleva a cabo para cribar e identificar compuestos que inhiben o reducen específicamente la unión de un polipéptido ActRIIA a activina. Alternativamente, el ensayo se puede usar para identificar compuestos que potencian la unión de un polipéptido ActRIIA a activina. En una realización adicional, los compuestos se pueden identificar por su capacidad para interactuar con un polipéptido de activina o ActRIIA.
Será suficiente una variedad de formatos de ensayo y, en vista de la presente divulgación, aquellos no explícitamente descritos en el presente documento serán, sin embargo, comprendidos por un experto habitual en la técnica. Como se describe en el presente documento, los compuestos de prueba (agentes) usados en el presente documento pueden ser creados por cualquier método químico combinatorio. Alternativamente, los compuestos objeto pueden ser biomoléculas que existen de forma natural sintetizadas in v ivo o in vitro. Los compuestos (agentes) a probar para su capacidad para actuar de moduladores del crecimiento de tejido se pueden producir, por ejemplo, por bacterias, levadura, plantas u otros organismos (por ejemplo, productos naturales), producidos químicamente (por ejemplo, moléculas pequeñas, que incluyen peptidomiméticos), o producidos recombinantemente. Los compuestos de prueba contemplados en el presente documento incluyen moléculas orgánicas no de peptidilo, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, azúcares, hormonas y moléculas del ácido nucleico. En una realización específica, el agente de prueba es una molécula orgánica pequeña que tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 2.000 dáltones.
Los compuestos de prueba se pueden proporcionar como entidades discretas individuales, o proporcionar en bibliotecas de mayor complejidad, tales como preparadas por química combinatoria. Estas bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alcoholes, haluros de alquilo, aminas, amidas, ésteres, aldehídos, éteres y otras clases de compuestos orgánicos. La presentación de compuestos de prueba al sistema de prueba puede ser en o una forma aislada o como mezclas de compuestos, especialmente en etapas de cribado iniciales. Opcionalmente, los compuestos pueden ser derivatizados con otros compuestos y tener grupos de derivatización que facilitan el aislamiento de los compuestos. Los ejemplos no limitantes de grupos de derivatización incluyen biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína verde fluorescente, isótopos, polihistidina, perlas magnéticas, glutatión S transferasa (GST), reticulantes fotoactivables o cualquier combinación de los mismos.
En muchos programas de selección de fármacos que prueban bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alta resolución para maximizar el número de compuestos analizados en un periodo de tiempo dado. Se prefieren frecuentemente ensayos que se realizan en sistemas sin células, tal que se puedan derivar con proteínas purificadas o semipurificadas, como cribados "primarios" ya que se pueden generar para permitir el rápido desarrollo y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de prueba. Además, los efectos de toxicidad celular o biodisponibilidad del compuesto de prueba pueden ser, en general, ignorados en el sistema in v itro , estando el ensayo en su lugar centrado principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular como puede manifestarse en una alteración de la afinidad de unión entre un polipéptido ActRIIA y activina.
Simplemente para ilustración, en un ensayo de cribado a modo de ejemplo, el compuesto de interés se pone en contacto con un polipéptido ActRIIA aislado y purificado que es, en general, capaz de unirse a activina. A la mezcla del compuesto y el polipéptido ActRIIA se añade entonces una composición que contiene un ligando de ActRIIA. La detección y cuantificación de complejos de ActRIINactivina proporciona un medio para determinar la eficacia del compuesto en la inhibición (o potenciamiento) de la formación de complejos entre el polipéptido ActRIIA y activina. La eficacia del compuesto se puede evaluar generando curvas de respuesta a dosis de datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de prueba. Además, también se puede realizar un ensayo de control para proporcionar un nivel basal para la comparación. Por ejemplo, en un ensayo de control, se añade activina aislada y purificada a una composición que contiene el polipéptido ActRIIA, y la formación del complejo ActRIINactivina se cuantifica en ausencia del compuesto de prueba. Se entenderá que, en general, se puede variar el orden en el que los reactantes se pueden mezclar, y se pueden mezclar simultáneamente. Además, en lugar de proteínas purificadas, se pueden usar extractos celulares y lisados para obtener un sistema de ensayo sin células adecuado.
La formación de complejos entre el polipéptido ActRIIA y activina se puede detectar mediante una variedad de técnicas. Por ejemplo, la modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada usando, por ejemplo, proteínas detectablemente marcadas, tales como polipéptido ActRIIA radiomarcado (por ejemplo, 32P, 35S, 14C o 3H), fluorescentemente marcado (por ejemplo, FITC) o enzimáticamente marcado, o activina, por inmunoensayo, o por detección cromatográfica.
En ciertos ejemplos, en el presente documento se contempla el uso de ensayos de polarización de fluorescencia y ensayos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) en la medición, ya sea directa o indirecta, del grado de interacción entre un polipéptido ActRIIA y su proteína de unión. Además, otros modos de detección, tales como los basados en guías de ondas ópticas (publicación PCT WO 96/26432 y la patente de EE. UU. N.° 5.677.196), resonancia de plasmones superficiales (SPR), sensores de carga superficial y sensores de fuerza superficial, son compatibles con muchos ejemplos descritos en el presente documento.
Además, se puede usar un ensayo de trampa de interacción, también conocido como el "ensayo de dos híbridos", para identificar agentes que alteran o potencian la interacción entre un polipéptido ActRIIA y su proteína de unión. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; y Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). En un ejemplo específico, en el presente documento se contempla el uso de sistemas inversos de dos híbridos para identificar compuestos (por ejemplo, moléculas pequeñas o péptidos) que disocian interacciones entre un polipéptido ActRIIA y su proteína de unión. Véase, por ejemplo, Vidal y Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal y Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; y las patentes de EE. UU. N.25.525.490; 5.955.280; y 5.965.368.
En ciertos ejemplos, los compuestos objeto se identifican por su capacidad para interactuar con un polipéptido ActRIIA o activina. La interacción entre el compuesto y el polipéptido ActRIIA o activina puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, dicha interacción se puede identificar al nivel de proteína usando métodos bioquímicos in vitro, que incluyen fotorreticulación, unión a ligando radiomarcado y cromatografía de afinidad (Jakoby W B et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1). En ciertos casos, los compuestos se pueden cribar en un ensayo basado en mecanismo, tal como un ensayo para detectar compuestos que se unen a un polipéptido activina o ActRIIA. Esto puede incluir un evento de unión en fase sólida o fase líquida. Alternativamente, el gen que codifica un polipéptido activina o ActRIIA se puede transfectar con un sistema indicador (por ejemplo, p-galactosidasa, luciferasa o proteína verde fluorescente) en una célula y cribar contra la biblioteca, preferentemente por un cribado de alta resolución o con miembros individuales de la biblioteca. Se pueden usar otros ensayos de unión basados en mecanismo, por ejemplo, ensayos de unión que detectan cambios en la energía libre. Los ensayos de unión se pueden realizar con la diana fijada a un pocillo, perla o chip, o capturar por un anticuerpo inmovilizado o resolver por electroforesis capilar. Los compuestos unidos se pueden detectar normalmente usando colorimetría o fluorescencia o resonancia de plasmones superficiales.
En ciertos aspectos, en el presente documento se describen métodos y agentes para modular (estimular o inhibir) la formación de hueso y aumentar la masa ósea. Por lo tanto, cualquier compuesto identificado se puede probar en células completas o tejidos, in v itro o in vivo, para confirmar su capacidad para modular el crecimiento o la mineralización óseos. Se pueden utilizar para este fin diversos métodos conocidos en la técnica. En particular, los compuestos se pueden probar por su capacidad para aumentar la renovación ósea.
Por ejemplo, el efecto de los polipéptidos ActRIIA o activina o compuestos de prueba sobre el crecimiento de hueso o cartílago se puede determinar midiendo la inducción de Msx2 o la diferenciación de células osteoprogenitoras en osteoblastos en ensayos basados en células (véase, por ejemplo, Daluiski et al., Nat Genet. 2001,27(1 ):84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Otro ejemplo de ensayos basados en células incluye analizar la actividad osteogénica de los polipéptidos de ActRIIA o activina objeto y compuestos de prueba en células progenitoras y osteoblásticas mesenquimatosas. Para ilustración, se pueden construir adenovirus recombinantes que expresan una activina o polipéptido ActRIIA para infectar células C3H10T1/2 progenitoras mesenquimatosas pluripotentes, células C2Cl2 preosteoblásticas y células TE-85 osteoblásticas. La actividad osteogénica se determina entonces midiendo la inducción de fosfatasa alcalina, osteocalcina y mineralización de la matriz (véase, por ejemplo, Cheng et al., J Bone Joint Surg Am.
2003, 85-A(8): 1544-52).
En el presente documento también se describen ensayos in v ivo para medir el crecimiento de hueso o cartílago. Por ejemplo, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001) desvela un modelo osteoporótico de rata en el que se estudia la reparación ósea durante el periodo inicial después de la fractura. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) también desvela un modelo osteoporótico de rata en el que se estudia la reparación ósea durante el periodo tardío después de la fractura. Andersson et al., J. Endocrinol. 170:529-537 describen un modelo de osteoporosis de ratón en el que los ratones son ovariectomizados, que hace que los ratones pierdan un contenido sustancial de hueso mineral y densidad mineral ósea, perdiendo el hueso trabecular aproximadamente el 50% de densidad mineral ósea. La densidad ósea se podría aumentar en los ratones ovariectomizados por administración de factores, tales como hormona paratiroidea. En ciertos aspectos, se pueden usar los ensayos de consolidación de fracturas que se conocen en la técnica. Estos ensayos incluyen técnica de fractura, análisis histológico y análisis biomecánico, que se describen en, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 6.521.750 para la divulgación de protocolos experimentales para causar, así como medir, el grado de fracturas, y el proceso de reparación.
7.11 COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS
Se pueden formular antagonistas de activina ActRII (por ejemplo, polipéptidos ActRII) con un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso con los métodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se puede administrar un polipéptido ActRII solo o como un componente de una formulación farmacéutica (composición terapéutica). Los compuestos objeto se pueden formular para administración en cualquier modo conveniente para su uso en medicina o veterinaria. ActRII puede ser ActRIIA o ActRIIB.
En ciertas realizaciones, el método terapéutico según la invención incluye administrar la composición por vía sistémica, o por vía local, como un implante o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para su uso en la presente invención está, por supuesto, en una forma fisiológicamente aceptable sin pirógenos. Los agentes terapéuticamente útiles distintos de los antagonistas de ActRII que también se pueden incluir opcionalmente en la composición que se ha descrito anteriormente se pueden administrar simultáneamente o uno detrás de otro con los compuestos objeto (por ejemplo, polipéptidos ActRII, tales como polipéptidos ActRIIA y/o ActRIIB (véase la Sección 7.9)).
Normalmente, los antagonistas de ActRII se administrarán por vía parenteral. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral pueden comprender uno o más polipéptidos ActRII en combinación con una o más disoluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables, o polvos estériles que se pueden reconstituir en disoluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos que convierten la formulación en isotónica con la sangre del receptor previsto o agentes de suspensión o espesantes. Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que se pueden emplear en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, usando materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersiones, y usando tensioactivos.
Además, la composición se puede encapsular o inyectar en una forma para la administración a un sitio de tejido diana (por ejemplo, hueso). En ciertas realizaciones, las composiciones pueden incluir una matriz capaz de suministrar uno o más compuestos terapéuticos (por ejemplo, polipéptidos ActRIIA) a un sitio de tejido diana (por ejemplo, hueso), proporcionando una estructura para el tejido en desarrollo y óptimamente capaz de ser resorbido en el cuerpo. Por ejemplo, la matriz puede proporcionar liberación lenta de los polipéptidos ActRIIA. Dichas matrices se pueden formar de materiales actualmente en uso para otras aplicaciones médicas implantadas.
La elección del material matriz se basa en biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, aspecto cosmético y propiedades de interfase. La aplicación particular de las composiciones objeto definirán la formulación apropiada. Posibles matrices para las composiciones pueden ser sulfato de calcio biodegradable y químicamente definido, fosfato de tricalcio, hidroxiapatita, ácido poliláctico y polianhídridos. Otros posibles materiales son biodegradables y biológicamente bien definidos, tales como hueso o colágeno dérmico. Otras matrices comprenden proteínas puras o componentes de la matriz extracelular. Otras posibles matrices son no biodegradables y están químicamente definidas, tales como hidroxiapatita sinterizada, biovidrio, aluminatos u otros cerámicos. Las matrices pueden comprender combinaciones de cualquiera de los tipos de material mencionados anteriormente, tales como ácido poliláctico e hidroxiapatita o colágeno y fosfato de tricalcio. Los biocerámicos se pueden alterar en la composición, tal como en calcioaluminato-fosfato, y procesar para alterar el tamaño de poro, tamaño de partículas, forma de la partícula y biodegradabilidad.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII se puede administrar por vía oral, por ejemplo, en forma de cápsulas, sellos, píldoras, comprimidos, pastillas para chupar (usando una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto), polvos, gránulos, o como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso, o como una emulsión líquida de aceite en agua o de agua en aceite, o como un elixir o jarabe, o como pastillas (usando una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y goma arábiga) y/o como enjuagues bucales y similares, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada de un agente como principio activo. Un agente también se puede administrar como un bolo, electuario o pasta.
En formas farmacéuticas sólidas para administración por vía oral (cápsulas, comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, polvos, gránulos y similares), se puede mezclar uno o más compuestos terapéuticos proporcionados en el presente documento con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como citrato de sodio o fosfato de dicalcio, y/o cualquiera de los siguientes: (1) cargas o sustancias de relleno, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y/o ácido silícico; (2) aglutinantes, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y/o goma arábiga; (3) humectantes, tales como glicerol; (4) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato cálcico, patata o almidón de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico; (5) agentes retardantes de la disolución, tales como parafina; (6) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (7) agentes humectantes, tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (8) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; (9) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y mezclas de los mismos; y (10) colorantes. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las composiciones farmacéuticas también pueden comprender agentes de tamponamiento. Las composiciones sólidas de un tipo similar también se puede emplear como cargas en cápsulas de gelatina blanda y dura usando excipientes, tales como lactosa o azúcares de la leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares.
Formas farmacéuticas líquidas para administración por vía oral incluyen emulsiones, microemulsiones, disoluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del principio activo, las formas farmacéuticas líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente usados en la técnica, tales como agua u otros disolventes, solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitano, y mezclas de los mismos. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales también pueden incluir adyuvantes, tales como agentes humectantes, emulsionantes y agentes de suspensión, edulcorantes, aromatizantes, colorantes, perfumantes y conservantes.
Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilensorbitol y ésteres de sorbitano, celulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, y mezclas de los mismos.
Las composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede garantizar por la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, y similares. También puede desearse incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro sódico y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede provocar por la inclusión de agentes que retrasan la absorción, tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Se entiende que la pauta posológica será determinada por el médico adjunto considerando diversos factores que modifican la acción de los compuestos objeto de la invención (por ejemplo, polipéptidos ActRII, tales como polipéptidos ActRIIA y/o ActRIIB (véase la Sección 7.9)). Los diversos factores incluyen, pero no se limitan a, cantidad de peso de hueso que se desea formar, el grado de pérdida de densidad ósea, el sitio de daño óseo, la condición del hueso dañado, la edad del sujeto, sexo y dieta, la intensidad de cualquier enfermedad que pueda ser que contribuya a la pérdida de hueso, el tiempo de administración y otros factores clínicos. Opcionalmente, la dosis puede variar con el tipo de matriz usado en la reconstitución y los tipos de compuestos en la composición. La adición de otros factores de crecimiento conocidos a la composición final también puede afectar la dosis. El progreso se puede monitorizar por evaluación periódica del crecimiento y/o reparación ósea, por ejemplo, rayos X (incluyendo DEXA), determinaciones histomorfométricas y marcado con tetraciclinas.
En el presente documento se desvela una terapia génica para la producción in v ivo de polipéptidos ActRII. Dicha terapia lograría su efecto terapéutico por introducción de las secuencias de polinucleótidos ActRII en células o tejidos que tienen los trastornos que se enumeraron anteriormente. La administración de secuencias de polinucleótidos ActRII se puede lograr usando un vector de expresión recombinante, tal como un virus quimérico o un sistema de dispersión coloidal. Para la administración terapéutica de secuencias de polinucleótidos ActRII se prefiere el uso de liposomas dirigidos. Los polipéptidos ActRII pueden ser polipéptidos ActRIIA y/o ActRIIB (véase la Sección 7.9)).
Diversos vectores víricos que se pueden utilizar para la genoterapia como se enseña en el presente documento incluyen adenovirus, virus del herpes, variolovacuna o, preferentemente, un virus de ARN, tal como un retrovirus. Preferentemente, el vector retrovírico es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Los ejemplos de vectores retrovíricos en los que un gen extraño individual se puede insertar incluyen, pero no se limitan a: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un marcador de selección de manera que las células transducidas se puedan identificar y generar. Los vectores retrovíricos se pueden hacer específicos de diana uniendo, por ejemplo, un azúcar, un glicolípido o una proteína. El direccionamiento preferido se lleva a cabo usando un anticuerpo. Los expertos en la técnica reconocerán que las secuencias de polinucleótidos específicas se pueden insertar en el genoma retrovírico o unir a una envoltura vírica para permitir la administración específica de diana del vector retrovírico que contiene el polinucleótido ActRII. En un ejemplo preferido, el vector se dirige a hueso o cartílago.
Alternativamente, el cultivo de células de tejido se puede transfectar directamente con plásmidos que codifican los genes estructurales retrovíricos gag, pol y env, por transfección convencional con fosfato de calcio. Estas células se transfectan entonces con el plásmido vector que contiene los genes de interés. Las células resultantes liberan el vector retrovírico en el medio de cultivo.
Otra administración elegida como sistema diana para polinucleótidos ActRII es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferido es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificiales que son útiles como vehículos de administración in v itro e in vivo. Se pueden encapsular ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y se administran a células en una forma biológicamente activa (véase por ejemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Se conocen en la técnica métodos para la eficiente transferencia génica usando un vehículo de liposoma, véase por ejemplo, Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. La composición del liposoma es normalmente una combinación de fosfolípidos, normalmente en combinación con esteroides, especialmente colesterol. También se pueden usar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes.
Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. El direccionamiento de liposomas también es posible basándose en, por ejemplo, la especificidad por órgano, la especificidad por célula y la especificidad por orgánulo y se conoce en la técnica.
En ciertas realizaciones, el inhibidor de la señalización de ActRII está sustancialmente puro en una composición farmacéutica. Específicamente, como máximo 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,1%, o como máximo 0,05%, de los compuestos en la composición farmacéutica son compuestos distintos del inhibidor de la señalización de ActRII y el vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferida, la composición farmacéutica se formula para administración subcutánea.
8. EJEMPLOS
8.1 Ejemplo 1
8.1.1 Proteínas de fusión ActRIIA-Fc
Se proporciona una proteína de fusión de ActRIIA soluble que tiene el dominio extracelular de ActRIIA humano fusionado con un dominio Fc humano o de ratón con un conector mínimo entremedias. Las construcciones se denominan ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc, respectivamente. ActRIIA-hFc se proporciona como SEQ ID NO:7.
Las proteínas ActRIIA-hFc y ActRIIA-mFc se expresaron en estirpes celulares CHO. Se consideraron tres secuencias conductoras diferentes:
(i) Melitina de abeja melífera (HBML): SEQ ID NO: 8
(ii) Activador tisular del plasminógeno (TPA): SEQ ID NO: 9
(iii) ActRIIA nativo: SEQ ID NO: 10
La forma seleccionada emplea el conductor TPA y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos sin procesar expuesta en SEQ ID NO: 13. Este polipéptido está codificada por SEQ ID NO: 14.
8.1.2 Proteínas de fusión ActRIIB-Fc
La estructura cristalina de un dominio extracelular de ActRIIB humano fusionado con un dominio Fc humano y activina no mostró ninguna función para los 15 aminoácidos finales (carboxiterminales) (denominados la "cola" en el presente documento) del dominio extracelular en la unión del ligando. Esta secuencia no resolvió la estructura cristalina, lo que indica que estos restos están presentes en un bucle flexible que no se empaquetó uniformemente en el cristal. Thompson et al. EMBO J. 2003 Apr 1 ;22(7):1555-66. Esta secuencia también se conserva poco entre ActRIIB y ActRIIA. Por consiguiente, estos restos se omitieron en la construcción de fusión ActRIIB-Fc básica, o de fondo. Además, la posición 64 en la forma de fondo está ocupada por una alanina, que, en general, se considera la forma "natural", aunque un alelo A64R ocurre naturalmente. Por lo tanto, la fusión ActRIIB-Fc de fondo tiene la secuencia desvelada como SEQ ID NO:21.
Sorprendentemente, se encontró que la cola carboxiterminal potenciaba la unión de activina y GDF-11, así una versión preferida de ActRIIB-Fc tiene una secuencia SEQ ID NO:20.
Una variedad de variantes de ActRIIB que se pueden usar según los métodos descritos en el presente documento se describe en la solicitud de patente internacional publicada como WO2006/012627 (véase, por ejemplo, pp. 59-60).
8.2 Ejemplo 2: Un estudio abierto, de fase 2 y de búsqueda de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1 (Int-1) o LMMC no proliferativa y anemia que requiere transfusión de RBC
8.2.1 Introducción
La anemia, un distintivo del SMD, es difícil de tratar, particularmente después del fracaso de los agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA). ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7; "sotatercept") es una proteína de fusión de receptor de tipo IIA de activina que actúa sobre la eritropoyesis de fase tardía para aumentar la liberación de eritrocitos maduros en la circulación (Carrancio et al. Br J Haematol 2014;165:870-82). El tratamiento de sujetos con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) estimuló la eritropoyesis y aumentó significativamente los niveles de hemoglobina (Hb) en sujetos sanos (Sherman et al. J Clin Pharmacol 2013 ;53:1121 -30), lo que soporta su desarrollo clínico para el tratamiento de anemia en sujetos con SMD de riesgo bajo.
8.2.2 Materiales y métodos
El objetivo principal de este ejemplo es determinar una dosis segura, tolerable y eficaz de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) que dé como resultado una mejora hemática eritroide (HI-E; criterios modificados de IWG 2006) en sujetos con anemia y SMD de riesgo bajo o Int-1 definido por IPSS o LMMC no proliferativa (glóbulos blancos < 13.000/|ul). Los objetivos secundarios incluyen tasa de independencia de transfusiones de RBC (RBC-TI) mayor o igual que 8 semanas. Los sujetos que cumplen los requisitos tuvieron anemia (requisito de transfusión mayor o igual que 2 unidades de RBC en las 12 semanas antes de la inclusión para Hb inferior o igual a 9,0 g/dl) sin respuesta, pérdida de respuesta o baja probabilidad de respuesta a ESA (eritropoyetina [EPO] en suero superior a 500 mUI/ml). Véase la Tabla 1 para una descripción de los sujetos estudiados en este ejemplo. Los sujetos recibieron ActRIIA-hFc subcutánea (SEQ ID NO:7) en niveles de dosis de 0,1,0,3, 0,5 o 1,0 mg/kg una vez cada 3 semanas. Véase la Figura 1 para un resumen del diseño del estudio.
8.2.3 Resultados
Se estudiaron un total de 54 sujetos con SMD: 7, 6, 21 y 20 en los grupos de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) 0,1, 0,3, 0,5 y 1,0 mg/kg, respectivamente. La mediana de edad fue 71 años (intervalo 56-86) y la mediana de tiempo desde el diagnóstico fue 4 años (intervalo 0-31); la mayoría de los sujetos fueron varones (70%). Los sujetos recibieron una mediana de 6 unidades de RBC (intervalo 0-18) en las 8 semanas antes del inicio del tratamiento. Cuarenta y cinco sujetos (83%) recibieron mayor o igual que 4 unidades de RBC en las 8 semanas antes del inicio del tratamiento (alta carga de transfusión; HTB) y 9 sujetos (17%) recibieron menos de 4 unidades en las 8 semanas antes del inicio del tratamiento (baja carga de transfusión; LTB). Diecinueve sujetos (35%) tuvieron IPSS bajo y 34 sujetos (63%) tuvieron SMD de riesgo Int-1 por IPSS; los datos de riesgo por IPSS estuvieron ausentes para 1 paciente. Cincuenta y un sujetos (94%) recibieron tratamiento anterior con ESA, 30 (56%) con agentes hipometilantes, 26 (48%) con lenalidomida y 26 (48%) con otros tratamientos para SMD; 15 sujetos (28%) tuvieron EPO en suero > 500 mUI/ml.
De los 53 sujetos evaluables para eficacia, se observó HI-E en 21 sujetos (40%) totales: 0, 4 (67%), 8 (40%) y 9 sujetos (45%) en los grupos de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) 0,1, 0,3, 0,5 y 1,0 mg/kg, respectivamente. Diecinueve de los 44 sujetos de HTB respondieron con una reducción de la carga de transfusión mayor o igual que 4 unidades de RBC/8 semanas; pareció que la duración de la respuesta a la transfusión era dependiente de la dosis. Véase la Figura 3 para un sujeto de HTB a modo de ejemplo que logró RBC-TI durante más de 56 días después del tratamiento con ActRIIA-hFc. Véase la Figura 4, que muestra la máxima duración de la respuesta a la carga de transfusión entre respondedores de HTB después de tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Cinco sujetos de HTB lograron RBC-TI mayor o igual que 8 semanas, con duración de RBC-TI que varió desde 59-345+ días. Véase la Figura 5, lo que demuestra la máxima duración de la respuesta de RBC-TI entre sujetos de HTB que logran RBC-TI durante al menos 56 días después del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Véase, por lo tanto, la Tabla 2.
Un subconjunto de sujetos de HTB que logran RBC-TI mayor o igual que 8 semanas tuvo elevados porcentajes de eritroblastos que fueron sideroblastos en anillo antes del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).
Ocho de 9 sujetos de LTB mostraron aumentos de Hb, no influidos por la transfusión, que variaron desde 1,3-3,8 g/dl. De estos, 2 sujetos tuvieron un aumento de Hb mayor o igual que 1,5 g/dl sostenido durante un tiempo mayor o igual que 8 semanas. Los sujetos con Hb superior a 11,0 g/dl se sometieron a retraso de la dosis por protocolo, que puede haber afectado la sostenibilidad del aumento de Hb. Se logró RBC-TI durante un tiempo mayor o igual que 8 semanas en 6 sujetos de LTB. Véase la Figura 6, que demuestra la proporción de sujetos de LTB que logran RBC-TI durante al menos 56 días y un aumento medio de Hb de al menos 1,5 g/dl después del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Véase la Figura 7, que muestra la máxima duración de la respuesta de RBC-TI entre LTB que logran RBC-TI durante al menos 56 días y un aumento medio de Hb de al menos 1,5 g/dl después del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). Se observaron aumentos en el nivel de plaquetas y neutrófilos en sujetos con trombocitopenia basal y sujetos con neutropenia basal, respectivamente.
ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) fue, en general, bien tolerada. Veinte sujetos (37%) comunicaron mayor o igual que 1 sospecha de acontecimiento adverso (AE) relacionado con el tratamiento; cansancio (11%), cefalea (9,3%), disminución del apetito (7,4%) y náuseas (7,4%) fueron los más comunes.
De los 35 sujetos (65%) que interrumpieron el tratamiento, 28 lo interrumpieron debido a la ausencia de un efecto terapéutico y 4 debido a AE. De los AE que conducen a interrupción, 3 fueron sospechas de estar relacionados con el tratamiento: 1 paciente con anemia hemolítica de grado 2, 1 paciente con hipertensión de grado 3 y 1 paciente con debilidad muscular de grado 2 en los grupos de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) 0,3, 0,5 y 1,0 mg/kg, respectivamente. Otros motivos para la interrupción fueron la retirada del consentimiento (n = 2; 4%) y la decisión del paciente (n = 1; 2%).
8.2.4 Conclusiones
ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) es bien tolerada en sujetos con SMD de riesgo bajo en los niveles de dosis probados, con evidencia prometedora de actividad clínica en esta cohorte mayoritariamente de HTB de sujetos con SMD resistentes a ESA, anémicos y de bajo riesgo. Además, estos datos indican que la presencia de sideroblastos en anillo en sujetos antes del tratamiento con un inhibidor de ActRII, por ejemplo, ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7), puede ser un indicador de tratamiento a largo plazo, independencia de transfusiones de RBC y aumentos a largo plazo en los niveles de hemoglobina.
Tabla 1. Características basales de los sujetos.
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Tabla 2. Respuesta a la transfusión entre sujetos con HTB (n=44)
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8.3 Ejemplo 3: ActRIIB-hFc aumenta la hemoglobina y reduce la carga de transfusión en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1: Resultados preliminares de un estudio de fase 2
8.3.1 Introducción
Se utilizó ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25; también denominado luspatercept), una proteína de fusión recombinante que contiene receptor de tipo IIB de activina modificado y Fc de IgG, para tratar anemias debido a eritropoyesis ineficaz, tales como SMD. Sujetos con SMD tienen frecuentemente niveles elevados de eritropoyetina (EPO) y puede ser no sensibles o resistentes a los agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA). Los sujetos con SMD también han mostrado tener niveles elevados de GDF11 en suero (Suragani R et al., Nature Medicine 2014) y elevada señalización de Smad 2/3 en la médula ósea (Zhou L et al., Blood 2008). ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) se une a ligandos en la superfamilia de TGF-p, que incluye GDF11, inhibe la señalización de Smad 2/3 y promueve la diferenciación eritroide en estado tardío por un mecanismo distinto de ESA. mActRIIB-Fc (versión murina de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) redujo la señalización de Smad 2, aumentó los niveles de hemoglobina (Hb) y disminuyó la hiperplasia eritroide de la médula ósea en un modelo de ratón de SMD (Suragani R et al., Nature Medicine 2014). En un estudio con voluntarios sanos, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fue bien tolerada y aumentó los niveles de Hb (Attie K et al., Am J Hematol 2014).
8.3.2 Materiales y métodos
Este ejemplo presenta datos de la búsqueda de dosis para evaluar los efectos de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) sobre la anemia en sujetos (véanse la Tabla 3 y Tabla 4) con SMD de riesgo bajo o Int-1 que tienen o alta carga de transfusión (HTB, definida como mayor o igual que 4 unidades de RBC/8 semanas antes del nivel basal) o baja carga de transfusión (LTB, definida como menos de 4 unidades de RBC/8 semanas antes del nivel basal). Los resultados incluyen respuesta eritroide (o aumentos de Hb en sujetos de LTB o carga de transfusión reducida en sujetos HTB), seguridad, tolerabilidad, biomarcadores FC y FD.
Los criterios de inclusión incluyeron SMD de riesgo bajo o Int-1, al menos 18 años en edad, anemia (definida como cualquier sujeto de HTB o que tiene Hb basal inferior a 10,0 g/dl en sujeto de LTB), EPO superior a 500 U/l o no sensible / resistente a ESA, sin azacitidina o decitabina previa y sin tratamiento actual con ESA, G-CSF, GM-CSF o lenalidomida. En la fase de aumento de dosis, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) se administró por inyección subcutánea (SC) una vez cada 3 semanas en 7 cohortes secuenciales (n=3-6) a niveles de dosis de 0,125, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,33 y 1,75 mg/kg durante hasta 5 dosis con un seguimiento de 3 meses. Se planea una cohorte de expansión (n=30), y todos los sujetos que completan este estudio se pueden incluir en un estudio de extensión de 12 meses. Véase la Figura 8 para una descripción del diseño experimental y la pauta posológica.
8.3.3 Resultados
Estuvieron disponibles datos para 26 sujetos (7 LTB/19 HTB). La mediana de edad fue 71 años (intervalo: 27-88 años), 50% fueron mujeres, 54% tuvieron terapia anterior con EPO y 15% tuvieron lenalidomida anterior. 69% fueron subtipo RCMD por la OMS, y los sujetos restantes fueron del(5q), RARs o RAEB-1. La Hb basal media (DE) para los sujetos de LTB (n=7) fue 9,1 (0,4) g/dl. Las unidades medias (DE) de RBC transfundidos en las 8 semanas antes del tratamiento fueron 0,9 (1,1) unidades para los sujetos de LTB y 6,3 (2,4) unidades para los sujetos de HTB. Véanse las Tablas 3 y 4.
Dos de los 7 sujetos de LTB tuvieron un aumento en Hb media >1,5 g/dl durante 8 semanas en comparación con el nivel basal. El aumento de Hb máxima media en los sujetos de LTB fue 0,8, 1,0, 2,2 y 2,7 g/dl en los grupos de dosis 0,125 (n=1), 0,25 (n=1), 0,75 (n=3) y 1,75 (n=2) mg/kg, respectivamente. Véase la Figura 9, que muestra el máximo aumento de hemoglobina en sujetos de LTB después del tratamiento con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Los sujetos de LTB administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) presentaron reticulocitos y niveles de hemoglobina elevados. Véanse las Figuras 10-12 y la Tabla 5. Seis de los 7 sujetos de LTB lograron independencia de transfusión de RBC (RBC-TI) durante >8 semanas durante el estudio.
Seis de los 19 sujetos HTB tuvieron una reducción >4 unidades o >50% en unidades de RBC transfundidas durante un intervalo de 8 semanas durante el periodo de tratamiento en comparación con las 8 semanas antes del tratamiento; cinco de estos 6 sujetos lograron RBC-TI > 8 semanas durante el estudio (intervalo 71-152 días). Se observaron aumentos en los niveles de hemoglobina en sujetos de HTB administrados con una ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Véase, por ejemplo, la Figura 13. Se observaron aumentos en la cifra de neutrófilos tras la administración del fármaco en estudio en algunos sujetos. Un subconjunto de los sujetos que logran RBC-TI mayor o igual que 8 semanas tuvo elevados porcentajes de eritroblastos que fueron sideroblastos en anillo antes del tratamiento de los sujetos con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Véase la Tabla 7.
ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fue, en general, bien tolerada. Los acontecimientos adversos más frecuentes, independientemente de la causalidad, fueron: diarrea (n=4, grado 1/2), dolor óseo, cansancio, espasmos musculares, mialgia y nasofaringitis (n=3 cada uno, grado 1/2).
Tabla 3. Características basales
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Tabla 4. Resumen de eficacia de la tasa de respuesta de HI-E en sujetos tratados con ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas.
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Tabla 5. Respuesta de la hemoglobina en sujetos de LTB
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Tabla 6. Respuesta a la transfusión en sujetos de HTB tratados con ActRIIB (SEQ ID NO:25) a las dosis indicadas.
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Tabla 7. Tasa de respuesta de IWG por morfología de sideroblastos en anillo (RS) y análisis mutacional
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8.3.4 Conclusiones
Basándose en los datos preliminares en sujetos de SMD bajo o Int-1, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) administrada SC cada 3 semanas durante hasta 5 dosis aumentó los niveles de Hb o disminuyó el requisito de transfusión, con un perfil de seguridad favorable. Estos datos soportan fuertemente una evaluación adicional del tratamiento a largo plazo de sujetos con SMD con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25).
8.4 Ejemplo 4: ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) aumenta la hemoglobina y reduce la carga de transfusión en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1: Resultados preliminares del estudio PACE-SMD de fase 2
8.4.1 Introducción
ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) es una proteína de fusión (receptor IIB de activina modificado/Fc de IgG) que está siendo investigado actualmente para el tratamiento de anemias con eritropoyesis ineficaz. Los sujetos con SMD tienen niveles elevados de GDF11 (Suragani, Nat Med 2014) y señalización aberrante de Smad2.3 en la médula ósea. ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) se une a ligandos de la superfamilia de TGF-p, que incluyen GDF11, activina B y BMP6, inhibe la señalización de Smad2.3 y promueve la diferenciación de eritroides de estadio tardío, distinta de ESA. En un estudio en voluntarios sanos, ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fue bien tolerada y aumentó los niveles de Hb (Attie, Am J Hematol 2014).
8.4.2 Objetivos
Los datos presentados en este ejemplo son de un estudio continuado, de fase 2, multicéntrico, abierto y de búsqueda de dosis para evaluar los efectos de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) sobre la anemia en sujetos con SMD de riesgo bajo o int-1 dependiente de transfusión (TD) o no dependiente de transfusión (NTD). Los resultados de los estudios incluyeron respuesta eritroide, seguridad, tolerabilidad, biomarcadores farmacocinéticos y biomarcadores farmacodinámicos. En sujetos de baja carga de transfusión (LTB), la respuesta eritroide se definió como un aumento en la concentración de hemoglobina. En sujetos de alta carga de transfusión (HTB), la respuesta eritroide se definió como carga de transfusión reducida.
8.4.3 Métodos
Los criterios de inclusión incluyeron SMD de riesgo bajo o int-1, edad > 18 años, con anemia definida como Hb < 10,0 g/dl (LTB, definida como <4 unidades de RBC/8 semanas antes del nivel basal) o >4 unidades de RBC/8 semanas antes del nivel basal (HTB), EPO >500 U/l o no sensible/resistente a ESA, sin azacitidina o decitabina previas, y sin tratamiento actual con ESA, G-CSF, GM-CSF o lenalidomida. ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) se administró por inyección subcutánea (SC) una vez cada 3 semanas en cohortes secuenciales (n=3-6 cada uno) a niveles de dosis que variaron desde 0,125 hasta 1,75 mg/kg durante hasta 5 dosis con un seguimiento de 3 meses. Una cohorte de expansión (n=30) está en curso, permitiéndose ajuste de la dosis a los sujetos individuales en función de la respuesta. Los sujetos que finalizan este estudio pueden ser incluidos en un estudio de extensión de 12 meses.
8.4.4 Resultados
Este ejemplo proporciona datos de seguridad y eficacia preliminar para 44 sujetos (19 mujeres, 25 varones; 15 sujetos de LTB, 29 sujetos de HTB) de 58 sujetos incluidos en el estudio de fase II. La mediana de edad de los sujetos fue 71 años.
61% de los sujetos recibieron una terapia anterior con EPO. 21% de los sujetos recibieron una terapia anterior con lenalidomida. 73% de los sujetos tuvieron RARS o RCMD-RS. 80% de los sujetos tuvieron más de 15% de sideroblastos en anillo en la médula ósea.
Los sujetos de LTB tratados con entre 0,75 mg/kg y 1,75 mg/kg (n=13) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) tuvieron un 77% de tasa de respuesta para el criterio principal de valoración (aumento de Hb >1,5 g/dl durante >2 semanas) y un 62% de tasa de respuesta de HI-E de IWG (mejora hemática eritroide del Grupo de Trabajo Internacional) (aumento de Hb >1,5 g/dl durante >8 semanas). El cambio máximo medio (desviación estándar) en la hemoglobina fue 2,7 (desviación estándar: 1,1) g/dl en los grupos de dosis más alta en comparación con 0,9 (desviación estándar: 0,1) g/dl en los grupos de dosis más baja.
Los sujetos de HTB tratados con entre 0,75 mg/kg y 1,75 mg/kg (n=13) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) tuvieron un 50% de tasa de respuesta a HI-E (reducción A4 unidades de RBC/8 semanas). La tasa de respuesta a HI-E fue 63% para sujetos con 15% de sideroblastos en anillo (n=30) y 80% para sujetos con mutaciones SF3B1 (n=10 ). ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fue, en general, bien tolerada. Los acontecimientos adversos más frecuentes independientemente de la causalidad fueron diarrea, nasofaringitis, mialgia, dolor óseo, bronquitis, cefalea y espasmos musculares.
8.4.5 Conclusiones
Basándose en los datos preliminares en sujetos de SMD bajo/Int-1, el tratamiento con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a niveles de dosis terapéutica durante 3 meses condujo a respuesta a HI-E para niveles elevados de Hb y/o disminuyó el requisito de transfusión en 54% de sujetos, con un perfil de seguridad favorable. Se observaron mayores tasas de respuesta en sujetos con sideroblasto en anillo y mutaciones SF3B1. Estos datos soportan fuertemente la utilización de los niveles de sideroblastos en anillo y la prevalencia de mutaciones SF3B1 como biomarcadores para el tratamiento eficaz con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) en sujetos con SMD.
8.5 Ejemplo 5: Un estudio abierto, de fase 2 y de búsqueda de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1 (Int-1) o LMMC no proliferativa y anemia que requiere transfusión de RBC
8.5.1 Introducción
Véase Introducción (Sección 8.2.1) y Materiales y métodos (Sección 8.2.2) para el Ejemplo 2 (Sección 8.2). Este ejemplo presenta datos adicionales del Ejemplo 2 (Sección 8.2), obtenidos en una fecha posterior en el estudio de fase 2.
8.5.2 Resultados
Se trató un total de 59 sujetos con SMD con o 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg o 2,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7). La Tabla 8 proporciona las características basales de los sujetos para cada grupo de tratamiento.
De los 53 sujetos evaluables para eficacia, se observó HI-E en 23 sujetos (43%) totales: 0, 4 (67%), 9 (45%) y 10 sujetos (50%) en los grupos de dosis de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) 0,1, 0,3, 0,5 y 1,0 mg/kg, respectivamente. Además, el tratamiento de sujetos de HTB con tan solo 0,3 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) produjo una reducción de carga de transfusión mayor o igual que 4 unidades de RBC/8 semanas (véase la Tabla 9). La duración de la respuesta de transfusión pareció que era dependiente de la dosis. Además, de los 45 sujetos evaluables de HTB, 6 (13) lograron RBC-TI durante al menos 8 semanas (véase la Tabla 9). Véase la Figura 13 para un sujeto de HTB a modo de ejemplo que logró RBC-TI durante al menos 337 días después del inicio del tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) en dosis de 1,0 mg/kg.
Tabla 8. Características basales de los sujetos.
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a a . espuesta a a transus n entre suetos e n=
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Además, de los 8 sujetos de LTB tratados con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7), 5 (63%) lograron RBC-TI con un aumento medio de Hb de al menos 1,5 g/dl durante cualquier periodo sin transfusión de 8 semanas. En particular, 33% de sujetos de LTB tratados con 0,5 mg/kg de ActRIIA-hFc (SeQ ID NO:7) y 80% de sujetos de LTB tratados con 1,0 mg/kg de ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) lograron RBC-TI con un aumento medio de Hb de al menos 1,5 g/dl durante cualquier periodo sin transfusión de 8 semanas. El aumento de Hb medio máximo en sujetos de LTB tratados con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) osciló entre 1,45 g/dl y 4,44 g/dl. La duración de RBC-TI en los sujetos de LTB tratados con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) osciló desde 76 hasta 472 días. Los sujetos de LTB con niveles de Hb superiores a 11,0 g/dl se sometieron a retardo de la dosis, que puede haber afectado la evaluación de la duración del aumento del nivel de Hb. Véase la Figura 14 para un sujeto de LTB a modo de ejemplo que logró RBC-TI y sostuvo aumentos en el nivel de hemoglobina durante al menos 358 días posteriores al inicio de tratamiento con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a una dosis de 1,0 mg/kg.
Además, se evaluó la asociación entre eficacia del tratamiento y presencia de sideroblastos en anillo (RS) en el nivel basal (véase la Tabla 10). HI-E se logró en 50% de sujetos RS-positivos. A diferencia, HI-E se logró en solo 10% de sujetos RS-negativos.
Tabla 10. Estado de sideroblastos en anillo en sujetos tratados con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7).
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ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) fue, en general, bien tolerada. Véase la Tabla 11. Cuatro sujetos interrumpieron el tratamiento debido a la sospecha de acontecimientos adversos relacionados con el tratamiento: Sujeto A (grupo de dosis de 0,3 mg/kg), anemia hemolítica de grado 2; Sujeto B (grupo de dosis de 0,5 mg/kg), hipertensión de grado 3; Sujeto C (grupo de dosis de 1,0 mg/kg), debilidad muscular de grado 2; Sujeto D (grupo de dosis de 2,0 mg/kg) y aumento de la tensión arterial de grado 2 con diarrea de grado 2.
8.5.3 Conclusiones
ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) es bien tolerada en sujetos con SMD de riesgo bajo en los niveles de dosis probados, con evidencia prometedora de actividad clínica en esta cohorte mayoritariamente de HTB de sujetos con SMD resistentes a ESA, anémicos y de bajo riesgo. Además, estos datos indican que la presencia de sideroblastos en anillo en sujetos antes del tratamiento con un inhibidor de la señalización de ActRII, por ejemplo, ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) puede ser un indicador de independencia de la transfusión de RBC en el tratamiento a largo plazo, aumentos a largo plazo en los niveles de hemoglobina y eficacia potenciada del tratamiento.
Tabla 11. Acontecimientos adversos en sujetos tratados con ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) a las dosis indicadas.
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8.6 Ejemplo 6: ActRIIB-hFc aumenta la hemoglobina y reduce la carga de transfusión en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1: Resultados preliminares de un estudio de fase 2
8.6.1 Introducción
Véase Introducción (Sección 8.3.1) y Materiales y métodos (Sección 8.3.2) para el Ejemplo 3 (Sección 8.3). Este ejemplo presenta datos adicionales del Ejemplo 3 (Sección 8.3), obtenidos en una fecha posterior en el estudio de fase 2.
8.6.2 Resultados
Estuvieron disponibles datos para 44 sujetos (15 LTB/29 HTB). La Tabla 12 proporciona las características basales para los sujetos estudiados en este ejemplo.
Se evaluó la respuesta eritroide en los sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Para los sujetos de LTB, el criterio principal de valoración fue un aumento de hemoglobina de al menos 1,5 g/dl durante al menos 2 semanas. Para sujetos de HTB, el criterio principal de valoración fue una reducción en la transfusión de RBC de al menos 4 unidades o al menos 50% durante 8 semanas. 33% (3/9) de los sujetos administrados con dosis más bajas (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró el criterio principal de valoración, mientras que 63% (22/35) de los sujetos administrados con dosis más altas (0,75-1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró el criterio principal de valoración.
Además, se evaluó HI-E de IWG. Para sujetos de LTB, HI-E de IWG es un aumento de hemoglobina de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. Para sujetos de HTB, HI-E de IWG es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas. 22% (2/9) de los sujetos administrados con dosis más bajas (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró HI-E de iWg , mientras que 54% (19/35) de los sujetos administrados con dosis más altas (0,75-1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró HI-E de IWG.
Los sideroblastos en anillo son eritroblastos anormales. Además, ciertas mutaciones somáticas asociadas al SMD provocan la formación de sideroblastos en anillo y eritropoyesis ineficaz. Las mutaciones dominantes en el factor 3B1 de corte y empalme (SF3B1) están asociadas con la formación de sideroblastos en anillo. Como se usa en el presente documento, "RS+" se refiere a al menos 15% de sideroblastos en anillo. Por lo tanto, la asociación entre la presencia de sideroblastos en anillo, mutaciones somáticas y eritropoyesis ineficaz y respuesta eritroide e independencia de la transfusión se evaluó en los sujetos tratados con dosis más altas (0,75 mg/kg-1,75 mg/kg) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) (véanse la Tabla 13 y Tabla 14). Los sujetos tratados con ActRIIB-hFc lograron HI-E de IWG e independencia de la transfusión (véase la Tabla 13, Tabla 14 y Figura 16). Estos datos indican que hubo un aumento de la respuesta eritroide en sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) cuando los sujetos fueron RS+ y/o tuvieron mutación (mutaciones) SF3B1.
Tabla 12. Características basales para sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)
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Tabla 13. Respuesta eritroide en sujetos RS+ y positivos para mutación SF3B1. Para sujetos de LTB, HI-E de IWG es un aumento de hemoglobina de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. Para sujetos de HTB, HI-E de IWG es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas.
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Tabla 14. Independencia de la transfusión en sujetos RS+ y positivos para mutación SF3B1. Independencia de la transfusión se refiere a sin transfusión de RBC durante al menos 8 semanas durante el tratamiento.
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8.6.3 Conclusiones
La administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a sujetos con SMD por vía subcutánea cada tres semanas fue, en general, segura y bien tolerada. La respuesta eritroide (HI-E de IWG) se logró en 54% de sujetos tratados con dosis de al menos 0,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Además, se observaron mayores tasas de respuestas eritroides en sujetos con sideroblastos en anillo o mutaciones en SF3B1. Además, la independencia de la transfusión se logró en 36% de los sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) en dosis de al menos 0,75 mg/kg.
8.7 Ejemplo 7: Un estudio de fase 2 de búsqueda de dosis de ActRIIA-hFC (SEQ ID NO:7) en pacientes con SMD de riesgo bajo y anemia que requiere transfusión
Véase Introducción (Sección 8.2.1) y Materiales y métodos (Sección 8.2.2) para el Ejemplo 2 (Sección 8.2). Este ejemplo presenta datos adicionales del Ejemplo 2 (Sección 8.2), obtenidos en una fecha posterior en el estudio de fase 2.
Las asociación entre eficacia del tratamiento y presencia de sideroblastos en anillo (RS) en el nivel basal se evaluó adicionalmente (véase la Tabla 15).
El logro de RBC-TI (con un aumento medio de Hb > 1,5 g/dl para pacientes de LTB) durante cualquier periodo de 8 semanas se muestra en la Figura 17.
Tabla 15. Respuesta eritroide: SMD sideroblástica frente a no sideroblástica en sujetos tratados con la fusión ActRIIA-hFC (SEQ ID NO:7). HI-E logrado en 64% de pacientes sideroblásticos y 20% no sideroblásticos en el grupo de dosis de sotatercept 1,0 mg/kg (prueba de la chi al cuadrado, P = 0,11)
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8.8 Ejemplo 8: ActRIIB-hFc aumenta la hemoglobina y reduce la carga de transfusión en sujetos con SMD de riesgo bajo o intermedio-1: Resultados preliminares de un estudio de fase 2 (continuación)
8.8.1 Introducción
Véase Introducción (Sección 8.3.1) y Materiales y métodos (Sección 8.3.2) para el Ejemplo 3 (Sección 8.3). Este ejemplo presenta datos adicionales del Ejemplo 3 (Sección 8.3), obtenidos en una fecha posterior en el estudio de fase 2.
8.8.2 Resultados
Se estudió un total de 49 sujetos con SMD. 27 de los 49 sujetos con SMD se incluyeron en un estudio de aumento de dosis de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) de 3 meses (0,125 mg/kg - 1,75 mg/kg), y 22 sujetos se incluyeron en un estudio de extensión posterior, como se muestra en la Tabla 16. La Tabla 17 proporciona las características basales para los sujetos estudiados en este ejemplo.
Estudio de aumento de dosis de 3 meses
Se evaluó la respuesta eritroide en los sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Véase la Tabla 18. Para los sujetos de LTB, el criterio principal de valoración fue un aumento de hemoglobina de al menos 1,5 g/dl durante al menos 2 semanas. Para sujetos de HTB, el criterio principal de valoración fue una reducción en la transfusión de RBC de al menos 4 unidades o al menos 50% durante 8 semanas. 33% (3/9) de los sujetos administrados con dosis más bajas (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró el criterio principal de valoración, mientras que 58% (23/40) de los sujetos administrados con dosis más altas (0,75-1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró el criterio principal de valoración.
Además, se evaluó HI-E de IWG. Véase la Tabla 18. Para sujetos de LTB, HI-E de IWG es un aumento de hemoglobina de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. Para sujetos de HTB, HI-E de IWG es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas. 22% (2/9) de los sujetos administrados con dosis más bajas (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró HI-E de IWG, mientras que 48% (19/40) de los sujetos administrados con dosis más altas (0,75-1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) logró HI-E de IWG.
Además, se evaluó la independencia de la transfusión. Véase la Tabla 18. Para sujetos que recibieron al menos dos unidades de RBC antes de la terapia de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25), la independencia de la transfusión se definió como el logro de al menos 8 semanas sin transfusión mientras que recibían tratamientos de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). 14% (1/7) de los sujetos administrados con dosis más bajas (0,125-0,5 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) lograron independencia de la transfusión, mientras que 37% (11/30) de sujetos administrados con dosis más altas (0,75-1,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)) lograron independencia de la transfusión. 4/6 sujetos de LTB y H24 sujetos de HTB lograron independencia de la transfusión. 10 de los 11 pacientes independientes de la transfusión tuvieron aparición en las primeras 6 semanas de los tratamientos con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25).
La asociación entre la presencia de sideroblastos en anillo, mutaciones somáticas y eritropoyesis ineficaz y respuesta eritroide e independencia de la transfusión se evaluó en los sujetos tratados con las dosis más altas (0,75 mg/kg-1,75 mg/kg) de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Véase la Tabla 19. 19/40 (48%) de todos los sujetos en los grupos de dosis más altas lograron HI-E de IWG. 19/35 (54%) de sujetos positivos para sideroblastos en anillo (RS) (definidos como que tienen al menos 15% de precursores eritroides en su médula ósea) lograron HI-E de IWG y 0/4 (0%) de los sujetos RS negativos lograron HI-E de IWG. 14/23 (61%) de los sujetos RS positivos con niveles de EPO inferiores a 200 mU/ml lograron HI-E de IWG y 5/12 (42%) de sujetos RS positivos con niveles de EPO inferiores a 200 mU/ml lograron HI-E de IWG. 16/26 (62%) de sujetos que llevan la mutación SF3B1 y 3/13 (23%) de sujetos que no llevan la mutación SF3B1 lograron HI-E de IWG.
En resumen, los resultados presentados en este ejemplo demostraron que los tratamientos con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) produjeron una robusta respuesta eritroide e independencia de la transfusión, especialmente en sujetos en los grupos de dosis más altas. Además, se encontró una respuesta eritroide enriquecida en sujetos RS+ positivos y positivos a mutaciones SF3B1.
ActRIIA-hFc (SEQ ID NO:7) fue, en general, bien tolerada. Véase la Tabla 20. La mayoría de los acontecimientos adversos (AE) fueron de grado 1 o 2. Se observaron dos acontecimientos adversos graves (SAE) posiblemente relacionados: dolor muscular de grado 3 (aparición día 90) y empeoramiento de grado 3 de la condición general (día de aparición 44, día de recidiva 66, sin relacionar). Se observó un AE de grado 3 no grave posiblemente relacionado de la cifra de blastocitos.
Tabla 16. Programa de administración de sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)
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Tabla 17. Características basales para sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)
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Tabla 18. Respuesta eritroide e independencia de la transfusión en sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)
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Tabla 19. Respuesta eritroide e independencia de la transfusión en sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25)
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Tabla 20. Acontecimientos adversos (todos los grados) notificados en >4 sujetos tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25), independientemente de la causalidad:
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Estudio de extensión
Los sujetos que terminaron el estudio de aumento de dosis de 3 meses cumplieron los requisitos de inclusión en un estudio de extensión de 12 meses posterior. Niveles de dosis iniciales de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fueron 1,0 mg/kg para sujetos cuyo tratamiento se interrumpió durante más de 3 meses. Los sujetos cuyo tratamiento con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) no se interrumpió continuaron sus tratamientos al mismo nivel de dosis que su última dosis en el protocolo de tratamiento de 3 meses.
Se incluyó un total de 58 sujetos en el estudio de tratamiento de 3 meses. De estos, 22 sujetos se incluyeron en un estudio de extensión de 12 meses, 9 pacientes de baja carga de transfusión y 13 pacientes de alta carga de transfusión. En el estudio de extensión, 17/22 sujetos continuaron sin interrumpir sus tratamientos con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) y 5/22 sujetos entraron después de una interrupción de >3 meses.
De los 9 pacientes de baja carga de transfusión, el aumento medio de hemoglobina en un mes fue aproximadamente 2 g/dl, aumentó hasta entre 2,5 y 3,0 g/dl y se mantuvo durante el periodo de 6 meses para el cual los datos están disponibles.
De los 13 pacientes de alta carga de transfusión, 43% logró independencia de la transfusión, manteniendo varios pacientes esta independencia de la transfusión durante más de 6 meses, siendo el paciente que fue más tiempo independiente de la transfusión casi 8 meses. Todos estos pacientes siguieron en el estudio.
La Figura 18 muestra los resultados para un sujeto a modo de ejemplo. Un sujeto de HTB RS-positivo se trató con dosis de 0,75 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) en el estudio de tratamiento inicial de 3 meses y se incluyó en el estudio de extensión de 12 meses después de una interrupción del tratamiento con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) de 11 meses, durante el cual el sujeto recibió EPO.
Se observó una respuesta de hemoglobina duradera en sujetos de LTB. 8/9 sujetos lograron HI-E de IWG. La Figura 19 muestra la respuesta de hemoglobina de un sujeto a modo de ejemplo.
Los sujetos en el estudio de extensión de 12 meses mostraron una respuesta duradera de independencia de la transfusión. La Figura 20 ilustra los resultados de 6 sujetos. 5 sujetos muestran una respuesta de independencia de la transfusión continua después de 2-7 meses, mientras recibieron tratamiento con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) a dosis de 1,0 mg/kg (4 sujetos) y 1,75 mg/kg (1 sujeto). Un sujeto (última fila en la Figura 20) recibió dos ajustes de dosis desde 1,0 mg/kg hasta 1,33 mg/kg y 1,75 mg/kg. Este último sujeto experimentó una independencia de la transfusión intermitentemente durante aproximadamente 2 meses y sigue logrando la respuesta de HI-E de IWG.
En conclusión, los resultados presentados en este ejemplo demostraron que sujetos con SMD RS-positivos de menor riesgo tratados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) demostraron una robusta mejora hemática, especialmente si se trataron con dosis de > 0,75 mg/kg. Los tratamientos con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) fueron, en general, bien tolerados. El tratamiento a largo plazo con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) demostró un aumento sostenido en el nivel de hemoglobina y mantuvo la independencia de la transfusión.
8.9 Ejemplo 9: Un estudio de fase III de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) para tratar anemia debida a SMD de riesgo muy bajo, bajo o intermedio por IPSS-R
Este ejemplo proporciona una visión general de un estudio de fase 3, con doble ocultación, controlado por placebo, multicéntrico y aleatorizado para determinar la eficacia y seguridad de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) para el tratamiento de anemia debido a SMD de riesgo muy bajo, bajo o intermedio por IPSS-R en sujetos con sideroblastos en anillo (al menos 15% de los eritroblastos son sideroblastos en anillo) que requieren transfusiones de RBC.
La anemia se considera una de las citopenias más prevalentes en pacientes que tienen síndrome mielodisplásico, un término paraguas usado para describir trastornos relacionados con la ineficaz producción de glóbulos rojos, glóbulos blancos y/o plaquetas. Variando en intensidad de leve (asintomática) a intensa, la anemia puede dar como resultado pacientes que requieren transfusiones de RBC, que puede conducir a complicaciones adicionales de sobrecarga de hierro. El objetivo de este estudio es evaluar la seguridad y eficacia de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) frente a placebo en pacientes anémicos que se clasifican como SMD de riesgo muy bajo, bajo o intermedio por IPSS-R, tienen sideroblastos en anillo presentes y requieren transfusiones de RBC. El diseño del estudio permitirá un periodo de aleatorización inicial de pacientes en cualquiera del grupo de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) o de placebo, seguido por un periodo de tratamiento con doble ocultación, y luego una visita de evaluación de la enfermedad SMD. Para los pacientes que se determinó que estaban experimentando un beneficio clínico como fue evaluado por el investigador del estudio por esta visita de evaluación de la enfermedad, se les permitirá que entren en la fase del estudio de extensión con doble ocultación. Una vez que los pacientes interrumpen el tratamiento del estudio, entrarán en un periodo de seguimiento post-tratamiento.
8.9.1 Diseño del estudio
A los sujetos se les administra una dosis inicial de 1,0 mg/kg de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25), por vía subcutánea, una vez cada tres semanas. A los sujetos de control se les administrará placebo, por vía subcutánea, una vez cada tres semanas.
(a) Criterios de inclusión
Los criterios de inclusión para la participación de sujetos en este estudio incluyen: (1) el sujeto tiene > 18 años de edad en el momento de firmar la declaración de consentimiento informado; (2) el sujeto tiene un diagnóstico de SMD que cumple la clasificación del Sistema Internacional de Puntaje Pronóstico-Revisado (IPSS-R) de enfermedad de riesgo muy bajo, bajo o intermedio y tiene: (a) más del 15% de precursores eritroides en la médula ósea son sideroblastos en anillo, y (b) menos del 5% de blastos en la médula ósea; (3) sujetos que requieren transfusiones de glóbulos rojos > 2 unidades en un periodo de 8 semanas; (4) puntaje del Grupo Oncológico Cooperativo de la Costa Este (ECOG) de 0, 1, o 2; (5) sujetos que son resistentes/intolerantes/no cumplen los requisitos para un tratamiento anterior con ESA; los resistentes a un tratamiento anterior con ESA requieren documentación de no respuesta o respuesta que ya no es mantenida al régimen que contiene ESA anterior, ya sea como un agente individual o combinación (por ejemplo, con G-CSF); el régimen de ESA debe haber sido o (a) eritropoyetina humana recombinante superior a 40.000 IU/semana durante al menos 8 dosis o equivalente, o (b) darbepoetina alfa superior a 500 μg una vez cada tres semanas durante al menos 4 dosis o equivalente; intolerante al tratamiento con ESA anterior requiere documentación de interrupción del régimen que contiene ESA anterior, ya sea como un agente individual o combinación (por ejemplo, con G-CSF), en cualquier momento después de la introducción debido a intolerancia o un acontecimiento adverso; los que no cumplen los requisitos de ESA requieren una baja probabilidad de respuesta a ESA basándose en un nivel de eritropoyetina endógena en suero superior a 200 U/l para sujetos no previamente tratados con ESA.
(b) Criterios de exclusión
La presencia de cualquiera de lo siguiente excluirá a un sujeto de la inclusión en el estudio: (1) terapia anterior con agentes modificadores de la enfermedad (por ejemplo, fármaco inmunomodulador, agentes hipometilantes o terapia inmunosupresora) o agentes experimentales para enfermedad de SMD subyacente; (2) SMD asociado a la anomalía citogenética del 5q; (3) SMD secundario, es decir, SMD que se conoce por haber surgido como resultado de lesión química o tratamiento con quimioterapia y/o radiación para otras enfermedades; (4) anemia clínicamente significativa conocida debido a deficiencias de hierro, vitamina B12 o folato, o anemia hemolítica autoinmune o hereditaria, o hemorragia gastrointestinal; la deficiencia de hierro será determinada por una tinción de aspirado de médula ósea para hierro, saturación de transferrina calculada (capacidad de unión a hierro/hierro total) < 20%, o ferritina en suero < 15 gg/l; (6) trasplante de células madre alógenas o autólogas anterior; (7) antecedentes de diagnóstico de leucemia mieloide aguda (LMA); (8) uso de cualquiera de lo siguiente en las 5 semanas antes de la aleatorización: agente quimioterapéutico citotóxico antineoplásico o tratamiento, corticosteroide, excepto sujetos en una dosis estable o decreciente durante > 1 semana antes de la aleatorización para afecciones médicas distintas de SMD, agentes quelantes de hierro, excepto sujetos con una dosis estable o decreciente durante al menos 8 semanas antes de la aleatorización, otros factores de crecimiento hematopoyéticos de RBC (por ejemplo, interleucina-3); (9) antecedentes de tumores malignos, distintos de SMD, a menos que el sujeto haya estado sin enfermedad durante > 5 años; se permiten sujetos con los siguientes antecedentes/afecciones concurrentes: carcinoma basal o de células escamosas de la piel, carcinoma in s itu de cuello uterino, carcinoma in s itu de mama, resultado histológico imprevisto de cáncer de próstata (T1a o T1b usando el tumor, nodos, sistema de estadificación clínica de metástasis); o (10) cirugía mayor en las 8 semanas antes de la aleatorización; los sujetos se deben haber recuperado completamente de cualquier cirugía previa antes de la aleatorización.
(c) Mediciones de resultados
La medición de los resultados principales de este estudio es la determinación de la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) que son independientes de transfusión de RBC (es decir, no requieren transfusión de RBC) durante ningún periodo consecutivo de 56 días.
Las mediciones de resultados secundarios incluyen la determinación de la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO: 25) que son independientes de transfusión de RBC (es decir, no requieren transfusión de RBC) durante ningún periodo consecutivo de 84 días después de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). También se determinará la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) que tiene una disminución en el número de unidades de RBC transfundidas durante un periodo de 16 semanas después de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Además, también se determinará la máxima duración de la independencia de la transfusión de RBC en sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Finalmente, también se determinará el tiempo requerido para que sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) alcancen la independencia de la transfusión de RBC; el tiempo hasta la independencia de la transfusión de RBC se define como el tiempo entre la aleatorización y la fecha en la que se observa en primer lugar la independencia de la transfusión (por ejemplo, día 1 de 56 días sin transfusiones de RBC).
También se determinará la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) que logran una mejora hemática eritroide modificada durante cualquier periodo consecutivo de 56 días después de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). En ciertos aspectos, la mejora hemática eritroide es como se define por IWG. En ciertos aspectos, la mejora hemática eritroide es como se define por 2006 IWG modificado. En ciertos aspectos, la mejora hemática eritroide para un paciente de baja carga de transfusión es un aumento en la concentración de hemoglobina en el paciente de al menos 1,5 g/dl durante al menos 8 semanas. En ciertos aspectos, la mejora hemática eritroide para un paciente de alta carga de transfusión es una reducción de al menos 4 unidades en la transfusión de RBC durante 8 semanas.
Se determinará la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) y que logran un aumento en al menos 1,0 g/dl de hemoglobina (en comparación con la concentración de hemoglobina en el sujeto antes de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) al sujeto) durante cualquier periodo consecutivo de 56 días en ausencia de transfusión de RBC.
Se determinará la disminución media en los niveles de ferritina en suero en sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) en comparación con los niveles de ferritina en suero antes de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). Se usará el análisis de la covarianza (ANCOVA) para comparar la diferencia entre grupos de tratamiento, con los factores de estratificación y el valor de ferritina en suero basal (administración pre-ActRIIB-hFC (SEQ ID NO:25)) como covariables.
Se determinará la disminución media en el uso de terapia de quelación del hierro en sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) en comparación con el uso de terapia de quelación del hierro antes de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). El cambio en la dosis de terapia de quelación del hierro diaria para cada sujeto se calcula como la diferencia de la dosis diaria media post-basal y la dosis diaria media basal. Se usará el análisis de la covarianza (ANCOVA) para comparar la diferencia entre grupos de tratamiento, con los factores de estratificación y los valores de terapia de quelación de hierro basal como covariables.
También se determinará la proporción de sujetos administrados con ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) que logra una mejora hemática de neutrófilos durante cualquier periodo consecutivo de 56 días después de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25). En ciertos aspectos, la mejora hemática de neutrófilos es como se define por IWG. En ciertos aspectos, la mejora hemática de neutrófilos es un aumento en los neutrófilos en al menos 100% y superior a 500/ul durante un periodo de 56 días consecutivos en el sujeto después de la administración de ActRIIB-hFc (SEQ ID NO:25) al sujeto.
También se determinará la proporción de sujetos que empeoran a leucemia mieloide aguda.
También se utilizará y evaluará la encuesta sobre la calidad de vida de la Organización Europea de Investigación y Tratamiento del Cáncer.
También se evaluarán acontecimientos adversos, supervivencia global, farmacocinética de la población y acontecimientos adversos.
9. DESCRIPCIÓN de LAS SECUENCIAS
Tabla 21. Información de secuencias
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de la señalización del receptor de tipo II de activina (ActRII) para su uso en un método de tratamiento de síndromes mielodisplásicos (SMD) en un sujeto, en donde el método comprende:
(a) determinar un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo; y
(b) administrar una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII de entre 0,1 mg/kg y 2,0 mg/kg al sujeto, si al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo,
en donde dicho inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende:
(i) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:7;
(ii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:7;
(iv) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7;
(v) una secuencia de aminoácidos que es al menos 90% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vi) una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% idéntica a SEQ ID NO:25;
(vii) una secuencia de aminoácidos que es al menos 98% idéntica a SEQ ID NO:25;
(viii) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25; o
(ix) un fragmento del dominio extracelular de ActRIIB, en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; un conector; y un Fc de una IgG.
2. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 1, en donde el método logra:
(a) reducción a largo plazo en un porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo en comparación con un porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo, en donde la reducción a largo plazo es una reducción en el porcentaje de eritroblastos mantenidos durante al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII; y/o
(b) aumento a largo plazo en un nivel de hemoglobina en el sujeto en comparación con un nivel inicial de hemoglobina en el sujeto, en donde el nivel inicial de hemoglobina en el sujeto es un nivel de hemoglobina en el sujeto en un periodo de tiempo previo antes de la administración al sujeto de una dosis inicial del inhibidor de la señalización de ActRII; en donde el aumento a largo plazo es un aumento en el nivel de hemoglobina mantenido durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
3. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII se administra durante un corto periodo de tiempo, y en donde el corto periodo de tiempo es 1,2, 3, 4 o 5 meses.
4. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende además: (c) determinar un segundo porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo después de un periodo de tiempo, opcionalmente en donde el periodo de tiempo es 1,2, 3, 4, 5 o 6 meses; y
(d) opcionalmente administrar al sujeto una dosis ajustada del inhibidor de la señalización de ActRII.
5. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el método comprende además: (c) determinar un nivel de hemoglobina en el sujeto después de que se administre el inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto, opcionalmente en donde el nivel de hemoglobina se determina 6, 12, 18 y/o 24 meses después de que se administre el inhibidor de la señalización de ActRII; y
(d) interrumpir la administración del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto, si el nivel de hemoglobina en el sujeto es al menos 11 g/dl.
6. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 1, en donde el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo se determina en 1 día, 2 días, 3, días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses o 6 meses desde la administración de la dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de la señalización de ActRII al sujeto.
7. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 2, en donde la reducción a largo plazo en el porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo es al menos 1,5, 2,5, 5,0, 7,5 o 10,0 veces menos del porcentaje inicial de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
8. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 2, en donde el aumento a largo plazo en el nivel de hemoglobina en el sujeto es un nivel de hemoglobina de entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl en el sujeto durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
9. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 3, en donde
(i) el primer porcentaje de eritroblastos que son sideroblastos en anillo en el sujeto administrado con el inhibidor de la señalización de ActRII durante el corto periodo de tiempo se reduce a menos del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, o menos del 1%, durante al menos 6, 12, 18 o 24 meses después del corto periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII; y/o
(ii) un nivel de hemoglobina en el sujeto administrado con el inhibidor de la señalización de ActRII durante un corto periodo de tiempo es entre aproximadamente 11 g/dl y 18 g/dl durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
10. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el sujeto tiene una elevada probabilidad de lograr la normalización de uno o más parámetros hemáticos, si al menos 15%, 16%, 17%, 18%, 19% o 20% de los eritroblastos en el sujeto son sideroblastos en anillo en comparación con un sujeto que tiene como máximo 15% de los eritroblastos que son sideroblastos en anillo.
11. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de la reivindicación 10, en donde el parámetro hemático es el nivel de hemoglobina, hematocrito, número de eritrocitos o porcentaje de eritroblastos en el sujeto que son sideroblastos en anillo.
12. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el sujeto no requiere transfusión de glóbulos rojos durante al menos 3, 4, 5, 6, 12, 18 o 24 meses después del periodo de tiempo de la administración del inhibidor de la señalización de ActRII.
13. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII se administra:
(i) una vez cada tres semanas;
(ii) una vez cada 28 días; o
(iii) una vez cada 42 días.
14. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII se administra por inyección, opcionalmente en donde la inyección es subcutánea.
15. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25.
16. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:7.
17. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el inhibidor de la señalización de ActRII es un polipéptido que comprende un fragmento del dominio extracelular de ActRIIB, en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:23; un conector; y un Fc de una IgG.18 18. El inhibidor de la señalización de ActRII para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el sujeto es un ser humano.
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